专利名称：：一种人亲和素蛋白在制备抗癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因和医药领域，具体的说，本发明提供了一种亲和素蛋白的用途。
背景技术：
：亲和素蛋白(Cycl叩hilins，CyPs)是一类高度保守、普遍存在肽基一一脯氨酰顺反异构酶活性(PPIase)的家族，它与FK560结合蛋白和parvulins共同组成了亲免素超家族(Biotechnologia(InPolish)3，135-152;ActaPharm.45,413-420;Ce".ifo丄"/eSc丄55，423-436)。尽管这三种蛋白质在序列上互不关联，在结构上也不相同，但他们都具有PPIase活性，都可以催化单肽或蛋白质中脯氨酸酰亚胺肽键的顺反异构化，从而加速细胞周期蛋白质合成过程中蛋白质的折叠。已有报道，一种人的CyP蛋白可结合HIV-1中的一种蛋白质，具有潜在的引起HIV感染的作用。CyPs广泛分布于从微生物到乳动物的各类物种中。CyclophilinA(CyPA)是首先从牛的胸腺细胞中发现的CyP家族中第一个成员，并验证它具有PPIase活性(5^'e/7ce，226,544-547;〃at"re337，473-478)。重组人T细胞的cycl叩hilinA(hCyPA)的三维结构及它与CsA、四肽及一些二肽形成的复合物的三维结构已有报道(尸roc./lead5W.〃5".A88，9483-9487;/#。丄228,539—550;/.5io人234，1119—1130.;yfe^/re,353，276-279;尸潔.淑丄Sci."5".A88,3324-3328;肠c力柳i",乂35'7362-7368)。CyPA与HIV相关蛋白质的复合物的结构也已报道(Ce^7，87,1285-1294;Sfr"""re5，139-146)。CyP家族的其他成员与CyPA具有序列同源性及三维结构类似的特性(尸roc.淑丄JcadSci."".90，11850-11854;尸roc.yVat丄Jcad5"c丄〃.5".91，5183—5186;/#0丄Wo丄331,45—56)。CyPJ是CyP家族的新成员，CYP-JcDNA长1.25Kb，编码161个氨基酸，已从人的胎脑cDNA文库中分离并鉴定(Cytoge/et.Ge/et.92，231-236)。在氨基酸序列上与线虫(C.e&卵/7s.)10具有72%的同源性。其具体核苷酸和氨基酸序列详见NCBI网站上基因登陆号为AF146799的基因报告。
发明内容本发明要解决的问题是人亲和素蛋白在制备抗癌药物中的应用。本发明提供了亲和素蛋白CYPJ(NCBI网站上基因登陆号为AF146799)的一种应用，即其在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明还提供了CYPJ蛋白在制备促进细胞生长药物中的应用。本发明中，所述的药物可以是片剂或者针剂。研究表明，转染有本发明的CYPJ基因的细胞与空白对照相比，能促进细胞的克隆形成率；转染后的293T、C0S7和Hela细胞都可以引起GO-Gl期细胞减少，S期细胞增多，G2/M期无明显变化，尽管程度有差别，但是趋势是一致的。S期是细胞物质合成周期，S期增多，说明CYPJ可以促进细胞物质的复制增殖。从而认为本发明的CYPJ蛋白有促进细胞增长的作用。CYPJ蛋白可以用于制备促进细胞生长药物，所述促进细胞生长药物可以是促进伤口愈合药物，等。本发明的CYPJ，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。以本发明的人CYPJ蛋白为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的人CYPJ可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的CYPJ还可与其他治疗剂一起使用。当本发明的人CYPJ蛋白被用作药物时，可将治疗有效剂量的该蛋白施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约l毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。本发明中，所述的促细胞增长药物是由含有效治疗量的CYPJ蛋白和药学上的载体或者赋形剂组成的药物组合物。表达有CYPJ蛋白的细胞及其对照注射在裸鼠的左右腋下，裸鼠的皮下移植瘤成功率为100%，潜伏期为14天，瘤体表面光滑或者呈结节状，直径大于2cm时有溃破和干涸。60天后比较左右两侧肿瘤的重量，结果注射有表达CYPJ蛋白的细胞的一侧的肿瘤明显大于对照，统计结果有显著性差异。用不同的单克隆重复三次，结果都有显著性差异，因而认为该基因有促进肿瘤细胞生长的功能。因此，本发明的CYPJ可以作为靶标，筛选抗肝癌物质。能够抑制cypj的活性或者表达量，既可以用于制备抗肝癌药物。本发明的CYPJ可以作为靶标，筛选抑制CYPJ活力的物质或者方法。筛选方法包括以下步骤A选择候选化合物；B提供检测CYPJ表达或者活性的体系；C用CYPJ的检测体系选择候选化合物；D确定CYPJ表达量或者活性在候选化合物的影响下的改变。作为靶标的除了CYPJ蛋白，还可以是CYPJ基因、CYPJ的mRNA、CYPJ的表达产物及其前述三者的特异性片断。所述"特异性片断"是指可以区别本发明的CYPJ与其它基因的片断。利用本发明的CYPJ，通过各种常规筛选方法，可筛选出与其发生相互作用的物质，如受体、抑制剂或拮抗剂等。这些与CYPJ发生相互作用或者抑制其活性的物质可以是核酸、氨基酸、化合物等。本发明的CYPJ蛋白抑制剂可以制成试剂盒，用于抑制或者减缓肿瘤病情的发展，或者与其它药物联用，减低药物用量或者改善使用效果。本发明的CYPJ蛋白能促进细胞的克隆形成率，可以促进细胞物质的复制增殖，并且能促进肿瘤细胞生长，因此，可以作为筛选抗肿瘤药剂的靶标。将CYPJ的抗体或者抑制剂与适当的药学载体联用，可以制成抗肿瘤药物，用于抑制或者减缓肿瘤病情的发展，降低患者的痛苦。具体实施例方式实施例一对克隆形成率的影响预先做L02细胞对G418的细胞药敏实验，按梯度浓度获得半数致死量约为600Pg/ml。按5X104的密度接种细胞于60mra细胞培养皿，按照上述操作转染带有Neor选择标记的pcDNA3.1B-CYPJ禾BpcDNA3.1，48-72小时后消化细胞，移入60cm皿，次日加入G418，连续培养15-20天时间，中间酌情换液。G418筛选培养15-20天时间之后，去掉培养基，用室温1XPBS洗一次，力口2ml预冷的甲醇4。C固定10min.弃去固定用的甲醇，用预冷的1XPBS洗一次，力BGIMESA染色剂，室温染色10min，清水洗3遍，去浮色，拍照、计数。用构建好的pcDNA3.1-CYPJ重组子与pcDNA3.1空载体转染L02细胞株。经过20天G418筛选之后，根据细胞数目确定克隆大小，大于200个细胞的称为大克隆，100-200个细胞之间的称为中克隆，50-100个细胞之间的称为小克隆。比较大中克隆之间的差异，重复2次每次三皿取平均值，转染pcDNA3.l-CYPJ重组子后L02所形成的克隆数显著大于转染pcDNA3.1空载体后所形成的克隆数。t检验结果示差异有显著性P〈0.01。这些结果提示，CYPJ能促进细胞克隆形成。L()2平板.pcDNA3,1pd:)NA3,l-CYPJ134土259±429±353土232吐i敲l435±468±3■5■27士2632土3^^^^表l宿主细胞L02经G418稳定筛选后的大中克隆数实施例二对细胞周期的影响取构建的CYPJ-CMV质粒和空载体CMV分别转染293T、C0S7和Hela细胞，步骤具体如下2.L取3X105细胞接种于60mm细胞培养皿。2.2分别共转阳性质粒PBB14-GFP和pcmv空载体、CYPJ-CMV质粒。目标质粒用量为3ug/皿，阳性共转质粒为PBB14-GFP用量为0.3ug/皿。37°CC02培养箱培养24hr。2.3将细胞培养液和细胞一起收集到细胞离心管中，1000rpm离心10min，弃上清。2.4细胞用2ml预冷的1XPBS洗l次，1000rpm离心IOmin，弃上清。2.5用70舒贞冷的乙醇4。C固定2hr或者更长(过夜也可以)。2.61000rpm离心IOmin，小心吸掉上清。2.7用500-1000ulPI染液重悬，室温暗处染色20min，过滤膜后用流式细胞仪检测细胞周期变化情况。_GOGl期(l)S顯tfO(a-M期ft)CMV('YPJCMVCYPj(:MVCYI^J旦74,7644.7622.6252.172.6:3l(坊4,W一22.848.712.562.42372,4824.051.553.44平均值40723-1650.812.872.42标准差i.041.670.641..500.53结果显示，转染后的293T、C0S7和Hela细胞都可以引起GO-Gl期细胞减少，S期细胞增多，G2/M期无明显变化。表2CYPJ对Hela细胞周期的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表3CYPJ对293T细胞周期的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表4CYPJ对C0S7细胞周期的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由上述三张表可见，CYPJ对细胞周期影响的趋势是一致的，程度有差别。对测得的转染CYPJ对Hela细胞的周期影响进行统计分析，用t-检验方法，结果显示G0-G1期和S期转染CYPJ与空载体pCMV相比两者有显著差异，p〈0.01，而在G2-M期无显著差异，p>0.05。用相同的方法分析转染CYPJ对293T和C0S7细胞的影响，结果与上相似，说明转染CYPJ基因可以引起293T，Hela禾PC0S7细胞G0-G1期减少，S期增多，而对G2-M期影响较小。S期是细胞物质合成周期，S期增多，说明CYPJ可以促进细胞物质的复制增殖。实施例三稳定表达株的裸鼠致瘤实验BALB/C-mi/nu裸鼠在无特定病原体(SPF)条件下饲养，4周-6周的裸鼠9只，对数生长期的上述单克隆细胞株L02-CYPJ-pcDNA3.1和L02-pcDNA3.l细胞分别取3X1()6悬浮于PBS200ul中，用6号针头的注射器分别注射在裸鼠的左右腋下。裸鼠的皮下移植瘤成功率为100%，潜伏期为14天，瘤体表面光滑或者呈结节状，直径大于2cm时有溃破和干涸。60天后比较左右两侧肿瘤的重量，结果L02-CYPJ-pcDNA3.1—侧的肿瘤明显大于L02-pcDNA3.1，统计结果有显著性差异。用不同的单克隆重复三次，结果都有显著性差异，认为该基因有促进L02等肿瘤细胞生长的功能。权利要求1.一种亲和素蛋白CYPJ在制备抗肿瘤药物中的应用。2.亲和素蛋白CYPJ在制备促细胞生长药物中的应用。3.如权利要求2或者1所述的应用，其特征在于，该药物是片剂或者针剂。全文摘要本发明涉及基因和医药领域，具体的说，本发明提供了一种亲和素蛋白的用途。亲和素蛋白(Cyclophilins，CyPs)是一类高度保守、普遍存在肽基——脯氨酰顺反异构酶活性(PPIase)的家族。CYP-JcDNA长1.25Kb，编码161个氨基酸，已从人的胎脑cDNA文库中分离并鉴定。本发明提供了亲和素蛋白CYPJ在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明的CYPJ蛋白能促进细胞的克隆形成率，可以促进细胞物质的复制增殖，并且能促进肿瘤细胞生长，因此，可以作为筛选抗肿瘤药剂的靶标。文档编号A61K38/17GK101181628SQ20071017080公开日2008年5月21日申请日期2007年11月22日优先权日2007年11月22日发明者龙余,张明君,剑陈申请人:复旦大学