专利名称：莫诺苷在预防或治疗脑重大疾病中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及莫诺苷的一种新的医药用途，尤其涉及莫诺苷在预防或治 疗脑重大疾病中的应用，属于中药领域。
莫诺苷(morroniside)是从中药山茱萸(Cornus officinalis Sicb)提取的化合物，其结构式如下<formula>formula see original document page 3</formula>
山茱萸为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sicb的干燥 成熟果肉，具有补益肝肾，涩精固脱等功效。山茱萸含挥发油、有机酸和 环烯醚萜苷类等多种化学成分，药理学研究表明，山茱萸具有抑菌抗病毒， 调节人体免疫功能，降血糖和抗衰老等作用，其提取物有明显的免疫抑制 活性，并对肾阳虚动物模型生命质量及多个脏器具有保护作用。
脑重大疾病，指脑卒中、脑缺血/再灌注损伤、痴呆、帕金森疾病， 占脑疾病的85%，它们共同的机理是在脑卒中、脑缺血/再灌注或者其它 损伤因素诱导下，脑内产生大量自由基，损伤神经元，引起神经元凋亡或 者死亡，神经功能受到破坏，或者神经功能逐步损伤、异常，造成死亡或
者中风后遗症、痴呆、帕金森疾病。
tr前认为，对于脑重大疾病，针对发病机理，治疗或者预防应采用抗 氧化、抗凋亡、增加神经营养功能，促进神经营养和再生，恢复神经功能， 对于预防和治疗脑卒中、脑缺血/再灌注患者具有重要意义，或者通过延 缓神经功能衰减的速度，对于痴呆、帕金森疾病的预防和治疗具有重要意 义。
发明内容
本发明人通过大量的实验发现，莫诺苷(morroniside)具有抗氧化、 抗凋亡、增加神经营养、促进神经生长等药理作用，.对脑重大疾病具有显 著的治疗或者预防的作用。
其中，所述的脑重大疾病脑指脑卒中、脑缺血/冉灌注损伤、痴呆、 帕金森疾病等，这类疾病共同的发病机理是在脑卒中、脑缺血/再灌注 或者其它损伤因素诱导下，脑内产生大量自由基，损伤神经元，引起神经 元凋亡或者死亡，神经功能受到破坏，或者神经功能逐步损伤、异常，造 成死亡或者中风后遗症、痴呆、帕金森疾病，由于莫诺苷具有抗氧化、抗 凋亡、增加神经营养、促进神经生长等药理功效，所以对这类具有共同发 病机理的脑重大疾病均具有治疗或者预防的作用。
所述的莫诺苷在用于治疗任意一种脑重大疾病时，其使用剂量范围为 30mg-8000mg/天，优选90mg-3000mg/天，更优选30mg-1000mg/天。
本发明还提供了一种治疗或者预防脑重大疾病的药物组合物，该药物 组合物含有治疗上有效量的莫诺苷和药学上可接受的辅料或载体；其中， 所述的脑重大疾病脑是指脑卒中、脑缺血/再灌注损伤、痴呆或帕金森疾 病等。
本发明提供的以莫诺苷为活性成分的药物组合物，其含量为 30-1000mg。其可以通过口服、舌下、皮肤、经肌肉后者皮下、皮肤粘膜、 静脉途径给药。可以以胶囊、软胶囊、片剂、口服液、粉针剂、水针剂等
制剂形式存在，这些制剂以药学常规方法制备而成。
本发明通过高效液相测定含量，YMC U色谱柱(4. 6mmX250mm， 5um); 流动相为甲醇-水(30: 70);检测波长为240nm;流速1. OmL. min—';柱温 25°C;进样量10uL。取莫若苷对照品适量，精密称，置量瓶中，用30% 甲醇制成每lml含0. 3mg溶液，精密汲取此溶液制成不同浓度的对照品溶 液。取莫诺苷提取物样品5mg，精密称定，置25ml量瓶中，用30%甲醇溶 解，过0.2um微孔滤膜，制成供试品溶液，精密汲取对照品和供试品溶液， 注入液相色谱仪测定含量，含量为95. 5%。
图l SY5Y神经细胞正常细胞形态。
图2 SY5Y神经细胞过氧化氢损伤后细胞形态。
图3莫诺苷对SY5Y神经细胞HA损伤LDH的影响；其中，LDH漏出 增多表示细胞膜损伤严重。
图4莫诺苷对SY5Y神经细胞HA损伤MTT的影响；其中，MTT比色 光密度降低表示细胞存活率降低。
图5莫诺苷对HA致SY5Y神经细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性降 低的影响。
图6莫诺苷对仏02致SY5Y神经细胞谷胱甘肽(GSH)活性降低的影响。
图7莫诺苷对&02致SY5Y神经细胞Bcl-2表达降低的影响。 图8莫诺苷对HA致SY5Y神经细胞NGF表达降低的影响。
具体实施例方式
以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅
用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
实施例l莫诺苷的制备
山茱萸粉碎，加10倍重量水煎煮3次，每次1小时，合并煎液，滤
过，减压浓縮，加乙醇沉淀，静置，滤过，加压回收乙醇，SP70大孔树脂 吸附，收取30%乙醇洗脱液，减压回收乙醇，真空干燥，得到山茱萸环烯 醚萜苷；用硅胶(60-80目)拌样，干燥、硅胶(200-300目)柱层析，
用氯仿/甲醇(氯仿甲醇=1: 0-3: 1)洗脱，TLC检测，相同部分合并，
回收溶剂；将莫诺苷在甲醇溶液中反复纯结晶，得到莫诺苷纯化合物，经 HPLC检测含量大于95. 5%。
实施例2:莫诺苷胶囊的制备
100g莫诺苷(实施例l所制备)，加100g糊精，加适量54%的乙醇， 搅拌润湿，制粒，干燥，装胶囊，即得；每粒含莫诺苷100mg。
试验例1莫诺苷促进神经保护作用
将人神经母细胞瘤系细胞系SY5Y细胞(瑞典卡诺琳娜大学赠送)(模 拟神经元细胞)以每毫升1.5X104的密度接种，48h后分为对照组与加药 组，加入过氧化氢(200-500uM)和莫诺苷(实施例l所制备)，每组8-12 个孔。测定LDH、 MTT、 SOD、 GSH、 Bel-2、 NGF、 BDNF，结果见图l-8， i式 验结果表明，莫诺苷有抑制LDH漏出、MTT代谢、抗细胞氧化损伤、抑制 细胞凋亡、增加神经营养因子分泌等药理作用，对SY5Y细胞有保护作用。
通过莫诺苷抑制HA造成SY5Y神经细胞氧化损伤模型实验表明，莫诺 苷(liiM， 10uM， 100iiM)具有极显著降低LDH漏出的作用，可显著增 加MTT含量。
试验结果表明莫诺苷具有增加神经细胞活性和神经保护作用。 试验例2莫诺苷抗氧化作用试验
MEM(Gibco BRL， 41500-()34)培养基中加入体积分数为0.1的灭活胎 牛血清(Gibco， 16000-044)、 15 mmol/L HEPES(北京鼎国生物技术发展中 心)、青霉素lxl05U/L、链霉素lxl()5u/L，在体积分数为0.05 C02， 37°C 的孵箱中培养，每周换液2次，传代1次。细胞加入不同浓度的药物孵育 24h后，加入H2O2 (500itmiol/L)损伤18h，用胰蛋白酶裂解，按照试剂盒 的说明测定SOD、 GSH含量。通过莫诺苷对H202造成SY5Y神经细胞氧化 损伤模型抗氧化作用研究，莫诺苷(10uM， 100 uM)具有显著升高SY5Y 细胞SOD含量的作用(图5);同时，莫诺苷(luM， 10uM， 100 uM)也 具有增加GSH含量的作用(图6)。
试验结果表明莫诺苷可以提高神经细胞内抗氧化酶的活性和小分子 抗氧化物质含量，具有抗氧化损伤作用。
试验例3 莫诺苷抗凋亡作用试验
将SY5Y细胞以密度为1X107L—^妾种于75cm2培养瓶中，待细胞生 长至90%密度时，更换为无血清培养基，分组。24h后弃去原培养液，用 预冷的磷酸盐缓冲液洗两遍，加入1.0mL细胞裂解液，冰浴中提取细胞蛋 白质。20min后，用细胞刮刀将细胞裂解物刮下收集到1.5 mLEpendorff 管中，15000r/min， 4'C离心30min，取上清。应用BioRad蛋白质测定试 剂盒检测蛋白质含量，以控制样品的加样量。80-120V电压下SDS-聚丙稀 酰胺凝胶电泳，转膜，5%奶粉封闭，加一抗Bcl-2稀释(l:500)， 二抗，碱 性磷酸酶显色系统显色。扫描仪扫描电泳条带，用软件分析数值。Bcl-2 对正常细胞功能和代谢没有影响，对病理性细胞凋亡具有抑制作用，研究 和观察莫诺苷对HA造成株SY5Y神经细胞氧化损伤模型Bcl-2表达的影 响，试验结果表明莫诺苷(luM， 100uM)具有显著增加Bcl-2表达的
作用(图7)，说明莫诺苷具有抑制神经细胞凋亡的作用。
试验例4莫诺苷神经营养作用试验
将SY5Y细胞以密度为1X107L—'接种f75cm2培养瓶中，待细胞生 长至90%密度时，更换为无血清培养基，分组。24h后弃去原培养液，用 预冷的磷酸盐缓冲液洗两遍，加入l.OmL细胞裂解液，冰浴中提取细胞蛋 白质。20min后，用细胞刮刀将细胞裂解物刮下收集到1.5 mLEpendorff 管中，15000r/min， 4r离心30min，取上清。应用BioRad蛋白质测定试 剂盒检测蛋白质含量，以控制样品的加样量。80-120V电压下SDS-聚丙稀 酰胺凝胶电泳，转膜，5%奶粉封闭，加一抗NGF稀释(1:500)， 二抗，碱 性磷酸酶显色系统显色。扫描仪扫描电泳条带，用软件分析数值。通过莫 诺苷对H202造成SY5Y神经细胞氧化损伤模型对神经营养因子表达影响作用 研究，结果表明莫诺苷(10uM， lOOtxM)具有增加SY5Y细胞表达神经生 长因子(NGF)表达的作用(图8)，试验说明莫诺苷具有增加神经营养因 子的作用，能够增强神经细胞神经营养和神经发生的作用。
权利要求
1、莫诺苷(morroniside)在制备治疗或者预防脑重大疾病药物中的用途；其中，所述莫诺苷的化学结构式如下
2、 按照权利要求1的用途，其特征在于所述脑重大疾病是指脑卒 中、脑缺血/再灌注损伤、痴呆或帕金森疾病。
3、 一种治疗或者预防脑重大疾病的药物组合物，其特征在于该药物组合物含有治疗上有效量的莫诺苷和药学上可接受的辅料或载体。
4、 按照权利要求3的药物组合物，其特征在于所述脑重大疾病是指脑卒中、脑缺血/再灌注损伤、痴呆或帕金森疾病。
全文摘要
本发明公开了莫诺苷(morroniside)在制备治疗或者预防脑重大疾病药物中的用途。通过大量实验发现莫诺苷具有抗氧化、抗凋亡、增加神经营养作用、促进神经生长的药理作用，对脑卒中、脑缺血/再灌注损伤、痴呆、帕金森病等脑重大疾病具有显著的治疗或者预防作用。
文档编号A61P9/10GK101336927SQ20071011851
公开日2009年1月7日 申请日期2007年7月6日 优先权日2007年7月6日
发明者林 李, 文 王, 艾厚喜 申请人:首都医科大学宣武医院