专利名称：用环介导等温扩增方法检测支气管败血波氏杆菌的试剂盒及其方法
用环介导等温扩增方法检测支气管败血波氏杆菌的试剂盒及其方法技术领域
本发明属于兽用生物制品领域中的疾病诊断技术，具体涉及一种用环介导等温扩增方法检测支气管败血波氏杆菌的试剂盒及其方法。
背景技术：
支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica, Bb)是寄生在呼吸道黏膜纤毛上皮细胞的一种革兰氏阴性小球杆菌，可广泛感染包括猪、犬等在内的多种哺乳动物， 使呼吸道产生不显性感染及急、慢性炎症，引起诸如犬传染性支气管炎、兔传染性鼻炎等疾病，也是猪传染性萎缩性鼻炎的病原之一，人也有感染该菌的报道，尤其是小孩和免疫力缺陷的人群。支气管败血波氏杆菌于1910年由Ferry首次从患有犬瘟热的犬呼吸道中分离出来，经历四次更名，最后Moreno—Lopez才将支气管败血波氏杆菌划为波氏杆菌属。目前，波氏杆菌属分为七个种，其中将百日咳波氏杆菌(B. pertussis)，副百日咳波氏杆菌 (B. parapertussis)和支气管败血波氏杆菌列为一群,而将包括禽波氏杆菌(B. avium)在内的其余四种归为另一群。
对于养猪业来讲，支气管败血波氏杆菌易与产毒素多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida, Pm)混合感染，产生进行性萎缩性鼻炎，其主要表现为鼻塞、打喷嚏、流鼻血、咳嗽、呼吸不畅、颜面变形或鼻梁歪斜、生长缓慢，哺乳仔猪感染本病后，除引起鼻 甲骨萎缩或消失外，还可以引起全身钙代谢障碍，致使仔猪发育迟缓，饲料利用率降低，有时伴发急、慢性支气管炎，导致仔猪死亡，给养殖业带来严重的经济损失。实验室通常的诊断方法是用聚合酶链式反应(PCR)，该方法虽然灵敏、特异，但是成本较高且需要专门的PCR仪，而且到目前为止，尚无有效的检测试剂盒问世，因此研制支气管败血波氏杆菌检测试剂盒能对该病进行快速诊断，对临床治疗和疾病控制有巨大的意义。
环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是由 T. Notomi于2000年发明的一种新型核酸扩增技术，该技术针对待测靶基因序列的6个区域设计一套两对特异引物，利用链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在65°C左右等温条件下能够特异性、高效、快速地进行核酸扩增，由于其扩增依赖于目的序列的四个特异性区域，因此其特异性和敏感性均较普通PCR和荧光定量PCR高，而且由于该反应在恒温条件下进行，因此不需要昂贵的仪器，而使用普通的水浴锅即能进行扩增反应，另外扩增反应可以在一个小时之内完成，所需时间短，且其反应产物易于观察，扩增结果可直接通过对扩增副产物焦磷酸镁沉淀进行肉眼观察判断。基于以上优点，LAMP从发明之日起，已被广泛用于病原的检测，如大肠杆菌、猪传染性胸膜肺炎、沙门氏菌、结核杆菌、禽流感、疱疹病毒等细菌性疾病和病毒性疾病的检测，但是到目前为止，未发现运用LAMP方法检测支气管败血波氏杆菌的报道。发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测支气管败血波氏杆菌的LAMP试剂盒并提供一种用环介导等温扩增方法检测支气管败血波氏杆菌的试剂盒及其方法。
一种用环介导等温扩增方法检测支气管败血波氏杆菌的试剂盒，该试剂盒包括
环介导等温扩增反应液，23 μ L/份，其组成如下
I μ L浓度为8U的BstDNA聚合酶，2. 5 μ L的聚合酶缓冲液，浓度为5 μ mo I/L的上游内引物FIP和下游内引物BIP各I μ L，浓度为25 μ mol/L的上游外引物F3和下游外弓I物 B3各I μ L，2 μ L浓度为IOOmM的MgSO4, 5 μ L浓度为IOmM的dNTP，5 μ L浓度为5Μ的甜菜碱,3. 5 μ L的无菌水；
其中聚合酶缓冲液含有200mM Tris-HCl (ρΗ8· 8)，IOOmM KCl, IOOmM(NH4)2SO4, 20mM 的 MgSO4,1 % Triton X-100 ；
所述的引物序列为
上游外引物F3 CCTTTGCCGCCAGATTCC
下游外引物B3 GCTCCCAAGAGAGAAAGGC
上游内引物FIP TGGATTACGGCAGGTTTGCGA-CCCGCACATTTCCGAACT
下游内引物BIP GGCAACAAAGGAAATCGCGGC-TCTTCAAACCGGGCAGCT
使用所述试剂盒检测支气管败血波氏杆菌的方法，包括以下步骤
(I)波氏杆菌DNA的提取
I)、取ImL细菌过夜培养液,5000rpm离心IOmin,去上清；
2)、加550 μ L的TE溶液悬浮沉淀，并加50 μ L10% SDS溶液，50 μ L20mg/mL蛋白酶K，混匀，37°C保温Ih ；
3)、加 150 μ L5mmol/L 的 NaCl 溶液，混匀加 150 μ L CTAB/NaCl 溶液，混匀，65°C保温 20min ；
4)、用等体积酹氯仿异戍醇(三者体积比25 24 I)抽提,5000rpm离心 lOmin，将上清液移至干净离心管中，用等体积酚氯仿(体积比24 I)抽提，取上清液移至干净试管中；
5)、加I倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止lOmin，沉淀DNA ；
6)、用70 %乙醇漂洗沉淀后，洗干，溶解于100 μ L的TE溶液，-20°C保存，作为模版备用。
(2)进行支气管败血波氏杆菌的环介导等温扩增
在装有23 μ L的LAMP反应试剂的反应管中加入2 μ L待检DNA，与65°C恒温水浴锅中放置I个小时，后将水浴锅调至80°C反应5min来终止反应。
(3)结果的观察
反应完毕后取出PCR管，12000转/分离心I分钟，然后观察PCR反应管底部有无白色沉淀，如有沉淀产生则判定为阳性。
本发明针对支气管败血波氏杆菌的鞭毛基因(flagellum gene)的高度保守序列建立了 LAMP技术，特异性强、灵敏度高，解决了现有技术中检测支气管败血波氏杆菌面临的所需周期长、成本高、灵敏度较低等问题，检测过程中无需昂贵的仪器，仅需水浴锅而已， 检测结果易于判别，而且扩增完成后可以在不开盖的情况下判定结果，避免了扩增产物对后续检测的污染，与其它的检测方法相比具有明显的优势，可广泛应用于临床的检测。
图I为试剂盒扩增后结果，图中“ + ”为阳性扩增结果，为阴性扩增结果。
图2为敏感性实验电泳结果，图中M为DNA分子量标准，I 8分别为100 107 倍稀释度扩增结果。
图3为特异性检测结果，图中M为DNA分子量标准，I 7分别为支气管败血波氏杆菌、百门咳波氏杆菌、副百日咳波氏杆菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例I支气管败血波氏杆菌LAMP引物设计与筛选
登录NCBI网站 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/,查找 Genbank 公布的支气管败血波氏杆菌鞭毛基因(flagellum gene)的序列，运用DNAstar、Blast进行序列比对后找出高度保守的序列，如下
TGGCGCCTGC CCTATCCCGT CCGCGCCGCA CGGACGCCTG TCCCCGCAGG AACATGCCCT TTGCCGCCAG
ATTCCCCCGC ACATTTCCGA ACTTCACTTT TTTTGCTTAA GTCCGTCGCA AACCTGCCGT AATCCAGGCA
ACAAAGGAAA TCGCGGCGCT GTGCAAGCGA AAGTCCGATG TTACAGATGG GCGGCCTAGC TGCCCGGTTT
GAAGAAGCCT TTCTCTCTTG GGAGC
运用PrimerExplore V4在线引物设计软件进行LAMP引物设计,从设计的引物序列中选取如下4条引物进行特异性、敏感性的实验并最终确认试剂盒使用的引物。
上游外引物F3 : CCTTTGCCGCCAGATTCC
下游外引物B3 :GCTCCCAAGAGAGAAAGGC
上游内引物 FIP TGGATTACGGCAGGTTTGCGA-CCCGCACATTTCCGAACT
下游内引物BIP GGCAACAAAGGAAATCGCGGC-TCTTCAAACCGGGCAGCT
2试剂盒的组装
LAMP反应液23 μ L/份，其组成如下
I μ L浓度为8U的BstDNA聚合酶，2. 5 μ L的聚合酶缓冲液(200mM Tris-HCl (ρΗ8· 8)，IOOmMKCl, IOOmM(NH4)2SO4, 20mM 的 MgSO4,1 % Triton X-100)，浓度为5μ mol/L的上游内引物FIP和下游内引物BIP各I μ L，浓度为25 μ mol/L的上游外引物F3 和下游外引物B3各lyL，2yL浓度为IOOmM的MgSO4, 5 μ L浓度为IOmM的dNTP，5 μ L浓度为5Μ的甜菜碱，3. 5 μ L的无菌水。将配制好的LAMP反应液置_20°C或_80°C冷冻保存， 尽量避免反复冻融。
3试剂盒的使用
细菌基因组的提取
I)、取ImL细菌过夜培养液,5000rpm离心IOmin,去上清；
2)、加550 μ L的TE溶液悬浮沉淀，并加50 μ LlO % SDS溶液，50 μ L20mg/mL蛋白酶K，混匀，37°C保温Ih ；
3)、加 150 μ L5mmol/L 的 NaCl 溶液，混匀加 150 μ L CTAB/NaCl 溶液，混匀，65°C保温 20min ；
4)、用等体积酹氯仿异戍醇(三者体积比25 24 I)抽提,5000rpm离心 lOmin，将上清液移至干净离心管中，用等体积酚氯仿(体积比24 I)抽提，取上清液移至干净试管中；
5)、加I倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止lOmin，沉淀DNA ；
6)、用70 %乙醇漂洗沉淀后，洗干，溶解于100 μ L的TE溶液，-20°C保存，作为模版备用。
进行支气管败血波氏杆菌的环介导等温扩增反应。
在装有23 μ LLAMP反应液的反应管中加入2 μ L的待检模版DNA，置于65°C的水浴锅中反应I个小时，后将水浴锅调至80°C反应5min来终止反应，将反应管12000转/分离心lmin，然后观察PCR反应管底部有无白色沉淀，如有沉淀产生则判定为阳性(如图I所示)O
实施例2本发明的试剂盒的敏感性检测
样品支气管败血波氏杆菌(原始浓度为8. 3 X IO6CFU/ μ L)
样品的处理将支气管败血波氏杆菌DNA进行10倍系列稀释，选取101 77个稀释度。
采用本发明的LAMP引物和LAMP试剂盒进行敏感性的检测，对反应结果运用凝胶电泳和肉眼观察沉淀等方法进行验证。电泳结果如图2所示，10° IO6均可检测到支气管败血波氏杆菌。
实验结果表明采用本发明试剂盒最低检测限为8CFU/管，表明本发明的试剂盒具有很高的敏感性。
实施例3本发明的试剂盒的特异性检测
通过酚-氯仿抽提法分别抽取百日咳波氏杆菌、副百日咳波氏杆菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌的基因组DNA，采用本发明的LAMP引物和LAMP试剂盒进行特异性的检测，检测结果发现支气管败血波氏杆菌呈阳性，其它均成阴性。该结果如图 3，结果表明，本发明制备的检测支气管败血波氏杆菌的试剂盒具有很强的特异性。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。权利要求
1.一种用环介导等温扩增方法检测支气管败血波氏杆菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括环介导等温扩增反应液，23 μ L/份，其组成如下I μ L浓度为8U的BstDNA聚合酶，2. 5 μ L的聚合酶缓冲液，浓度为5 μ mol/L的上游内引物FIP和下游内引物BIP各I μ L，浓度为25 μ mol/L的上游外引物F3和下游外引物B3各I μ L，2 μ L浓度为IOOmM的MgSO4, 5 μ L浓度为IOmM的dNTP，5 μ L浓度为5Μ的甜菜碱，3.5 μ L的无菌水；其中聚合酶缓冲液含有 200mM Tris-HCl (pH8. 8), IOOmM KCl，IOOmM(NH4)2SO4, 20mM 的MgSO4,1 % Triton X-100 ；所述的引物序列为上游外引物 F3 CCTTTGCCGCCAGATTCC下游外引物 B3 GCTCCCAAGAGAGAAAGGC上游内引物 FIP TGGATTACGGCAGGTTTGCGA-CCCGCACATTTCCGAACT下游内引物 BIP GGCAACAAAGGAAATCGCGGC-TCTTCAAACCGGGCAGCT
2.一种使用权利要求I所述试剂盒检测支气管败血波氏杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)波氏杆菌DNA的提取1)、取ImL细菌过夜培养液,5000rpm离心IOmin,去上清；2)、加550μ L的TE溶液悬浮沉淀，并加50 μ L 10% SDS溶液，50 μ L 20mg/mL蛋白酶K，混匀，37°C保温Ih ；3)、加150 μ L 5mmol/L 的 NaCl 溶液，混匀加 150 μ L CTAB/NaCl 溶液，混匀，65°C保温20min ；4)、用等体积酪:氯仿:异戊醇(三者体积比25: 24 : I)抽提，5000rpm离心lOmin，将上清液移至干净离心管中，用等体积酚氯仿(体积比24 I)抽提，取上清液移至干净试管中；5)、加I倍体积异丙醇,颠倒混合,室温下静止lOmin，沉淀DNA；6)、用70%乙醇漂洗沉淀后，洗干，溶解于100 μ L的TE溶液，-20°C保存，作为模版备用。(2)进行支气管败血波氏杆菌的环介导等温扩增在装有23 μ L的LAMP反应试剂的反应管中加入2 μ L待检DNA，与65°C恒温水浴锅中放置I个小时，后将水浴锅调至80°C反应5min来终止反应。(3)结果的观察反应完毕后取出PCR管，12000转/分离心I分钟，然后观察PCR反应管底部有无白色沉淀，如有沉淀产生则判定为阳性。
全文摘要
本发明与动物疫病分子生物学检测领域有关，具体涉及一种用环介导等温扩增(LAMP)技术快速检测支气管败血波氏杆菌的检测试剂盒及其方法。本发明根据NCBI中Genbank数据库中发布的支气管败血波氏杆菌序列，经过序列比对，采用LAMP引物设计软件设计引物，运用环介导等温扩增技术进行支气管败血波氏杆菌的检测，具有快速、灵敏度高、特异性强、成本低等特点，可广泛应用于临床的检测。
文档编号C12Q1/68GK102925547SQ201210271618
公开日2013年2月13日 申请日期2012年8月2日 优先权日2012年8月2日
发明者徐志文, 朱玲, 张辉, 杨宏伟, 周远成 申请人:四川农业大学, 四川太平洋生物技术有限公司