大蒜挥发油在制备防治败血性波氏杆菌药物中的应用的制作方法

专利名称：：大蒜挥发油在制备防治败血性波氏杆菌药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药领域，具体地说是大蒜挥发油在医药领域中的新用途。
背景技术：
：波氏菌属为一类严格好氧、非发酵性、革兰氏阴性、不形成芽孢的菌，在鲍-姜氏琼脂上缓慢生长，形成隆起、有菌毛和荚膜、呈卩溶血有毒力的I相菌落，各个种遗传亲缘关系密切，为人或温血动物呼吸道的严格寄生菌和病原菌。败血波氏菌在全世界哺乳动物广为分布。分离到此菌的家畜包括猪、狗、猫、马、牛、绵羊和山羊；实验动物包括兔、豚鼠、小鼠、大鼠、仓鼠及猴；野生动物包括鼠、雪貂、刺猬、淙熊、狐、臭鼬、考拉熊和栗鼠等。引起呼吸道的不显性感染及急、慢性炎症，通称波氏菌病(Bordetellosis)。造成独立的传染病，如猪的传染性萎缩性鼻炎，狗的传染性气管支气管炎，兔的传染性鼻炎。在狗中，本菌除引起幼犬的气管支气管炎外，常为犬瘟热的继发病原菌，使病犬表现致死性支气管肺炎。在豚鼠、小鼠、猫、大鼠、猴及雪貂等饲养动物群中，也可以造成呼吸道病流行。人也有感染的报告。此外，也有在动物的中耳炎、生殖道、腹腔脏器、脓肿和粪便中分离到本菌的报告。犬传染性气管支气管炎(InfectiousTracheobronchitis,ITB)又名犬窝咳，早在19世纪初期，文献即有本病与犬瘟热一起发病的病例报道，是犬的一种重要的、世界范围的呼吸道传染病，常在犬集中饲养的群体中传染流行。在ITB病犬呼吸道中，支气管败血波氏杆菌(BordetellaBronchis印tica)是最常被分离到的革兰氏阴性、需氧球杆菌，被认为是本病的主要病原菌。与人百曰咳的病原菌(百曰咳波氏杆菌，BordetellaPertussis)同为一属，但免疫性不同。猪传染性萎缩性鼻炎(简写AR)是由支气管败血波氏杆菌引起的猪一种慢性呼吸道传染病，其特征为鼻炎、鼻梁变形、鼻甲骨萎缩，以鼻甲骨下卷曲部最常见。临床症状表现为打喷嚏、鼻塞、颜面部变形或歪斜，病猪生长缓慢，常见于2~5月龄猪。本病1830年在德国发现，此后在英、法、美、加拿大、前苏联发生。日本从美国引进种猪发现，现遍布养猪发达国家，据报道世界猪群约有25%~50%受感染。美国本病血清学阳性率达54%,已成为重要猪传染病之一。我国1964年浙江余姚从英国进口"约克"种猪发现本病，20世纪70年代我国一些省、巿从欧、美等国家大批引进痩肉型种猪使本病多渠道传入我国，目前猪的血清阳性率达71.2%，因此造成本病在我国传播。支气管败血波氏杆菌在体内和体外对多种抗生素敏感。为了控制和预防本病的发生，因越来越多的联合用药滋生出许多支气管败血波氏杆菌的耐药性菌株，导致用药的难度逐渐加大。早期报道支气管败血波氏杆菌对磺胺类药物敏感，此类药物也曾经有效地控制过感染的发生。但是，Harris在1969年研究发现从25个猪场分离出的85%的菌株对磺胺类药物产生抗性。随后的报道也发现在61株猪源支气管败血波氏杆菌中11%的菌株对磺胺耐药，并且对氨节青霉素和链霉素有交叉耐药现象。目前的研究表明，支气管败血波氏杆菌对庆大霉素、氨节西林和红霉素等敏感，而青霉素、复方磺胺、痢特灵、杆菌肽等不敏感。因此目前临床首选药主要以联合应用抗生素为主。首选药物为阿莫西林、拜有利(恩诺沙星)。实践证明中药在防治ITB方面具有防治效果良好、不易产生耐药性，增强机体抵抗力等特点。但是当前中药制剂存在着一些问题，如有效成份不明确、疗效不稳定、使用不便、剂量较大，尤其是药理作用机制不明确等不足，不利于中药在实际生产中广泛使用，严重阻碍中药产业化及中药产品进入国内外巿场。大蒜挥发油有两种来源途径一种是生物提取法，目前日本、德国等国家采用；另一种是化学合成法，我国许多厂家釆用该法，其产量高，应用广泛。1、提取法a、水蒸气蒸馏法原理是将水蒸气通入不溶于水或难溶于水但具有一定挥发性的大蒜水溶液中，大蒜油具有一定挥发性，在低于100'C的温度下随水蒸气一起蒸馏出来，再经进一步分离获得较纯物质。该方法具有设备简单、成本低、稳定性好等特点，是最常用的方法之一。工艺流程选择充分成熟、清洁干燥、无虫蛀和机械损伤、辛辣味足的大蒜，去皮—洗净—加水捣碎—发酵—水蒸气蒸馏—分液分离4大蒜精油。b、有机溶剂浸提法大蒜油呈浅黄色油状液体、微溶于水，易溶于乙醇、苯、乙醚等有机溶剂，利用这一性质可以用有机溶剂将大蒜油浸提出来。该法获得的大蒜油与水蒸气蒸馏获得的大蒜油没有明显的区别。有机溶剂的选择非常关键，要求该溶剂的溶解度充足，而且浸提结束后易于分离)沸点差异显著，不含其他的不良气味和溶剂残留。c、超临界C02萃取法其建立在该流体在临界点处温度和压力的微小变化，引起流体的溶解能力有很大变化的基础上，利用流体在高压低温时对大部分物质具有较大溶解能力的性质，提取原料中的有效成分，然后在较低的压力下进行分离，从而实现混合物的分离与提纯。因为C02无毒，价格便宜，常被作为萃取剂。该技术具有高效节能、工艺简单、安全可靠等优点，广泛应用于化工、食品和医药等行业，用于提取大蒜油是一种较为理想的方法2、化学合成方法合成反应为CH2=CH-CH2CI+Na2S203—CH2=CH-CH2-S203NaCH2=CH-CH2-S203Na+Na2S—CH2=CH-CH2-S-S-S-CH2-CH=CH2其具体合成方法可参照现有技术合成(林承仪，大蒜素的合成与稳定性制剂[J].饲料工业，2001,22(11):13-14)。无论釆用对天然大蒜的水蒸馏法还是使用化学合成法制取的大蒜挥发油中含有多种硫醚类化合物，因制取方法不同多含有包括一硫醚、二硫醚、三硫醚、四硫醚、五硫醚及磺酸酯、亚磺酸酯等；含硫杂环类化合物有硫杂环戊烯、硫杂环己二烯、硫杂环己烯和噻烯类。现代药物化学研究证明，大蒜内含硫成分多达30余种，其中主要的生物活性物质是含硫化合物二烯丙基一硫化物、二烯丙基二硫化物、二烯丙基三硫化物等。近年来，大量的基础研究表明，大蒜挥发油对伤寒沙门氏菌、霍乱孤菌、绿脓杆菌、痢疾志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌和腊样芽胞杆菌有不同程度的抑制作用，但其对败血性波氏杆菌的抑杀菌效果研究始终未见报道。
发明内容本发明的目的在于提供大蒜挥发油的一种新用途，具体地说是在医药领域中的应用，特别是在兽药中的应用。本发明将大蒜挥发油与巿场所卖同类药品品进行体外抑制波氏杆菌试验比对，发现大蒜挥发油的最低抑菌浓度、最低杀菌浓度和平均杀菌率远远优于目前临床其他首选化药阿莫西林、拜有利(恩诺沙星)。本发明设计出专门针对ITB-Bb的动物模型。建立了KM小鼠感染ITB-Bb模型，小鼠体重在18-22g，半数致死量为3.77xl05cfU/kg，4.75x103cfU/kg可作为ITB-Bb致病的参考剂量，作用时间为24~48h。大蒜挥发油安全毒理实验表明腹腔给药的半数致死量为260.495mg/kg。用大蒜挥发油对犬败血波氏杆菌Bb(ITB-Bb)引起的传染性疾病"窝咳"进行治疗，研究表明4.0mg/kg七w可作为大蒜挥发油治疗ITB的参考剂量。用大蒜挥发油对支气管败血波氏杆菌(AR-Bb)引起的传染性疾病猪传染性萎缩性鼻炎(AR)进行治疗，研究表明1.5mg/kg可作为大蒜挥发油治疗AR的参考剂量。大蒜挥发油可以通过现有技术制备成各种剂型。为了更好地说明本发明的实质，下面从大蒜挥发油的体外抑菌实验、毒性实验以及临床实验来充分说明本发明。大蒜挥发油对败血性波氏杆菌体外抑菌效果观察1.材料与方法菌种犬支气管败血波氏杆菌(S.6rawc/^印"ra),菌悬液制成含菌1.9x106cfU/mL悬液。供试药品大蒜挥发油由本实验室研制，原始浓度均为0.5%。制备方法为常规水蒸馏提取，减压分馏，其中质量控制参数为烯丙基二硫化物50%-80%。巿售大蒜挥发油，购自山东邹平兴隆科技有限公司。阿莫西林颗粒购自珠海联邦制药股份有限公司中山分公司，批号M061102-N02,无菌水稀释为浓度0.5%的药液备用；拜有利(恩诺沙星)注射液拜耳医药保健股份有限公司生产，批号KP03U5P，浓度5%;试剂96孔培养板美国Costar产品，批号3599(北京科昊泽生物技术有限公司)；营养肉汤培养基中国兽药监察所，批号20060530;营养琼脂中国进出口商品检验技术研究所，批号051130(北京陆桥技术有限责任公司)；仪器设备隔水式电热恒温培养箱，型号PYX-DHS-50x65-l(上海跃进医疗器械厂)；THZ-C恒温振荡器(太仓巿光明试验分析仪器厂)；LABCONCO生物安全柜，型号1-800-926-6100等。菌悬液制备Bb在鲍-姜氏绵羊血培养基传代2-3次，挑取单个菌落接种到2mL营养肉汤管内，经37。C48h培养后，吸取O.lmL于10mL灭菌生理盐水管内，充分混勾，以无菌营养肉汤配成1.0xl09cfo/mL、1.0xl08cfU/mL、1.0xl07cfo/mL、1.0x106cfti/mL四种浓度的菌悬液。实验分组用营养肉汤培养基将药物倍比稀释成16个梯度，移入96孔细胞培养板中，每孔150pL，充分混匀。表l治疗药物筛选实验分组<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表中大蒜提取物烯丙基二硫化物含量50%-80%;巿售大蒜挥发油样品中烯丙基二硫化物含量不低于30%。用以说明不同的大蒜挥发油对均可作用于Bb。将同一浓度的菌悬液分别接种于含不同药物梯度的肉汤培养基中，每孔100pL。另作不含药物的培养基，接种菌悬液，作为生长菌的阳性对照。阴性对照组中药物倍比稀释如前，加入100pL无菌营养肉汤取代菌悬液。最终各孔容量为250jiL，将孔内溶液充分混匀。于37。C恒温培养箱内培养，48h后观察细菌生长情况，以溶液保持澄清的最小药物浓度为(MIC),不同浓度的菌悬液重复操作,判断标准见表2。_表2体外抑菌试验液体浑浊度判断标准_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>找出每组药剂液体浑浊度为"-"的阴性孔，其浓度设为MIC。把MIC浓度附近孔内培养液5)LiL涂在营养琼脂平板上，置于37。C恒温温箱内培养一周，取出观察结果。并对所涂平板进行菌落计数，未生长菌的最小药物浓度为(MBC)，为了统一标准，单独选取1.0xl06cfli/mL浓度菌悬液计算平均杀菌率。平均杀酵，M^mignMM舰2.结果表3不同药物对败血性波氏杆菌MIC的影晌(单位"g/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>根据表3设定的判断标准，对各孔混悬液进行评价。结果表明，对败血性波氏杆菌的抑菌效果大蒜挥发油=巿售大蒜挥发油>阿莫西林>拜有利。最低抑菌浓度为125飓/mL。表4大蒜挥发油较其它药物对败血性波氏杆菌MBC的影响(单位:pg/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>毒性实验使用腹腔注射给药途径，药物浓度0.5%，给药量设定为200mg/kg、240mg/kg、288mg/kg、346mg/kg、415mg/kg五组，每组IO只小鼠，雌雄各半。给药前小鼠停食8h,饮水照常，给药2h后饲喂照常。连续观察7d，记录死亡量。寇氏法计算LDso。急性毒性试验表明LDso为260.495mg/kg七w。动物模型治疗实验表明靶器官的细菌滴度为药效学判断的主要依据，阿莫西林、拜有利组细菌滴度平均为20cfU/板，而自制的大蒜挥发油高剂量和中剂量组的细菌滴度可视为O，低剂量组的细菌滴度将近为6cfU/板。此结果与先前体外抑菌预试验的结论相一致。动物临床实验小鼠观察一星期后腹腔注射0.5mL浓度为1.9xl(T2的菌悬液攻毒，模型造好后开始进行药效学试验。选取腹腔注射形式给药，剂量为最大耐受量的1/20、1/40、1/80。试验分为阴性对照组(每日腹腔注射无菌生理盐水0.5mL/只)、阳性对照组(攻毒后每日腹腔注射无菌生理盐水0.5mL/只)、低剂量组(每日腹腔注射3mg/kg)、中剂量组(每日腹腔注射4.5mg/kg)、高剂量组(每日腹腔注射9mg/kg)、阳性药物组(每曰腹腔注射拜有利2.5mg/kg)六组，每组IO只小鼠，雌雄各半，每日定时给药，连续7d。通过综合分析进行药效评判。表5药效治疗试验评判标准<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>在3家宠物医院对30只患病犬大蒜注射剂临床治疗实验表明通过对犬窝咳的药物对比实验，大蒜挥发油的注射剂治疗剂量为3-4mg/kg七w,治愈率达到80%以上。且治疗周期缩短。有望继续开发成治疗支气管败血波氏杆菌的首选药物。有关猪传染性萎缩性鼻炎(AR)也是由支气管败血波氏杆菌引起的猪一种慢性呼吸道传染病，初步实验表明，大蒜挥发油制成的注射剂对(AR-Bb)引起的传染性疾病AR进行治疗，1.5-3mg/kg七w作为大蒜挥发油治疗AR的参考剂量。结论1大蒜挥发油对败血性波氏杆菌的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度为125昭/mL和250jig/mL。其最低抑菌浓度、最低杀菌浓度和平均杀菌率优于目前临床其他首选化药。2通过对犬窝咳的药物对比实验，大蒜挥发油的注射剂治疗剂量为3-4mg/kg七w，与拜有利组相比效果明显，可使治疗周期缩短，治愈率达到80%以上。3猪传染性萎缩性鼻炎(AR)也是一种由支气管败血波氏杆菌引起的猪慢性呼吸道传染病，初步实验表明大蒜挥发油制成的注射剂对(AR-Bb)引起的传染性疾病AR进行治疗，1.5-3mg/kg七w作为大蒜挥发油治疗AR的参考剂量。进一步研发该制剂将对防治动物败血性波氏杆菌疾病具有重要意义。附图说朋图l是不同用药组的体温考察；图2是不同用药组WPC数量考察；图3是不同用药组ALT数值考察；图4是不同用药组AST数值考察；图5是不同用药组ALP数值考察；图6是不同用药组BUN数值考察；图7是不用用药组CRE数值考察。表7确定发病的临床评判标准判断指标阴性对照阳性对照临床症状呼吸正常，饮食良好，精神状态喘,咳嗽,肺部呼吸音粗厉,胸膈区听诊佳,鼻湿润无脓性分泌物有啰音，有脓性鼻涕,食量减退体温(°c)38.9-40>40具体实施方式下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。实施例l:口服制剂按照每千克含5g大蒜挥发油来制备口服液，余量为水。实施例2:注射剂大蒜挥发油按重量比1:4与聚山梨酯混合后用蒸馏水定容至1000mL实施例3:片剂将大蒜挥发油与糊精按照重量比(l:IO)混合均匀，压成片剂。实验例犬波氏杆菌病的疗效分析犬感染ITB后治疗结果首先，选择临床发病动物确定临床病例，在30只不同品种发病犬鼻腔分泌物中分离ITB-Bb;对犬感染临床检测指标测定和判断后分成6组。随后进行大蒜挥发油防治试验。实验分组临床选取患窝咳的犬分别釆用大蒜提取物高、中、低三种剂量和拜有利注射液进行单独治疗，每组5只。为更好的模拟临床条件，本次试验对犬种和年龄不作要求。表6本动物治疗实验分组<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>X-ray肺部及胸腔正常,无阴影肺部有高密度絮状阴影，紋理增粗，有渗出液,肺水肿,心肌肥大WBC(xl09L)6.00-17.00偏高或偏低均不正常ALT(U/L)4-66<正常范围或数值偏低AST(U/L)8-38<正常范围或数值偏低血ALP(U/L)清学BUN皿(腿ol/L)0-801.8-10.4<正常范围或数值偏低>正常范围或数值偏低CRE60-110>正常范围或数值偏低((imol/L)注:本标准参考自《2006年兽医临床手册》表8本动物感染ITB疗效判定标准治愈显效有效无效临床症状呼吸正常,饮食良好，精神状态佳,鼻湿润无脓性分泌物呼吸正常,饮食良好,鼻湿润无脓性分泌物呼吸正常，鼻湿润无脓性分泌物喘,咳嗽，胸膈区听诊有口罗音,有脓性鼻涕体温('c)38.94038.94038.9-40>40X-ray肺部及胸腔正常，无阴影肺部无阴影,心肌增厚肺部阴影变浅，渗出液明显减少肺部有高密度絮状阴影，紋理增粗，有渗出液WBC(x109L)6.00-17.006.00-17.00数值偏高明显偏高或偏低ALT(U/L)4-664-66数值偏低明显低于正常范围AST(U/L)8-388-38数值偏低明显低于正常范围ALP(U/L)0-800-80数值偏低明显低于正常范围BUN(mmol/L)1.8-10.41.8-10.4数值偏高明显高于正常范围CRE()imol/L)60-11060-110数值偏高明显高于正常范围注:本标准参考自《2006年兽医临床手册》连续给药4天后进行临床检测。指标测定静脉釆血0.4mL，用EDTA进行抗凝，作为血常规检测(白细胞计数)；取全血分离出血清lmL，做血液生化检测(天冬氨酸胺基转换酶(AST)、丙氨酸胺基转换酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、肌苷(Crea)等。临床观察体温、体征、X光片l.临床检查表9犬感染临床检测指标2.治疗结果临床症状观察用药4天后，除低剂量给药组的一只病犬仍有咳嗽迹象外，其他实验犬呼吸正常，饮食良好,精神状恢复，鼻湿润再无脓性分泌物。2.1体温状况阳性对照组平均体温42°C，阴性对照组平均体温39。C,拜有利阳性药物组平均体温4(TC，大蒜提取物高剂量组平均体温38.5'C，中剂量组平均体温39"C，低剂量组平均体温39.5'C.使用大蒜提取物的试验组体温普遍低于拜有利阳性药物组，与小鼠模型观察的结果一致。见图1。2.2X-ray检査结果治疗前X-my检查发现肺部有高密度絮状阴影,紋理增粗,有渗出液,肺水肿，心肌肥大，治疗后检查肺部及胸腔正常,无阴影。2.4血液检测指标阴性对照组阳性对照组WBC(xl09L)ALT(U/L)AST(U/L)ALP(U/L)BUN(mmol/L)CRE(nmol/L)6.00-17.004-668-380-801.8-10.460-110偏高或偏低均不正常<正常范围或数值偏低<正常范围或数值偏低<正常范围或数值偏低>正常范围或数值偏低>正常范围或数值偏低血清学指标2.4.1WBC检测结果阳性对照组平均WBC明显高于其他组，阴性对照组平均WBC最低，拜有利阳性药物组平均WBC处于正常范围内，大蒜提取物随给药剂量的降低WBC有升高趋势，低剂量组平均WBC超出正常范围。比较患病前后犬的WBC值，发现感染ITB的犬WBC明显增高，犬的药效试验根据临床经验以4天为一个疗程，症状初期患病犬的WBC明显升高，随着药量的加大，抑制体内WBC的增加，呈现下降趋势。如图2。2.4.2ALT检测结果阳性对照组平均ALT明显低于阴性对照组，拜有利阳性药物组平均ALT处于二者之间，依此降低的是高剂量组、中剂量组和低剂量组。如图3。2.4.3AST检测结果阳性对照组平均AST明显低于阴性对照组，拜有利阳性药物组平均AST处于正常范围内，依此降低的是高剂量组、中剂量组和低剂量组。大蒜提取物的平均AST值均低于阳性对照组，但仍属正常范围。如图4。2.4.4ALP检测结果阳性对照组平均ALP明显低于阴性对照组，拜有利阳性药物组、高剂量组和中剂量组的平均ALP值都高于阴性对照组，低剂量组略低于阴性对照组。各组数值均未超过正常范围。如图5。2.4.5BUN检测结果阳性对照组平均BUN明显高于阴性对照组，低剂量组平均BUN最低，其次是拜有利阳性药物组，高剂量组和中剂量组BUN数值随给药剂量的加大而增高。各组数值均处于正常范围。如图6。2.4.6CRE检测结果阳性对照组平均CRE明显高于阴性对照组，拜有利阳性药物组平均CRE处于二者之间，大蒜提取物随给药剂量的升高CRE有增长趋势，高剂量组平均CRE超出正常范围。如图7。3治疗效果评判_表10犬治疗效果评判表_不同药物组_阳性对照药物组高剂量组中剂量组低剂量组治疗效果评判_显效临床治疗试验表明3-4mg/kg七w可作为大蒜挥发油注射剂的推荐剂量，从临床上证明了大蒜挥发油对ITB-Bb的治疗效果。权利要求1、大蒜挥发油在制备治疗波氏菌病的药物中的应用。2、如权利要求l所述的应用，所述的波氏菌病为呼吸道不显性感染及呼吸道的急、慢性炎症。3、如权利要求2所述的应用，其中所述的波氏菌病为传染性萎缩性鼻炎、传染性气管支气管炎与传染性鼻炎。4、如权利要求l、2或3任一项所述的应用，其中所述的波氏菌病是由波氏杆菌引起的疾病。5、如权利要求4所述的应用，其中所述的波氏杆菌为败血性波氏杆菌。6、如权利要求l-5任一项所述的应用，其中所述的药物为注射剂、冻干粉针剂、药膏、胶囊、丸剂、片剂、合剂或预混剂。全文摘要本发明公开了大蒜挥发油的一种新用途。具体地说是其在制备防治败血性波氏杆菌药物中的应用。实验表明大蒜挥发油对败血性波氏杆菌最低抑菌浓度为125μg/mL，最低杀菌浓度为250μg/mL。文档编号A61P31/04GK101332281SQ20071011795公开日2008年12月31日申请日期2007年6月26日优先权日2007年6月26日发明者刘凤华,张站平,许剑琴申请人:中国农业大学;北京农学院;北京元亨神农科技发展有限公司