专利名称：一种快速检测猪巨细胞病毒的lamp试剂盒的制作方法
一种快速检测猪巨细胞病毒的LAMP试剂盒技术领域
本发明属于兽用生物制品领域中的疾病诊断技术，具体涉及一种快速检测猪巨细胞病毒的LAMP试剂盒。
背景技术：
猪巨细胞病毒(Porcine cytomegalovirus,PCMV)是一种有囊膜的双链DNA病毒， 隶属疱疫病毒科，β疱疫病毒亚科，巨细胞病毒属。1955年英国首次报道了本病毒的感染， 1972年日本也报道了此病毒，并于1985年首次分离到病毒。目前该病毒广泛分布于世界各地，英国和日本猪群中血清抗体检测率分别达90%和98.4% .北美和澳大利亚也有报道，其中美国的发病率最高，抗体保有率为90% .我国河北、河南以及广西等地也先后报道了该病的发生。该病毒在体外增殖相对困难，据报道，仅猪肺泡巨噬细胞适宜病毒的首次分离，猪输暖管细胞和人成纤维细胞支持病毒的复制。猪巨细胞病毒的具体结构尚不清楚，仅见DNA聚合酶、gB、MCP等几个基因的研究。基于这些基因的研究，研究人员发现其同源性与人疱疹病毒6型和7型更相近，认为应将本病毒划入玫瑰疹病毒属更为恰当。另外，在异种器官移植方面，猪器官逐渐作为人类器官移植的主体，由此在进行移植时很有可能就将猪体内的潜在危险转移到人身上，猪巨细胞病毒有可能就是其中一个。
猪巨细胞病毒感染主要发生幼龄仔猪，在易感猪群中引起胚胎和仔猪死亡，表现为发育不良、鼻炎和肺炎等临床症状。成年猪多成隐形感染。猪巨细胞病毒感染的临床症状并不明显，并且无疫苗预防以及有效的治疗方法和商业化的检测试剂盒问世，因此研发检测PCMV病毒的LAMP试剂盒，对此病毒进行快速的检测，对PCMV的流行病学调查、临床诊治和疾病预防均有巨大意义。
环介导的等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)是由日本学者T. Notomi于2000年发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖四条特异性的引物针对目的序列的四个区域进行扩增，所运用的DNA聚合酶具有链置换功能，因此可以实现恒温扩增。由于其扩增依赖于目的序列的四个特异性区域，因此其特异性和敏感性均较普通PCR和荧光定量PCR高，而且由于该反应在恒温条件下进行，因此不需要昂贵的仪器， 而使用普通的水浴锅即能进行扩增反应，另外在扩增反应可以在一个小时之内完成，所需时间短，且其反应产物易于观察，可以通过肉眼判定扩增样本是否为阳性。基于以上优点， LAMP至发明之日其，已被广泛用于病原的检测，如病毒性出血败血症、巨细胞病毒、埃博拉病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒、结核杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、禽流感、猪流感等病毒性疾病和细菌性疾病的检测。到目前为止，未发现运用LAMP方法检测PCMV病毒的报道。发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足提供一种用于检测PCMV的LAMP试剂盒，根据PCMV的基因序列设计四对特异性的引物对PCMV核酸进行恒温扩增，此扩增不需要昂贵的设备，可在一个小时内完成，具有高效的敏感性和特异性，并且仅需要通过观察反应管是否有沉淀产生即可判断扩增结果。
本发明采用如下技术方案
一种快速检测猪巨细胞病毒的LAMP试剂盒，每个反应用量为23 μ L的LAMP反应液和I μ L的BstDNA聚合酶，该23 μ L的LAMP反应液中各组分及浓度如下2. 5 μ L的聚合酶缓冲液，3mM的MgSO4, IM甜菜碱，O. 4mMdNTP, O. 25mM引物F3，O. 25mM引物B3，2mM引物 FIP, 2mM引物BIP ;其中，所述2. 5 μ L的聚合酶缓冲液的组分及浓度为20mMTris-HCl、其 pH 8. 8, IOmMKCl, IOmM(NH4)2SO4,, 1% Triton X-100 ；
其中各引物序列为
F3 AAAAATATAGTTCCGCACACT ；
B3 TTTCTAATCTCGGCAGCG ；
FIP TGACATGAACGTCTCTATACGTCGTTTTTTTTTTGTTAGGACGTATACCA ；
BIP TGATAGGTCTTCATATAAAGTGCCCTTTTGACCATTCAAATTTATATATCCAGC
本发明所述用于检测PCMV的LAMP试剂盒使用方法，其步骤为
(I)运用无菌双蒸水配制上述23 μ L的LAMP反应液于反应管中；
(2)取IyL待检测基因组DNA于步骤⑴中23 μ L的LAMP反应液中，在95°C条件下作用IOmin使基因组DNA解链为单链状态，作用完成后将反应管置于冰，使其快速冷却；
(3)于步骤⑵的冷却反应管中加入IyL的BstDNA聚合酶，使终反应体积为 25 μ L.上下颠倒混匀数次，再IOOOOrpm瞬时离心10秒，使反应液全部沉到管底；
(4)取上述步骤(3)反应的试剂，置65°C反应I小时。反应完成后观察反应管中是否出现混浊以判定扩增结果，为方便观察，可在反应后将反应管置离心机内12000转/分离心I分钟，观察管低有无白色沉淀，如果观察到白色沉淀则判为阳性。或取4μ I反应终产物于2%琼脂糖凝胶(含EB染料)中电泳30min后于紫外灯下观察电泳图像为梯状条带判为阳性。
本发明所述的用于检测PCMV的LAMP试剂盒具有以下优点
(I)操作简单，而且不需要昂贵的设备本发明没有繁琐的操作过程，仅需要一个恒温水浴锅，即可在等温条件下完成检测。
(2)高特异性和高敏感性运用四条引物，针对PCMVgB基因序列的六个区域进行扩增，其特异性和敏感性均比同条件下的PCR和定量PCR高，参见实施例6、7和图1、2。
(3)反应时间短，扩增可以在一个小时内完成反应。
(4)结果判定简单，可以运用肉眼判定是否出现混浊以判断是否有特异性的扩增， 而且扩增完成后可以在不开盖的情况下判定结果，避免了扩增产物对后续检测的污染。
图I为敏感性实验电泳结果，图中M为DNA分子量标准，I 8分别为IO1 IO8倍稀释度扩增结果。
图2为特异性检测结果，图中M为DNA分子量标准，I为PCMV的扩增，2 10分别为猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪瘟病毒、传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、轮状病毒、 圆环病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒和猪流感病毒扩增结果。
图3为试剂盒扩增后结果，图中“ + ”为阳性扩增结果，可见底部的白色沉淀为阴性扩增结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明。下述实验中所使用的方法均为常规实验方法，所使用的试剂均为常规生化试剂。
实施例1PCMVLAMP引物设计与筛选
登录美国国立生物技术中心(NCBI)网站http://www. ncbi. nlm. nih. gov/,查找 Genbank 公布的 PCMVgB 基因的序列(AF268039、AF268042、FJ870561、FJ870562、AF394056、 AF268040、AF268041、FJ595497、FJ844360、FJ870563、FJ870564、HQ721832、HQ721831、 HQ686080、HQ686081、AF394057)，运用DNAstar进行序列比对后，以PCMV病毒gB基因为模板，运用 PrimerExplore V4(https://primerexplorer. jp/e/)在线引物设计软件进行 LAMP反应弓丨物设计，从设计的引物序列中选取如下4条弓丨物进行特异性、敏感性的实验，并最终确认试剂盒使用的引物序列为以下两对
F3 AAAAATATAGTTCCGCACACT ；
B3 TTTCTAATCTCGGCAGCG ；
FIP TGACATGAACGTCTCTATACGTCGTTTTTTTTTTGTTAGGACGTATACCA ；
BIP TGATAGGTCTTCATATAAAGTGCCCTTTTGACCATTCAAATTTATATATCCAGC ；
实施例2确定最优反应体系
运用正交实验进行各组分的优化，设置不同的内部引物(FIP，BIP)和外部引物 (F3，B3)的浓度比例2 1、4 1、6 1、8 UlO I ;不同浓度的 dNTP :0· 2mM、0. 3mM、 O. 4mM、0. 5mM、0. 6mM ;不同浓度的 MgSO4 :2mM、3mM、4mM、5mM、6mM ;不同的反应温度61°C、 62°C、63°C、64°C、65°C ;不同的反应时间:30min、40min、50min、60min.最后确立 LAMP 的最优反应体系Bst DNA聚合酶8U，2. 5yL的聚合酶缓冲液(20mMTris-HCl、其pH 8. 8，IOmM KCl，IOmM(NH4)2SO4,, 1% Triton X-100)，3mM 的 MgSO4, IM 甜菜碱，0. 4mMdNTP,0. 25mM 引物 F3，0. 25mM 引物 B3,2mM 引物 FIP,2mM 引物 BIP ;于 65°C反应 60min.
实施例3试剂盒的组装(以50个反应为例)
本发明所述试剂盒由LAMP反应液和BstDNA聚合酶(8U/ μ L)构成，该LAMP反应液由灭菌双蒸水配制，其中规格为50个反应的试剂盒中含有
(I)酶的配制取浓度为8υ/μ I的Bst DNA聚合酶大片段50 μ 1，装置无核酸酶的塑料瓶中。
(2)缓冲液的配制-M 125 μ I 聚合酶缓冲液(20mM Tris-HCl、其pH 8. 8，IOmMKCl, I OmM (NH4)2SO4,, I % Triton X-100)，装于无核酸酶的塑料瓶中。
(3)引物的配制取浓度为12. 5mM的F325y 1，取浓度为12. 5mM的Β325μ 1，取浓度为25mM的FIP 100 μ 1，取浓度为25mM的BIP 100 μ 1，分别装于4个无核酸酶的塑料瓶中。
(4) dNTP的配制取浓度为2. 5mM的dNTP 200 μ 1，装于无核酸酶的塑料瓶中。
(5) MgSO4的配制取浓度为25mM的MgS04150 μ 1，装于无核酸酶的塑料瓶中。
(6)甜菜碱的配制取浓度为5mM的甜菜碱250 μ 1，装于无核酸酶的塑料瓶中。
将配制好的LAMP反应液置-20°C或-80°C冷冻保存运输，尽量避免反复冻融。
实施例4病毒基因组DNA的提取
运用酚-氯仿法提取病毒基因组DNA，其步骤为
(I)取约O. 5mg感染PCMV病猪肺、淋巴结等组织病料于研钵中，加入Iml无菌水研磨破碎组织；
(2)取步骤(I)中病料研磨于Iml反应管中，反复冻融3次使组织细胞破碎释放病毒，后 12000rpm 离心 5min ；
(3)取步骤(2)中上清液400 μ 1，加入500 μ I饱和酚，上下颠倒混匀，静置5min 后 12000rpm 离心 5min ；
(4)取步骤(3)中上清液，加入饱和酚、氯仿各200 μ 1，上下颠倒混匀，静置5min 后12000rpm离心5min ；(可重复此步骤,效果会更佳)；
(5)吸取步骤⑷中上清液(注不要吸到中间层蛋白)，加入500μ1氯仿，上下颠倒混勻，静置5min后12000rpm离心5min ；
(6)吸取步骤(5)中上清液，加入约750 μ I异丙醇，轻摇约2min，室温静置10 20min, 12000rpm 离心 5min ；
(7)弃掉步骤(6)中上清液，用Iml冰冻的75%的乙醇洗涤沉淀和管壁，静置5min 后 12000rpm 离心 5min ；
(8)弃掉步骤(7)中上清液，室温干燥沉淀至无乙醇味即可；
(9)于步骤⑶的干燥反应管中加入30 50μ I灭菌双蒸水溶解基因组 DNA，-20°C保存备用。
实施例5PCMV LAMP试剂盒的使用及结果判定
取23 μ L的LAMP反应液，加入到O. 2ml薄壁PCR反应管中，随后加入I μ L提取的基因组DNA样品，轻微混匀，于95°C反应5到10分钟。后加入I μ L的BstDNA聚合酶，置水浴锅中，65°C反应60分钟。反应完毕后取出PCR管，12000转/分离心I分钟，然后观察 PCR反应管底部有无白色沉淀，如有沉淀产生则判定为阳性(如图3所示)，或取4 μ I反应终产物于2%琼脂糖凝胶(含EB染料)中电泳30min后于紫外灯下观察电泳图像，其图像为梯状条带即为阳性。
实施例6试剂盒的敏感性实验
用酚-氯仿法提取PCMV阳性病料DNA，进行10倍系列稀释，选取10卜8等8个稀释度，用该发明制备的试剂盒进行敏感性实验，对反应结果运用凝胶电泳和肉眼观察沉淀等方法进行验证。电泳结果如图I显示，随着模板浓度的降低，其电泳结果和离心观察沉淀量有所差异，但不显著。IO1倍 IO8倍稀释均可检测到PCMV核酸。
实施例7试剂盒的特异性实验验证
分别运用常规DNA和RNA提取方法提取猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪瘟病毒、传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、轮状病毒、圆环病毒、猪细小病毒等病毒的DNA或者 RNA，将提取的RNA运用常规方法反转录为cDNA后，以灭菌双蒸水作为阴性对照，与提取的 DNA —同运用该试剂盒进行检测。检测结果如图2所示，发现PCMV呈阳性，其它均成阴性。 该结果表明，本发明制备的检测PCMV的试剂盒具有特异性。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种快速检测猪巨细胞病毒的LAMP试剂盒，其特征在于，每个反应用量为23 μ L的LAMP反应液和I μ L的BstDNA聚合酶，该23 μ L的LAMP反应液中各组分及浓度如下.2.5μ L的聚合酶缓冲液，3mM的MgSO4, IM甜菜碱，O. 4mMdNTP,0. 25mM引物F3，0. 25mM引物B3,2mM引物FIP，2mM引物BIP ;其中，所述2. 5 μ L的聚合酶缓冲液的组分及浓度为20mMTris-HCl、其 pH 8. 8, IOmM KCl, IOmM(NH4)2SO4,, 1% Triton X-100 ；其中各引物序列为F3 AAAAATATAGTTCCGCACACT ；B3 TTTCTAATCTCGGCAGCG ；FIP TGACATGAACGTCTCTATACGTCGTTTTTTTTTTGTTAGGACGTATACCA ；BIP TGATAGGTCTTCATATAAAGTGCCCTTTTGACCATTCAAATTTATATATCCAGC
2.权利要求I中LAMP试剂盒的使用方法包括如下步骤(1)运用无菌双蒸水配制上述23μ L的LAMP反应液于反应管中；(2)取Iμ L待检测基因组DNA于步骤⑴中23 μ L的LAMP反应液中，在95°C条件下作用IOmin使基因组DNA解链为单链状态，作用完成后将反应管置于冰上，使其快速冷却；(3)于步骤(2)冷却的反应管中加入Iμ L的BstDNA聚合酶，使终反应体积为25 μ L上下颠倒混勻数次，再IOOOOrpm瞬时离心O. 5min,使反应液全部沉到管底；(4)将步骤(3)中所得反应物于65°C恒温水浴锅中，反应60min;(5)反应完毕后取出反应管12000rpm离心Imin,通过观察管底是否有沉淀,或取4μ I反应终产物于2%琼脂糖凝胶中电泳30min后于紫外灯下观察电泳图像来判断阴阳性。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测猪巨细胞病毒的LAMP试剂盒，每个反应用量为23μL的LAMP反应液和1μL的BstDNA聚合酶，该23μL的LAMP反应液中各组分及浓度如下2.5μL的聚合酶缓冲液，3mM的MgSO4，1M甜菜碱，0.4mMdNTP，0.25mM引物F3，0.25mM引物B3，2mM引物FIP，2mM引物BIP；其中，所述2.5μL的聚合酶缓冲液的组分及浓度为20mM Tris-HCl、其pH 8.8，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，1％Triton X-100。本发明可以高效快速的对可疑PCMV感染进行检测，且检测手段简单，不需要昂贵的实验仪器，适合在临床疾病诊断中推广。
文档编号C12R1/93GK102925588SQ20121027163
公开日2013年2月13日 申请日期2012年8月2日 优先权日2012年8月2日
发明者徐志文, 朱玲, 廖春燕, 杨宏伟, 周远成 申请人:四川农业大学, 四川省欧邦动物药业有限公司