专利名称：一种从小球藻藻粉中提取纯化叶黄素的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别是提供了一种从小球藻藻粉中提取纯化叶黄素的方 法，在采用小球藻生产重要生命活性物质叶黄素方面具有重要的应用价值和前景。
技术背景叶黄素属于一种不对称的二羟基类胡萝卜素，是人眼视网膜中黄斑色素的主要组成 成分。目前研究发现叶黄素主要有以下三个方面的医药价值1)防止老年人视黄斑退 化；2)具有抗癌作用；3)对心脑血管疾病有防治作用。另外，叶黄素作为高价值的纯 天然色素，可以广泛应用于食品着色、化^(品和医药等行业中。目前叶黄素的价格与黄 金价格基本相当，有食物黄金的美称，其国内市场年需求达10万吨，但生产量仅6千 吨，远远满足不了国内外市场的需要，因此具有广阔的市场潜力。目前，叶黄素的化学合成技术尚未取得成功，因此只能主要从万寿菊等植物中提取 提纯得到。叶黄素生产工艺是首先将万寿菊青贮、压搾、干燥制粒，然后采用正己烷提 取和蒸馏后获得。因为万寿菊生长缓慢，因此研究生长速度快和叶黄素含量高的其它生物物种来取代万寿菊作为生产叶黄素的生物资源已经成为一个非常重要的研究课题。我 们研究发现小球藻细胞中叶黄素含量基本与万寿菊中的叶黄素含量相当，特别是我们采 用异养发酵方法培养超高细胞浓度小球藻的技术已经成熟，可以快速培养出大量的小球 藻生物量。因此采用小球藻作为一种生产叶黄素的生物资源以替代万寿菊是完全可能 的。国内外学者在从万寿菊中提取叶黄素的优化控制方法方面进行了大量的研究，但在 从小球藻中如何高效提取并纯化叶黄素方面的研究报道却不多见。小球藻中的叶黄素经 过有机溶剂的萃取后，大部分是以酯类性形式存在的。由于叶黄素的水溶性非常差，叶 黄素酯类衍生物不能被人体直接吸收代谢，不能发挥药用价值，叶黄素酯在人体内酶的 作用下，水解为游离态叶黄素，继而被吸收参与代谢。该方面的转化研究集中于将叶黄 素酯置于碱性环境中，通过皂化反应得到游离态叶黄素。目前，主要的皂化方法有两种， 一种是冷皂化，即在提取的叶黄素酯中按照预定比例加入碱溶液，搅拌后反应过夜。另 一种是热皂化，与冷皂化不同的地方是对加入碱液后的混合溶液加热直至反应结束。常 用皂化剂为40%氢氧化钾甲醇溶液或饱和的氢氧化钠溶液。经皂化后，得到的皂化品中仍存在着部分酯溶性杂质，因此还要做进一步纯化处理。在成功筛选出能够异养生长小球藻种并通过优化培养控制获得超高细胞浓度小球藻 的基础上，我们在选择冷皂化、热皂化和最佳皂化条件从小球藻藻粉中提取纯化叶黄素方面进行了比较系统和全面的研究，发现采用热皂化利用20%的氢氧化钠水溶液可以从 藻粉中高效地将叶黄素酯转化为叶黄素，这为进一步采用小球藻生产叶黄素奠定了非常 重要的基础
发明内容
本发明的目的在于提供一种从小球藻藻粉中提取纯化叶黄素的方法，采用一种小分子量的极性有机溶剂乙醇和一种非极性试剂正己垸进行混合作为提取剂，20%氢氧化钠 溶液作为皂化剂，通过进一步纯化处理，可以高效地将小球藻藻粉中叶黄素酯类转化 为叶黄素,提取量达到3.2mg/g。实现了从小球藻细胞中高效地将叶黄素酯转化为叶黄素 的皂化工艺。为采用异养发酵培养小球藻生产叶黄素的产业化生产奠定基础。本发明先利用混合试剂进行叶黄素及其酯类的提取，然后用5 30%的氢氧化钠进 行皂化，经旋转蒸发，洗涤，结晶后获得较高纯度叶黄素晶体。从小球藻藻粉中提取叶黄 素工艺为称取0.2 2 g藻粉放入50 500 ml离心管中，加入8.0 80.0ml混合液 体溶剂进行提取，温度为10 4(TC，时间为0.5 2小时。皂化工艺为向加入混合提 取剂的试管中加入10 100 ml的5~30%氢氧化钠水溶液，30 7(TC皂化3 8小时， 低温离心5 10分钟，有机相中获得从藻粉中提取出的叶黄素。本发明所述的混合液体溶剂为极性溶剂乙醇，非极性溶剂正己烷；二者溶剂中的碳 原子和氧原子比值20: 1。1、不同皂化剂对小球藻藻粉中叶黄素酯转化的效果向50 500ml离心管中加 入0.2 2g藻粉，在加入混合提取剂提取后，分别向离心管中加入10 100ml的5 30%氧氧化钠溶液、氢氧化钠-水-乙醇溶液或氢氧化钠-水-甲醇溶液，30 7CTC皂化3~ 8小时，提取溶剂上清液直接在高压液相色谱上测定叶黄素浓度，以确定不同皂化剂对 藻粉中叶黄素酯转化的效果。研究结果显示，在测试的不同溶剂中，氢氧化钠溶液作为 皂化剂时上层有机相中的叶黄素浓度最高，皂化效果最好。2皂化剂浓度对小球藻藻粉中叶黄素酯转化的效果确定了皂化剂后，采用同样的 方法，分别测试5%、 10%、 20%、 30%、 40%的氢氧化钠溶液的皂化效果。综合实验 效果和成本，我们认为采用20%氢氧化钠溶液进行皂化比较合适。3皂化温度对小球藻藻粉中叶黄素酯转化的效果采用同样的方法，分别对25'C、5crc、 7crc、 8crc下叶黄素酯的转化效果进行了比较。随着温度升高有利于叶黄素脂的转化，但温度进一步升高会造成游离的叶黄素的分解，测试结果显示50 6(TC时叶黄素酯的转化效果最好，测定的上层有机相中叶黄素浓度最高。4皂化时间对小球藻藻粉中叶黄素酯转化的效果采用同样的方法分别测试2h、 4 h、 6h、 8h、 10h的皂化效果。因为时间短使叶黄素酯的皂化不彻底，而时间过长叶 黄素本身具有易被氧化和不稳定的特性使得其含量下降，结果发现6小时为最合适的皂化时间。工作原理皂化反应可以使叶黄素酯水解为游离的叶黄素，是因为酯在碱性条件下水解，生成 醇和一种脂肪酸盐。随着碱溶液氢氧化钠浓度的增高，叶黄素的量不断增加并在某一浓 度时叶黄素的量达到最高，但之后叶黄素的量开始下降下降。其原因是在一定浓度氢氧 化钠下，可以使叶黄素酯发生水解，脂肪酸甘油配基及游离脂肪酸被除去，有利于转化 为叶黄素。但碱的浓度过高会增加叶黄素的不稳定性，因为当脂肪酸配基被皂化后，叶 黄素失去保护而被强碱破坏，容易发生降解。对于温度，在一定范围内随着温度升高有利于叶黄素脂的转化，但温度进一步升高会造成游离的叶黄素的分解，因此5(rc为比较 适宜的皂化温度。时间短叶黄素皂化不彻底，时间长叶黄素量反而下降。这是因为在常温下叶黄素主要以反式结构存在，在受热、光照及化学作用下约有7%的叶黄素由反式结构转化为顺式结构，而起活性作用的主要是反式结构。如果在较高的温度下皂化时间 过长，会有较多的叶黄素由反式结构转化为顺式结构，从而影响叶黄素的质量，降低其 抗氧化活性和抗癌效果。 本发明的优点由于叶黄素在小球藻内大部分以酯的形式存在，通过皂化反应将大部分叶黄素酯转 化为游离地叶黄素，可以从小球藻细胞中更有效提取出叶黄素，确定了从小球藻细 胞中高效提取出叶黄素最佳皂化工艺，在采用小球藻生产叶黄素的产业化生产方 面具有重要的价值。
图1为本发明采用不同皂化溶剂时小球藻中叶黄素酯转化的效果。横坐标为皂化溶剂种类，纵坐标为皂化后上层有机相中的叶黄素浓度mg/L。图中显示，在测试的皂化 剂中，氢氧化钠溶液作为皂化剂时上层有机相中的叶黄素浓度最高，叶黄素酯的转化效 果最好。图2为本发明采用不同皂化剂浓度时小球藻叶黄素酯转化的效果。横坐标为皂化剂 浓度，纵坐标为皂化后上层有机相中的叶黄素浓度mg/L。图中显示，在测试的不同皂 化剂浓度时，氢氧化钠溶液浓度为20%时上层有机相中的叶黄素浓度最高，叶黄素酯的 转化效果最好。图3为本发明采用不同温度时小球藻中叶黄素酯转化的效果。横坐标为不同的温度， 纵坐标为化后上层有机相中的叶黄素浓度mg/L。图中显示，5CTC时叶黄素酯的转化效 果最好。图4本发明采用为不同皂化时间时。小球藻中叶黄素酯转化的效果。横坐标为不同 的皂化时间，纵坐标为化后上层有机相中的叶黄素浓度mg/L。图中显示叶黄素酯的转 化率在1h到6 h内呈上升趋势并在6 h达到最大，但6 h后随时间的延长叶黄素的量 逐渐下降，因此6h为最合适的皂化时间。
具体实施方式
1、小球藻藻粉实验材料本发明实验所用藻种为一株我们自己筛选的能够无光照异养生长的小球藻-USTB01 (C/7/0A"e//a sp)， cgmcc N。1448，保藏日期2005年8
月25日。经过2天的异养发酵培养的小球藻经喷雾干燥获得藻粉。2、从小球藻藻粉中提取叶黄素:在离心管中加入0.2g藻粉和混合提取试剂8 ml, 室温下静置1小时。3、叶黄素酯的转化向提取后的离心管中，加入20%的氢氧化钠，50'C进行皂 化6小时，结束后取上层有机相进行旋转蒸发，温度43'C，时间8分钟。用正己烷溶 解附于瓶壁上的叶黄素，放到-8'C冰箱结晶过夜，即得到纯度较高的叶黄素。4、提取剂中的叶黄素测定采用HPLC测定叶黄素的浓度，测定的条件是:高效液 相色谱(HPLC)仪(岛津LC-10ATvp泵，SPD-M10Avp 二极管阵列检测器)，Zorbax SB-C18 (4.6mmx25cm)分离柱，流动相是乙腈-甲醇-乙酸乙酯(45:10:45)，流速为1 mL.min-1，进样量20iJL，检测波长:474nm。实验中根据测定样品的峰高代入建立的叶 黄素峰高(y)与叶黄素浓度(x)的一元线性回归方程(y-4.0408x-0.8169， R2=0.9987)， 即可计算出叶黄素的浓度。5、采用小球藻生产叶黄素采用极性溶剂乙醇与非极性溶剂正己烷按照碳原子与 氧原子比为20: 1混合作为提取溶剂，20%氢氧化钠溶液作为皂化剂，5(TC皂化6小时， 皂化剂用量与藻粉的比为(v:w 10:1)可以高效地将小球藻藻粉中的叶黄素酯转化为叶 黄素，为采用小球藻生产叶黄素的产业化生产奠定了非常重要的基础，具有重要的应用 价值。
权利要求
1、一种从小球藻藻粉中提取纯化叶黄素的方法，其特征在于先利用混合试剂进行叶黄素及其酯类的提取，然后用5～20％的氢氧化钠进行皂化，经旋转蒸发，洗涤，结晶后获得较高纯度叶黄素晶体；从小球藻藻粉中提取叶黄素工艺为称取0.2～2g藻粉放入50～500ml离心管中，加入8.0～80.0ml混合液体溶剂进行提取，温度为10～40℃，时间为0.5～2小时；皂化工艺为向加入混合提取剂的试管中加入10～100ml的5～30％氢氧化钠水溶液，30～70℃皂化3～8小时，离心5～10分钟，有机相中获得从藻粉中提取出的叶黄素。
2、 按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的混合液体溶剂为 极性溶剂乙醇，非极性溶剂正己垸；二者溶剂中的碳原子和氧原子比值SO.-
全文摘要
一种从小球藻细胞中提取纯化叶黄素的方法，属于生物技术领域。先利用混合试剂进行叶黄素及其酯类的提取，然后用5～20％的氢氧化钠进行皂化，经旋转蒸发，洗涤，结晶后获得较高纯度叶黄素晶体；从小球藻藻粉中提取叶黄素工艺为称取0.2～2g藻粉放入50～500ml离心管中，加入8.0～80.0ml混合液体溶剂进行提取，温度为10～40℃，时间为0.5～2小时；皂化工艺为向加入混合提取剂的试管中加入10～100ml的5％～30％氢氧化钠水溶液，30～70℃皂化3～8小时，低温离心5～10分钟，有机相中获得从藻粉中提取出的叶黄素。优点在于，确定了从小球藻细胞中高效提取出叶黄素最佳皂化工艺。
文档编号A61K36/02GK101130513SQ200710120740
公开日2008年2月27日 申请日期2007年8月24日 优先权日2007年8月24日
发明者硕 刘, 宾 张, 张明忠, 许倩倩, 海 闫, 钢 陆 申请人:北京科技大学;北京科大方兴科技孵化器有限责任公司