专利名称：一种从中药钩藤提取液中分离钩藤总生物碱的方法
技术领域：
本发明涉及一种中药有效成分的提取分离，特别是涉及一种从中药钩藤提取液中提取分 离钩藤总生物碱的方法，属中药领域。
背景技术：
生物碱是自然界中广泛存在的一大类碱性含氮化合物，是许多中草药的有效成分，是自 然界中存在的一类重要物质。钩藤，收载于中国药典2005年版一部180页，系茜草科植物钩 藤Uncaria rhynchophylla (Miq. ) Jack、大叶钩藤Uncaria macrophylla Wall.、毛钩藤 Uncaria hirsute Havil.、华钩藤Uncaria sinensis (Oliv. ) Havil.或无柄果钩藤Uncaria sessilifructus Roxb.的干燥带钩茎枝，又名大钩丁、双钩藤等，是一种常用民间中草药， 具有清热平肝、息风定惊等功效。研究表明，钩藤总碱是其主要有效部位，包括钩藤碱 (rhynch叩hylline)、异钩藤碱(Isorhynchophylline)等，临床制剂已用于头痛眩暈、感 冒夹惊、惊痢抽搐、妊娠子痫、高血压等症的治疗。因此，钩藤总生物碱有效部位制剂临床 需求量很大。
现阶段，中药生物碱的提取工艺已较成熟，根据生物碱的理化特性，采用适宜的溶剂如 水、酸水、酸醇及碱醇等，利用浸渍、渗漉、煎煮、回流、超声、酶解等技术将生物碱类成 分提取出来，提取率能达到90%以上。但由于生物碱在中药中的相对含量较低(多数含量为 0. 01%-1%)，提取时势必引入大量的其他药物成分和杂质类成分，要保证最后制剂的安全有效， 必须对其进行精制纯化，制备成有效部位甚至有效成分来应用，因此生物碱有效部位的精制 纯化技术就显得十分重要。但由于其他多种成分的并存以及淀粉、树胶、果胶、粘液质、色 素等杂质的干扰，生物碱有效部位的精制技术一直是中药现代化的"瓶颈"，严重影响了现代 中药制剂对三效(高效、速效、长效)、三小(剂量小、毒性小、副作用小)、五方便(生产、 运输、携带、贮存、应用方便)的要求。
虽然在教科书及各种文献中多有提取分离中药总生物碱的方法，但这些方法仅停留于实 验室的研究水平，多数是将含有生物碱的溶液过柱后，以氨液或Na0H溶液洗脱，收集洗脱液 后再以有机溶剂萃取生物碱；或者将上过样品的树脂以碱液浸泡，然后再用有机溶剂回流提 取生物碱。但这些方法具有步骤繁琐，有机溶剂用量大、大设备无法实现和生物碱转移率低 等缺点，因而一直处于实验室研究水平，不能在大生产中应用。梁勇、温碧珍在2000年第1 期的《中国热带医学》发表了《钩藤中总生物碱的提取分离研究》，文中提出了一种最新的从 中药钩藤中提取分离总生物碱的技术是用离子交换树脂法，基本过程为将从钩藤饮片中提取得到的粗总生物碱溶液，通过阳离子交换树脂柱吸附后，用氨性乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，得钩藤总生物碱。这种方法避免了大量有机溶剂的使用，可以提高生物碱的纯度，具有一定的进步性，但仍存在严重缺陷试验中以生物碱水液直接上样，钩藤生物碱电离不完全，过柱吸附效果差；采用氨性乙醇溶液作为洗脱剂，洗脱效果不高，导致总生物碱的转移率低；碱性条件下游离的钩藤总生物碱需要在乙醇溶液中才有较好的溶解度，但乙醇溶液的使用，会在洗脱液中带入树脂单体成分如苯乙烯、二乙烯苯等的残留，影响制剂安全；同时由于工艺中使用乙醇，还要求树脂前处理必须增加乙醇处理步骤，后期还要回收乙醇，增加了工艺步骤，提高了生产成本。故为了适应市场及生产，需要一种安全、低成本、收率高的提取分离方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种安全、低成本、高效率的提取分离钩藤总生物碱的方法。该发明目的是通过如下工艺实现的取钩藤提取液，调整pH值l至7，滤过，取滤液加
于阳离子交换树脂柱上，先以水洗脱除杂，再用0.5% 15%酸液洗脱，收集洗脱液，加碱中和，经脱盐处理，浓縮干燥得钩藤总生物碱。
在上述工艺过程中，将含有总生物碱的提取液调至合适的酸度后，生物碱电离成为阳离子，非碱性物质不被电离，提取液过阳离子交换树脂柱后，电离的生物碱有机离子与树脂柱上的氢离子交换而被牢固地吸附于树脂柱上。这里提取液的pH值不宜过高或过低，如果过高，提取液呈中性或碱性，生物碱不能电离，也就不能完成树脂上的交换过程；如果过低，提取液中的氢离子浓度太高，阻碍了树脂柱上的氢离子解离，同样不能很好地完成树脂交换过程，因而实验中发现调整提取液的pH值为1至7是比较合适的。以水洗脱时，使用的是去离子水，以确保不引入新的离子干扰，洗脱时那些没有被树脂吸附的非碱性物质就很容易被水洗脱下来，从而与被吸附在树脂柱上生物碱有机离子分离了。此后再加较高浓度的酸液进行洗脱，由于此时酸液中的氢离子浓度很高，就会竞争性地与树脂相结合，从而将吸附在树脂柱上的生物碱有机离子交换下来，溶解在酸洗脱液中，流出树脂柱，完成生物碱的富集过程。之后，在洗脱液中加入碱中和掉多余的酸，再经常规脱盐处理，即可得到纯度较高的钩藤总生物碱了。
该工艺过程与现有技术相比，工艺流程简单，不使用有机溶剂、无树脂单体成分残留、生物碱转移率高；其重要的贡献还在于，打破了传统理论认为的离子交换能力顺序规律，艮P:Ca2+>K+^NH4+〉Na+〉H+。正是在这一传统理论的影响下，所有关于钩藤总生物碱的离子交换树脂分离法中都是碱液或氨液进行洗脱，或者先用碱液中和树脂柱再用有机溶剂回流提取理 论上已经游离的生物碱，而实际应用中的效果非常不理想且不适于大生产。在本发明的技术 方案中，虽然氢离子的交换能力是最弱的，但通过提高酸洗脱液中氢离子的浓度，从而抵消 了其交换能力弱的缺点，同时在酸性条件下，可以使交换下来的生物碱迅速溶解到酸液中， 并被冲出柱子，由此保证了生物碱的洗脱效果。并且，以酸液进行洗脱，在洗脱的同时，也 使阳离子交换树脂柱得以再生，从而可以循环使用，减少了碱液洗脱后再生树脂柱的过程， 降低了成本。本发明的技术完全突破了现有技术中以碱液洗脱的传统观念和工艺过程，取得 了意想不到的效果，极大的提高了钩藤总生物碱的得率，使阳离子交换树脂在工业生产中用 于精制分离钩藤总生物碱成为可能。
基于上述工艺过程，发明人又进行了进一步的研究，细化各步骤的参数，筛选出最优方 案，具体内容如下
1、 上柱前调整药液的pH值范围优选为2至5，效果更加明显。
2、 所用的阳离子交换树脂可以是大孔型或凝胶型强酸型离子交换树脂，在实际使用时可
以根据情况处理成氢型、钠型或铵型中的任一种。
3、 所用阳离子交换树脂柱的柱径与柱高之比并无一定之规，但考虑生产实际，柱径柱 高=1: 5 1: IO时可以取得最好的效果。
4、 给树脂柱上样的药液浓度为每ml相当于生药0. 1 3g，具体情况可以根据药液的前 处理方式决定，如果是采用浸渍、渗漉等方式，得到的药液就会比较稀；而如果是回流提取、 煎煮等方式，尤其是经过浓縮处理，药液的浓度就会比较大，但只要是在这个范围内，都能 实现上样。同时，上样速度也根据药液的浓度进行适时调整，基本满足在0. 5 5倍柱体积/ 小时即可。
5、 上样方式一般选择为从柱上端上样，药液靠自流力而流过整个柱子；发明人发现，如 果逆流上样，即将药液从柱子底端上样，通过一定的压力，使药液注满整个柱子，这种上样 方式可以发挥柱子的最大交换效率，也避免了从上端上样时由于生物碱交换不完全而发生的 提前穿透问题。这一点也是发明人创造性的发现。
6、 洗脱所用的酸液优选为盐酸溶液或硫酸溶液，其浓度均优选为3% 6%。
7、 洗脱时洗脱液的流速不宜过快或过慢，如果过快，则氢离子与生物碱有机离子的交换 不充分，酸液浪费较多；如果过慢，则解离下来的生物碱有机离子可能又重新吸附回树脂柱 上，影响洗脱效率。实验发现，洗脱速度保持在2 6倍柱体积/小时为宜。进一步优选，洗 脱速度保持在4 6倍柱体积/小时最好。
8、 发明人还发现，如果想更高地提高洗脱效率，可以在水洗脱除杂后，不立即进行酸液洗脱，而是先在树脂柱中充满酸液并静置2小时以上， 一般不需超过12个小时，再进行洗脱。
经过静置后，大量的生物碱有机离子已被氢离子交换下来，或者处于半吸附半解离的状态，此时进行洗脱，生物碱富集效果明显，洗脱效率明显提高。
9、 为了进一步提高洗脱效率，还可以在洗脱用的酸液中加入少量NH4C1、 NaCl或CaCl2，加入量不宜过少或过多，如果过少，则起不到作用；如果过多，则因盐浓度过高易盐析而影响生物碱有机离子的溶解度。实验发现，洗脱液中以腿4+、 Na+或C^+浓度为().1 lmol/L时为佳，进一步优选，NH4+、 Na+或Ca2+的浓度为0. 1 0.3mol/L时最好。
10、 工艺中所说的脱盐方法可以是透析法除盐、膜滤过除盐以及其他各种药物生物领域常规的除盐方法，目前这些方法都已经比较成熟，并可以管道化生产。
11、 该方法中所说的钩藤提取液可以通过浸渍、滲漉、超声、微波或煎煮中的任一种方式提取制得，并且提取的溶媒可以是水、酸水、乙醇溶液、酸性乙醇溶液中的任一种，但都属于目前中药领域的常规提取方法。区别点在于，如果是用浸渍或渗漉方法制得，可以直接上样；如果是用其他方法提取得到的，还要经过醇沉、过滤或离心除杂等步骤，以保证上样的顺利。
需要说明的是，上述优选的技术参数，可以根据实际情况的需要，与基本工艺进行任意组合，且均能取得良好的效果，解决技术问题，达到本发明的目的。下面通过对比实验来说明本发明的优点。一、实验方案-
取钩藤饮片1500g，加pH-4的酸水煎煮2次，每次10倍量，煎煮2小时，合并煎煮液，离心，滤液稀释至3000ml并调节pH-3，均分成三份，分别按以下步骤处理-
① 根据现有技术，取上述提取液1000ml，上阳离子交换树脂(001X7，氢型，径高比l:5)，以去离子水洗至注出液无色，再用氨性乙醇洗脱，洗脱速度为5倍柱体积/小时，至生物碱检査为阴性，收集这部分洗脱液，回收乙醇，得钩藤总生物碱。
② 根据本发明的技术，取上述提取液1000ml，上阳离子交换树脂(001X7，氢型，径高比h 5)，以去离子水洗至注出液无色，再用3%盐酸溶液洗脱，洗脱速度为5倍柱体积/小时，至生物碱检查为阴性，收集酸洗脱液，用氢氧化钠中和至中性，除盐，滤液浓縮干燥得钩藤总生物碱。
③ 根据本发明的技术，取上述提取液1000ml，上阳离子交换树脂(001X7，氢型，径高比l: 8),逆流上样，以去离子水洗至注出液无色，加0.1mol/L的NaCl的3X盐酸溶液至全柱，静置2个小时，再用上述溶液以5倍柱体积/小时的速度洗脱，至生物碱检查为阴性，收集这部分洗脱液，用氢氧化钠中和至中性，除盐，滤液浓縮干燥得钩藤总生物碱。
二、 结果计算分别称量三种工艺所得钩藤总生物碱的重量，并与药材量相除，得总生物碱的收率；以酸碱滴定法对三种方法所得总生物碱进行含量测定，计算总生物碱的纯度。
三、 结果对比，见下表
三种工艺的效果评价表
工艺1工艺2工艺3
收率0. 5%1.0%1.2%
纯度63%86%85%
成本步骤多，使用乙醇作为洗 脱剂，成本高不用有机溶剂，成本低不用有机溶剂，且酸洗脱 液的用量减少，成本更低
时间周期长，至少需8小时周期短，仅需要5小时周期短，仅需要4.5小时
安全性用气相色谱测得提取物 中含有苯乙烯、二乙烯苯无树脂单体残留物无树脂单体残留物
复杂程度需用乙醇预处理树脂柱， 洗脱后还要再生树脂柱； 洗脱时间长；洗脱效率较 低；洗脱产物需回收乙醇过程简单，只需正常预处 理树脂柱，在酸洗脱的同 时也再生了树脂柱过程简单，只需正常预处 理树脂柱，在酸洗脱的同 时也再生了树脂柱
由以上对比结果可见，本发明的技术方案可以解决现有技术中的不足，并显著地提高产品的质量、降低成本、提高安全性和生产可行性，本发明达到了发明目的。
具体实施方式
实施例h
取钩藤饮片1000g，加水煎煮2次，每次10倍量，煎煮2小时，合并煎煮液，离心，调节pH二3，离心，上清液以4倍柱体积/小时通过阳离子交换树脂(001X7，氢型，径高比l:8),水洗至流出液无颜色，再用15%盐酸溶液洗脱，洗脱速度为2倍柱体积/小时，至生物碱检查为阴性(流出液滴加10%硅钨酸无沉淀)，收集这部分洗脱液，用氢氧化钠中和至中性，除盐，滤液浓縮干燥得钩藤总生物碱。实施例2:
取钩藤饮片1000g，加p^5的酸水渗漉，合并渗漉液加水稀释至10000ml，离心，调节pH=l，离心，上清液以5倍柱体积/小时通过阳离子交换树脂(Doulex 50，钠型，径高比1:5)，水洗至流出液无颜色，再用5%盐酸溶液洗脱，洗脱速度为4倍柱体积/小时，洗脱2倍柱体积后浸泡5小时，再洗脱至生物碱检査为阴性(流出液滴加10%硅钨酸无沉淀)，收集这部分洗脱液，用氢氧化钙中和至中性，除盐，滤液浓縮干燥得钩藤总生物碱。实施例3:
取钩藤饮片5kg，加70%乙醇超声提取两次，每次加5倍量，超声0. 5小时，合并提取液， 离心，回收乙醇，加水至5000ml，调节pH4，离心，上清液以2倍柱体积/小时通过上阳离 子交换树脂(001X10，钠型，径高比1: 7)，水洗至流出液无颜色，再用1%盐酸溶液(含 1%的氯化钠)洗脱，洗脱速度为5倍柱体积/小时，至生物碱检查为阴性(流出液滴加10%硅 钨酸无沉淀)，收集这部分洗脱液，用氢氧化钠中和至中性，除盐，滤液浓縮干燥得钩藤总生 物碱。 实施例4:
取钩藤饮片10kg，加水煎煮2次，每次10倍量，煎煮2小时，合并煎煮液，滤过，滤 液浓縮至相对密度为1. 1(60。C)，加乙醇至浓度为7(W，静置，上清液回收乙醇，加水至3000ml， 调节pH=4，离心，上清液以3倍柱体积/小时通过上阳离子交换树脂(AmberliteIR-120，氨 型，径高比l: 9)，水洗至流出液无颜色，再用10%盐酸溶液洗脱，洗脱速度为6倍柱体积/ 小时，至生物碱检査为阴性(流出液滴加10%硅钨酸无沉淀)，收集这部分洗脱液，用氢氧化 钠中和至中性，除盐，滤液浓缩干燥得钩藤总生物碱。 实施例5:
取钩藤饮片10kg，加水煎煮2次，每次10倍量，煎煮2小时，合并煎煮液，滤过，滤 液浓縮至相对密度为1. 1(60°0，加乙醇至浓度为70%，静置，上清液回收乙醇，加水至5000ml， 调节pH-5，离心，上清液以3倍柱体积/小时通过上阳离子交换树脂(D001X4，氢型，径高 比l: 10)，水洗至流出液无颜色，再用3%盐酸溶液洗脱，洗脱速度为3倍柱体积/小时，至 生物碱检查为阴性(流出液滴加10%硅钩酸无沉淀)，收集酸洗脱液，用氢氧化钠中和至中性， 除盐，滤液浓縮干燥得钩藤总生物碱。 实施例6:
取钩藤饮片2000g，加pH3的盐酸溶液，微波提取2次，每次加5倍体积微波提取0. 5 小时，滤过，滤液加水稀释至1600ml，调节pH:6，离心，上清液以2倍柱体积/小时通过上 阳离子交换树脂(Doulex50，氢型，径高比l: 6)，水洗至流出液无颜色，再用2%盐酸溶液 (含0.2mol/L的氯化氨)洗脱，洗脱速度为5倍柱体积/小时，至生物碱检査为阴性(流出 液滴加10%硅钨酸无沉淀)，收集这部分洗脱液，用氢氧化钠中和至中性，除盐，滤液浓縮干 燥得钩藤总生物碱。实施例7:
取钩藤饮片10kg，加水煎煮2次，每次10倍量，煎煮2小时，合并煎煮液，滤过，滤液浓縮至相对密度为1.1(60。C)，加乙醇至浓度为70%,静置，上清液回收乙醇,加水至4000ml，调节pH4，离心，上清液以0.5倍柱体积/小时通过上阳离子交换树脂(AmberliteIR-120，氢型，径高比1: 6)，水洗至流出液无颜色，再用0. 5%硫酸溶液(含lmol/L的氯化钠)洗脱，洗脱速度为5倍柱体积/小时，至生物碱检査为阴性(流出液滴加10%硅钨酸无沉淀)，收集这部分洗脱液，用氢氧化钠中和至中性，除盐，滤液浓縮千燥得钩藤总生物碱。实施例8:
取钩藤饮片10kg，加水煎煮2次，每次10倍量，煎煮2小时，合并煎煮液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.1 (6(TC)，加乙醇至浓度为70%，静置，上清液回收乙醇，加水至10000ml,调节p&3，离心，上清液以3倍柱体积/小时通过上阳离子交换树脂(001X5，氢型，径高比l: 8)，水洗至流出液无颜色，再用2%盐酸溶液(含0.3mol/L的氯化钙)洗脱，洗脱速度为6倍柱体积/小时，至生物碱检查为阴性(流出液滴加10%硅钩酸无沉淀)，收集这部分洗脱液，用氢氧化钠中和至中性，除盐，滤液浓縮千燥得钩藤总生物碱。实施例9:
取钩藤饮片1000g，加水煎煮2次，每次10倍量，煎煮2小时，合并煎煮液，滤过，滤液浓縮至相对密度为1. 1(6(TC)，加乙醇至浓度为70%，静置，上清液回收乙醇，加水至1000ml,调节pH:3，离心，上清液以3倍柱体积/小时通过上阳离子交换树脂(Doulex 50，氢型，径高比l: 8)，水洗至流出液无颜色，再用4%硫酸溶液洗脱，洗脱速度为4倍柱体积/小时，至生物碱检查为阴性(流出液滴加10%硅钨酸无沉淀)，收集酸洗脱液，用氢氧化钠中和至中性，除盐，滤液浓縮干燥得钩藤总生物碱。
权利要求
1、一种从中药钩藤提取液中分离钩藤总生物碱的方法，其特征在于该方法为取钩藤提取液，调整pH值1至7，滤过，取滤液加于阳离子交换树脂柱上，先以水洗脱除杂，再用0.5％～15％酸液洗脱，收集洗脱液，加碱中和，经脱盐处理，浓缩干燥得钩藤总生物碱。
2、 如权利要求1所述的分离钩藤总生物碱的方法，其特征在于上柱前调整药液的pH值 范围为2至5。
3、 如权利要求1所述的分离钩藤总生物碱的方法，其特征在于所用阳离子交换树脂可以 是大孔型或凝胶型强酸性离子交换树脂。
4、 如权利要求3所述的分离钩藤总生物碱的方法，其特征在于所用阳离子交换树脂柱的柱径柱高=1: 5 1: 10。
5、 如权利要求1所述的分离钩藤总生物碱的方法，其特征在于该方法中上样药液的浓度为每ml相当于生药0. 1 3g，上样速度为0. 5 5倍柱体积/小时。
6、 如权利要求5所述的分离钩藤总生物碱的方法，其特征在于上样方式优选为逆流上样。
7、 如权利要求1所述的分离钩藤总生物碱的方法，其特征在于该方法中洗脱用的酸液是 3% 6%的盐酸溶液或3% 6%的硫酸溶液。
8、 如权利要求7所述的分离钩藤总生物碱的方法，其特征在于洗脱速度为2 6倍柱体 积/小时。
9、 如权利要求8所述的分离钩藤总生物碱的方法，其特征在于洗脱速度为4 6倍柱体 积/小时。
10、 如权利要求1所述的分离钩藤总生物碱的方法，其特征在于在水洗脱除杂后，可以 先在树脂柱中充满洗脱用酸液并静置2 12个小时，再进行洗脱。
11、 如权利要求7所述的分离钩藤总生物碱的方法，其特征在于洗脱用的酸液中还可以 加入0. 1 lmol/L的NHX1、 NaCl或CaCl2。
12、 如权利要求11所述的分离钩藤总生物碱的方法，其特征在于酸液中盐的浓度优选为 0. 1 0. 3mol/L。
13、 权利要求1 12中任何一项所述的方法制备的钩藤总生物碱。
全文摘要
本发明公开了一种分离中药总生物碱的方法，尤其是一种从中药钩藤提取液中分离总生物碱的方法，属中药领域。该方法包括如下技术方案取钩藤提取液，调整pH值1至7，滤过，取滤液加于阳离子交换树脂柱上，先以水洗脱除杂，再用0.5％～15％酸液洗脱，检查无生物碱为止，收集洗脱液，加碱中和，经脱盐处理，浓缩干燥得钩藤总生物碱。该方法克服了现有技术提取率低、有机溶剂用量大、工艺复杂、无法大生产等不足，可以高效率地从钩藤提取液中分离高纯度的钩藤总生物碱。
文档编号A61K36/74GK101491610SQ20071009844
公开日2009年7月29日 申请日期2007年4月18日 优先权日2007年4月18日
发明者刘英辉, 蓉 李, 王广录 申请人:北京和润创新医药科技发展有限公司