含有乳酸盐类和超极化的¹³C-丙酮酸盐的成像介质的制作方法

专利名称：含有乳酸盐类和超极化的¹³C-丙酮酸盐的成像介质的制作方法
含有乳酸盐类和超极化的13。丙酮酸盐的成像介质
本发明涉及含有乳酸盐类(lactate)和超极化的"C-丙酮酸盐的成 像介质，制备所述成像介质的方法，所述成像介质的应用，以及其中 应用所述成像介质的"C-MR成像和/或^C-MR光谱学的方法。
磁共振(MR)成像(MRI)已成为对医师特具吸引力的成像技术，因为 它可以以非侵入性的方式获得患者的身体或其部分的图像，并且不会 使得患者和医护人员暴露于可能有害的射线诸如X-射线中。由于它的 高质量图像和良好的时空分辨率，MRI是对于成像软组织和器官有利 的成像技术。
可用或不用MR造影剂进行MRI。然而，对比增强的MRI通常使 探测更小的组织变化成为可能，这使其成为探测早期组织变化例如'J 、 的肿瘤或转移的强有力工具。
几种类型的造影剂已被用于MRI。可溶于水的顺磁性金属螯合剂， 例如，釓螯合物，如Omniscan (GE Healthcare)是广泛使用的MR造 影剂。由于它们的低分子量，当将它们给予血管系统内时，它们迅速 分布于细胞外空间(即血液和间隙组织)内。它们也相当迅速地从身体中 清除。
另一方面，血池MR造影剂，例如超顺磁性氧化铁颗粒，在血管 系统中长时间滞留。已经证明，它们在肝脏中非常有益于增强对比， 但也检测出毛细血管渗透性异常，如，由肺瘤血管生成引起的肿瘤中 "渗漏的，，毛细血管壁。
尽管上述的造影剂具有无异议的卓越特性，但是它们的应用并非 无任何风险。虽然顺磁性金属螯合物通常具有高度稳定性常数，但在 给药后毒性金属离子可能在体内释放。再有，这些类型的造影剂表现 出不佳的特异性。
WO-A-99/35508公开了对患者采用高T!剂的超极化溶液作为MRI 造影剂的MR研究方法。术语"超极化"意指，提高存在于高T!剂中的 NMR活性核，即具有非零核自旋的核，优选"C-或"N-核的核极化。 一旦提高了 NMR活性核的核极化，这些核的激发态和基态核自旋状态 之间的总体差(p叩ulation difference)显著增加，因此MR信号强度成百倍因数及以上的地放大。当使用超极化的富含130和/或15N-高T！剂时， 它们将基本上不受背景信号的影响，因为13C和/或15N的天然丰度可 以忽略不计，因此图像对比将有利地高。常规MRI造影剂和这些超极 化的高Ti剂的主要差别是，前者的对比变化是通过影响身体中水质子 的弛豫时间引起的，而后一类试剂可被认为是非放射性示踪剂，因为 获得的信号单独由该试剂引起。
在WO-A-99/35508中，公开了用作MR成像剂的多种可能的高T！ 剂，包括非内源性和内源性化合物，如乙酸盐、丙酮酸盐、草酸盐或 葡糖酸盐，糖如葡萄糖或果糖，脲，酰胺，氨基酸如谷氨酸盐、甘氨 酸、半胱氨酸或天冬氨酸盐，核苷、维生素如抗坏血酸，青霉素衍生 物和磺胺类。还据称诸如柠檬酸循环之类的代谢循环中的中间体是用 于代谢活性的MR成像的优选成像剂。
在人和非人动物体内代谢过程起作用的超极化的MR成像剂具有 重大的意义，因为这些超极化的成像剂可用于体内MR研究中以获得 有关组织代谢状态的信息，即它们用于代谢活动的体内成像。例如， 组织代谢状态的信息可被用于辨别健康和病变组织。
丙酮酸盐是在柠檬酸循环和超极化的13。-丙酮酸盐转化为其代谢 物超极化的"C-乳酸盐类中起作用的化合物，超极化的"C-碳酸氢盐和 超极化的"C-丙氨酸可用于人体代谢过程的体内MR研究。例如，如 在WO-A-2006/011810中详细描述的那样，超极化的130丙酮酸盐可用 作体内肺瘤成像的MR成像剂，并且如在WO-A-2006/054903中详细描 述的那样，通过MR成像用于评估心肌组织生存能力。
丙酮酸盐是内源性化合物，甚至在高浓度情况下也被人体非常良 好地耐受。作为柠檬酸循环中的前体，丙酮酸盐在人体中起重要的代 谢作用。丙酮酸盐被转化为不同的化合物其氨基交换生成丙氨酸， 经由氧化脱羧作用，丙酮酸盐被转化为乙酰辅酶A和二氧化碳(其进一 步被转化成碳酸氢盐)，丙酮酸盐的还原生成乳酸盐类，并且其羧基化 生成草酰乙酸盐。
而且，超极化的"C-丙酮酸盐代谢转化为其代谢物超极化的13C-乳酸盐类、超极化的"C-碳酸氢盐(仅在"d-丙酮酸盐、"d,2-丙酮酸 盐或"d,2,r丙酮酸盐情况下)和超极化的"C-丙氨酸，可用于人体代谢 过程的体内MR研究。130丙酮酸盐在人全血中于37。C具有约42秒的Tl弛豫，然而，已发现超极化的130丙酮酸盐转化为超极化的130乳
酸盐类、超极化的"c-碳酸氢盐和超极化的"c-丙氨酸足够迅速，以致
能检测来自"C-丙酮酸盐母体化合物及其代谢物的信号。丙氨酸、碳 酸氢盐和乳酸盐类的量取决于被研究组织的代谢状态。超极化的13C-乳酸盐类、超极化的"C-碳酸氢盐和超极化的130丙氨酸的MR信号强 度与在检测时剩下的这些化合物的量和极化的程度相关，因此，通过 监测超极化的"C-丙酮酸盐向超极化的"C-乳酸盐类、超极化的13C-碳酸氢盐和超极化的"C-丙氨酸的转化，使通过使用非侵入性MR成 像或MR光谱学研究人或非人动物体内代谢过程成为可能。
由不同的丙酮酸盐发生的MR信号振幅因组织的类型而异。由丙 氨酸、乳酸盐类、碳酸氲盐和丙酮酸盐形成的独特的代谢峰图样能够 用作被检查组织的代谢状态的指紋(fingerprint)。
现在已经发现，含有非超极化的乳酸盐类和超极化的13C-丙酮酸盐 的MR成像剂，较之单独的超极化的13(2-丙酮酸盐，具有更好的特性。 这样的成像剂的使用导致可观察到的"C-乳酸盐类的量增加，因而从 "C-乳酸盐类产生的MR信号增强。如WO-A-2006/011810中所描述的 那样，由130乳酸盐类产生的信号是监测MR肿瘤成像的信号，其中 肿瘤组织是通过高"C-乳酸盐类信号指示的。因为由"C-乳酸盐类产 生的信号增强，所以可以在非常早的阶段探测较小的肿瘤或肿瘤组织。 如WO-A-2006/054903中所描述，由130乳酸盐类产生的信号也是监测 MR心脏成像的信号，其中心肌组织濒临危险，即由最低的"C-碳酸氢 盐信号和/或最高的"C-乳酸盐类信号鉴定的缺血性心肌组织。此外， 由"C-乳酸盐类产生的信号是监测细胞死亡的MR成像的信号，其中 死亡组织是通过低130乳酸盐类信号或没有130乳酸盐类信号指示的。
因此，在本发明的第一个方面，提供了使用含有乳酸盐类和超极 化的13。-丙酮酸盐的成像介质的"C-MR成像或13C-MR光谱的方法。
术语"超极化"和"极化"在下文中可交互使用，表示核的极化水平过 量0.1%,更优选过量1%,最优选过量10%。
可以通过固态超极化的"C-丙酮酸盐，例如通过"C-丙酮酸盐的动 态核极化(DNP)获得的固态超极化的"C-丙酮酸盐中的固态13C-NMR 测量值来确定极化水平。固态13C-NMR测量值优选由使用低倾倒角 (low flip angle)的单脉冲捕获NMR序列(simple pulse-acquire NMRsequence)组成。将NMR光谱中的超极化"C-丙酮酸盐的信号强度与极 化过程前获得的NMR光i普中的"C-丙酮酸盐的信号强度进行比较。然 后由极化前和极化后的信号强度的比率计算极化水平。
采用类似的方法，可以通过液态NMR测量值，来确定溶解的超极 化的"C-丙酮酸盐的极化水平。再次将溶解的超极化的130丙酮酸盐的 信号强度与极化前的溶解的"C-丙酮酸盐的信号强度比较。然后从极 化前和极化后的13C-丙酮酸盐的信号强度的比率计算极化水平。
术语"成像介质"是指含有超极化的130丙酮酸盐作为MR活性剂， 即成像剂和非超极化的乳酸盐类的液体组合物。本发明成像介质可以 在MR成像中用作成像介质或者在MR光语中用作MR光谱剂。
可以将用于本发明方法的成像介质用作体内13C-MR成像或光谱 的成像介质，即在活的人或非人动物中。而且，可以将用于本发明方 法的成像介质用作体外13C-MR成像或光谱的成像介质，例如在细胞培 养物，得自人或非人体的样本例如尿、唾液、血液，或者在离体(ex v;vo) 组织例如得自活组织检查的离体组织中。
用于本发明方法的超极化的13C-丙酮酸盐的同位素富集优选是至 少75%,更优选至少80%,而特别优选至少90%,超过90%的同位素 富集是最优选的。理想地，富集是100%。用于本发明方法的"C-丙酮 酸盐可以在Cl-位(下文表示为"d-丙酮酸盐)，在C2-位(下文表示为 13(^2-丙酮酸盐)，在Ch位(下文表示为"C3-丙酮酸盐)，在Cl-和C^-位 (下文表示为13(^,2-丙酮酸盐)，在Cl-和C3-位(下文表示为BCw-丙酮 酸盐)，在C2-和C3-位(下文表示为13(32,3-丙酮酸盐)或在Cl-、 C2-和 C3-位(下文表示为Ud,2,3-丙酮酸盐)是同位素富集的。在Cl-位上的同 位素富集是优选的，因为与在其他C-位上同位素富集的130丙酮酸盐 相比，"C广丙酮酸盐在人全血中于37。C具有更高的T驰豫(约42 s)。
NMR活性"C-核的超极化可以通过不同的方法来实现，所述方法 描述于WO-A-98/30918、 WO-A-99/24080和WO-A-99/35508中，所述 专利引入本文以供参考，并且超极化方法是由稀有气体，"强制力，，， 自旋冷冻，仲氢方法和动态核极化(DNP)的极化转移。
为了获得超极化的"C-丙酮酸盐，优选直接极化130丙酮酸盐，或 者将"C-丙酮酸极化并将"C-丙酮酸转化为极化的"C-丙酮酸盐，例如 通过用碱中和来进行转化。获得超极化的13c-丙酮酸盐的 一 种适宜的方法是从 WO-A-98/30918中描述的超极化的稀有气体的极化转移。通过使用循 环偏振光可以将具有非零核自旋的稀有气体超极化。可以用超极化的 稀有气体，优选He或Xe,或者这样的气体的混合物来进行"C-核的 极化。超极化的气体可以是气相，可以溶解在液体/溶剂中，或者超极 化的本身可以作为溶剂。或者，可以将气体冷凝到冷的固体表面上并
以这样的方式使用，或者让之升华。优选将超极化的气体与"C-丙酮 酸盐或13。丙酮酸充分混合。因此，如果13。丙酮酸是极化的，其在室 温是液体，那么优选将超极化的气体溶解在液体/溶剂中或者作为溶剂。 如果13C丙酮酸盐是极化的，那么优选将超极化的气体溶解在也溶解丙 酮酸盐的液体/溶剂中。
获得超极化的13C-丙酮酸盐的另 一种适宜的方法是通过在非常低 的温度下和高场中的热力学平衡将130-核极化。与NMR光谱计的工作 场和温度相比，超极化是通过使用非常高的场和非常低的温度(强制力) 来进行。使用的磁场强度应当尽可能的高，适宜地高于1T,优选高于 5T,更优选15T或更高，而特别优选20T或更高。温度应当非常低， 例如4.2K和更低，优选1.5K或更低，更优选1.0K或更低，特别优 选100 mK或更寸氐。
获得超极化的"C-丙酮酸盐的另 一方法是旋转冷冻法。该方法涉及 通过旋转冷冻极化将固体化合物或系统旋转极化。将系统用合适的结 晶顺磁性材料掺杂或成分混合，所述结晶顺磁性材料具有三级或更高 级对称轴，并且是例如Ni2+、镧系元素或锕系元素离子。该仪器操作 比DNP所需的仪器操作简单，不需要均匀磁场，因为施加没有施加任 何共振激发。该方法通过将样本沿着垂直于磁场方向的轴物理旋转来 进行。该方法的必要条件是，顺磁物质具有高的各项异性g-因子。作 为样本旋转的结果，电子顺磁共振将与核自旋接触，导致核自旋温度 下降。进行样本旋转直至&自旋极化达到新的平衡。
在优选的实施方案中，使用DNP(动态核共振)来获得超极化的13C-丙酮酸盐。在DNP中，欲极化的化合物中MR活性核的极化通过极化 剂或所谓的DNP剂来进行，DNP剂是包含未配对电子的化合物。在 DNP处理期间，提供能量，通常是以微波辐射形式提供能量，能量最 初将激发DNP剂。在衰退到基态后，极化从DNP剂的未配对电子上转移到欲极化的化合物的NMR活性核上，例如"C-丙酮酸盐中的13C 核上。通常，在DNP方法中使用中等或高的磁场以及非常低的温度， 例如在液氦以及约1T或更高的磁场中进行DNP方法。或者，可以采 用中等磁场以及实现足够极化提高的任何温度。DNP技术例如进一步 描述在WO-A-98/58272和WO-A-01/96895中，二者均引入本文以供参 考。
为了通过DNP方法将化合物极化，制备欲极化的化合物与DNP 剂的混合物("样本")，然后将其冷冻，并且插到用于极化的DNP偏振 器内。极化后，通过熔化或者通过溶解在合适的溶解介质中而将冷冻 固体极化样本迅速转化成液态。溶解是优选的，并且冷冻极化样本的 溶解方法及其合适的装置详细描述在WO-A-02/37132中。熔化方法以 及用于熔化的合适的装置例如描述在WO-A-02/36005中。
为了在欲极化的化合物中获得高的极化水平，在DNP方法期间， 需要将所述化合物与DNP剂充分接触。如果样本在冷冻或冷却之后结 晶，则不是这样。为了避免结晶，样本中需要存在玻璃状物前体或者 需要针对极化来选择冷冻后不会结晶而是形成玻璃状物的化合物。
如上所述，13(3-丙酮酸或130丙酮酸盐是适于获得超极化"C-丙酮 酸盐的原料。
同位素富集的"C-丙酮酸盐可商购获得，例如作为e.g. as sodium "C-丙酮酸钠商购获得。或者，其可以按照S. Anker, J. Biol. Chem 176, 1948, 133-1335中描述的方法来合成。
合成"Cr丙酮酸的几种方法是本领域已知的。简言之，Seebach 等人，Journal of Organic Chemistry 40(2), 1975, 231-237描述了一种 合成途径，该合成途径依赖含羰基原料作为S,S-缩醛，例如1,3-二噻烷 或2-曱基-l,3-二噻烷的保护和激活。将该噻烷金属化，并且与含有曱 基的化合物和/或"C02反应。如该参考文献所述，通过使用合适的同
位素富集的"c-成分，可以获得13(:广丙酮酸盐、。cv丙酮酸盐或13cu-丙酮酸盐。然后通过使用该文献中描述的常规方法将羰基官能团释放 出来。不同的合成途径由乙酸开始，首先将乙酸转化成乙酰溴，然后
与Cu"CN反应。将所获得的腈经由酰胺转化成丙酮酸(参见例如S.H. Anker等人，J. Biol. Chem. 176 (1948), 1333或J. E. Thirkettle, Chem Commun. (1997), 1025)。此外，"C-丙酮酸可以通过将商购获得的13C-丙酮酸钠质子化，例如通过US专利6,232,497中描述的方法或者通过 WO-A-2006/038811中描述的方法来质子化。
通过DNP将"C-丙酮酸超极化详细描述于WO-A1-2006/011809 中，该文献引入本文以供参考。简言之，"C-丙酮酸可以直接用于DNP， 因为其在冷冻时形成玻璃状物。在DNP之后，冷冻的超极化的130丙 酮酸需要溶解和中和，即转化成"C-丙酮酸盐。对于该转化，需要强 碱。此外，因为"C-丙酮酸是强酸，需要选择在该强酸中是稳定的DNP 剂。优选的碱是氢氧化钠，并且用氢氧化钠转化超极化的"C-丙酮酸， 会生成超极化的"C-丙酮酸钠，对于用于体内MR成像和/或光语的成 像介质，即在人或非人动物活体中进行的MR成像和/或光镨，其是优 选的130丙酮酸盐。
或者，13。-丙酮酸盐，即13。-丙酮酸的盐可用于DNP。优选的盐是 这样的"C-丙酮酸盐，其包含选自下列的无机阳离子NH4+、 K+、 Rb+、 Cs+、 Ca2+、 Sr2，。 Ba2+,优选NH4+、 K+、 Rb+或Cs+,更优选K+、 Rb+、 Cs+,最优选Cs+,如PCT/NO07/00109中详细描述，该文献引入本文 以供参考。这些优选的"C-丙酮酸盐的合成还公开在PCT/NO07/00109 中。如果在用于体内MR成像和/或光谱的成像介质中使用超极化的13C-丙酮酸盐，优选通过生理非常耐受的阳离子例如Na+或葡曱胺交换选自 下列的无机阳离子NH4+、 K+、 Rb+、 Cs+、 Ca2+、 Sr"和Ba2+。这可通 过本领域已知的方法，例如使用阳离子交换柱来进行。
另外优选的盐是有机胺或氨基化合物的130丙酮酸盐，优选 TRIS-"Ci-丙酮酸盐或葡甲胺-"C广丙酮酸盐，如WO-A-2007/069909中 详细描述，该文献引入本文以供参考。这些优选的"C-丙酮酸盐的合 成也公开在WO-A-2007/069909中。
如果在本发明方法中使用的超极化的13C-丙酮酸盐是通过DNP获 得的，则包含"C-丙酮酸或"C-丙酮酸盐和DNP剂的欲极化样本还可 以包含顺磁性金属离子。已经发现，在欲通过DNP极化的组合物中存
在顺磁性金属离子导致Bc-丙酮酸/"c-丙酮酸盐中的极化水平增，如
WO-A-2007/064226中详细描述，该文献引入本文以供参考。
如上所述，根据本发明方法的成像介质可以用作用于体内MR成 像和/或光谱，即在人或非人动物活体中进行的MR成像和/或光谱的成 像介质。除了 MR活性剂13。-丙酮酸盐以外，这样的成像介质优选还包含水载体，优选生理可耐受和生理可接受的水载体，例如水、緩冲 溶液或盐水。这样的成像介质还可以包含常规药用或兽药用载体或赋 形剂，例如制剂助剂，如常用于人药用或兽药用诊断组合物中的制剂助剂。
此外，根据本发明方法的成像介质可以用作用于体外MR成像和/ 或光语，例如用于检测细胞培养物或离体组织中的细胞死亡的成像介 质。除了 MR活性剂"C-丙酮酸盐以外，这样的成像剂优选还包含与 体外细胞或组织分析相容并且用于体外细胞或组织的溶剂，例如 DMSO或甲醇或包含水载体与非水溶剂的溶剂混合物，例如DMSO与 水或緩沖溶液的混合物，或者曱醇与水或緩冲溶液的混合物。对于本 领域技术人员来说显而易见的是，在这样的成像介质中可以存在可药 用载体、赋形剂以及制剂助剂，但是对于这样的目的，这不是必需的。
用于本发明方法的成像介质包含乳酸盐类和超极化的13C-丙酮酸 盐。乳酸盐类是非超极化的。在极化方法之后，将乳酸盐类适当地加 到超极化的"C-丙酮酸盐中。加入乳酸盐类的几种方法是可能的。当 极化方法生成包含超极化的13。-丙酮酸盐的液体组合物时，可以将乳 酸盐类溶解在所述液体组合物中，或者可以将乳酸盐类在合适的溶剂， 优选水载体中的溶液加到液体组合物中。如果极化方法生成包含超极 化的"C-丙酮酸盐的固体组合物，可以将乳酸盐类溶解在用于溶解该 固体组合物的溶解介质内。例如，可以将通过DNP方法极化的"C-丙 酮酸盐溶解在包含乳酸盐类的水载体例如水或緩冲溶液中。如果已经 通过动态核极化获得了超极化的"C-丙酮酸盐，则优选将乳酸盐类加 到最终的液体组合物中，即在溶解/熔化之后加到液体组合物中，或者 在除去DNP剂和/或任选顺磁性金属离子之后加到液体组合物中。也可 以将乳酸盐类作为固体加到液体组合物中，或者优选溶解在合适的溶 剂例如水载体如水或緩冲溶液中。为了促进乳酸盐类的溶解，可以使 用本领域已知的几种手段例如搅拌、涡旋或超声处理。然而，迅速并 且不需要混合装置或者有助于和液体组合物接触的方法是优选的。因 此，方法例如涡旋或超声处理是优选的。
适当地，乳酸盐类以乳酸或乳酸的盐，优选乳酸锂或乳酸钠，最 优选乳酸钠的形式加入。超极化的"C-丙酮酸盐和乳酸盐类在用于本 发明方法的成像介质中的浓度是大约相等或相等的，或者乳酸盐类以比"C-丙酮酸盐低或高的浓度存在。如果例如成像剂含有xM"C-丙酮 酸盐，则其含有xM或大约xM或更低浓度的乳酸盐类，但是优选不 低于x M的十分之一浓度的乳酸盐类，或更高浓度的乳酸盐类，但优 选不超过x M的三倍浓度的乳酸盐类。在优选的实施方案中，乳酸盐 类在用于本发明方法的成像介质中的浓度大约等于或者等于超极化的 13C-丙酮酸盐的浓度。术语"大约相等的浓度"是指乳酸盐类浓度是13C-丙酮酸盐浓度的100%+/- 30%,优选100%+/- 20%,更优选100%+/-10%。
为了在本发明方法中用作用于体内^C-MR成像或"C-MR光谱的 成像介质，将包含乳酸盐类和超极化的"C-丙酮酸盐的成像介质作为 适于给予人或非人动物活体的组合物来提供。成像介质优选包含水载 体例如上述緩冲液或緩沖液的混合物。成像介质还可以包含常规可药 用载体、赋形剂和制剂助剂。因此，成像介质可以例如包括稳定剂、 渗透压调节剂、助溶剂等。
如果在本发明方法中使用的成像介质是用于体内MR成像或光谱， 例如在人或非人动物活体中使用，则所述成像介质优选通过胃肠外途 径，优选静脉内给予所述体内。通常，处于检查的身体的位置是位于 MR磁体中。专用13C-MR RF-线圏覆盖所关注的区域。成像介质的剂 量和浓度将取决与多种因素，例如毒性和给药途径。适当地，成像介 质以最高达1 mmol "C-丙酮酸盐/kg体重，优选0.01-0.5 mmol/kg,更 优选0.1-0.3 mmol/kg的剂量给药。给药速度优选小于10 ml/s，更优选 小于6 ml/min,最优选为5 ml/s-0.1 ml/s。在给药后不到400 s,优选在 给药后不到120 s,更优选在给药后不到60 s,尤其优选在给药后20-50 s，施加MR成像程序，该成像程序以合并的频率和空间选择途径来编 码所关注的体积。这将产生"C-丙酮酸盐和"C-乳酸盐类的代谢图像。 施加MR程序的精确时间高度取决与所关注的体积。
为了在本发明方法中用作用于体外"C-MR成像或13C-MR光语的 成像介质，将包含乳酸盐类和超极化的"C-丙酮酸盐的成像介质作为 适于加到例如细胞培养物、得自人或非人身体的样本或离体组织例如 活组织检查组织的组合物来提供。对于本领域技术人员来说，成像介 质中还可以存在常规可药用载体、赋形剂和制剂助剂，但是对于这样 的目的来说，这不是必需的，因此优选包含水载体例如上述緩冲液或緩沖液的混合物和/或一种或多种与细胞培养物或组织相容的非水溶剂
例如DMSO或甲醇。用于细胞培养物、得自人或非人身体的样本或离 体组织例如活组织;险查组织的成<象介质优选包含10 mM-100 mM的 130丙酮酸盐，更优选20 mM-90 mM,最优选40-80 mM的"C-丙酮酸
盐
在进一步的方面，本发明提供了包含乳酸盐类和超极化的13。丙酮 酸盐的成像介质。
在进一步优选的实施方案中，本发明成像介质包含大约相等或相
等浓度的乳酸盐类和超极化的"c-丙酮酸盐，或者包含浓度比"c-丙酮
酸盐低或高的乳酸盐类。如果例如成像剂含有xM 130丙酮酸盐，则其 含有xM或大约xM或更低浓度的乳酸盐类，但是优选不低于xM的 十分之一浓度的乳酸盐类，或更高浓度的乳酸盐类，但优选不超过xM 的三倍浓度的乳酸盐类。在优选的实施方案中，乳酸盐类在本发明成 像介质中的浓度大约等于或者等于超极化的"C-丙酮酸盐的浓度。术 语"大约相等的浓度"是指乳酸盐类浓度是"C-丙酮酸盐浓度的 100%+/-30%,优选100%+/-20%,更优选100%+/-10%。
在另一个优选的实施方案中，乳酸盐类选自乳酸、乳酸锂或乳酸钠。
成像介质优选用于13C-MR成像或13C-MR光谱。
如果本发明成像介质是用作体内成像介质，即给予活的人或非人 动物，则所述成像介质优选还包含水载体例如上述緩沖液或緩冲液的 混合物。成像介质还可以包含常规可药用载体、赋形剂和制剂助剂。 因此，成像介质可以例如包含稳定剂、渗透压调节剂、助溶剂等。
如果本发明成像介质是用于体外UC-MR成像或nC-MR光语，其 还可以如上所述包含可药用载体、赋形剂和制剂助剂。然而，对于本 领域技术人员来说显而易见的是，对于这样的目的，可药用载体、赋 形剂和制剂助剂不是必须存在。因此，成像介质优选还包含水载体例 如上述緩沖液或緩沖液的混合物和/或 一种或多种与细胞培养物或组织 相容的非水溶剂例如DMSO或甲醇。
本发明的另 一个方面是制备包含乳酸盐类和超极化的13C-丙酮酸 盐的成像介质的方法，其中通过130丙酮酸或"C-丙酮酸盐的动态核极 化来获得超极化的130丙酮酸盐，并且将乳酸盐类加到所述超极化的"C-丙酮酸盐的溶液中。
本发明的另一个方面是本发明成像介质在使用13C-MR成像和/或
本发明的另一个方面是本发明成像介质在使用13C-MR成像和/或 13C-MR光谱的细胞培养物、得自人或非人动物身体的样本或离体组织 中代谢过程的体外研究中的应用。
本发明的另一个方面是本发明成像介质在使用13C-MR成像和/或 13C-MR光谱的人或非人动物身体中肺瘤组织体内鉴定中的应用。
本发明的另一个方面是本发明成像介质在使用13C-MR成像和/或 "C-MR光谱的细胞培养物、得自人或非人动物身体的样本或离体组织 中肺瘤细胞体外鉴定中的应用。
用于肿瘤组织的体内鉴定和肿瘤细胞的体外鉴定的合适的13C-MR 成像和/或13C-MR光谱方案描述在WO-A-2006/011810中。
本发明的另一个方面是本发明成像介质在使用13C-MR成像和/或 13C-MR光谱的人或非人动物身体中心肌组织存活力的体内评估中的应 用。
用于人或非人动物身体中心肌组织存活力的体内评估的合适的 13C-MR成像和/或13C-MR光谱方案描述在WO-A-2006/054903中。
本发明的另一个方面是本发明成像介质在使用13C-MR成像和/或 13C-MR光语的人或非人动物身体中细胞死亡的体内检测中的应用。
本发明的另一个方面是本发明成像介质在使用13C-MR成像和/或 "C-MR光谱的细胞培养物、得自人或非人动物身体的样本或离体组织 中细胞死亡的体外检测中的应用。
细胞死亡(例如细胞程序死亡和坏死)可以通过本发明方法，根据 13C-丙酮酸盐的信号及其代谢物13C-乳酸盐类的信号随着时间的改变 来检测。在活细胞中，"C-丙酮酸盐信号随着时间而衰退。130乳酸盐 类信号首先由于"C-丙酮酸盐代谢转化为"C-乳酸盐类而增加，然后由 于驰豫而緩慢地降低。在死亡细胞中，130丙酮酸盐代谢转化为13C-乳酸盐类大大地降低，并且，虽然13〇-丙酮酸盐信号随着时间而衰退， 但是根据细胞死亡的程度/垂死/死亡细胞的量，"C-乳酸盐类信号只有 轻微的增加，或者可能根本检测不到。虽然不希望受缚于理论，但是 我们相信这是由于乳酸脱氬酶的活性损失所致，乳酸脱氢酶催化丙酮酸盐与乳酸盐类的相互转化,伴随NADH与NAD+的相互转化,和/或 由于辅因子NADH和NAD+的损失和/或由于细胞乳酸盐类浓度下降所 致。
通过用依托泊苷处理而被诱导以经历细胞死亡的EL-4鼠淋巴瘤细 胞的酸提取物的31P-NMR测量已经证实了 ，当与未处理的对照细胞相 比，从NAD(H)产生的共振强度下降。NAD(H)的损失可以通过酶聚 -ADP-核糖聚合酶(PARP)的DNA损害诱导的激活来解释，该酶将多种 不同的蛋白聚腺苷酸化，并且使用NAD+作为底物。从糖酵解中间体果 糖-l,6-二磷酸(FBP)产生的共振也增加，这可通过糖酵解酶甘油醛3-磷 酸脱氢酶(GAPDH)通过其辅酶NAD(H)的损失的抑制来解释。使用竟争 性抑制剂(20 mM烟酰胺)或3-氨基苯曱酰胺(10 mM)抑制PARP活性抑 制了 NAD(H)的损失，并且在细胞程序死亡的细胞中观测到的FBP浓 度增力口。
这种由于PARP激活而导致的NAD(H)损失应当还抑制乳酸脱氬酶 (LDH)活性，以及因此测量的在丙酮酸盐与乳酸盐类之间的"C-标记的 通量。与该假设一致的是，观察到用烟酰胺与依托泊苷或者3-氨基苯 曱酰胺与依托泊普处理的细胞保持了他们在丙酮酸盐与乳酸盐类池之 间转移超极化的13。标记的能力，同时仍然表现出如使用荧光显微镜 检查所检测的垂死细胞的共有形态学特征。
如果本发明成像介质用于在体外检测细胞死亡，例如用于在细胞 培养物、得自人或非人动物身体的样本或离体组织中检测细胞死亡， 则成像介质包含10mM-50mM的"C-丙酮酸盐，优选20 mM-40 mM。
如果本发明成像介质用于在体内检测细胞死亡，即用于在活的人 或非人动物身体中检测细胞死亡，则本发明成像介质优选通过胃肠外 途径，优选静脉内给予所述体内。通常，处于检查的身体的位置是位 于MR磁体中。专用13C-MR RF-线圏覆盖所关注的区域。成像介质的 剂量和浓度将取决与多种因素，例如毒性和给药途径。适当地，成像 介质以最高达1 mmol "C-丙酮酸盐/kg体重，优选0.01-0.5 mmol/kg, 更优选0.1-0.3 mmol/kg的剂量给药。给药速度优选小于10 ml/s，更优 选小于6ml/min，最优选为5 ml/s-0.1 ml/s。在给药后不到400 s,优选 在给药后不到120 s，更优选在给药后不到60 s,尤其优选在给药后 20-50 s,施加MR成^象程序，该成4象程序以合并的频率和空间选择途径来编码所关注的体积。这将产生130丙酮酸盐和130乳酸盐类的代谢
图像/光谱。对于检测细胞程序死亡，施加MR程序的精确时间高度取 决与所关注的体积。
施加以合并的频率和空间选择途径来编码所关注体积的MR成像 程序，在从加入成像剂0=0)到约IO分钟，优选6分钟，更优选5分钟 的期间内，通过MR成像或光谱来测定130丙酮酸盐的"C-MR信号之 后。在相同时间期间内，监测"C-乳酸盐类信号的出现、增加以及随 后的下降。为了达到定量评估，可以进行健康细胞或组织的MR成像 或光谱，并且可以比较结果-即在给定时间期间内形成的乳酸盐类的 量。
所关注体积的编码可以通过使用所谓的光谱成像程序来实现，如 例如T.R. Brown等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79， 3523-3526 (1982); A. A. Maudsley,等人，J. Magn. Res 51, 147-152 (1983)中所述。光谱 图像数据含有多个体积元素，其中每个元素含有完全的^C-MR光谱。 "C-丙酮酸盐及其代谢物"C-乳酸盐类在13C-MR光谱中具有其独特的 位置，并且其共振频率可以用于鉴定它们。该峰在其共振频率的积分 与13。-丙酮酸盐和"C-乳酸盐类的量直接相关。当使用如L. Vanhamme 等人，JMagnReson 129， 35-43 (1997)中描述的时域拟合方法评估13C-丙酮酸盐和"C-乳酸盐类的量时，可以产生有关"C-丙酮酸盐和13C-乳酸盐类的图像，其中彩色编码或灰色编码代表所测量的130丙酮酸 盐和"C-乳酸盐类的量。
虽然已经证明了光谱成像方法在使用所有种类MR核例如^、"P、 23Na产生代谢图像中的价值，但是完全编码光语图像所需要的重复的 量使得该方法较不适于超极化的13C。必须小心以保证在整个MR数据 获得期间能够获得超极化的"C-信号。在降低信噪比的代价下，这可 通过降低在每一相位编码步骤中施加的RF-脉沖角来实现。较高的矩阵 尺寸需要更多的相位编码步骤和较长的扫描时间。
基于在数据获取期间施加读出梯度的P.C. Lauterbur (Nature, 242, 190-191, (1973)和P. Mansfield (J. Phys. C. 6, L422-L426 (1973))的开创 工作的成像方法容许较高的信噪比图像或同等物，较高的空间分辨图 像。然而，以其基本形式的这些成像方法将不能产生有关"C-丙酮酸 盐和13。乳酸盐类的单独的图像，即不能鉴定出特异性代谢物。在优选的实施方案中，使用成像程序，该成像程序利用了多个回
显(echoes)来编码频率信息。可以产生单独的水和脂肪^-图像的程序 描述在例如G. Glover, J Magn Reson Imaging 1991; 1: 521—530和S.B. Reeder等人，MRM 51 35-45 (2004)中。因为欲检测的代谢物以及其本 身的MR频率是已知的，所以在上面的参考文献中描述的方法可以用 于获得"C-丙酮酸盐和"C-乳酸盐类的直接图像。该方法更有效地利用 了超极化的"C-MR信号，给出了与光谱成像相比更好的信号质量、更 高的空间分辨率以及更快的获取时间。
在优选的实施方案中，细胞死亡的检测包括从预先给予本发明成 像介质的人或非人动物身体，或者从其中已加入本发明成像介质的细 胞培养物、得自人或非人身体的样本或离体组织获得13。-丙酮酸盐和 13。乳酸盐类的直接的13C-MR图像或光语。通过低的来自"C-乳酸盐 类的"C-信号强度或者不存在来自130乳酸盐类的信号或者降低的130 乳酸盐类形成速度来鉴定和检测细胞死亡。
为了校正丙酮酸盐信号，可以在每一个单独的图像中将乳酸盐类 和丙酮酸盐图像归一化至最大值。然后，将归一化的乳酸盐类图像乘 以倒置的丙酮酸盐图像，例如图像中最大丙酮酸盐信号减去每一像素 的丙酮酸盐水平。作为最后一个步骤，将在上述操作中获得的中间结 果乘以最初的乳酸盐类图像。或者，可以将在其各自图像的每个像素 中的丙酮酸盐和乳酸盐类峰强度拟合到丙酮酸盐与乳酸盐类之间的 13C标记通量的动力学模型中，以获得有关标记通量和自旋点阵驰豫时 间的速度常数。至于多个RF脉沖对于极化损失的影响，可能需要作出 校正。
如果使用该方法来在体内检测细胞死亡，则解剖学和/或灌注信息 可以包括在细胞死亡的检测中。解剖学信息可以例如通过采用或不采 用合适的造影剂获取质子或13C-MR图像来获得。相对灌注可以通过使 用MR造影剂例如OmniscanTM来确定。同样，不给予造影剂的用于灌 注测量的MR成像技术是本领域已知的。在优选的实施方案中，使用 未代谢的超极化的"C-造影剂来定量测定灌注。合适的技术和造影剂 例如描述在WO-A-02/23209中。在更优选的实施方案中，使用超极化 的"C-丙酮酸盐来定量测定灌注。
在另一个优选的实施方案中，反复给药本发明成像介质，由此容许动态研究。由于丙酮酸盐的低毒性及其有利的安全性，反复剂量的 该化合物被患者良好地耐受。
获得的结果例如容许医生给检查的患者选择合适的治疗，或者容 许医生确定治疗是否成功。
附图筒述


图1描绘了在用依托泊普处理的EL4细胞悬浮液中以及在未处理 的EL4细胞悬浮液中13(^-丙酮酸盐和"d-乳酸盐类的峰强度对时间。 图1中的曲线编号代表下列
1: 在未处理的对照细胞和依托泊苷处理的细胞悬浮液中的13(^-丙 酮酸盐强度(除以100)
2: 对照细胞悬浮液中的"d-乳酸盐类强度
3: 依托泊苷处理的细胞悬浮液中的"Cr乳酸盐类强度
图2显示了依托泊普和依托泊苦/烟酰胺处理对于EL4细胞对细胞 死亡诱导药物依托泊苷的反应的影响。图2中的柱状图代表3个实验 +/-标准偏差。
图2中的柱编号代表下列 1: 未处理的EL4细胞悬浮液 2: 依托泊普处理的EL4细胞悬浮液 3: 依托泊普/烟酰胺处理的EL4细胞悬浮液
实施例
在下文中，术语丙酮酸盐、"C-丙酮酸盐和"d-丙酮酸盐交替使用， 并且都是指"d-丙酮酸盐。同样，术语丙酮酸、130丙酮酸和uc广丙 酮酸也是交替使用，并且都是指"Cr丙酮酸。
实施例1: 合成三(8-羧基-2,2,6,6-(四(甲氧基乙基)苯并-[1,2-4,5，]二 -(1,3)二硫杂环戊二烯-4-基)甲基钠盐， 一种DNP剂
在氩气氛下将已经根据WO-A1-98/39277的实施例7合成的10 g (70 mmol)三(8-羧基-2,2,6,6-(四(羟基乙基)苯并-[l,2-4,5，]-二-(l,3)-二硫 杂环戊二烯-4-基)甲基钠盐悬浮在280 ml二曱基乙酰胺中。依次加入氢
18化钠(2.75 g)和曱基碘(5.2 ml),并且让轻微放热的该反应在34°C水浴 中进行1小时。用相同量的每一化合物重复两次氢化钠和曱基碘的加 入，并且在最后一次加入之后，将该混合物在室温搅拌68小时，然后 倒入500 ml水内。使用1 MNaOH(水溶液)将pH调节至pH〉 13,并 且将该混合物在室温搅拌15小时以水解所形成的曱基酯。然后使用50 ml 2 M HC1 (水溶液)将该混合物酸化至pH为约2,并且用乙酸乙酯(500 ml和2 x 200 ml)萃取3次。将合并的有机相用Na2S04干燥，然后蒸发 至干。将粗产物(24g)通过制备HPLC纯化，使用乙腈/水作为洗脱剂。 傳合并的级份蒸发以除去乙腈。使用乙酸乙酯芊取剩余水相,并且将 有机相用Na2S04干燥，然后蒸发至干。将水(200 ml)加到残余物中， 并且用0.1 MNaOH (水溶液)将pH小心地调节至7，在该处理期间残余 物緩慢地溶解。中和之后，将水溶液冷冻干燥。
实施例2:制备包含乳酸盐类和超极化的^CV丙酮酸盐的成像介质
通过将实施例的产物溶解在^C广丙酮酸(44mg, 91%)中来制备15 mM溶液。将该样本混合至均勾，^fc该溶液置于样本杯中，并且插到 DNP偏振器内。
将样本在DNP条件下于1.2 K在3.35 T磁场中，在微波(分别是94 GHz和100 mW)辐射下极化。极化之后进行固态NMR。 90分钟超极化 之后，将样本溶解在6ml94mMNaOH、 30mMNaCl、 40 mM HEPES 和50 mg/升EDTA的水溶液中。溶解的样本的pH为7.4,最终的13Cr 丙酮酸盐浓度是75mM。
将2 ml所得溶液与含有18 mg乳酸锂的500 pl水合并，获得包含 60 mM超极化的"Cr丙酮酸盐和75 mM乳酸盐类的成像介质。
实施例3:在细胞培养物中检测细胞死亡 3.1制备EL4细月包
将EL4鼠淋巴瘤细胞(108个细胞)用15 依托泊苷(PCH Pharmachemie BV, Harleem)处理16小时，依托泊苷是一种已知诱导细 胞死亡的化合物。将一组单独的细胞用15pM依托泊普加20mM烟酰 胺一一种已知PARP抑制剂处理16小时。通过吖啶橙和二碘化丙锭染 色来证实细胞死亡(细胞程序死亡和坏死)。将细胞用含有10% FCS的RPMI 1640生长培养基于37。C洗涤3次，并且向2 ml依托泊苷和依托 泊苦/烟酰胺处理的EL4细胞悬浮液中加入2 ml根据实施例2的成像介 质。因此，最终的细胞悬浮液含有30 mM超极化的"C广丙酮酸盐和37.5 mM乳酸盐类。
3.2 EL4细胞的"C-MR光谱
在如3.1中所描述的依托泊苷处理的EL4细胞悬浮液中，在从加 入成像介质的时间开始的240秒时间期间内，监测130丙酮酸盐和13C-乳酸盐类的13。信号强度。对于总#、 240个光谱，在9.4T使用低倾倒 角脉冲每秒获得一个13C光谱。还如上所述检测非依托泊苷处理的(未 处理的)EL4淋巴瘤细胞的对照，并且将未处理和依托泊普的"C-丙酮 酸盐和"C-乳酸盐类的峰强度在图上绘图(图1)。
3.3 EL4细胞的"C-MR光谱
在如3.1中所描述的依托泊苷处理和依托泊普/烟酰胺处理的EL4 细^^悬浮液中，在>^人加入成<象介质的时间开始的240秒时间期间内， 监测13。丙酮酸盐和"C-乳酸盐类的130信号强度。对于总共240个光 谱，在9.4T使用低倾倒角脉沖每秒获得一个"C光谱。还如上所述检 测非依托泊苷处理的(未处理的)EL4淋巴瘤细胞的对照，并且比较未处 理、依托泊苷处理和依托泊苦/烟酰胺处理的EL4细胞的"C-丙酮酸盐 和"C-乳酸盐类的峰强度。基于修饰的Bloch公式将数据拟合到双位点 交换模型中，并且测定正向和反向交换"C-通量的速度常数。图2中 的柱状图代表3个实验+/-标准偏差。
权利要求
1. 包含乳酸盐类和超极化的13C-丙酮酸盐的成像介质。
2. 权利要求1的成像介质，其中所述成像介质包含大约相等或相 等浓度的乳酸盐类和超极化的13。丙酮酸盐。
3. 权利要求1或2的成像介质，其中所述乳酸盐类选自乳酸、乳 酸钠或乳酸^l里。
4. 权利要求l-3任一项的成像介质，其中所述成像介质还包含水 载体。
5. 权利要求l-4任一项的成像介质，其中所述成像介质还包含常 规可药用载体和/或赋形剂和/或制剂助剂。
6. 用于体内13C-MR成像和/或"C-MR光谱的权利要求1-5任一 项的成像介质。
7. 权利要求l-4任一项的成像介质，其中所述成像介质还包含一 种或多种非水溶剂，优选DMSO和/或甲醇。
8. 用于体外13C-MR成像和/或13C-MR光谱的权利要求1-4和7 任一项的成像介质。
9. 权利要求1-6任一项的成像介质在使用13C-MR成像和/或
10. 权利要求7-8任一项的成像介质在使用13C-MR成像和/或 13C-MR光谱的人或非人动物身体中肿瘤组织体内鉴定中的应用。
11. 权利要求1-6任一项的成像介质在使用13C-MR成像和/或 13C-MR光谱的人或非人动物身体中心肌组织存活力的体内评估中的应 用。
12. 权利要求1-6任一项的成像介质在使用13C-MR成像和/或 13C-MR光谱的人或非人动物身体中细胞死亡的体内检测中的应用。
13. 权利要求7和8任一项的成像介质在使用13C-MR成像和/或 "C-MR光谱的细胞培养物、得自人或非人身体的样本或离体组织中代 谢过程体外研究中的应用。
14. 权利要求7和8任一项的成像介质在使用13C-MR成像和/或 13C-MR光谱的细胞培养物、得自人或非人身体的样本或离体组织中肿 瘤细胞的体外鉴定中的应用。
15. 权利要求7和8任一项的成像介质在使用13C-MR成像和/或13C-MR光谱的细胞培养物、得自人或非人身体的样本或离体组织中细 胞死亡的体外检测中的应用。
16. 制备权利要求l-8任一项的成像介质的方法，其中通过"C-丙 酮酸或"C-丙酮酸盐的动态核极化获得超极化的13。丙酮酸盐，并且将 乳酸盐类加到所述超极化的13C-丙酮酸盐的溶液中。
17. 使用权利要求1-8任一项的成像介质的"C-MR成像和/或 ^C-MR光谱的方法。
全文摘要
本发明涉及含有乳酸盐类和超极化的¹³C-丙酮酸盐的成像介质，制备所述成像介质的方法，所述成像介质的应用，以及其中使用所述成像介质的¹³C-MR成像和/或¹³C-MR光谱的方法。
文档编号A61K49/18GK101505802SQ200780030593
公开日2009年8月12日 申请日期2007年8月17日 优先权日2006年8月18日
发明者K·M·布林德尔, S·E·戴 申请人:通用电气医疗集团股份有限公司