专利名称：一种用于检测猪Kobu病毒的检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于检测技术领域，特别涉及一种可以精确、特异、快速检测猪Kobu病毒，具体涉及一种用于检测猪Kobu病毒的检测试剂盒。
背景技术：
猪kobu病毒(Kobu virus, PBoV)属于小核糖核酸病毒科成员，为无囊膜RNA病毒。Reuter G等于2007年2月从匈牙利某猪场健康猪群中采集60份粪便样品，经检测，检出Kobu病毒阳性39份，阳性率为65%。亚洲和欧洲的不少学者已经报道了猪Kobu病毒感染状况，表明在健康猪群和表现腹泻症状的猪群或血清样品中均检出较高的阳性率，可见其流行很广。经对猪Kobu病毒感染猪日龄的调查，表明幼龄猪较成年猪更易感。对严重腹泻仔猪采集的样本分析发现，流行性腹泻、传染性胃肠炎和轮状病毒检测阳性率较低，阳性率不足5%,而猪博卡病毒(porcine bocavirus, PBoV)和猪Kobu病毒检测阳性率达到 86.6%。由此可见，PBoV和Kobu病毒是这次仔猪腹泻的罪魁祸首。但到目前为止，由于对该两种病毒的认识还不够深入，尚无实时荧光定量RT-PCR检测猪Kobu病毒技术的出现，因此建立一种用于检测猪Kobu病毒的荧光定量RT-PCR方法能对该病毒进行快速诊断，对临床治疗和疾病控制有巨大的意义。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，在反应体系中加入荧光分子，通过荧光信号的按比例增加来反应DNA量的增加，使PCR产物的实时检测成为可能。满足实验目的的荧光化学物质包括DNA结合染料和荧光标记的序列特异引物或探针；专门的热循环仪配备荧光检测模块，用于监测扩增时的荧光，检测到的荧光信号反映了每个循环扩增产物的量由于该技术不仅实现了 PCR从定性到定量的飞跃，相对常规PCR而言，荧光定量PCR的主要优点是准确地确定初始模板拷贝数和宽的动态范围内和高的灵敏度。荧光定量PCR结果可以用于定性(判断一段序列的有无)，也可以用于定量(确定DNA拷贝数)，即qPCR，而常规PCR只能做半定量。另外，荧光定量PCR的结果无需通过琼脂糖凝胶电泳来评估，大大节省实验时间，提高实验效率。还有，由于PCR反应和检测都在反应管中进行，样品污染的几率大大降低，无需扩增后的实验操作，目前已得到广泛应用。基于以上优点，实时荧光定量PCR技术至发明之日起，已被广泛用于病原的检测，如猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪蓝耳病毒、沙门氏菌、大肠杆菌等病原的检测。到目前为止，未发现运用实时荧光定量RT-PCR方法检测猪Kobu病毒的报道。
发明内容
针对目前检测Kobu病毒方法存在的问题，本发明目的在于提供一种用于检测猪Kobu病毒的检测试剂盒本发明采用如下技术方案一种用于检测猪Kobu病毒的检测试剂盒，检测50个样品的试剂盒组成如下
试剂A :TRIZ0L20ml、氣仿 5ml、异丙醇 12. 511^751% 乙醇 10ml、RNasa_free 水 Iml ；试剂B:5XPrimeScript Buffer 100 μ l>PrimeScript RT Enzyme Mix I 25 μ I、OligodT Primer 25 μ I、Random 6 mers 100 μ I、RNase Free dH20 250 μ I ；试剂C:上游引物 Pl 25μ1、下游引物 P2 25 μ l.SYBR Green I 染料 500 μ l、ddH20160μ I ；上游引物PI : 5 ’ -GGACCCAGACACTTACGAACA-3，；下游引物P2 :5 ’ -TCGGACCAGAATGGAAAGCA-3 ’。利用试剂A抽提病毒的RNA，试剂B对其进行反转录，试剂C对其进行荧光定量PCR 反应，从而对Kobu病毒进行特异性、定量检测。该方法是通过荧光染料或对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模版的初始浓度。采用上述试剂盒进行检测的方法具体步骤如下I)采用常规方法提取猪Kobu病毒总RNA2)引物设计根据GenBank中发表的猪Kobu病毒的3D基因序列(AB624488)，设计一对特异性引物，目的基因片段为lOlbp，引物序列如下上游引物PI : 5 ’ -GGACCCAGACACTTACGAACA-3 ’下游引物P2 :5 ’ -TCGGACCAGAATGGAAAGCA-3 ’3)猪Kobu病毒的3D基因RT-PCR扩增取猪Kobu病毒总RNA，加入反转录引物(大连宝生物有限公司)、5XRT Buffer、dNTP/RNasin inhibitor及反转录酶进行反转录得到cDNA ;以反转录所得的cDNA为模版进行PCR扩增，得到猪Kobu病毒的3D基因片段，取PCR产物经I %琼脂糖凝胶电泳分析，并纯化回收PCR产物；4)猪Kobu病毒的3D基因的克隆与鉴定将回收纯化后PCR产物与载体连接，将连接产物转化至感受态细胞，筛选得到单菌落，挑选单菌落至含抗生素的液体培养基中，过夜培养，提取质粒，以提取的重组质粒DNA为模版进行PCR鉴定，并对重组质粒进行测序鉴定；5)标准品模版的制备提取验证正确的阳性重组质粒，用紫外分光光度计测定阳性重组质粒的浓度，并计算基因模版拷贝数，将重组质粒进行10倍倍比梯度稀释，共做7个稀释度101，102，103，104，105，106，107，将其作为标准品模版；6) SYBR Green I 实时定量 PCR 检测取标准品模版进行SYBR Green I实时定量PCR扩增，得到扩增动力曲线及标准曲线；选取猪Kobu病毒同一浓度的质粒标准品模版进行SYBR Green I实时荧光定量反应，验证此方法上的重复性与稳定性；7)敏感性与特异性试验将已计算出拷贝数的质粒做10倍倍比稀释，进行敏感性试验；分别加入猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)核酸作为阳性对照，同时设置阴性对照，验证此方法的特异性。
步骤3)所述的PCR扩增体系为Premix Ex Tap 12 μ 1，浓度为O. 5 μ moL/L的引物PI、P2各0. 5 μ I, cDNA I μ I,最后用灭菌的双蒸水补至25 μ I。步骤3)所述的PCR扩增反应程序为(1)95°C 预变性 5min ；(2)95°C变性50s、55°C退火50s、72°C延伸lmin，此步骤为一个循环，共35个循环；(3) 72O 延伸 IOmin。步骤6)所述的SYBR Green I实时定量PCR反应体系为上游引物O. 5 μ 1，下游弓丨物为O. 5 μ I, SYBR Premix Ex Tap II聚合酶10 μ I,模版I μ I，灭菌去离子水8 μ I。步骤6)所述的SYBR Green I实时定量PCR反应程序 (1)95°C 预变性 5min ；(2)95°C变性10s、55°C退火15s、72°C延伸15s，此步骤为一个循环，共45个循环；当反应结束后先加热至95°C，然后在降至55°C，开始以O. 5°C /s递增至95°C检测荧光信号得出扩增产物的溶解曲线。本发明的有益效果I、扩增曲线呈现出良好的S型，只出现扩增产物特异性的单个峰，产物的Tm值都在78-79°C之间，说明没有引物二聚体及非特异性扩增产物出现；2、检测的灵敏度可达10拷贝/微升，且具有很好的重复性；3、该方法与对照组的TGEV、PEV、PRV、CSFV, PRRSV不发生交叉反应，具有良好的特异性；4、该方法起始模版浓度与Ct值之间呈现良好的线性关系，标准曲线的斜率为-3. 537，扩增效率为91.8%，相关系数R2为O. 992，说明此反应体系具有很高的精确度和良好的稳定性；5、与常规的PCR比较，不但可以定性检测猪Kobu病毒，也可以定量检测猪Kobu病毒，而且能够检测出常规PCR无法检测的病料，同时也免去了 DNA水平电泳的步骤，更加省时，且操作简单。
图I为猪Kobu病毒的3D基因RT-PCR扩增电泳2为猪Kobu病毒实时定量PCR扩增动力曲线；图3为猪Kobu实时定量PCR标准曲线；图4为猪Kobu实时定量PCR扩增产物溶解曲线；图5为荧光定量PCR检测猪Kobu病毒的重复性结果；图6荧光定量PCR检测猪Kobu病毒的特异性结果。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例I猪Kobu病毒总RNA提取取阳性感染猪的血清400 μ 1，加入400 μ I的Trizol，剧烈振荡l_2min，使其充分混匀；加入100 μ I氯仿/异戊醇(24 I)，剧烈振荡混匀30s，12000rpm离心5min ;将上清小心转移到无菌EP管中，加入200 μ I无水乙醇，混匀；将上述溶液全部转移到放于2ml的收集管内的GenClean柱中，室温放置2min, 8000rpm离心Imin ;小心取出柱子,弃去收集管中的废液，将柱子放回收集管；在柱子上加入450 μ I RPEsolution (漂洗液加5倍无水乙醇)，IOOOOrpm,室温离心30s ;倒掉废液，重复洗涤一次，小心取出柱子，弃去收集管中的废液，将柱子放回收集管中，12000rpm室温离心3min ;将柱子放入新EP管，加DEPC (预先预热)20 μ I于柱中；封口膜封口，水浴70°C 2-3min, 12000rpmlmin即得到猪Kobu病毒总RNA样品，用紫外分光光度计测定其0D260值及0D280值，计算出其0D260/0D280。测得样品的浓度为4 μ g/ μ I，取5 μ I提取总RNA，用DEPC水稀释成O. 2 μ g/ μ I。实施例2引物设计根据GenBank中发表的猪Kobu病毒的3D基因序列(ΑΒ624488)，利用Primer5. O软件设计一对引物，用设计的引物可以扩增3D基因部分片段(Kobu-3D)101bp。引物序列如下 上游引物PI : 5 ’ -GGACCCAGACACTTACGAACA-3 ’下游引物P2 :5 ’ -TCGGACCAGAATGGAAAGCA-3 ’引物由大连宝生物生物技术有限公司合成。实施例3猪Kobu病毒的3D基因RT-PCR扩增取5μ1 RNA样品加DEPC水补足11μ 1，然后加入反转录引物1μ I 70°C水浴lOmin，后迅速置冰上5min，稍离心；取出依次加入5XBuffer 4 μ I, dNTP 2μ I,RNasinhibiter I μ I,瞬时离心；42°C水浴2min,快速加入I μ I反转录酶，封口膜封好；42°C水浴60min，转至70°C水浴15min，反转录结束；取反转录所得的cDNA为模版进行PCR扩增；PCR扩增体系为Premix Ex Tap 12 μ 1，浓度为 O. 5 μ mol/L 引物P1、P2各O. 5 μ 1，cDNA 1μ 1，最后用灭菌的双蒸水补至25μ I ;PCR扩增反应程序为(1)95°C 预变性 5min ；(2) 95°C变性50s、55°C退火50s、72°C延伸lmin，此步骤为I个循环，共35个循环；(3) 72O 延伸 IOmin ;取5μ I PCR产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，结果显示扩增出一条片段大小为IOlbp特异性条带(如图I所示)，按DNA凝胶回收试剂盒(北京天跟生物技术有限公司)说明书回收PCR产物。实施例4猪Kobu病毒的3D基因的克隆与鉴定(I)将回收纯化后PCR产物与PMDT19 simple载体相连，连接反应体系为solution I5. 0 μ I
纯化PCR产物I. O μ I PMDT19 simple vector 0. 5 μ I
ddH203. 5 μ
总体积10 μ I 将上述反应体系混匀后4°C连接过夜，连接产物直接用于转化；(2)取100 μ 1DH5 α感受态细胞，加入连接产物5 μ 1，冰浴30min，42°C热应激90s，冰浴5min，加入950 μ I不含抗生素的LB液体培养基，37°C 250r/min振荡培养50min，8000rpm离心5min,弃上清液,加入200 μ I液体培养基重悬沉淀,再加入42 μ I IPTG (mg/mL)和42 μ ΙΧ-gal (20mg/mL)，混匀，均匀涂布于含有60 μ g/mLAmp的LB固体平板上，37 °C培养12h ；(3)挑选单菌落，接入含50 μ g/mL Amp的LB液体培养基中，37 °C过夜培养，采用质粒提取试剂盒(北京天跟生物技术有限公司)，提取质粒，以提取的质粒为模版进行PCR鉴定，并用I %琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，去PCR验证正确的阳性质粒送大连宝生物有限公司测序鉴定，将测序验证正确的重组质粒命名为PMDT-K0BU。实施例5标准品模版的制备挑选测序正确的阳性克隆，接入含50 μ g/mL Amp的LB液体培养基中，37°C过夜培养，用碱裂解法提取重组质粒PMDT-K0BU，用紫外分光光度计检测并计算质粒浓度，按下面公式计算拷贝数基因模版拷贝数=DNA浓度/DNA分子量X 6. 02 X IO23经计算得PMDT-K0BU质粒的拷贝数，根据得到的结果，将重组质粒进行10倍倍比稀释，得到浓度为 I X IO7,1 X IO6,1 X IO5,1 X IO4,1 X IO3,1 X IO2,1 X IO1 拷贝数 / 微升的重组质粒，将其作为标准品模版；实施例6SYBR Green I实时定量PCR检测(I)分别取浓度为 I X IO7,1 X IO6,1 X IO5,1 X IO4,1 X IO3,1 X IO2,1 X IO1 拷贝数 /
微升的重组质粒为模版进行SYBR Green I实时定量PCR扩增，得到扩增动力学曲线、标准曲线，如图2及图3所示，标准曲线的相关系数R2为O. 992，标准曲线的斜率为-3. 537，扩增效率为91. 8%0其中PCR扩增反应体系为上游引物O. 5 μ 1，下游引物O. 5 μ 1，SYBR PremixExTapII聚合酶10 μ 1，模版I μ 1，灭菌去离子水8 μ I ;PCR反应程序为(1)95°C 预变性 5min ；(2)95°C变性10s、55°C退火15s、72°C延伸15s，此步骤为一个循环，共45个循环；当反应结束后先加热至95°C，然后降至55°C，开始以O. 5°C /s递增至95°C检测荧光信号得出扩增产物的溶解曲线，如图4所示，标准品的溶解温度都在78-79°C之间；(3)选取猪Kobu病毒同一浓度的质粒标准品模版进行SYBR Green I实时定量PCR反应，验证此方法的重复性与稳定性，结果显示如图5所示，两次试验所得的S曲线相似，其Ct值十分接近，说明本方法具有良好的重复性与稳定性；(4)将已计算出拷贝数的质粒做10倍倍比稀释，进行敏感性试验，结果显示，浓度为10拷贝/微升时，仍可以得到S型荧光曲线；(5) SYBR Green I实时定量PCR体系中分别加入猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)核酸作为阳性对照，同时以水作为阴性对照，验证此方法的特异性，试验结果如图6所示，阳性对照及阴性对照均无S型曲线，只有以重组质粒PMDT-K0BU为模版的PCR扩增，有S型曲线，说明本方法具有很好的特异性。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种用于检测猪KobU病毒的检测试剂盒，其特征在于，检测50个样品的试剂盒组成如下试剂 A TRIZ0L 20ml、氣仿 5ml、异丙酉享 12. 511^751% 乙醇 10ml、RNasa-free 水 Iml ；试剂 B :5XPrimeScript Buffer 100 μ I、PrimeScript RT Enzyme Mix I 25 μ I、OligodT Primer 25 μ I、Random 6 mers 100 μ I、RNase Free dH20 250 μ I ；试剂 C :上游引物 Pl 25 μ I、下游引物 P2 25 μ I, SYBR Green I 染料 500 μ I、ddH20160μ I ；上游引物 Pl :5’ -GGACCCAGACACTTACGAACA-3’ ；下游引物 P2 :5’ -TCGGACCAGAATGGAAAGCA-3’。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测猪Kobu病毒的检测试剂盒，检测50个样品的试剂盒组成如下试剂ATRIZOL 20ml、氯仿5ml、异丙醇12.5ml、75％乙醇10ml、RNasa-free水1ml；试剂B5×PrimeScript Buffer 100μl、PrimeScript RT Enzyme Mix I 25μl、Oligo dT Primer 25μl、Random 6 mers 100μl、RNase Free dH2O 250μl；试剂C上游引物P1 25μl、下游引物P2 25μl、SYBR Green I染料500μl、ddH2O 160μl；上游引物P15’-GGACCCAGACACTTACGAACA-3’；下游引物P25’-TCGGACCAGAATGGAAAGCA-3’。利用本试剂盒进行实时荧光定量PCR扩增曲线呈现出良好的S型，只出现扩增产物特异性的单个峰，产物的Tm值都在78-79℃之间，说明没有引物二聚体及非特异性扩增产物出现；检测的灵敏度可达10拷贝/微升，且具有很好的重复性。
文档编号C12Q1/68GK102925586SQ20121027160
公开日2013年2月13日 申请日期2012年8月2日 优先权日2012年8月2日
发明者徐志文, 李雪梅, 朱玲, 刘孟良, 周远成 申请人:四川农业大学, 四川川娇生态猪业股份有限公司