专利名称：：一种人亲和素蛋白在制备抗肝癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因和医药领域，具体的说，本发明提供了一种亲和素蛋白的用途。
背景技术：
：亲和素蛋白(Cycl叩hilins，CyPs)是一类高度保守、普遍存在肽基——脯氨酰顺反异构酶活性(PPIase)的家族，它与FK560结合蛋白和parvulins共同组成了亲免素超家族(Biotechnologia(InPolish)3,135-152;ActaPharm.45，413-420;#0丄Zi/eSc丄55，423-436)。尽管这三种蛋白质在序列上互不关联，在结构上也不相同，但他们都具有PPIase活性，都可以催化单肽或蛋白质中脯氨酸酰亚胺肽键的顺反异构化，从而加速细胞周期蛋白质合成过程中蛋白质的折叠。已有报道，一种人的CyP蛋白可结合HIV-1中的一种蛋白质，具有潜在的引起HIV感染的作用。CyPs广泛分布于从微生物到乳动物的各类物种中。Cycl叩hilinA(CyPA)是首先从牛的胸腺细胞中发现的CyP家族中第一个成员，并验证它具有PPIase活性(Scie"ce,226，544-547;7fe"/re337，473-478)。重组人T细胞的cyclophilinA(hCyPA)的三维结构及它与CsA、四肽及一些二肽形成的复合物的三维结构已有报道(尸roc.yVaf.^cad5"c丄〃.5".A88，9483-9487;/.飾丄5io丄228，539—550;/.vl/o丄234,1119—1130.;7Vat〃re，353,276—279;Wat丄^cad5"c丄〃.A88,3324—3328;^z'oc/e历j'sz^r,35，7362-7368)。CyPA与HIV相关蛋白质的复合物的结构也已报道(CW人87，1285-1294;5Yr"cti/re5，139-146)。CyP家族的其他成员与CyPA具有序列同源性及三维结构类似的特性(尸roc.船t丄Jcac/.Sci.〃.5".A90，11850-11854;尸roc.船t丄^cad5b丄"5".A91，5183—5186;/.Az'o丄331,45—56)。CyPJ是CyP家族的新成员，CYP-JcDNA长1.25Kb，编码161个氨基酸，已从人的胎脑cDNA文库中分离并鉴定(Ge/7et.92,231-236)。在氨基酸序列上与线虫(C.e7ega/7s.)10具有72%的同源性。其具体核苷酸和氨基酸序列详见NCBI网站上基因登陆号为AF146799的基因报告。
发明内容本发明要解决的问题是人亲和素蛋白在制备抗肝癌药物中的应用。本发明提供了亲和素蛋白CYPJ(NCBI网站上基因登陆号为AF146799)的一种应用，即其在制备抗肝癌药物中的应用。本发明中，所述的药物可以是片剂或者针剂。研究表明，转染有本发明的CYPJ基因的细胞与空白对照相比，能促进细胞的克隆形成率；转染后的293T、C0S7和Hela细胞都可以引起GO-Gl期细胞减少，S期细胞增多，G2/M期无明显变化，尽管程度有差别，但是趋势是一致的。S期是细胞物质合成周期，S期增多，说明CYPJ可以促进细胞物质的复制增殖。从而认为本发明的CYPJ蛋白有促进细胞增长的作用。表达有CYPJ蛋白的细胞及其对照注射在裸鼠的左右腋下，裸鼠的皮下移植瘤成功率为100%，潜伏期为14天，瘤体表面光滑或者呈结节状，直径大于2cm时有溃破和干涸。60天后比较左右两侧肿瘤的重量，结果注射有表达CYPJ蛋白的细胞的一侧的肿瘤明显大于对照，统计结果有显著性差异。用不同的单克隆重复三次，结果都有显著性差异，因而认为该基因有促进肿瘤细胞生长的功能。肝癌病理样本分析表明，CYPJ蛋白在癌旁组织中表达要普遍低于在肝癌组织中的表达量，而且表达量的差异与肝癌的分级有密切关系。因此，本发明的CYPJ可以作为靶标，筛选抗肝癌物质。能够抑制cypj的活性或者表达量，既可以用于制备抗肝癌药物。本发明的CYPJ可以作为靶标，筛选抑制CYPJ活力的物质或者方法。筛选方法包括以下步骤A选择候选化合物；B提供检测CYPJ表达或者活性的体系；C用CYPJ的检测体系选择候选化合物；D确定CYPJ表达量或者活性在候选化合物的影响下的改变。作为靶标的除了CYPJ蛋白，还可以是CYPJ基因、CYPJ的mRNA、CYPJ的表达产物及其前述三者的特异性片断。所述"特异性片断"是指可以区别本发明的CYPJ与其它基因的片断。利用本发明的CYPJ，通过各种常规筛选方法，可筛选出与其发生相互作用的物质，如受体、抑制剂或拮抗剂等。这些与CYPJ发生相互作用或者抑制其活性的物质可以是核酸、氨基酸、化合物等。本发明的CYPJ，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。以本发明的人CYPJ蛋白为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的人CYPJ可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的CYPJ还可与其他治疗剂一起使用。当本发明的人CYPJ蛋白被用作药物时，可将治疗有效剂量的该蛋白施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约l毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。本发明中，所述的促细胞增长药物是由含有效治疗量的CYPJ蛋白和药学上的载体或者赋形剂组成的药物组合物。本发明的CYPJ蛋白抑制剂可以制成试剂盒，用于抑制或者减缓肝癌病情的发展，或者与其它药物联用，减低药物用量或者改善使用效果。本发明的CYPJ蛋白能促进细胞的克隆形成率，可以促进细胞物质的复制增殖，并且能促进肿瘤细胞生长，因此，可以作为筛选抗肿瘤药剂的靶标。将CYPJ的抗体或者抑制剂与适当的药学载体联用，可以制成抗肝癌药物，用于抑制或者减缓肿瘤病情的发展，降低患者的痛苦。具体实施例方式实施例一对克隆形成率的影响预先做L02细胞对G418的细胞药敏实验，按梯度浓度获得半数致死量约为600M/ml。按5X104的密度接种细胞于60mm细胞培养皿，按照上述操作转染带有Neor选择标记的pcDNA3.IB-CYPJ和pcDNA3.1，48-72小时后消化细胞，移入60cm皿，次日加入G418，连续培养15-20天时间，中间酌情换液。G418筛选培养15-20天时间之后，去掉培养基，用室温1XPBS洗一次，力n2ml预冷的甲醇4'C固定10min.弃去固定用的甲醇，用预冷的1XPBS洗一次，加GIMESA染色剂，室温染色10min，清水洗3遍，去浮色，拍照、计数。用构建好的pcDNA3.1-CYPJ重组子与pcDNA3.1空载体转染L02细胞株。经过20天G418筛选之后，根据细胞数目确定克隆大小，大于200个细胞的称为大克隆，100-200个细胞之间的称为中克隆，50-100个细胞之间的称为小克隆。比较大中克隆之间的差异，重复2次每次三皿取平均值，转染pcDNA3.l-CYPJ重组子后L02所形成的克隆数显著大于转染pcDNA3.1空载体后所形成的克隆数。t检验结果示差异有显著性P〈0.01。这些结果提示，CYPJ能促进细胞克隆形成。表l宿主细胞L02经G418稳定筛选后的大中克隆数<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例二稳定表达株的裸鼠致瘤实验BALB/C-nn/nu裸鼠在无特定病原体(SPF)条件下饲养，4周-6周的裸鼠9只，对数生长期的上述单克隆细胞株L02-CYPJ-pcDNA3.1和L02-pcDNA3.l细胞分别取3X10e悬浮于PBS200ul中，用6号针头的注射器分别注射在裸鼠的左右腋下。裸鼠的皮下移植瘤成功率为100%，潜伏期为14天，瘤体表面光滑或者呈结节状，直径大于2cm时有溃破和干涸。60天后比较左右两侧肿瘤的重量，结果L02-CYPJ-pcDNA3.1—侧的肿瘤明显大于L02-pcDNA3.1，统计结果有显著性差异。用不同的单克隆重复三次，结果都有显著性差异，认为该基因有促进L02等肿瘤细胞生长的功能。实施例三在肝癌组织中的表达结果以e-MG作为cDNA上样量参照，先用P-MG和CYPJ引物进行PCR扩增，确定最佳循环数，取30个循环作为最佳循环数。然后用e-MG引物将40对肝癌及癌旁组织总RNA反转录cDNA模板调至相对一致，用CYPJ引物对调整好的模板进行PCR扩增。将作为参照的e-MGPCR产物与CYPJPCR产物混合上样电泳，经凝胶成像拍摄得到电泳结果。结果显示，肝癌组织大多比癌旁组织上调表达。对上述电泳结果条带做扫描定量分析。每一个病理样品得到4个扫描值，即C7尸/的肝癌及癌旁扫描值，P-MG的肝癌及癌旁扫描值。最后我们按照(C7尸/肝癌/e-MG肝癌)/(07y癌旁/e-MG癌旁)的计算公式得到一个反映CT/y基因表达情况的DR值。我们规定DR值大于l.5表示该基因上调表达，DR值小于O.75表示下调表达，0.75〈DR〈1.5表示表达无显著变化。结果显示，26/40肝癌组织中比癌旁组织上调表达。经过进一步统计分析表明，CYPJ的表达与肝癌分级(Edmondson，s分级)有显著相关，P〈0.01。权利要求1.一种亲和素蛋白CYPJ在制备抗肝癌药物中的应用。2.如权利要求l所述的应用，其特征在于，该药物是片剂或者针剂。全文摘要本发明涉及基因和医药领域，具体的说，本发明提供了一种亲和素蛋白的用途。亲和素蛋白(Cyclophilins，CyPs)是一类高度保守、普遍存在肽基——脯氨酰顺反异构酶活性(PPIase)的家族，CYP-JcDNA长1.25Kb，编码161个氨基酸，已从人的胎脑cDNA文库中分离并鉴定(Cytogenet.CellGenet.92，231-236)。本发明提供了CYPJ在制备抗肝癌药物中的应用。本发明的CYPJ蛋白能促进肿瘤细胞生长，可以作为筛选抗肿瘤药剂的靶标，用于抑制或者减缓肿瘤病情的发展，降低患者的痛苦。文档编号A61K38/17GK101181627SQ20071017080公开日2008年5月21日申请日期2007年11月22日优先权日2007年11月22日发明者龙余,张明君,帅陈申请人:复旦大学