专利名称：基于dna分析的羊毛羊绒定量检测方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体地说，是关于一种基于DNA分析的羊毛羊绒定量检测方法。
背景技术：
羊绒素有“软黄金”之称，价格昂贵，其良好的服用性能使得羊绒产品一直广受欢迎。我国是山羊绒的重要生产国之一，世界上70%的羊绒都出自我国内蒙、新疆、宁夏等地，每年依靠此项出口创汇数额可观。一些不法商贩将羊毛或脱鳞(改性)羊毛，拉伸绵羊毛等极易与山羊绒纤维混淆的纤维混为山羊绒，牟取暴利，极大地败坏了我国的声誉。2004-2006年，经多次协商，英、美、法、澳大利亚及我国的专家一致同意用鳞片厚度来鉴别羊毛羊绒。羊绒的鳞片厚度(鳞片细胞本身的厚度)为O. 42 μ m以下，羊毛鳞片均在·
O.54 μ m以上。近年来，一方面是超细绵羊品种的出现，这些羊毛的鳞片厚度均在O. 50 μ m以下；另一方面，片面追求高产，辽宁盖县的高产绒山羊得到了大力推广，羊绒普遍增粗，鳞片厚度增大。依靠鳞片厚度的鉴别方法已经无法正确鉴别羊毛羊绒。羊毛羊绒的精确检测一直是纺织品检测领域的难题。一般来说化学合成纤维的鉴别相对容易，而物理、化学性质相近的天然纤维的鉴别就比较困难，加之天然动物纤维常常要进行防缩处理及染色等工艺，增加了检测的难度。目前常规使用的检测方法为物理法，主要包括光学显微镜法和扫描电镜法(SEM)。国内外不同标准不约而同地将显微镜法置于最重要和最广泛的应用地位。显微镜检测存在一些问题费时，费力，且依赖检测人员的经验，因而具有不可避免的主观性。而扫描电镜也存在着成本高，制样麻烦，检测时间长等缺陷。图I是扫描电镜下放大600倍的山羊绒和绵羊毛纤维。因此，建立新的方法，准确客观地鉴别细羊毛与山羊绒纤维，对于公平贸易和维护我国产绒大国的良好声誉，显得尤为迫切。随着生物技术和生命科学的飞速发展，DNA检测技术以其客观性和精准性在食品、动植物检疫、医疗诊断、司法鉴定及环境监测等领域得到了广泛的应用。近年，有很多学者开展了基于DNA技术的纤维物种鉴别研究，对纺织品质量检测现代化技术的发展具有重要的推动作用。
发明内容
本发明的的第一个目的在于提供一种基于DNA分析的羊毛羊绒定量检测方法。本发明的的第二个目的在于提供一种山羊源性纤维成分的检测试剂盒。本发明的的第三个目的在于提供所述山羊源性纤维成分的检测试剂盒的应用。本发明的的第四个目的在于提供一种绵羊源性纤维成分的检测试剂盒。本发明的的第五个目的在于提供所述山羊源性纤维成分的检测试剂盒的应用。本发明的的第六个目的在于提供一种山羊源性纤维成分的特异性引物和特异性探针。
本发明的的第七个目的在于提供一种绵羊源性纤维成分的特异性引物和特异性探针。本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现作为本发明的第一方面，一种基于DNA分析的羊毛羊绒定量检测方法，包括以下步骤步骤一、以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增；步骤二、检测扩增产物的荧光信号；步骤三计算待测样品中山羊源性纤维成分和绵羊源性纤维成分的含量；其中，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增山羊源性纤维成分特异性引物对和山羊源性纤维成分特异性探针，以及扩增绵羊源性纤维成分特异性引物对和绵羊源性纤维成分特异性探针。·其中，所述扩增山羊源性纤维成分特异性引物对的序列如SEQ ID NO :1和SEQ IDNO 2所示。其中，所述山羊源性纤维成分特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。其中，所述扩增绵羊源性纤维成分特异性引物对的序列如SEQ ID NO :4和SEQ IDNO 5所示。其中，所述绵羊源性纤维成分特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示。作为本发明的第二方面，一种山羊源性纤维成分的检测试剂盒，含有以下试剂(a)扩增山羊源性纤维成分特异性引物对；(b)山羊源性纤维成分特异性探针。进一步地,所述试剂盒还包括(C)标准参照物。其中，所述扩增山羊源性纤维成分特异性引物对的序列如SEQ ID NO :1和SEQ IDNO 2所示。其中，所述山羊源性纤维成分特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。其中，所述标准参照物是山羊源性纤维成分DNA，或含有山羊源性纤维成分扩增目的片段的质粒DNA，或山羊绒。作为本发明的第三方面，一种山羊源性纤维成分的检测试剂盒的应用，用于定量检测山羊源性纤维成分。作为本发明的第四方面，一种绵羊源性纤维成分的检测试剂盒，含有以下试剂(a)扩增绵羊源性纤维成分特异性引物对；(b)绵羊源性纤维成分特异性探针。进一步地,所述试剂盒还包括(C)标准参照物。其中，所述扩增绵羊源性纤维成分特异性引物对的序列如SEQ ID NO :4和SEQ IDNO 5所示。其中，所述绵羊源性纤维成分特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示。其中，所述标准参照物是绵羊源性纤维成分DNA，或含有绵羊源性纤维成分扩增目的片段的质粒DNA，或绵羊毛。
作为本发明的第五方面，一种绵羊源性纤维成分的检测试剂盒的应用，用于定量检测绵羊源性纤维成分。作为本发明的第六方面，一种山羊源性纤维成分的特异性引物和特异性探针，其中，所述山羊源性纤维成分特异性引物的序列如SEQ ID NO :1和SEQ IDNO 2所示；所述山羊源性纤维成分特异性探针的序列如SEQ ID N0:3所示。作为本发明的第七方面，一种绵羊源性纤维成分的特异性引物和特异性探针，其中，所述绵羊源性纤维成分特异性引物的序列如SEQ ID NO 4和SEQ IDNO 5所示；所述绵羊源性纤维成分特异性探针的序列如SEQ ID N0:6所示。本发明的有益效果I、可快速、简便地检测羊毛羊绒混纺制品中的羊毛和羊绒含量； 2、灵敏度高，荧光定量PCR只需微量的DNA模板；3、针对山羊源性和绵羊源性的特异性引物和探针特异性好，准确度高，误差小于10%。
图I为山羊绒(左)和绵羊毛(右)的扫描电镜图。图2为山羊源性检测引物和探针的位置。图3为绵羊源性检测引物和探针的位置。图4为山羊源性成分的实时荧光PCR结果。图5为绵羊源性成分的实时荧光PCR结果。图6为山羊源性成分的探针引物的特异性检测结果。图7为绵羊源性成分的探针引物的特异性检测结果。图8为山羊源性成分体系的灵敏度检测结果，其中，从左往右各点分别代表山羊绒DNAl倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍梯度稀释。图9为绵羊源性成分体系的灵敏度检测结果其中，从左往右各点分别代表绵羊毛DNAl倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍梯度稀释。图10为羊绒羊毛定量标准曲线图。图11为标为100%的羊绒围巾的显微镜检测结果。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验室手册》(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件或厂商提供的条件进行。实施例I、引物和探针的设计针对山羊源性成分的产物大小为67bp。荧光定量引物和探针的位置如图2所示，序列如下GolF :5，-CCCGTCACCCTCCTCAAGT-3，(SEQ ID NO 1)
GolR :5’ -CCTCTCATGTAGTTGATGCGTGTT-3’(SEQ ID NO :2)Pgol FAM-AATACAATGCACTCAAGC-MGB (SEQ ID NO :3)针对绵羊源性成分的产物大小为97bp。荧光定量引物和探针的位置如图3所示，序列如下ShlF :5’ -CGTCACCCTCCTCAAGTAAATATGA-3’ (SEQ ID NO 4)ShlR :5’ -TTCCAGTATGCTTACCTTGTTACGA-3’ (SEQ ID NO 5)PshlFAM-ACCTATTTACATATATCAACCACAC-MGB (SEQ ID NO 6)其中，FAM表示荧光报告基团，MGB表示淬灭基团。本发明采用荧光探针法，其检测 原理是利用荧光标记特异性探针来识别模板。与现有技术中SYBR染料法相比，本发明荧光标记特异性探针的特异性更强。实施例2、山羊源性成分和绵羊源性成分反应体系的优化分别取山羊绒、绵羊毛5mg,剪碎后用progema毛发抽提试剂盒抽提DNA, 70 μ I洗脱液洗脱DNA。反应体系除ABI Taqman universal PCR master mix (2 X) 10 μ I, DNA 模板4 μ I以外，其他成分如表I和表2所示。引物的浓度为10 μ Μ，探针的浓度为2 μ Μ。表I、山羊源性成分测定优化反应体系中其他成分的用量(单位μ I)
体系引物探针 ddH20 ~ 04 T&~
~20 4 2376~
306 Tl~
~ 06 2 O~
506 Σδ 2 9~
608 H~
~0 8 23 2~
~808ΓδΓ ~
917023
~10170ΓδΓδ~
~ΠO22Γ2~
~12O2 5Tl~表2、绵羊源性成分测定优化反应体系中其他成分的用量(单位μ I)
权利要求
1.一种基于DNA分析的羊毛羊绒定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤 步骤一、以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增； 步骤二、检测扩增产物的荧光信号； 步骤三计算待测样品中山羊源性纤维成分和绵羊源性纤维成分的含量； 其特征在于，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增山羊源性纤维成分特异性引物对和山羊源性纤维成分特异性探针，以及扩增绵羊源性纤维成分特异性引物对和绵羊源性纤维成分特异性探针。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述扩增山羊源性纤维成分特异性引物对的序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述山羊源性纤维成分特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO : 3所示。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述扩增绵羊源性纤维成分特异性引物对的序列如SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5所示。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述绵羊源性纤维成分特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示。
6.一种山羊源性纤维成分的检测试剂盒，含有以下试剂 Ca)扩增山羊源性纤维成分特异性引物对； (b)山羊源性纤维成分特异性探针。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括 (C)标准参照物。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增山羊源性纤维成分特异性引物对的序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述山羊源性纤维成分特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO : 3所示。
10.如权利要求6、中任一项的试剂盒的应用，用于定量检测山羊源性纤维成分。
11.一种绵羊源性纤维成分的检测试剂盒，含有以下试剂 Ca)扩增绵羊源性纤维成分特异性引物对； (b)绵羊源性纤维成分特异性探针。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括 (C)标准参照物。
13.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增绵羊源性纤维成分特异性引物对的序列如SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5所示。
14.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述绵羊源性纤维成分特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示。
15.如权利要求1Γ14中任一项的试剂盒的应用，用于定量检测绵羊源性纤维成分。
16.一种如权利要求I所述的山羊源性纤维成分的特异性引物和特异性探针，其特征在于，所述山羊源性纤维成分特异性引物的序列如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示；所述山羊源性纤维成分特异性探针的序列如SEQ IDNO 3所示。
17.—种如权利要求I所述的绵羊源性纤维成分的特异性引物和特异性探针，其特征在于，所述绵羊源性纤维成分特异性引物的序列如SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5所示；所述绵 羊源性纤维成分特异性探针的序列如SEQ IDNO 6所示。
全文摘要
本发明公开了一种基于DNA分析的羊毛羊绒定量检测方法，包括步骤一、以待测样品的DNA为模板，进行PCR扩增；步骤二、检测扩增产物的荧光信号；步骤三计算待测样品中山羊源性纤维成分和绵羊源性纤维成分的含量；其中，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增山羊源性纤维成分特异性引物对和山羊源性纤维成分特异性探针，以及扩增绵羊源性纤维成分特异性引物对和绵羊源性纤维成分特异性探针。
文档编号C12Q1/68GK102899397SQ20121027160
公开日2013年1月30日 申请日期2012年8月1日 优先权日2012年8月1日
发明者费静, 杨娟, 陆维民, 周辉, 唐敏峰, 张舒亚, 王卫华, 张小明, 王小平, 叶尚华, 高友军, 刘锦瑞 申请人:上海出入境检验检疫局工业品与原材料检测技术中心, 中华人民共和国新疆出入境检验检疫局, 河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心