专利名称：一种动物皮胶原本体改性的方法
技术领域：
本发明涉及一种以碳化二亚胺、京尼平等改性剂对动物皮胶原本体进行改性的方法。
背景技术：
来自动物皮的胶原蛋白，不仅具有独特的理化性能，而且还具有良好的生物相容 性、可生物降解性、低免疫性以及止血性能等优良性能，尤其是其在动物体内容易被 吸收，亲水性强、无毒副作用、安全性好，因而被认为是最为理想的生物医学材料之 一。源自动物皮的胶原蛋白可以分为两类，即胶原本体和水解胶原。胶原本体是指以 胶原为主要成分的动物组织或器官为主要原料，未经或经过少量的化学或物理方法处 理，保留天然胶原结构和性质的动物组织或器官。
目前，国内外关于胶原本体纯化以及改性的文献均相对较少。但卫华等人利用天 然动物皮为主要原料，经过一系列物理化学作用进行纯化并最终获得胶原本体材料， 很大程度上保留了天然胶原结构和性质(但卫华，廖隆理，李志强，等.脱细胞真皮基 质材料的制备方法.中国发明专利.200410022506.9)。以此工艺制备的胶原本体材料具 有机械强度高、微弱抗原性、易于加工成型等特点，具有应用于生物医学领域的潜力， 如体表创伤修复材料、人工皮肤基质材料等。另外，柴家科等人亦利用猪皮为主要原 料，选择性地去细胞并将其作为人工皮肤代替物(柴家科，杨红明，刘强.选择性去细 胞猪皮作为人体皮肤代替物的应用及其制备方法.中国发明专利.200303148291.0)。
虽然胶原本体材料具有优良的物理机械性能、生物学性能等，但是其明显的缺点 如降解性能的不稳定，还是很大程度地限制了其作为生物医用材料的应用。究其根本， 改变这种状况的基本方法是对胶原本体材料中胶原纤维的交联形式以及交联程度达到 可控的掌握。在多种改性试剂与改性方法中，碳化二亚胺与京尼平具有一定的优势。
l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide，EDC)是一种水溶性的零长度蛋白质交联剂，随着人们对其改性反应基本 原理的进一步认知以及对其改性特点的进一步认可使得碳化二亚胺的应用越来越广 泛。在国内外，关于碳化二亚胺的研究主要是对组织工程支架材料或者人工皮肤代替 物进行改性，不仅改善材料的物理机械性能、稳定性[Heather M. Power, Steven T. Boyce. EDC cross-linking improves skin substitute strength and stability [J]. Biomaterials, 2006, 27:5821-5827.刘玲蓉，张立海，马瑞东等.碳化二亚胺交联的胶原一硫酸软骨素支架材 料构建人工真皮的研究[J].中国修复重建外科杂志,2003, 17(2): 83-87.]，同时也进一步 改进材料的生物相容性与综合性能[Heather M. Power, Steven T. Boyce. Wound closure with EDC cross-linked cultured skin substitutes grafted to athymic mice[J]. Biomaterials. 2006, 10: 1-9.]。
京尼平是传统中药杜仲的活性成分之一，是从京尼平甙中分离、提纯而获得的。 杜仲是属于杜仲科的一种落叶乔木，为我国特产，主要分布于中西部地区。从化学结 构上看，京尼平是一种环烯醚萜类的杂环化合物，具有羟基、羧基等多个活性官能团。 虽然近年有研究者开始关注京尼平[丁克毅.京尼平与皮胶原的反应性研究[J].中国皮 革.2007, 36(5): 10-12, 16. Butler, Michael F., Ng， Yiu-Fai; Pudney, Paul D.A. Mechanism and kinetics of the crosslinking reaction between biopolymers containing primary amine groups and genipin[J]. Journal of Polymer Science, Part A: Polymer Chemistry. 2003， 41(24): 3941-3953.]，但是其交联机理尚不十分明确，但是已经证实改性过程是自发的，且具 有极低的细胞毒性与基因毒性。金勋杰等人就京尼平改性明胶基材料与戊二醛改性明 胶基材料的生物学特性进行比较，基本认为京尼平具有更好的生物学性能[金勋杰，杨 显生，姬烨，等.蛋白交联剂京尼平与戊二醛的生物学特性比较[J].中国临床康复. 2006， 10(25): 60-62.]。在我国台湾地区，较早开始京尼平的相关研究，并取得了一定的 成果[Fwu陽Long Mi; Shin-Shing Shyu; Chih-Kang Peng. Characterization of ring-opening polymerization of genipin and pH-dependent cross-linking reactions between chitosan and genipin[J]. Journal of Polymer Science, Part A (Polymer Chemistry). 2005, 43(10): 1985-2000. Liang， Huang-Chien; Chang, Wen-Hisung; Liang, Hsiang-Fa; etal. Crosslinking structures of gelatin hydrogels crosslinked with genipin or a water-soluble carbodiimide[J]. Journal of A卯lied Polymer Science. 2004, 91(6): 4017-4026.]。在国外，研究工作者将京 尼平用于组织工程各种材料的改性研究，如药物缓释材料[Jin， J.; Song, M. Chitosan and chitosan陽PEO blend membranes crosslinked by genipin for drug release[J]. Journal of Applied Polymer Science. 2006, 102(1): 436-44.]，可降解型PEG凝胶[Moffat， Kristen L., Marra, Kacey G. Biodegradable poly(ethylene glycol) hydrogels crosslinked with genipin for tissue engineering applications [J]. Journal of Biomedical Materials Research - Part B Applied Biomaterials. 2004, 71(1): 181-187.]
到目前为止，国内外尚无文献资料利用碳化二亚胺或京尼平对胶原本体材料进行 改性的报道。因此，利用动物皮为主要原料制备胶原本体材料并采用碳化二亚胺或京尼平进行改性，进一步增强胶原本体材料的综合性能，拓展其生物医学领域的应用， 是一种具有重大意义的创新思路。
综上所述，现在技术存在以下不足
1. 现有技术采用戊二醛等化学方法或者采用辐照、热脱氢等物理方法对应用于生 物医学领域的胶原本体材料进行改性，具有一定的细胞毒性或者交联程度难以控制等 缺点。
2. 现有技术釆用碳化二亚胺或者京尼平对组织工程支架材料的改性主要集中在 水解胶原、壳聚糖等天然高分子材料，忽略了将其应用于胶原本体材料的可行性与潜 力。
发明内容
本发明的目的在于为生物医学领域提供一种应用范围更为宽广的胶原本体材料及 其改性方法，其特点是利用天然动物皮为原料获得胶原本体材料，经过特定条件的碳 化二亚胺或者京尼平改性后获得胶原本体材料，具有反应条件温和、交联程度可控等 优点。
本发明的目的是由以下技术措施来实现的，其中所述原料份数除特别说明外，均 为重量份数
胶原本体材料(厚度0.1-1.0 mm) 100份 碳化二亚胺 2 30份
京尼平 3 15份 所述胶原本体材料是以动物皮肤为主要原料制备的合格脱细胞胶原本体材料。 所述碳化二亚胺、京尼平均为市售分析纯试剂。其它述及的化学试剂，未经特殊
说明均为市售分析纯材料，且使用前不经任何提纯等操作。
上述胶原本体材料采用碳化二亚胺的改性方法，其特征是所述方法是按照以下
工艺分4个步骤
(1) pH值调节
称取胶原本体材料100重量份，加入800 2000重量份浓度为20 70 mmol/L， pH 值为5.0 6.0的2-N-吗啉乙烷磺酸(2-N-morpholino ethanesulfonic acid, MES)的40 80v/vQ/。乙醇溶液中或者pH值为5.0 6.0的磷酸盐缓冲液(PBS)中，振荡15 60min;
(2) 改性
在上述pH值调节液中，分别加入2 30重量份的EDC和N-羟基丁二酰亚胺(N-hydroxysuccinimide， NHS)，室温条件下振荡4 24 h获得胶原本体改性材料；
(3) 清洗
将上述胶原本体改性材料依次用0.1 mol/L的磷酸二氢钠溶液、pH 7.2 7.4的磷 酸盐缓冲液、双蒸水反复清洗，每次清洗不少于60min，每种清洗液清洗不少于3 h， 累计总清洗时间达到24 h以上；
(4) 干燥
将上述清洗后的胶原本体材料冷冻干燥即获得改性胶原本体材料。 上述胶原本体材料采用京尼平的改性方法，其特征是所述方法是按照以下工艺 分4个步骤 .
(1) pH值调节
称取胶原本体材料100重量份，加入800 2000重量份pH值为6.0 8.0的磷酸盐 缓冲液(PBS)中，振荡15 60min;
(2) 改性
在上述pH值调节液中，加入3 15重量份的京尼平，20 40。C条件下振荡10 24h获得胶原本体改性材料；
(3) 清洗
将上述胶原本体改性材料依次用0.1 mol/L的磷酸二氢钠溶液、pH 7.2 7.4的磷 酸盐缓冲液、双蒸水反复清洗，每次清洗不少于30min，每种清洗液清洗不少于1 h， 累计总清洗时间达到3 h以上；
(4) 干燥
将上述清洗后的胶原本体材料冷冻干燥即获得改性胶原本体材料。 鉴于胶原独特的结构与性能，胶原基生物医用材料的研究受到格外关注。胶原本 体材料秉承了胶原蛋白的优良特性，具有生物相容性、可生物降解性等性能，同时经
过碳化二亚胺或者京尼平改性后，克服了材料本身的缺点，且可以通过改性程度的控 制达到对目标材料降解性能可控的目的，从而大大扩展了胶原本体材料的应用范畴。 与现有的工艺技术相比，本发明具有以下优点
(1) 改性工艺简单、条件温和、易于操作，结合胶原本体材料的实际情况改进 工艺条件，充分发挥改性剂的效率；
(2) 利用碳化二亚胺或京尼平改性得到的胶原本体材料生物相容性极好，综合性能优异，进一步拓展了胶原本体材料的应用范畴。
具体实施例方式
下面通过实施对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本 发明进行进一步说明，而不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人 员可以根据上述发明的内容做出一些非本质的改进和调整。
实施例1
(1) pH值调节
称取胶原本体材料100重量份，加入800重量份浓度为70 mmol/L， pH值为6.0 的MES的80v/v。/。乙醇溶液中，振荡15 min;
(2) 改性
在上述pH值调节液中，分别加入30重量份的EDC和NHS，室温条件下振荡4h 获得胶原本体改性材料；
(3) 清洗
将上述胶原本体改性材料依次用0.1 mol/L的磷酸二氢钠溶液、pH 7.2的磷酸盐缓 冲液、双蒸水反复清洗，每次清洗不少于60min，每种清洗液清洗不少于3 h，累计总 清洗时间达到24h以上；
(4) 干燥
将上述清洗后的胶原本体材料冷冻干燥即获得改性胶原本体材料。 实施例2
(1) pH值调节
称取胶原本体材料100重量份，加入2000重量份浓度为20 mmol/L， pH值为5.0 MES的40v/v。/。乙醇溶液中，振荡60 min;
(2) 改性
在上述pH值调节液中，分别加入2重量份的EDC和NHS，室温条件下振荡24h 获得胶原本体改性材料；
(3) 清洗
将上述胶原本体改性材料依次用0.1 mol/L的磷酸二氢钠溶液、pH 7.4的磷酸盐缓 冲液、双蒸水反复清洗，每次清洗不少于60min，每种清洗液清洗不少于3 h，累计总 清洗时间达到24h以上；(4)干燥
将上述清洗后的胶原本体材料冷冻干燥即获得改性胶原本体材料。
实施例3
(1) pH值调节
称取胶原本体材料100重量份，加入1200重量份浓度为50 mmol/L， pH值为5.5 的MES的磷酸盐缓冲液(PBS)中，振荡60min;
(2) 改性
在上述pH值调节液中，分别加入15重量份的EDC和NHS，室温条件下振荡8 h 获得胶原本体改性材料；
(3) 清洗
将上述胶原本体改性材料依次用0.1 mol/L的磷酸二氢钠溶液、pH 7.2的磷酸盐缓 冲液、双蒸水反复清洗，每次清洗不少于60min，每种清洗液清洗不少于3 h，累计总 清洗时间达到24h以上；
(4) 干燥
将上述清洗后的胶原本体材料冷冻干燥即获得改性胶原本体材料。
实施例4
(1) pH值调节
称取胶原本体材料100重量份，加入800重量份pH值为6.0的磷酸盐缓冲液(PBS) 中，振荡60 min;
(2) 改性
在上述pH值调节液中，加入3重量份的京尼平，2(TC条件下振荡24 h获得胶原 本体改性材料；
(3) 清洗
将上述胶原本体改性材料依次用0.1 mol/L的磷酸二氢钠溶液、pH 7.2的磷酸盐缓 冲液、双蒸水反复清洗，每次清洗不少于30min,每种清洗液清洗不少于1 h，累计总 清洗时间达到3h以上；
(4) 干燥
将上述清洗后的胶原本体材料冷冻干燥即获得改性胶原本体材料。
实施例5
(1) pH值调节称取胶原本体材料100重量份，加入2000重量份pH值为8.0的磷酸盐缓冲液(PBS) 中，振荡15 min;
(2) 改性
在上述pH值调节液中，加入15重量份的京尼平，40'C条件下振荡10 h获得胶 原本体改性材料；
(3) 清洗
将上述胶原本体改性材料依次用0.1 moI/L的磷酸二氢钠溶液、pH 7.4的磷酸盐缓 冲液、双蒸水反复清洗，每次清洗不少于30min，每种清洗液清洗不少于1 h，累计总 清洗时间达到3h以上；
(4) 干燥
将上述清洗后的胶原本体材料冷冻干燥即获得改性胶原本体材料。
实施例6
(1) pH值调节
称取胶原本体材料100重量份，加入1600重量份pH值为7.5的磷酸盐缓冲液(PBS) 中，振荡40min;
(2) 改性
在上述pH值调节液中，加入10重量份的京尼平，35"条件下振荡16h获得胶原 本体改性材料；
(3) 清洗
将上述胶原本体改性材料依次用0.1 mol/L的磷酸二氢钠溶液、pH 7.2的磷酸盐缓 冲液、双蒸水反复清洗，每次清洗不少于30min，每种清洗液清洗不少于1 h，累计总 清洗时间达到3h以上；
(4) 干燥
将上述清洗后的胶原本体材料冷冻干燥即获得改性胶原本体材料。
权利要求
1.一种动物皮胶原本体改性的方法，其特征是以动物皮肤为主要原料制备的胶原本体材料，以及市售碳化二亚胺和京尼平为主要原料。经过pH值调节、改性、清洗、干燥等过程获得改性的胶原本体材料。其中，各组分原料的重量百分比组成计为胶原本体材料(厚度0.1-1.0mm) 100份碳化二亚胺2～30份京尼平3～15份。
2. 如权利要求1所述的胶原本体材料的碳化二亚胺改性方法，其特征在于该方法 包括以下步骤(1) pH值调节称取胶原本体材料100重量份，加入800 2000重量份浓度为20 70 mmol/L， pH值为5.0 6.0的2-N-吗啉乙垸磺酸(2-N-morpholinoethanesulfonicacid, MES)的 40 80v/v。/。乙醇溶液中或者pH值为5.0 6.0的磷酸盐缓冲液(PBS)中，振荡15 60 min;(2) 改性在上述pH值调节液中，分别加入2 30重量份的l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳 化二亚胺(l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC)和N-羟基丁二酰亚 胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)，室温条件下振荡4 24 h获得胶原本体改性材料；(3) 清洗将上述胶原本体改性材料依次用0.1 mol/L的磷酸二氢钠溶液、pH 7.2 7.4的磷 酸盐缓冲液、双蒸水反复清洗，每次清洗不少于60min，每种清洗液清洗不少于3 h, 累计总清洗时间达到24h以上；(4) 干燥将上述清洗后的胶原本体材料冷冻干燥即获得改性胶原本体材料。
3. 如权利要求1所述的胶原本体材料的京尼平改性方法，其特征在于该方法包括以下步骤(1) pH值调节称取胶原本体材料100重量份，加入800 2000重量份pH值为6.0 8.0的磷酸盐 缓冲液(PBS)中，振荡15 60min;(2) 改性在上述pH值调节液中，加入3 15重量份的京尼平，20 40。C条件下振荡10 24 h获得胶原本体改性材料；(3) 清洗将上述胶原本体改性材料依次用0.1 mol/L的磷酸二氢钠溶液、pH 7.2 7.4的磷 酸盐缓冲液、双蒸水反复清洗，每次清洗不少于30min，每种清洗液清洗不少于1 h， 累计总清洗时间达到3 h以上；(4) 干燥将上述清洗后的胶原本体材料冷冻干燥即获得改性胶原本体材料。
全文摘要
本发明公开了一种动物皮胶原本体改性的方法，其特点是取胶原本体材料100重量份，加入800～2000重量份浓度为20～70mmol/L，pH值为5.0～6.0的2-N-吗啉乙烷磺酸(2-N-morpholino ethanesulfonic acid，MES)的40～80v/v％乙醇溶液中或者pH值为5.0～6.0的磷酸盐缓冲液(PBS)中，振荡15～60min，然后分别加入2～30重量份的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)，室温条件下振荡4～24h获得胶原本体改性材料；或者取胶原本体材料100重量份，加入800～2000重量份pH值为6.0～8.0的磷酸盐缓冲液(PBS)中，振荡15～60min，然后加入3～15重量份的京尼平，20～40℃条件下振荡10～24h获得胶原本体改性材料；再依次用0.1mol/L的磷酸二氢钠溶液、pH 7.2～7.4的磷酸盐缓冲液、双蒸水反复清洗，每次清洗不少于60min，每种清洗液清洗不少于3h，累计总清洗时间达到24h以上；最后冷冻干燥获得改性胶原本体材料。
文档编号A61L27/54GK101314058SQ20071004917
公开日2008年12月3日 申请日期2007年5月28日 优先权日2007年5月28日
发明者但卫华, 但年华, 刘汝诚, 海 林, 黄惠兴 申请人:江阴奔翔生物科技有限公司