心脏保护化合物的制作方法

专利名称：：心脏保护化合物的制作方法心脏保护化合物本发明涉及肽和基于肽的化合物，其用作为组织保护化合物，例如心脏保护化合物。曱硫氨酸-脑啡肽和亮氨酸-脑啡肽是五肽，分别具有结构Tyr-Gly-Gly誦Phe國Met和Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu(HughesJ,SmithTW,KosterlitzHW,FothergillLA,MorganBA,MorrisHR(1975)Nature,Lond.258,577-579)。许多对这些及其类似化合物已经进行的研究集中于止痛活性。相比之下，对于用脑啡肽类似物的细胞保护或的组织保护只有相对很少的研究。类似物[D-Ala2,MePhe4Met(0)5-醇]-脑啡肽已经显示出抗胃损害的保护作用(Ferri,S.,Speroni，E.，Candeletti,S.,Cavicchini，E,Romualdi,P.，Govoni,P-,&Marchini,M.(1988).Pha画cology36,140-144;Ferri，S.,Arrigo-Reina,R.,Candeletti,S.,Costa，S.，Murari,G.,Speroni,E.,&Scoto，G(1983)，Pha誦colResCommun15,409-418)。Dalargin[D-Ala2,Leu5,Arg6]也已经显示出抗胃损害的保护作用(TimoshinSS，ShvetsSI，RadivozMI，AleksandrovichAG,Mel'nikEI,BiullEkspBiolMed.1991Aug;112(8):130-2)。-脑啡肽(DADLE)已经显示出在器官移植之前延长多-器官存活时间和组织保存方面是有效的(Chien,S.，Oeltgen,P.R.,Diana，J.N.,Shi,X.,Nilekani，S.P.,&Salley,R.(1991)JThoracCardiovascSurg102,224-234;Chien,S.,Oeltgen,P.R.，Diana,l.N.,&Salley,R.K.(1994)JThoracCardiovascSurg107，964-967;Oeltgen,P.R.,Horton,N.D.,Boiling,S.F.，&Su,T.P.(1996)AnnThomeSurg61，1488-1492)。已经研究了S-阿片样物质(opioid)受体活化的作用。已经发现[D-Pen(2,5)]脑啡肽(DPDPE);5啡肽-D,—种新S(2)-阿片样物质促效剂预处理降低了梗塞尺寸，然而[D-Ala(2),D-Leu(5)]脑啡肽(DADLE)没有效果(AmJPhysiolHeartCircPhysiol.2002Jun;282(6):H1953-60)。Takasaki等已经证明了两种天然脑啡肽产生了保护，然而，(3-内啡肽没有所述效果[TakasakiY.,WolffR.A.,ChienG.L.,VanWinkleD.M.,1999,Am.J.Physiol,277,H2442-50](在分离的兔肌细胞中的研究)。市场上有许多止痛药，使得可以选择适当的一种用于特定情况。对比之下，可论证地存在对于有效的组织保护化合物(如心脏保护化合物)的更大需求。例如，心肌梗塞的治疗仍然是医学重点。我们现在发现了显示出有用的组织保护作用的新化合物。从第一方面，本发明提供了包含四肽结构A-B-C-D的化合物，或其药学上可接受的盐。本文所指的四肽结构A-B-C-D根据惯例从其N-末端到其C-末端进行定义。该化合物的N-末端，其为氨基酸残基A,可以是未4皮取代的，即可以是自由的NH2基团。或者该NH2基团的每个氬任选地可独立地被C!-5烷基或C!-5酰基取代，其中Cw表示可以是直链的或支链的1-5个碳原子的碳链，例如曱基，乙基，正-丙基，异-丙基，正-丁基，异-丁基，叔-丁基，正-戊基及其异构体。A是D或L-构型芳族氨基酸残基，优选地为L-构型。在本发明的一些方面，该部分的芳族环可包含一个或多个硝基。然而，所述硝基不是强制的并且在该位置没有硝基时已经获得了有效的结果。A的一些适当的氨基酸包括Tyr,Thyronine,Phe或Trp。在本发明的一些方面，芳族环包括羟基取代基，优选地在p-位置。A优选地是Tyr。B是D-或L-构型二氨基酸残基，其中侧链氨基基团用d-5酰基，Cw烷基，-8'-(:1-5酰基或-8，^1_5烷基取代，其中B，是任选地可用一个或多个硝基取代的氨基酸残基。然而，所述硝基不是强制的并且在该位置没有硝基已经获得了有效的结果。相应地，优选地B，不用任何硝基取代。B优选地为D-构型。由于B是二氨基酸残基，利用一种氨基酸基团形成与A部分的肽键并且另一氨基酸在侧链上并且如本文所述衍生化。适当的二氨基酸残基包括Dap,Dab，Orn,Lys,4,5-脱氢-赖氨酸或2,6-二氨基-4-己炔酸，优选地Dab,Orn或Lys,更优选地Orn。在本发明的其他方面，B可以是Lys。在本发明的其他方面，B可以是Dab。B的侧链氨基基团用d.5酰基基团或d-s烷基基团取代，产生在此5点上的酰胺连接或仲胺。这有利地影响了化合物的活性。用d.5酰基基团的取代是优选的。据信这通过改变电荷和极性促进了有效性。D-或L-构型(优选地L-构型)氨基酸残基B'可存在于B和C]-5酰基基团或Cw烷基基团之间，在这种情况下，B的侧链氨基基团与B，的羰基基团形成肽键，并且B，的氨基基团用C^烷基基团或(优选地)d-5酰基基团取代。优选地d-5酰基基团是乙酰基。优选地B，，如果存在，为Gly,Ala,Pro,Leu,Asn或Met,更优选地Gly或Asn。C是Gly,其中肽N-H任选地可(然而优选地不)被改变为N-甲基。换句话说，主链可被修饰使得Gly的氮原子可被曱基化。D是D-或L-Phe,优选地L-Phe,其在芳族环上用至少一个硝基取代。这种硝基增强了化合物的活性。还可有多至四种在芳族环上的其他进一步的取代，独立地选自硝基，氟代，氯代，溴代，碘代，三氟曱基或氰基。然而仅一个硝基的取代是关键的。硝基取代优选地在对位。肽N-H任选地可(但是优选地不)被被改变为N-甲基。换句话说，主链可被修饰使得Phe的氮原子可被曱基化。残基D的C-末端可采取自由酸-COOH或替代地-CONH2，-CONHd-5烷基，-CONH-NH2，-CONH-NHCw烷基，COO-d.5烷基，或-CH20H的形式。在一些实施方式中，残基D的C-末端不采取自由酸-COOH或-CH20H的形式，而是选自CONH2,-CONHd.5烷基，-CONH-NH2,-CONH-NHCw烷基，或COO-d.5烷基。优选地它是-CONH2。与其他部分结合，这产生了具有在体外和体内生物学测试中高活性的化合物。从进一步的方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的化合物，以及用作药物的化合物。从进一步方面，本发明提供了这些化合物用于制备用于组织保护治疗或心脏保护治疗的药物的用途。本发明的化合物保护组织，例如经历缺血的心脏肌肉。我们还观察到明显的抗缺氧作用和显著的止痛活性。这三种作用的组合在包括心脏学和加强监护的几种医学领域是特别有利的。缺血综合征和循环性缺氧(circulatoryhypoxia)的控制在几种病症中是重要的。因此，在进一步的方面，本发明的化合物另外地或可替代地用于抗缺氧和/或止痛治疗中。在一些方面，本发明涉及肽和基于肽的化合物，其用作用于心肌缺血(例如缺血性胸痛和心肌梗塞)的抗缺血药物或为了改善特定脑机能障碍，例如缺血性脑损害(中风等)的效果的抗缺血药物。我们的新化合物的抗缺氧特性提高了对依赖氧气的病理状态，例如肺，肝，眼的机能障碍，和分娩，中风，流血和身体超负荷的病理学，的稳定性。新物质的止痛作用可用于緩解与例如心肌梗塞相关的疼痛。在一些方面，新化合物显示出显著有用的心脏保护，抗缺氧和止痛作用。显著的止痛作用可用于緩解与心肌梗塞相关的疼痛。放到一起，组合的作用先前是未知的，但却是高度理想的。根据本发明优选地的化合物是Tyr-D-Orn(Ac)-Gly-Phe(p-N02)-NH2(1)N02根据本发明的四种化合物(在通式A-B-C-D中修饰位置B)Tyr-D-Lys(Ac)-Gly-Phe(p-N02)-NH2(2)Tyr-D-Orn(Ac-Asn)-Gly-Phe(p-N02)-NH2(3)Tyr-D-Dab(Ac)-Gly-Phe(p-N02)-NH2(4)Tyr-D-Orn(Ac-Gly)-Gly-Phe(p-N02)-NH2(5)曰疋:附图简述图1.图解了用于研究肽(l,2,3,4,5)在心肌梗塞大鼠模型中的效果的实验方案。肽在闭塞(occlusion)之前5分钟给药。梗塞尺寸(infarctsize)在120分钟再灌注期之后分析。图2.当在25分钟闭塞和120分钟再灌注期之前5分钟向雄性Sprague-Dawley大鼠i.v.给药时，肽(4)降低了梗塞尺寸(其表示为危险区域的百分比(IS/AAR))。图3.当在除去25分钟左冠状动脉闭塞之后立即i.v.给药雄性Sprague-Dawley大鼠时，肽(4)与对照相比降低了梗塞尺寸(其表示为危险区域的百分比(IS/AAR))。图4.脑啡肽类似物(1-5)在静脉内给药小鼠中的止痛活性("热板"法)。图5.跳《夭潜伏期作用的效力(potencyoftheeffectofjumplatencytime),表示为在从"5分钟"的点直到"90分钟"的点的曲线之下的区域。图6.在给药肽(A)和吗啡(B)之后15分钟点的跳跃潜伏期的剂量-响应图表。实施例缩写词符号和缩写词是才艮据IUPAC-IUBJointCommissiononBiochemicalNomenclature(S/oc/zem.J.(1984),219，345-374)的建议。任选地所有活性的氨基酸具有L-构型除非另外声明。使用的缩写词DCC,二环己基碳二亚胺；DCU,二环己脲；DMF,二曱基甲酰胺；HOBt,l-羟基苯并三唑；OPcp,五氯代苯；OPfp,五氟代苯；p-N02,对-硝基；RP-HPLC,反相高效液相色镨；DIEA，二异丙基乙胺；TFA,三氟乙酸；DCM,二氯曱烷；MeOH,曱醇；MeCN,乙腈；"BuOH正-丁醇，,'PrOH,异丙醇；NH4OBt,l-羟基苯并三唑铵盐；DPPA,叠氮石舞酸二苯酯(diphenylphosphorylazide);i.cist,脑池内；i.v.,请争月7jc内；i.p.,腹月莫内；OR，阿片类物质受体；GPI,豚鼠回肠；MVD,小鼠输精管；Phe(/7-N02)，4-硝基-L-苯丙氨酸；Dab，a,"二氨基丁酸；Orn,鸟氨酸；Boc，叔-丁氧基-羰基；Z,千氧基羰基；MBHA树脂，4-曱基二苯甲基胺树脂；Ac,乙酰基；AcOH,乙酸。化学8类似物(2，3,4,5)通过利用BOC/Bzl-化学禾:N,N':」异丙基碳二亚胺作为偶联剂的固相方法合成。实验方案实施例1脑啡肽类似物(l)的合成脑啡肽类似物(l)的合成利用活性酯和叠氮偶联方法而进行。所有氨基酸具有L-构型，除了D-鸟氨酸。氨基酸衍生物获自Reanal(匈牙利)。在40。C下在真空中进行蒸发。利用数字熔点分析器"Fisher",型号355确定熔点(未校正的)。！H-NMR光谱在BrukerWM-360光语仪上进行记录。合成的化合物的纯度使用SilufolUV254(捷克斯洛伐克)或获自Merck(德国)的Silicagel60F254通过TLC在以下系统中进行证实A,CHCl3-EtOH-AcOH(85:10:5);B,nBuOH-吡咬-AcOH誦H2O(15:10:3:6);C,nBuOH-AcOH-H20(4:l:l);D,CHCl3-MeOH-AcOH-H2O(30:20:4:6);E,(60:18:2:3)。在肽在密封的安瓿中水解(在110。C，24小时)之后在BiocalBC-200氨基酸分析器上进行氨基酸分析。保护的肽在色谱柱"Merck";型号C(440-37)上纯化。利用下列溶剂系统进行评价CHCl3-EtOH-乙酸乙酯-AcOH-H20,185:5:8:2:0.25(chl);85:5:8:2:0.25(ch11)。用于分析目的的HPLC在Dupontmodel8800HPLC系统上利用填充了反相吸附剂SilasorbC18(Lachema)的柱(4.6x110mm)而进行。旋光度用带有10-cm水加套池(waterjacketedcell)的Perkin-Elmer141旋光仪在溶剂中和在下述浓度时进行测定。紐-G(y-尸/z咖M^向将4.2g(20mmol)的L-Phe(p-N02)溶解于20ml的INNaOH溶液中，添加1.68g的NaHC03,25mlDMF,和在搅拌下和冷却到5。C时，加入溶解于10mlDMF中的8.47g(20mmol)的Boc-Gly-OPcp。在搅拌几小时之后，当反应结束时(色谱控制)，混合物用乙酸乙酯和水稀释并且用5%KHS04溶液酸化到pH3。将乙酸乙酯层分离并另外用两部分乙酸乙酯提9取水相。将三种有机相合并，用水，NaCl的饱和水溶液洗涤，并且最后在无水Na2S04上干燥。溶剂蒸发之后，利用添加少量的石油醚从乙酸乙酯中重结晶晶体沉淀。得到4.67g(63%)的二肽(6),熔点(m.p.)167-168。C,[a]D24+46.9。(cl，EtOH)，Rf0.79(A);0.77(B);0'83(E)。紐匿G-尸A咖M^-,("7」将1.52g(10mmol)的NH4OBt和2.06g(10mmol)的DCC添加到溶解于20ml的DMF的3.67g(10mmol)的化合物(6)中。反应混合物留置过夜。DCU被过滤并且在蒸发溶剂之后将残留物溶解于氯仿中。有机相用5%KHS04溶液、水、5。/。NaHC03溶液、水、NaCl饱和水溶液洗涤并且最后在无水Na2S〇4上干燥。蒸发溶剂后，使产物从具有少量的乙酸乙酯的纯乙醇中结晶。得到2.72g(74%)的保护的二肽酰胺(7),熔点169-171。C,[a]D22-9.2。(cl，DMF),Rf0.84(A);0.88(B);0.66(E)。将2.66g(10mmol)的D-Orn(Z)溶于10ml的lNNaOH，添加0.84g的NaHC03,25ml的DMF,和在搅拌下和冷却到-5。C时，加入溶解于15mlDMF的5.47g(10mmol)的Boc-Tyr(Boc)-OPfp。反应进行几小时并且留置过夜。反应结束之后，对材料进行类似于化合物(6)的处理。除去溶剂并从二乙基醚和正-己烷中结晶产物。固体残留物从相同的溶剂混合物中重结晶出并真空干燥。得到3.28g(52。/。)的保护的二肽(9),熔点112-114。C,[a]D22+4.2。(c0.5，EtOH),Rf0.66(A);0.52(A,"Merck");0.78(B"Merck")。将钯黑添加到在10ml的MeOH、0.5ml的AcOH和5ml的H20中的2.1g(3.3mmol)的保护的二肽(9)中，并且进行氢化几小时。反应结束之后(色谱控制)，催化剂被过滤并且滤液被蒸发。将残留物溶解在具有少量的乙酸乙酯的醚中。混合物静置在水箱中直到所有产物结晶出。产物被过滤出，在过滤器上用冷醚洗涤，并真空干燥。得到1.54g(83%)的化合物(10),其具有Rf0.16(C"Merck，，)；0.66(B，，Merck");0.67(D)。将8.32g(15mmol)的二肽乙酸盐(dipeptideacetate)(10)溶解在50ml的DMF中，一旦搅拌和冷却时，加入在15mlDMF中的5.lml(30mmo1)10DIEA和溶解于5mlDMF中的2.7g(15mmol)的对-硝基苯基乙酸酯。搅拌反应混合物2-3小时，并且当反应结束(色谙控制)时对其进行类似于化合物(6)的操作。除去溶剂并将残留物溶解于醚中并且用己烷再沉淀两次。产物被过滤出并真空干燥。得到6.52g(81。/。)的保护的二肽(11),其具有Rf0.33(A"Merck，，)；0.55(E，，Merck，，)；熔点95。C,[a]D22-9.6。(c0.5,EtOH)。Soc-7)rfBoc;"YA^4c」-iD-(9m-G-尸/ze^-A^^-AW2(72」将4.75g(13mmol)的二肽(3)被溶解在30ml在DCM中的50%TFA中并且保持30分钟。除去溶剂；残留物用醚研磨，过滤，在滤器上用醚洗涤并且在氢氧化钾上进行真空干燥。得到4.Mg(92%)的二肽三氟乙酸盐(8),其具有Rf0.37(D);0.17(E)。将1.14g(3mmol)的二肽酰胺三氟乙酸盐(8),1.6g(3mmol)的保护的二肽(ll)溶解在60ml的DMF中，冷却到-5。C,并且一旦搅拌并冷却，添力口0.51ml(3mmol)的DIEA,并将溶解于5ml的DMF的0.75ml(3.6mmol)的DPPA緩慢地滴加到混合物中。反应进行几小时并且留置过夜。反应完成之后(色谱控制)，混合物用乙酸乙酯和水稀释，冷却到0°C并且用5。/oKHS04溶液酸化到pH3。乙酸乙酯层被分离出；另外用一部分乙酸乙酯萃取水相。合并有机相，用5%NaHC03溶液、水、5%KHS04、水、饱和NaCl水溶液洗涤，并且最后在无水Na2S04上进行干燥。除去溶剂并且产物在硅胶柱(C)上纯化(产物在chl系统中进行装载并且在chII系统中连续洗脱)。收集分别的级分，蒸发并真空干燥。得到0.73g(31%)的保护的四肽酰胺(12)。通过RP-HPLC纯化分析样品。熔点169-170°C,[a]D22-46.8。(c0.25,DMF),Rf0.51(E,"Merck");0.66(B"Merck")。7y匿fA^4c,-Z)-0"-G(y-尸/^-M^-丽2(7」将0.25g(31mmol)的四肽酰胺(12)溶解于10ml在DCM中的50%TFA中，并且继续如同对化合物(8)地进行操作。产物在SephadexG-10柱上纯化。用0.02AcOH溶液进行洗脱。冷冻干燥后得到0.18g(90%)四肽酰胺(l)。熔点130画131。C,[a]D22+80。(c0.15,0.2N,AcOH),Rf0.52(D,"Merck");0.49(B"Merck");氨基酸分析Gly1.00;TyrO.86;Orn0.82;Phe(p-N02)0.91。分析性HPLC分析显示k'=1.6的峰(柱ii4.6x110,SilasorbSPH,流动相:CH3CN和0.2M乙酸铵緩冲液(21:79),pH5,流速1.5ml/分钟，X:220nm。实施例2,3,4,5脑啡肽类似物(2,3,4，5)的合成N-保护的氨基酸衍生物，载体和用于肽合成的试剂购自Sigma,FisherScientific,Bachem;Reanal(匈牙利)；SaxonBichemicalsGMBH(德国)。除了4-曱基二苯甲基氨基聚合物外，其购自瑞士Novabiochem。HPLC-级溶剂DCM,DMF(用4A分子篩进行储存)，MeCN和MeOH用于合成和纯化。其他试剂是试剂级的。在Boetiushotplate(德国)上测定熔点。肽(2,3,4,5)的合成利用NPS-4000半自动合成仪(NeosystemLaboratories,法国)(其使用在MBHA树脂上的标准BOC/Bzl保护基团策略(standardBOC/BzlprotectinggrouptacticsonMBHAresin))通过固相方法而进行。氨基酸残基的ot-氨基官能用BOC保护基团保护，并且反应性侧链官能团进行如下保护Ac基团用于D-Lys;Fmoc基团用于D-Dab和D-Orn;和2-溴千氧基羰基(2-Br-Z)用于Tyr氨基酸残基。Asn的侧链是未保护的。用酰胺化的C末端将所有肽构建在4-曱基二苯甲基胺树脂(0.6mmol/g树脂取代)上。将3倍过量的Boc-氨基酸用于偶联反应。利用在二曱基曱酰胺中的N,N'-二异丙基碳二亚胺进行氨基酸的偶联，以便在6-Cl-HOBt存在下将氨基酸残基偶联到生长肽树脂上。在偶联2小时之后，在每个阶段，通过标准茚三酮测试监测酰化的完成。在不完全偶联的情况下，在除去Boc保护基团之前重复该偶联过程。在DCM中的三氟乙酸(65%(体积/体积))用于选择性断裂N-保护基团，然后用在DMF中的三乙胺(5%(体积/体积))进行中和。肽的侧链氨基基团的乙酰化通过用在DCM中的10%Ac20溶液(还包含三乙胺)的处理而达到。最后的去保护以及肽从树脂的断裂通过在苯硫基曱烷和乙烷二硫醇存在下用1M在TFA中的三氟曱烷^璜酸溶液的处理而进^f亍。合成的肽通过凝力交过滤进行脱盐，通过RP-HPLC进行纯化并通过质谱和氨基酸分析进行表征。凝胶过滤在ToyopearlTSKHW-40柱上进行。在iPrOH中的0.1M12NH4HC03溶液用于洗脱肽。最后的纯化通过RP-HPLC在装配了用于分析色谱法的Lunad8柱(4.6xl50mm)和装配了用于制备色语法的VydacC!8柱(22x250mm)的SystemGoldChromatograph(Beckman,美国)上获得。肽分别用梯度的在0.1。/。H3PO4中的乙腈以lml/分钟的流速(分析柱)和用梯度的在0.1%TFA中的乙腈以1Oml/分钟的流速(制备柱)进行洗脱。在230nm进行UV检测。氨基酸衍生物的纯度在预涂敷(precoated)的MerckF254板(德国)上在下列色谱系统中通过TLC进行控制1:3的1%氨-仲丁醇，9:2的氯仿-甲醇，和90:7:3的氯仿-曱醇-乙酸。合成的肽的纯度在下列系统中进行测定nBuOH-AcOH-H20(4:l:l);CHCl3-MeOH-AcOH-H2O(30:20:4:6);(60:18:2:3)。通过在254nm的UV照射，通过用茚三酮溶液或使用氯/联苯胺试剂喷射，显现色层语。在密封的安瓿中的肽水解(在U0。C,24小时)之后在MicrotechnaT339M分析仪(捷克共和国)上进行氨基酸分析。质谱在电喷雾离子化(FINEPKhF)和反射模式的MX-5303飞行时间质语仪上进行记录。生物学生物学活性的实施例脑啡肽类似物(l)的心脏保护作用根据本发明的脑啡肽类似物(l)的心脏保护作用已经在体重在200-250g的145只雄性大白鼠上进行测试。通过结扎左冠状动脉产生了急剧的心肌缺血。冠状动脉闭塞30分钟之后以0.05mg/kg和0.5mg/kg的剂量对动物进行腹膜内注射研究化合物。对硝化甘油和anaprilinum作为用于心肌梗塞治疗的传统药物进行测试用于对比。接受了注射生理溶液的具有急剧心肌缺血的大鼠用于对照实验。在结扎冠状动脉6和24小时后处死动物，并且取血样和心脏组织样品用于研究。/人血液中洗涤心脏，左心室与右心室分离，并且切成4-5块一致的横向段。所有段在37。C在pH7.4的磷酸盐緩沖液中的0.1%的氮蓝四唑溶液中培养15分钟。心肌的坏死区域尺寸通过重力方法(gravitationmethod)进行测定。缺血损害率根据在血液中肌酸磷酸激酶(CPK)水平和它的心脏分数(heartfraction)(HF-CPK)进行估计。使用标准试剂盒(Boehringer,德国)来测试和计算两种激酶(CPK+HF-CPK)的活性。获得的结果利用Student's标准(Student'scriterion)进行统计学处理。据测定，冠状动脉闭塞有助于在6小时后可检测的坏死区域的出现，坏死区域在接下来的24小时中逐渐地扩展。观察到在血液中的特征性代谢改变。乳酸盐含量增加，这表明缺血程度和循环性缺氧。CPK和HF-CPK的酶活性增加，其反映了缺血性心肌细胞(cardiomyocite)损害(表2)。与对照组大鼠相比，在具有心肌梗塞的大鼠中通过腹膜给药脑啡肽类似物(l)引起的冠状动脉闭塞后的6小时之前和之后的坏死区域尺寸之间在统计学上没有显著的区别。然而，与对照组动物相比，用新脑啡肽类似物(l)注射的动物的心肌坏死区域尺寸在24小时实验结束时在统计学上更小(表1)。表l.脑啡肽类似物对于具有冠状动脉结扎的大鼠的心肌坏死尺寸的影响号动物组动物数量观察时间6小时12小时MI+生理溶液MI+Tyr-D-Om(Ac)-Gly-Phe(N02)-NH20.05mg/kgMI+Tyr-D-Orn(Ac)-Gly-Phe(N02)-NH20.5mg/kgMI+辨化甘油Ml+anaprilinum151515151543.07±2.9140.70±1.52P>0.0540.05±1.93P>0.0555.80±1.7147.51±1.63P>0.0546.64±2.20P>0.0554.04±1.76P>0.0553.80±1.90P>0.05血液中的乳酸盐含量是心肌梗塞发展的主要可靠指数。据测定0.05mg/kg剂量的新脑啡肽类似物(l)减少了在血液中的CPK和HF-CPK酶的血乳酸过多症和活动过强的发展。心脏和肝的糖原(主要能量储存)水平提高(表2)。这证实了化合物(l)对于病理过程的有益影响。实验动物的降低的致死率恰好是对于此的证据(见表3)。还表示新脑啡肽类似物(l)提高了对于依赖氧的病理状态的生物体稳定性(例如，中风，缺血，流血等)。表2.对具有急性心肌缺血的动物的血液和组织(包含生理溶液，脑啡肽类似物(l)或硝化甘油)测试的代谢结果动物组对照Ml+生理溶液MI+化合物(1)MI+硝化甘油数据6小时n=1224小时n=116小时n=1124小时n=1024小时n=12乳酸盐(mmol/l)1.44±0.074.03±1.26P<0.052.01±0.05PO.051.61±0.45P>0.051.70±0.09P<0.051.80±0.09PO.05CPK单位/]68.3±5.8134.6±7,6P<0.05108.8±6.2P<0.0593,5±5.3PO.0586.6±4.9P<0.05101.1±6.1P<0.05HF-CPK单位/111.9±1.118.1±0.6P<0.0526.6±2.1P<0.0515.3±0.7P<0.0512.3±0.7P<0.0519.8±1.1PO.05心脏糖原，g勾1.35±0.130.41±0.06P<0.050.46±0,07P<0.051.00±0.12P>0.05.1.11±0.17P>0.05肝糖原，g/kg6.94±0.444.85±0.62PO.056.98±1.02P>0.05表3.具有急剧心肌梗塞的包含生理溶液和脑啡肽类似物(1)的大鼠的致死率动物组N致死率%MI+生理溶液3053MI+化合物(1)，0.05mg/kg3033MI+化合物(1),0.5mg/kq3027结果显示根据本发明的新脑啡肽类似物(1)具有对实验性心肌梗塞的过程的有利的影响。形态学研究和血液中酶水平的研究证实了心脏保护作用和限制心15肌坏死区域尺寸的扩展的能力。使用最高治疗剂量的硝化甘油和anaprilinum以与传统用于心肌梗塞治疗的药物比较。显示出注射了硝化甘油和anaprilinum的动物的高酵素血症(hyperfermentemia)的衰减速率(decrementrate)和心肌坏死区域尺寸的衰减(表1和2)比注射新脑啡肽类似物(1)时小得多。得出结论，新脑啡肽类似物(l)比已知的心脏保护化合物、硝化甘油和anaprilinum更有效地降低心肌缺血损害的程度。新脑啡肽类似物(l)具有抗缺血作用和提高生物体对缺氧的稳定性。它限制了有实验性心肌梗塞的动物的心肌的坏死区域尺寸的扩展并且降低了实验动物的致死率。脑啡肽类似物(4)的体内心脏保护活性测定用于本研究的大鼠来自实-睑室动物饲养中心(LabAnimalsBreedingCentre),并且根据俄罗斯科学院(IBCRAS)的生物有机化学研究所(Branch)实验室动物护理和使用委员会(CommitteeonCareandUseofLaboratoryAnimalsoftheInstituteofBioorganicChemistry(Branch),RussianAcademyofSdence)的立场(position)的策略和指南而伺养。测"i式设备遵循实验室标准操作程序(StandardOperatingProcedures)(SOPs)中阐明的要求。心脏缺血大鼠模型动物准备外科手术和左冠状动脉闭塞(LCAO)体重280-380g的雄性Sprague-Dawley(CD)大鼠用于本研究。大鼠通过i.p.给药乌拉坦(urethane)(l-1.5g/kg)而进行麻醉。进行气管切开术，并且动物的气管用与啮齿动物呼吸才几(型号UGOBASILE7025)相连的套管进行插管。利用加热垫使体温保持在37。C,并且利用与数字温度计相连的在直肠放置的温度探针进行监测。体温被监测并被保持在37±1。C。股动脉被分离并且被插管以通过与计算机相连的BP转换器(型号PN:1891-E45,DTXTM,新加坡)测量血压(BP)。通过特定软件计算平均动脉压和心率。右股静脉被插管以允许给药肽或盐水和亚甲蓝染料。进行了左胸廓切开术以在第五肋间空间暴露心脏。除去心包，并且在肺流出道和左心室之间的沟中的左冠状动脉之下缝合。利用置于心肌表面的管，结扎线可围绕左冠状动脉被拉紧并且被夹紧以提供容易地可逆的血流闭塞。血液动力学和体温在过程中#皮监测。在经受心肌缺血-再灌注的乌拉坦麻醉的开胸大鼠中实施的实验方案图示于图l(见附录)。所有动物经受25分钟的闭塞和2小时的再灌注。闭塞之前5分钟给予几种剂量(0.1ng/kg-lpg/kg)的肽(4)。通过在缝线上拉起并且用塑料管夹住它而闭塞所有大鼠中的冠状动脉。在25分钟时，凝块(clump)被释放并且允许冠状动脉再灌注。左心室表面变成粉红色(pinksup)。120分钟的再灌注之后，结扎线再次拉紧以闭塞左冠状动脉，并且注射2%亚曱蓝染料(0.4ml的10。/。w/v盐水中)。一旦染料已经染色了心脏，除了在危险区域，清楚地划界出总的危险区域(AAR)的界线，然后心脏从动物中快速除去，并且在水中冲洗，并将心房，瓣膜材料和右心室壁除去，仅仅留下左心室。然后将左心室横向切片为2-mm切片。定义为正常(染为蓝色)的区域从AAR(未染为蓝色)中分离，并且通过在PH7.4緩沖液中的1%2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetmzoliumchloride)中在37°C下培养15分钟而染色切片。在2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色之后梗塞的区域表现为微白色，而非梗塞或存活区域颜色上表现为微红色。然后切片浸入10%福尔马林中5分钟以固定(fixing)。危险区域和梗塞尺寸的测量对切片摄相。对于每个切片，梗塞区域(拒绝2,3,5-三苯基氯化四氮唑)和危险区域(2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色的)利用计算机化测面法技术进行描绘和数字化。利用计算机化测面法("ImageTool"程序)估计每个区^或的面积。梗塞面积除以危险面积以确定梗塞面积/危险面积的比例(IS/AAR)。数据被表示为作为AAR的百分比的梗塞尺寸(IS)(即，％IS/AAR),用于统计学分析心脏保护作用(降低的％IS/AAR)。与载体(vehicle)对照进行体内梗塞降低的统计学比较。实验方案肽(4)的心脏保护效果的剂量-响应曲线(与载体对比(11=12))利用在LCAO之前5分钟以大丸剂的lml/kg剂量(dosingvolume)i.v.给药肽(4)17剂量0.01(『6)，0.1(n=12),1.0(n=12)pg/kg,和0.005(n=12)mg/kg而得到。肽(4)对于缺血后再灌注损害的影响通过在除去LCAO之后马上(O分钟；n=6)给药l.Opg/kg肽(4)(lml/kg大丸剂)进行评价。结果对心脏保护作用的^t拟剂量-响应曲线。对照动物显示了42.9±2.7的平均梗塞尺寸。当在缺血之前5分钟时给药，肽(4)显著降低了被表示为危险区域的Q/。(IS/AAR)(PO.05;表4)的梗塞尺寸，并且小于在0.2ng/kg和3.2pg/kg之间的剂量时的30%。肽(4)的作用在1.0pg/kg剂量时最大(26.0土3.5Q/())。以0.01pg/kg的低剂量静脉内给药肽(4)对于梗塞尺寸没有作用(45.1±4.6%)(附录的表4和图2)。肽(4)对于再灌注损害的影响当除去LCAO之后马上给药时(即，在120分钟再灌注期开始时)，肽(4)相比对照显著降低了缺血损害的水平(32.5±2.4%,平均值土S.E.M.;图3,见附录)。得出结论当在25分钟闭塞和120分钟再灌注期之前5分钟i.v.给药雄性Sprague-Dawley大鼠时，肽(4)限制了在体内缺血性损害。肽(4)(剂量1.0pg/kg)与盐水处理的对照相比减小了梗塞面积大约39%(表4)。对于梗塞尺寸的有益效果显示了对于外科手术引起的缺血之前和突发事件中的临床应用的可能性。1表4.在用肽(4)处理的大鼠心脏中的梗塞尺寸数据。梗塞尺寸以危险<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>抗缺氧作用新脑啡肽类似物(l)的抗缺氧作用通过测量在正常气压的低氧性缺氧条件下的小鼠的生命期而确定。实验在体重为20到22g的BALB-bread小鼠上进行。通过将动物置于包含吸收过量二氧化碳的Ca(OH)2的密封暗室中模拟正常气压的低氧性缺氧条件。在将动物置于暗室中之前，腹膜内注射研究物质1分钟。肽以1.0mg/kg的剂量进行使用。据发现，所述剂量对于研究肽的抗缺氧性质是最佳的。以最高治疗剂量的羟基丁酸钠(sodiumoxybutyrate)用作对比化合物。生命期以当动物停止呼吸运动时的时间进行估计。结果显示于表5中。表5.脑啡肽类似物和羟基丁酸钠对于处于低氧性缺氧(hypoxigenation)的小鼠的生命期的影响编号注射的化合物剂量mg/kg动物数量生命期分钟P对照(生理溶液)2010.7±0.41Tyr-D-Orn(Ac)-Gly-Phe(N02)-NH21.02216.9±1.10.01对照2012.5±0.3羟基丁酸钠1000.02015.5±0.40.01注射了新脑啡肽类似物(l)的动物的寿命比对照实验中的长57%。羟基丁酸钠的注射与对照实验相比提高了动物生命期24%。脑啡肽类似物(l)的体内止痛活性试验"尾部夹痛"方法脑啡肽类似物的止痛活性通过"尾部夹痛(tai1pinch)"方法进行测定[UedaH.;AmanoH.;ShiomiH.;TakagiH.(1979).Eur.J.Pharmacol.,56,265-268]。通过与对体重为18-22g的远系繁殖的雄性小鼠脑池内和静脉内给药的吗啡、[LeuS]-和[Met"-脑啡肽的比较进行研究止痛效果。在每个实验中使用十只小鼠。将研究的物质溶解于无菌生理溶液中并且在J形针头中以10)^1的剂量注射入清醒的小鼠的脑中。对照动物接受10pl无菌生理溶液。静脉内给药到尾静脉。通过用具有200g压力的动脉夹夹痛小鼠尾巴来测试止痛活性。选择在施加夹痛之后一秒钟之内咬该夹子的小鼠用于测定。止痛活性定义为大于6秒的咬响应(bitingresponse)的潜伏期(latency)。给药之后5，15,30,60和90分钟时和然后每30分钟进行止痛测试直到止痛反应停止。肽的止痛活性表示为不显示咬响应的小鼠的百分比。结果总结于表6和7中。止痛活性以相对于吗啡进行显示(吗啡=1)。20表6.脑池内给药时的脑啡肽类似物的止痛活性("尾部夹痛"方法)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>如表6所示，新脑啡肽类似物(l)具有显著的止痛作用，它比天然脑啡肽(化合物a)、b))有效得多，并且在脑池内给药后效力是阿片样物质标准-吗啡的60倍。不像天然脑啡肽，新脑啡肽类似物(l)在静脉内给药后是活性的。在静脉内给药后它的活性是吗啡的2倍(见表7)。脑啡肽类似物(l,2,3,4,5)的体内止痛活性试验"热板"法本研究根据目前的美国FDA的非临床实验研究的良好实验室作业(GLP)规范(U.S.FDAGoodLaboratoryPractice(GLP)RegulationsforNon-clinicalLaboratoryStudies)(21CFRPart58)而进4亍。实,睑i殳备遵循实验室标准操作程序(StandardOperatingProcedures)(SOPs)中规定要求。肽(l-5)的止痛活性在CD-I雄性小鼠中通过在静脉内给药后的热板测试(G.Woolfe和A.D.Macdonald,J.Pharmacol.Exp.Ther.,80,300(1944))进行测定。吗啡已经作为对照化合物进^f亍测试。度:18-26。C，8a.m,8p.m.亮-暗循环)，接受标准实验室饮食(LaboratoryRodentDietPK-120)和随意自来水。小鼠仅仅被测试一次。热板仪(Hot-plate-meter)表示恒温可控制的、电加热的由透明壁(L:25cm,W:25cm,H:35cm)界定的表面。该装置的前面板装配了控制时间和温度才莫式的4安钮(ColumbusInstruments)。用于静脉内(i.v.)给药的所有肽和吗啡溶解于盐水中。以大丸剂注射的i.v.给药通过尾静脉来进行。对于所有动物的剂量根据个体体重的最终值进行计算。i.v.注射盐水或肽之后，将动物准确地置于预加热的热板(55士0.5。C)上，并且测量首次舔足和首次跳跃的潜伏期。其他行为反应被忽略。首次跳3夭之后动物/人热表面移走。利用180s的截止时间(cut-offtime)避免组织损害。为评价热板测试响应，在注射盐水或肽之后分别地测定对照潜伏期(t0)和测试潜伏期(ti)。最大可能作用百分比(％MPE)以。/oMPEKt广to)/(trto)xlOO进行计算，其中截止时间(t2)为180s。在热板测试中首次跳跃的潜伏期被认为是最有指示性。表示为跳跃潜伏期的肽(l-5)(剂量8pmol/kg)的止痛活性表示于图4中(见附录)。时间-响应曲线之下的面积通过别处描述的方法进行计算(CiceroandMeyer,1973),以评价抗痛的等级(图5,见附录)。与吗啡对比的结果示于图6(见附录)。还对该参数计算了半数止痛剂量(ED5。)。在静脉内给药后15分钟的时间点在小鼠热板测试中肽(l,2,3,5)的止痛活性的结果示于表8中。如图4所示(见附录)，在向小鼠i.v.给药后("热板"法)，脑啡肽类似物(l-5)具有持续最多90-300分钟的显著的止痛作用。肽(1)和(5)显示出类似的表现(profiles),然而肽(3)显示出15分钟的迟延效果并且在那以后具有与肽(1)和(5)类似表现。肽(4)显示出显著的止痛作用，并在30分钟时显示最大值。但是，肽(4)的止痛作用比其他四种测试的肽的作用更弱。22表8.静脉给药之后在15分钟的时间点在小鼠热板测试中肽(1,2，3,5)的止痛活性<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>在热板测试中，肽(l-5),新合成的脑啡肽类似物具有显著的止痛活性。肽(3)和(5)显示了几乎与吗啡相似的止痛能力。肽(l)(ED》1.27mg/kg)和肽(2)(ED5o丄7mg/kg)被证明为最活性的。肽(1)和(2)的止痛活性分别是吗啡2和1.5倍(表8)。体外止痛活性试验GPI和MVD生物试-险肽对于外周阿片样物质受体的作用通过抑制具有肠系膜神经丛的豚鼠回肠的纵肌和小鼠输精管的电刺激引起的片段收缩能力进行测定[PatonW.D.M.;VisiE.S.(1969).Brit.J.Pharmacol.,35,10-28]。来自任何性别豚鼠(体重350-550g)的回肠纵肌与下面的环状肌中仔细地分离并且置于具有36°C的Krebs溶液的小池中。持续对溶液充气。对组织应用0.2g的恒定的负荷。利用环状铂电极通过0.1Hz频率1iusec持续时间的单脉沖刺激该组织。在与NihonKohden多道记录仪(polygraph)相连的TB-611T记录器上记录等长收缩。将小鼠(体重2孓30g)输精管置于具有31°C的改性Krebs溶液(不包含硫酸镁))的池中。将研究的物质溶解于蒸馏水中。通过累积剂量、在不洗涤时添加渐增浓度的化合物进行测定化合物的抑制活性。制剂的活性表示为IC50(nmol/l)。在8-10个测试中获得的结果利用Student's标准进行统计学处理。表9显示了具有P0.05的可靠区间的IC50。表9.脑啡肽类似物在豚鼠回肠(GPI)和d、鼠输精管(MVD)中的阿片类物质活性<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>在GPI试验中(主要是p-型阿片类物质受体)脑啡肽类似物(1)显示了高效力水平。它的p-亲和性是[Leu勺-脑啡肽的亲和性的23倍。脑啡肽类似物(1)也比吗啡活跃一个数量级(order)。结论因此我们显示了新肽的显著心脏保护活性(降低梗塞尺寸24-39%),比其他已知心脏保护药物例如硝化甘油和(3-肾上腺素阻断剂anaprilinum提供的更好的对心肌的缺血损害的保护，比已知的药理学药物(如羟基丁酸钠)显著的抗缺氧作用，和比静脉给药的吗啡更显著和更持久的止痛活性。权利要求1.包含以下四肽结构的化合物A-B-C-D其中，氨基酸残基A的N-末端NH2的每个氢任选地可独立地被C1-5烷基和C1-5酰基取代，A-是芳族氨基酸残基，其中芳族环任选地可用一个或多个硝基取代，B-是二氨基酸残基，其中侧链氨基基团用C1-5酰基，C1-5烷基，-B’-C1-5酰基或-B’-C1-5烷基取代，其中B’是任选地可用一个或多个硝基取代的氨基酸残基，C-是Gly，其中肽N-H任选地可被改变为N-甲基，D-是Phe，其在芳族环上用至少一个硝基取代并且任选地在芳族环上进一步用一个或多个独立选自硝基，氟代，氯代，溴代，碘代，CF3或CN的基团取代，其中肽N-H任选地可被改变为N-甲基，和氨基酸残基D的C-末端C＝O用NH2，NHC1-5烷基，NH-NH2，NH-NHC1-5烷基，或O-C1-5烷基取代；或C-末端是COOH或CH2OH，或其药学上可接受的盐。2.如权利要求1所述的化合物，其中N-末端NH2未被取代。3.如前述权利要求任一项所述的化合物，其中A-选自Tyr,Thyronine,Phe或Trp,其中芳族环任选地可用一个或多个硝基取代，优选地A是未被取代的Tyr。4.如前述权利要求任一项所述的化合物，其中B-是Dap,Dab，Orn,Lys,4,5-脱氢-赖氨酸或2,6-二氨基-4-己炔酸，其中侧链氨基基团用Cw酰基，Cw烷基，-B，-Cw酰基或-B，-Cw烷基取代。5.如前述权利要求任一项所述的化合物，其中，B-是Dab,Orn或Lys,其中侧链氨基基团用酰基，Cw烷基，-B，-Cw酰基或-B，-d.5烷基取代，并且优选地B是用C"5酰基取代的Orn。6.如前述权利要求任一项所述的化合物，其中B的侧链氨基基团用d-5酰基或-B，-d-5酰基，优选地d.5酰基，更优选地乙酰基取代。7.如前述权利要求任一项所述的化合物，其中B，-是Gly,Ala,Pro,Leu,Asn或Met，优选地Gly或Asn。8.如前述权利要求任一项所述的化合物，其中C-是未被取代的Gly。9.如前述权利要求任一项所述的化合物，其中D-是Phe,其在对位用硝基取代，并且任选地进一步在芳族环上用一个或多个独立选自硝基，氟代，氯代，溴代，碘代，CFs或CN的基团取代，其中肽N-H任选地可浮皮改变为N-甲基，并且优选地在芳族环上唯一的取代基是对-硝基。10.如前述权利要求任一项所述的化合物，其中氨基酸残基D的C-末端C=0用NH2取代。11.如权利要求1所述的化合物，其包含下列结构Tyr-D-Orn(Ac)-Gly-Phe(p-N02)-NH2。12.药物组合物，其包含如前述权利要求任一项所述的化合物和药学上可接受的稀释剂，载体或赋形剂。13.用作药物的权利要求1-11任一项中所述的化合物或权利要求12所述的药物组合物。14.权利要求1-11任一项所述的化合物用于制备用于组织保护治疗，优选地心脏保护治疗的药物的用途。15.权利要求1-11任一项所述的化合物用于制备用于抗缺氧治疗的药物的用途。16.权利要求l-ll任一项所述的化合物用于制备用于止痛治疗的药物的用途。17.权利要求l-ll任一项所述的化合物用于制备用于抗缺血治疗的药物的用途。18.权利要求1-11任一项所述的化合物用于制备用于与抗缺氧或止痛治疗两者之一或与这两者的结合的组织保护治疗，优选地心脏保护治疗的药物的用途。19.实施在权利要求14-18任一项中所说明的治疗的方法，其包括向需要治疗的受试者给药有效量的如权利要求1-11任一项所述的化合物或如权利要求12中所述的药物组合物。全文摘要组织保护化合物包括四肽结构A-B-C-D，其中氨基酸残基A的N-末端NH₂的每个氢任选地可独立地被C_1-5烷基和C_1-5酰基取代，A-是芳族氨基酸残基，其中芳族环任选地可用一个或多个硝基取代，B-是二氨基酸残基，其中侧链氨基基团用C_1-5酰基，C_1-5烷基，-B’-C_1-5酰基或-B’-C_1-5烷基取代，其中B’是任选地可用一个或多个硝基取代的氨基酸残基，C-是Gly，其中肽N-H任选地可被改变为N-甲基，D-是Phe，其在芳族环上用至少一个硝基取代并且在芳族环上任选地进一步用独立选自硝基，氟代，氯代，溴代，碘代，CF3或CN的一个或多个基团取代，其中肽N-H任选地可被改变为N-甲基，并且氨基酸残基D的C-末端C＝O用NH₂，NHC_1-5烷基，NH-NH₂，NH-NHC_1-5烷基，或O-C_1-5烷基取代；或C-末端是COOH或CH₂OH，或其药学上可接受的盐。文档编号A61P9/00GK101506225SQ200780030604公开日2009年8月12日申请日期2007年8月17日优先权日2006年8月17日发明者I·博布罗瓦申请人:埃里比斯药品公司