多价肺炎球菌多糖-蛋白质共轭物组合物的制作方法

专利名称：：多价肺炎球菌多糖-蛋白质共轭物组合物的制作方法
技术领域：
：总体来说，本发明涉及医药领域，且具体来说，涉及微生物学、免疫学、疫苗及通过免疫来预防细菌性病原体感染。
背景技术：
：肺炎链球菌是在全世界范围内婴幼儿中引起脑膜炎、肺炎和严重侵入性疾病的主要原因。多价肺炎球菌多糖疫苗得到许可已有许多年并已证明在预防老年人及高危患者肺炎球菌疾病方面颇具价值。然而，婴幼儿对大部分肺炎球菌多糖反应不佳。7-价肺炎球菌共轭物疫苗(7vPnC，Prevnar)是首个此类药物，经证明其在婴幼儿中具有高免疫原性且对侵入性疾病及中耳炎非常有效。此疫苗目前已在全世界的许多国家得到批准。Prevnar含有来自血清型4、6B、9V、14、18C、19F及23F的荚膜多糖，每--多糖均与称作CRM^的载体蛋白共轭结合。Prevnar在美国、欧洲和世界其它地区分別覆盖约80卞:90%、60至80%和40至80%的侵入性肺炎球菌疾病(IPD)[1,2]。在引入PrcvnarA7数年间搜集的监视数据己清楚表明，如所预期美国婴儿侵入性肺炎球尚疾病W所卜'降(图1)|3，4]。'jI入Prcvnar之前T美国婴儿中实施的IPD监视表明，大部分由血洁群6及19引起的疾病足由6A(约1/3)及19A(约1/4)血清型造成的[5，6]。向Prevnar颁发许n丁证/Tf美国实施的肺炎球脔侵入性疾病监视表明，造成疾病巨大负担的原因仍为血清型6A和19A([冬l1)[3j。此外，由此两种血清型引起的侵入性疾病病例超过了rtj血清型1、3、5和7F总共引起的病例(8.2对3.3例/100,000个2岁及以下儿童)。此外，血洁型6A和19A与抗生素抗性的高发率有关(图2)[7,8,9]。尽管随着更多儿童受到免疫，血洁群交叉保护有可能会减少血清型6A和19A疾病，但有证据表明，这种减少很冇限IL山这聘血清型引起的疾病造成的重大负担仍会继续存在(参见下文)。考虑到由血洁型1、3、5、6A、7F和19A引起的侵入性肺炎球菌疾病的相对负扭及承:要性，向Prcvnar'调ft!物中添加这些血清型会在美国及欧洲使侵入性疾病的覆盖范围增加—,:>卯％，k在亚洲及拉丁美洲会使之增加至高达70%至80%。这种疫苗会使覆盖范闺明U超过Prevnar的覆盖范围，并提供不依赖于血清群交叉保护限制的6A和19A覆盖范围
发明内容因此，总体来说，本发明提供一种多价免疫原性组合物，其包含13个各不相同的多糖-蛋白质共轭物，其中所述共轭物中每一个含有共轭结合至载体蛋白的来自不同肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，以及生理上可接受的媒剂。视需要，在所述调配物中納入诸如基于铝的佐剂等佐剂。更具体来说，本发明提供一种13-价肺炎球菌共轭物(13vPnC)组合物，所述组合物包含7种存于7vPnC疫苗中的血清型(4、6B、9V、14、18C、19F及23F)加6种额外血清型(1、3、5、6A、7F及19A)。本发明还提供一种多价免疫原性组合物，其中所述荚膜多糖是来自肺炎链球菌的血清型l、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F且所述载体蛋白是CRM朋。本发明进一步提供一种多价免疫原性组合物，其中所述荚膜多糖是来自肺炎链球菌的血清型l、3、4、5、6A、6B、7F、9V、W、18C、19A、19F及23F,所述载体蛋白是CRM所，且所述佐剂是基于铝的佐剂，例如，磷酸铝、硫酸铝及氮氧化铝。在—个本发明特定实施例中，所述佐剂是磷酸铝。本发明还提供一种多价免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含多糖-蛋白质共轭物以及生理上可接受的媒剂，其中所述共轭物中每一个包含共轭结合至载体蛋白的来自不同肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，且所述荚膜多糖是由血清型3及至少一种额外血清型制备而成。在一个这种多价兔疫原性组合物的实施例中,所述额外血清型选自由血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F组成的群组。在另一实施例中，所述载体蛋白是CRM附。在又一实施例中，所述组合物包含佐剂，例如，选自磷酸铝、硫酸铝及諷银化铝的基f铝的佐剂。在一个特定实施例中，所述佐剂是磷酸铝。本发明还提供--种多价兔疫原性組合物,其包含多糖-蛋白质共轭物以及生理上可接受的媒剂，其中所述共轭物中每一个包含共轭结合至载体蛋白的来自不同肺炎链球菌血淸型的奖脇多糖，且所述荚膜多糖是由血清型4、6B、9V、14、18C、19F、23F及至少一种额外血清型制备而成。在一个这种多价免疫原性组合物的实施例中,所述额外血清型选自由血清型1、3、5、6A、7F和19A组成的群组。在另一实施例中，所述载体蛋内是CRMW。在又一实施例中，所述组合物包含佐剂，例如，选自磷酸铝、硫酸铝及氢氧化铝的基于铝的佐剂。在一个特定实施例中，所述佐剂是磷酸铝。本发明还提供一种用子诱发针对肺炎链球菌荚膜多糖共轭物的免疫反应的方法，所述方法包括对人类投与免疫有效鼋的任--刚刚阐述的免疫原性组合物。本发明进一步提供所投与任一免疫原性组合物为单个0.5毫升剂量，其经调配以含有2微克的各种糖，只有6B是4微克；约29微克的CRMw7载体蛋白；0.125毫克的元素铝(0.5毫克磷酸铝)佐剂；及作为赋形剂的氯化钠与琥珀酸钠缓冲剂。本发明还提供制造包含共价连接至载体蛋白的肺炎链球菌iL清型19A(Pn19A)多糖的免疫原性共轭物的方法。在一个实施例中，所述方法包含(i)使经纯化血清型19A多糖与氧化剂反应，产生活化血清型19A多糖；抑将所述活化血清型19A多糖与载体蛋白调和在一起；(iii)将经调和的活化血清型19A多糖与载体蛋白一起冻干(iv)将所述经调和的活化血清型19A多糖与载体蛋白重新悬浮于二甲基亚砜OJMSO)中；(v)使所述经调和的活化血清型19A多糖及载体蛋白与还原剂反应,产生血清型19A多餘载体蛋白共轭物;并(vi)对所述血清型19A多糖:载体蛋白共轭物的未反应醛进行封端,产生包含共价连接至载体蛋白的肺炎链球菌血清型19A多糖的免疫原性共轭物。在另一实施例中，制造包含共价连接至载体蛋白的肺炎链球菌血清型19A多糖的免疫原性共轭物的所述方法包含(i)使经纯化血清型19A多糖与高碘酸钠反应，产生活化血清型19A多糖；(ii)将所述活化血清型19A多糖的pH调节至6.5±0.2;0ii)将所述活化血清型19A多糖与蔗糖调和在一起(iv)将所述活化血清型19A多糖与CRM恥载体蛋白以0.8:1比率调和在一起(v)将经调和的活化血清型1M多糖与载体蛋白一起冻干;(vi)将所述经调和的活化血清型19A多糖与载体蛋白重新悬浮于DMSO中；(vii)使所述经调和的活化血清型19A多糖及载体蛋白与氰基硼氢化钠反应，产生血清型19A多糖虔体蛋白共轭物；并(viii)用硼氢化钠对血清型19A多糖:载体蛋白共轭物的未反应醛进行封端，产生包含共价连接至载体蛋白的肺炎链球菌血清型19A多糖的免疫原性共轭物。本发明还提供制造包含共价连接至载体蛋白的肺炎链球菌多糖的免疫原性共轭物的方法，其中所述多糖在两个重复单元之间包含磷酸二酯键。在一个实施例中，所述方法包含(i)使所述多糖与氧化剂反应，产生活化多糖；(H)将所述活化多糖与载体蛋白调和在一起；(iii)将经调和的活化多糖及载体蛋白一起冻干；(iv)将所述经调和的活化多糖及载体蛋白重新悬浮于DMSO中;(v)使所述经调和的活化多糖及载体蛋白与还原剂反应，产生多糖:载体蛋白共轭物；并(vi)对所述多糖潘体蛋ft共轭物的未反应醛进行封端，产生包含共价连接至载体蛋白的肺炎链球菌多糖的免疫原性共轭物。在这些方法的其它实施例中，在两个重复单元之间包含磷酸二酯键的多糖是肺炎链球菌多糖血淸型19A、l处'、6A、或6B。在另一实施例中，所述载体蛋白是CRM附。附困说明图1绘示在自基线(19將/1999年)至2001年间年龄<2岁的美国儿童中由血清型产生的IPD率变化。图2绘示对青'霜素(PCN)有抗性的肺炎球菌分离菌在年龄<5岁的儿童中的分布(1998)。图3绘示来自D118-P16Prevnar试验的OPA第三剂后结果的反累彩!分布曲线(RCDC)。具体实施方式/￥,rA微4、紐，,P、！￥，H/肌縱趣A据来自1995至19诉年间IPD监视的数据估计，Prevnar中7种血清型是造成年龄<2岁的儿童中约82%IPD的原因5]。在北加利福尼亚州(功效试验进行地)，嬰幼儿中所有IPD病例的卯％是由Prevnar血清型造成的阔。自从2000年引入Prevnar疫苗以来，整体IPD率已有明显下降，这是因为由疫亩血清型引起的疾病减少了[3，4。因此，目前尚无法证明自下一代肺炎球菌共轭物疫苗中去除任一Pre，血清型的正确性，但是可增加血清型以得到更广泛的覆盖范围。虛艨麥J、3、5及7F游游A在美国，年龄小于5岁的儿童中由血清型l造成的IPD率为《n/n,约与血清型3和7F中每一种相同[1，6。血清型1及5是造成美国侵入性肺炎球菌疾病高危人群中较高IPD率的原因。具体来说，血清型1在年龄<2岁的阿拉斯加本地儿童中造成3.5%的1PD,且在年龄为2至4岁的儿童中造成1线的IPD11〗。血清型1及血清型5二者在世界其它地区及发达国家的本地居民中均会明显造成疾病[12,13,14〗。与其它肺炎球菌血清型相比血清型1也可能与更为严重的疾病有対15。这种观测结论是基于美国与欧洲之间在病例鉴定率上的差异及医疗实践上的相关差异。总之，欧洲的IPD发病率低于美国。然而，在欧洲由血清型1造成的EPD百分比不成比例地高于美国(分别为6至7%对1至2%)。在欧洲，主要从就医儿童中获取血液培养物。在美国,在门沴病人中自出i^39r发热及白细胞数增加的儿童中获取血液培养物是常规医疗实践。考虑到医疗实践方而的差异，人们推定在美国由血清型l引起的疾病的较低白'分比可能是被由引起较轻疾病的其它血淸型的较高比例冲淡，而在欧洲较髙百分比则反映更严顶的疾病。此外，患有复杂肺炎的儿童的血清流行病学研究证明，血清型！以不成比例的形式争现[16,n,18。此表明，血淸型1的納入可降低严重肺炎球菌疾病的数奪:，同时有助于侵入性肺炎球菌疾病的整体下降。添加tfa清型3和7F会增加针对IPD的覆盖范围，在世界大部分地区可增加约3%至7%,且在亚洲可增加约9%。因此，U-价疫苗在亚洲能够覆盖50%的IPD而在所有其它地区覆盖约8(P/n的IPD[1，2]。对于中耳炎覆盖范围，这些血清型也很重要[19]。造成中耳炎的肺炎球菌血洁型的跨国研究中，豪斯多夫(Hausdorff)等人发现血清型3是全部最常见的中耳液体分离菌中的第8个[20〗。血清型3占与中耳炎有关的肺炎球菌組淸型的多达8.7%。因此，血清型3和7F在中耳炎以及在IPD中的重要性使之有理由被纳入肺炎球—萌共轭物疫苗中。然而，拟产生对瓶清型3多糖展现显著免疫原性的多价肺炎球菌共轭物疫苗的尝试未获得成功。例如，在11-价肺炎球菌蛋白质D共轭物疫苗(n-Pn-PD)的免疫原性和安全性研究中，于已接受3剂量疫苗其后又接受相同疫苗或肺炎球菌多糖疫苗强化剂的婴几中未观察到对血清型3的激发效应(努克(Nurkka)等人，(2004)儿科感染性疾病期刊(PW.J"/D纽./),23:1008-1014)。在另一研究中，来自已接受数剂ll-Pn-PD的婴儿的调斑吞噬分析(OPA)结果在与其它经测试血清型相当的水平下未能表现出针对血清型3的抗体反应(格彻连(Gatehalian)等人.，儿童感染性疾病欧洲学会的第17次年会(17也AnnualMeetingoftheEur.Soc.Paed.Inf.Dis.)(ESPID),第4期海报(PosterNo.4),PIA海报发表(PosterSession)1,伊斯坦布尔(Istanbul)土耳其(Turkey),2001年3月27日)。在评定ll-Pn-H)于急性中耳炎预防中功效的又一研究中，所述疫苗未能提供针对由血清型3引起的事件的保护(普利穆拉(Prymula)等人，(2006)剌络针Oo"cef),367:740-748)。因此，包含来自血清型3的荚膜多糖且能够引发针对血清型3多糖的免疫原性反应的肺炎球菌共轭物疫苗可带来超越业内现状的明显改进。虛鹏似,編腳A汰虛獰麥6』游mi游蘑0W学文献中监视数据表明，在年龄<2岁的美国儿童中血清型6A和19A引起的侵入性肺炎球菌疾病超过血清型l、3、5和7F引起的疾病数总和(图l)[1，5〗。此外，这些血清型通常与抗生素抗性有关(图2)并在中耳炎中起到重要作用[6,19，20]。尚不清楚当前Pre丽疫苗使人们免受由6A和19A引起的疾病的能力。下文论述在BvPnC疫苗中纳入6A和19A组份的基本原理。6.冶6S^MF多靜遂,游,浙ty務mi游f座获得许可的非共轭结合的肺炎球菌多糖疫苗(用于年龄至少为2岁的儿童)已含有6A成6B荚胶多糖伹未将二者同时纳入〖21]。在调配23-价肺炎球菌多糖疫苗时产生的免疫原性数据证明，6B单价疫苗诱发出针对6A和6B荚膜二者的抗体。来自在各种將:体中以游离多糖及肺炎球菌共轭物疫苗评定IgG及调理吞噬分析(OPA)反应之若干试验的数据表明,对6A之IgG反应由6B抗原诱发，但所述反应水平-般较低，且6A有机体的OPA活性不同于6B冇机体[22,23,24,25〗。此外，产生為水平6B抗体反应的受试者会具有很少或没有针对6A的活性。与其中存在高度相似性的6A和6B荚膜多糖的化学组成形成对比，19A和19F荚膜完全不同，原因在亍19A多糖中存在两条额外侧链。并不奇怪的是，在经19F多糖疫苗免疫的人类志愿者屮测量的免疫反应表明，在80%的受试者中诱发出对19F的反应，但仅有20Q/n受试者对19A产生反应[26。还已在使用共轭物疫苗的试验中证明，在用19F多糖兔疫后对血清型19A存在低水平交叉反应性IgG及OPA反应[24，2司。有关对6A和19A的交叉反应性OPA反应的内部数据d在美国婴儿中实施的7vPnC衔接性临床试验(D118-P16)中获得(图3)。这些研究与其它研究的实验结果一致，并证明用6B多糖免疫后对6A多糖存在交叉反应性功能抗体的诱发，但水平较低，且用19F免疫后产生极少量的针对19A的功能抗体。动參撐遼伊6fi,"F扇iTJ^"教JA4游蘼耱曾使用动物模型来评估使用多糖兔疫进行交叉保护的潜力。在由吉彬(Giebiiik)等人研发的中耳炎模型中，用四价多糖外膜蛋白(OMP)共轭物疫苗(包含6B、14、19F、23F糖)或安慰剂免疫栗鼠f27。在此试验中，似乎存在一定程度针对6A的交8叉保护；然而此并未达到统计学显著水平且此针对中耳炎的保护水平低于6B。在此相同模型中，存在100%针对19F中耳炎的保护，但仅有rm针对19A中耳炎的保护。希兰德(Saeland)等人在肺感染模型中使用来自用8-价肺炎球菌破伤风共轭物疫苗(含有6B和19F)免疫的婴儿的血清来被动免疫小鼠，之后用6A有机体进行鼻内攻击[2S〗。在59个血清样品中，有53%的小鼠受到针对与犯相关的菌血症的保护且有37%受到针对6A的保护。在相同模型中用19A有机体对用来自经4剂U-价肺炎球菌共轭物疫苗(含有与破伤风类毒素共轭的19F)免疫的婴儿的血清被动免疫的小鼠施以鼻内攻击[29]。在经被动免疫且随后经攻击的100只小鼠中，有60只小鼠在肺组织中没有检测到19A有机体，而在所有给予盐水安慰剂的小鼠中均鉴定出有机体。然而，在此模型中被动免疫未能使之免受19F有机体的攻击；因此，所述模型与血清群19的相关性仍存在疑问。一般来说，这些模型可提供6B免疫对6A有机体产生某种生物学影响的证据，但对异种血清型的影响与同种血清型中观察到的影响不网。由这些模型不能充分了解19F免疫对19A有机体的影响。激j^褒力試發-^教"F多禁关叛餘j&sr对"務m4ji^游多碱在表1中示出7vPnC和9vPnC(7vPnC+血清型1及5)功效试验中因6B、6A、19F和19A血清型引起的疾病病例数〖30,10,31]。侵入性疾病病例数过少，故对于血清型6A和19A无法得出任何结论。然而，芬兰人中耳炎试验得到了大量肺炎球菌分离菌[32〗。在按方案分析中，7vPnC对84M(95%CI62%、93%)由血清型6B引起的中耳炎有效且对57%(95%CI24%、76%)由血清型6A引起的中耳炎有效(表l)。相反，7vftiC对于由19F或19A引起的中耳炎并未展现出血清型特异性功效。表l.在7vPiiC及9vPnC疫苗的功效试验中由血清型6B、6A、19F和l餘引起的肺炎球菌疾病病例<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*经证明的统计学显著功效来自参考文献30、10及33以及个人私下交流Contr=对照ITT-意向治疗分析PP-按方案分析上市后IPD监视数据还可自疾病控制中心(CentersforDiseaseControl)实施的旨在评估Pre胃效力的病例对照试验中获得33]。在监视实验室中鉴定在3至23个月大儿童中出现的且在年龄及邮递区号与3个对照病例相匹配的肺炎球菌侵入性疾病病例。得到允许后，自父母及医疗供应者处获得病例与对照的病史和免疫史(若受试者曾接受至少1剂Prevnar即认为其受到免疫)。在2003年ICAAC会议上提出了初步结果并在表2中示出有关6B、l好、19A和6A疾病的研究结果总结。此等数据表明Pre丽能够预防由6A引起的疾病，但在程度上可能稍低于血清型6B疾病。这些数据还表明对由19A引起的侵入性疾病的交叉保护很有限。表2.通过CDC实施的病例对照试验的初步结果(在2003年ICAAC上提出)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>*疫苗效力，对接种疫苗(21剂量)与未接种疫苗进行比较，并根据基本条件加以调整参考文献40及个人/保密信函使用Prevrw的已发表分析[3]还表明，血清型6B和19F使由血清型6A和19A在年龄小于2岁的儿童中引起的IPD适当降低([3中表1)。由血清型6A、9A、9L、9N、18A、l犯、18F、19A、19B、19C、23A及23B("所有疫苗相关血清型")引起的未经免疫的成年人中的发病率稍有降低([3]中之表2)。这些数据确定，用Prevnar在年龄小于2岁的儿童中进行群体免疫适合血清型6A和19A,且为将血清型6A和19A纳入本发明13vPnC疫苗中提供依据。絲添肅"浙編游潜论示于阁1及农2中使用7vPnC疫苗进行的上市后监视数据和病例对照研究结果表明，与上述动物模型屮有关免疫反应及性能的其它信息一致，会存在一定程度针对6A疾病的交叉保护，伹与6B疾病相比程度较低。此外，针对19A的保护似乎很有限。闺此，含有血消型6A和19A的13vPnC疫苗可提供不依赖于血清型6B和19F的血清群交叉保护限制的覆盖范围。闲此，本发明提供一种包含13个各不相同的多糖-蛋白质共轭物以及生理上可接受的媒剂的多价免疫原性組合物，其中所述共轭物中每一个均包含共轭结合至载体蛋Cl的不同荚膜多糖，且其中所述荚膜多糖是由肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F制备而成。一种此载体蛋白是称作CRM附的白喉类毒素。所述免疫原性组合物可进一步包含佐剂，例如，基于铝的佐剂，如磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝。荚膜多糖可通过熟悉此项技术者已知的标准技术来制备。在本发明中，荚膜多糖是由肺炎链球菌的血清型l、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F制备而成。这些肺炎球菌共轭物可通过分开的方法制备并可将其调配成单剂量调配物。例如，在一个实施例中，使每一肺炎球菌多糖血清型生长于以大豆为主的培养基中。然后可通过离心、沉淀、超滤和柱色谱纯化各个多糖。对经纯化的多糖实施化学活化以使所述糖能够与载体蛋白发生反应。—且活化，每一荚膜多糖会分别与载体蛋白共轭结合以形成糖共轭物。在，个实施例中，每一荚膜多糖与相同载体蛋白共轭结合。在此实施例中，所述共轭结^是通过还原性胺化作用达成。多糖的化学活化及随后与载体蛋白的共轭结合可通过习知方法达成。可参见(例如)美国专利第4,673,574号及第4,卯2,506号34,3S]。载体蛋白优选为无毒及不具反应原性且可以足够量及足够纯度获得的蛋白质。载体蛋白应能够经受标准共轭结合程序。在本发明一个特定实施例中，使用CRMw7作为载体蛋白。CRM197(惠氏(Wyeth),桑福德(S肌ford),NC)是白喉毒素的无毒变体(即，类毒素)，其分离自生长于以水解酪蛋白氨基酸及酵母抽提物为主的培养基中的白喉杆謝(Co/ye6fl"mOT#^/im'a)菌株C7(pl97)培养物。CRMw是通过超滤、硫酸铵沉淀和离子交换色谱法纯化。或者，可根据以引用方式并入本文中的美闺专利第5,614,382号以重组方式制备CRM附。其它白喉类毒素也适于用作载体蛋白。其它适宜载体蛋白包括经灭活的细菌毒素，诸如破伤风类毒素、百曰咳类毒素、霍乱类毒素(例如，国际专利申请案第WO2004/083251号中所述者[38)、大肠杆菌(五-co//)LT、大肠杆菌ST和来自绿脓杆菌CP從iofo附oBasamigi朋加)的外毒素A。还i，J"使用细斷外膜蛋白质，例如，外膜复合体c(OMPC)、细胞外膜孔道蛋白(porin)、铁传递蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌粘附素蛋白(PsaA)、来自A族或B族链球菌的C5a肽酶、或流感嗜血杆菌(好fle附opfc泌细/縱旭ae)蛋内D。还可用其它蛋白质，例如，卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或结核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)作为载体蛋白。荚胰多糖与载体蛋白进行共轭结合后，可通过多种技术来纯化多糖-蛋白质共轭物(相对于多糖-蛋白质共轭物的量进行富集)。这些技术包括浓縮/透析过滤操作、沉淀/洗脱、柱色谱法及深度过滤。参见下文实例。对各糖共轭物进行纯化后，将其调和在一起以调配可用作疫苗的本发明免疫原性组合物。本发明免疫原性组合物的调配可使用业内公认的方法达成。例如，可将13种单独肺炎球銜井轭物与生理上可接受的媒剂调配在一起来制备所述组合物。这些媒剂的实例包括但不限于水、经缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及葡萄糖溶液。在某些实施例中，免疫原性组合物会包含一种或多种佐剂。如本文所定义"佐剂"是可用来增强本发明免疫原性组合物免疫原性的物质。因此，佐剂常用来加强免疫反应且为熟悉此项技术者所熟知。可增强组合物效力的适宜佐剂包括但不限于-(1)铝盐(明矾)，例如，氨氧化铝、磷酸铝、硫酸铝，等等；(2)水包油型乳液调配物(含有或不含其它特异性免疫调节剂，例如，胞壁酰肽(如下文定义)或细菌细胞壁组份)，例如，(a)MF59(PCT公开案第WO卯/14837号)，其含有5%角鳘烯、0.5%吐温80和0.5%Span85(任选地含有不同量的MTP-PE(见下文，但并非必需》)，使用微射流均质机(例如，型号为110Y的微射流均质机)(微流体技术(Microflddics),牛顿(Newton),MA)将其调配成亚微米颗粒，(b)SAF,其含有10°/。角鲨烯、0.4%吐温抑、5%普罗尼克(pluronic)嵌段聚合物L121和thr-MDP(见下文)，可将其微流化成亚微米乳液或进行涡旋以形成较大粒径的乳液，及(c)Ribi^佐剂系统(RAS)(科里沙(Corixa),汉密尔顿(Hamilton)，MT)，其含有2%角鲨烯、0.2%吐温80和一种或多种选自由阐述于美国专利第4,912,094号中的3-0-去芳基化单磷脂A(MPL)(科里沙)、二分枝菌酸海藻糖(TDM)和细胞娥骨架(CWS)组成的群组的细菌细胞壁组份，优选为^11^+CWS(Detox);(3)可使用皂苷佐剂，诸如Quila或STIMULONtmqs-21(安帝君斯(Antigenics),弗雷明汉(Frarain^iam)，MA)(美国专利第5,057,540号)或由其形成的颗粒，诸如ISCOM(免疫刺激复合体)；(4)细菌脂多糖，合成的脂质A类似物，例如，胺基烷基葡萄糖胺磷酸化合物(AGP)或其衍生物或类似物,其可购自科里沙(Corixa)且阐述于美国专利第6，113,918号中；一种此AGP是2-『(R)-3冲四烷酰基氧基十四烷酰基胺萄乙基2-脱氧-4-0膦酰基-3-0-|:(11)-3-i四烷酰基氧基十四烷酰基]-2-[(R)-3-十四烷酰基氧基十四烷酰基胺基〗-b-D-吡喃葡萄糖苷，其也称作529(先前称作RC529)，可将其调配成水性形式或稳定乳液；又如合成的多核苷酸，例如，含有CpG基序的寡核苷酸(美国专利第6,207,646号)；(5)细胞闲子，例如，介白素(例如，IL-1、IL-2、IL4、IL"5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18,等等)、f扰素(例如，Y干扰素)、粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、协同剌激分子B7-l和B7-2，等等(6〉细菌ADP-核糖化毒素的去毒突变体，例如，呈野生型或突变型的霍乱毒素(CT)(例如，根据公开的国际专利申请案第WO00/18434号(也参见WO02/0诉368及WO02/0诉369)，其中29位氨基酸谷氨酸被另一氨基酸(优选为组氨酸)取代)、12百日咳毒素(PT)、或大肠杆菌热不稳定毒素(LT),尤其是LT-K63、LT-R72、CT-S109、PT-K9/G129(参见，例如，WO93/13302及WO92/19265):及(7)可用作免疫调节剂以增强组合物效力的其它物质.胞壁酰肽包括但不限于N-乙酰基-胞壁酰基-L"苏氨酰基-D"异谷氨截胺(fer-MDP)、N-乙酰基-降胞壁酰吝L-丙氨酸-2Kl，-2，二棕榈酰基湖-甘油-3-羟基磷酰基氧基)^乙胺(MTP-PE),等等本发明疫苗调配物可用于借助经系统或粘膜途径投与疫苗来保护或治疗葛受肺炎球菌感染的人类。这些投与可包括经肌内、腹膜腔内、皮内或皮下途径注射.或经由粘膜向口腔/食道、呼吸道或泌尿生殖道投与。在一个实施例中，使用鼻内投与来治疗肺炎或中耳炎(因可更有效地防止肺炎双球菌的鼻咽运输，从而减弱早期阶段的感染)。对每一疫苗剂中共轭物的量应加以选择，所述量应能够诱发免疫保护反应，而且无明显的副作用。视肺炎球菌血清型而定，所述量会有所变化。一般来说，每一剂会含有0.1至100微克的多糖，具体来说，含0.1至10微克，且更具体来说，含1至5微克》用于特定疫苗的组份的最佳量可通过涉及观察受试者中适当免疫反应的标准研究来确定。初次免疫接种后，受试者可接受一或数次经恰当间隔开的加强免疫。在本发明一个特定实施例中，13vPnC疫苗是分别共轭结合至CRM附的血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F肺炎球菌荚膜多糖的无菌液体调配物。每--0.5毫升剂经调配以含有2微克的各种糖，仅有6B为4微克；约29微克的之CRM附载体蛋白；0.125毫克的元素铝(0.5毫克磷酸铝)佐剂；以及作为赋形剂的氯化钠与琥珀酸钠缓冲剂。将所述液体填装入不含保存剂的单个剂量注射器中。震荡后，疫苗呈均质ftl色悬浮液状态，备用于肌内投与。13vPnC疫苗剂鬚:水平的选择类似于上市的7vPnC疫亩(Prevnar)。对于所有血清型均选择2微克的糖剂量水平，仅6B为每剂4微克。7vPnC疫苗对于血清型4、9V、14、18C、19F和23F在2微克糖剂量水平下以及对于6B在4微克剂量下已显示出合意的安全性、免疫原性和针对IPD的功效。免疫方案可遵循指定用于7vPnC疫苗的方案。例如，针对因纳入13vPnC疫苗中的血清型而由肺炎链球菌'l!起的侵入性疾病的例行方案可用于2、4、6及12至15月龄的婴儿和幼童。本发明组合物也适用于较大儿童、靑少年及成年人。本发明组合物可进一步包括一种或多种针对由其它细菌感染造成的中耳炎的额外抗原。这些细菌包括非典型的流感嗜血杆菌(ifee附opM鄉细/縱《孤)、卡他莫拉菌cfltor^a/fe)(先前称作卡他布兰汉氏菌(丑ra"^wwe/focfltowAafo))和耳炎差异球齒""o/ococc綱舰纽)。适于纳入的非典型流感嗜血杆菌抗原的实例包括P4蛋白质，也称作蛋白质"e"(美国专利第5,601,831号；国际专利申请案第WO03/078453号)、P6蛋白质，也称作PAL或PBOMP-l蛋白质(美国专利第S，110，卯8号；国际专利申请案第WO01007卯号)、P5蛋白质(美国再公告专利第37,741号)、嗜血杆菌黏附和透过蛋白(美国专利第6,245,337号及第6,676,948号)、LKP尖端粘附素蛋白(美国专利第5,643,725号)及NucA蛋白(美国专利第6,221,365号)。适于纳入的卡他莫拉菌抗原的实例包括UspA2蛋白(美国专利第5,552,146号、第6，31(J,1卯号)、CD蛋白(美国专利第5,725,862号)、E蛋白(美国专利第5，9我412号)及74kD外膜蛋白质(美国专利第6,899,885号)。适于纳入的耳炎差异球菌抗原的实例包括那些在国际专利申请案第WO03/048304号中得到鉴别者。本发明组合物还可包括一种或多种来自肺炎链球菌的蛋白质。适于纳入的肺炎链球菌蛋白质的实例包括那些在国际专利申请案第WO02/083855号中得到鉴别者，.以及阐述于国际专利申请案第WO02/053761号中的肺炎链球菌蛋白质。本发明组合物可进一步包括一种或多种脑膜炎双球菌(iSfe&掀towe"f"辨Z淑〉类型B的蛋白质。适于纳入的脑膜炎双球菌类型B蛋白质的实例包括那些在国际专利申请案WO03/063766、WO2004/094596、WO01/85772、WO02/16612和WO01/87939中得到鉴别者。麟楚微逾微旭邻游一絲f麟絲敏涯血淸型19A比其它肺炎链球菌血清型更容易发生热降解，这是因为在其亚单位之间存在磷酸.衍键。为了改良共轭结合效率及控制生来不稳定的血清型19A多糖的稳定性，在血清型19A多糖与载体蛋白CRMw7的共轭结合中于二甲基亚砜(DMSO)存在时进行一起冻千和共轭结合过程。就分子大小和血清型19A游离糖的百分比来说，此过程与使用涉及在DMSO中分别冻干多糖与载体蛋白的共轭结合过程或涉及在无DMSO时在水性介质中一起冻干多糖与载体蛋白的过程相比可提供改良的共轭物特征。如在下文实例17中更具体地阐述,血清型19A多糖与载体蛋白CRM197的共轭结合是一个两步反应过程。第一歩涉及高碘酸氧化(活化)以在多糖上产生反应性醛基团。随后通过超滤来纯化活化多糖以去除糖片段和小分子反应副产物。随后将所述活化多糖与CRM197合并在一起并与作为低温防护剂的蔗糖一起冻干。借助还原胺化反应作用机制于氰狨硼氢化钠存在时在DMSO中实施共轭结合步骤。通过添加硼氢化钠来还原(封端)未反应醛棊团。随后纯化所述共轭物以去除未反应CRM,97和糖片段(例如，通过依次经由磷酸盐缓冲液及缓冲盐水透析过滤)，获得糖共轭物在缓冲盐水中的最终批料浓缩物。尽管在上文所述方法中的优选载体蛋白是突变白喉毒素CRM197，但在本发明方法中也可以使用其它载体蛋白与血清型19A多糖共轭结合。应选择载体蛋白以增加结合血清型19A多糖的兔疫原性及/或产生针对所述载体蛋白的抗体，这些抗体在诊断上、分析上及/或治疗上有益。抗原性分子(例如，多糖)与载体的共价连接可赋予增强14免疫原性和T-细胞依赖性(波日髙伊(Pozsgay)等人(1999)美国国家科学院院刊OW必)，96:5194-97;里(Lee)等人(1976)免疫学杂志(J./附附柳o/.),116:1711-18;丁兹(Dintzis)等人(1976)美国国家科学院院刊(/W必)，73:3671-75)。如本文所述，有用的载体蛋白包括经灭活的细菌毒素，例如，破伤风类毒素、百日咳类毒素、:霍乱类毒素(例如，如在国际专利申请案WO2004/083251中所述)、大肠杆菌(五.LT、大肠杆菌ST和来自绿脓杆菌(i^ewflto附owosflen^加加)的外毒素A。还可使用细菌外膜蛋白质，例如，外膜复合体c(OMPC)、细胞外膜孔道蛋白(poriii):、铁传递蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌粘附素蛋白(PsaA)、来自A族或B族链球菌的C5a肽酶、或流感嗜血杆菌(Wae加qpMws/續"e旭ae)蛋白D。还可用其它蛋白质，例如，卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白或结核菌素的纯化蛋白衍生物作为载体蛋白。尽管此在DMSO中一起冻干及共轭结合过程阐述用于血清型19A多糖，但此过程也可用于在结构上与血清型19A类似且在其两个重复单元之间也含有磷酸二酷键的血清型，例如，6A、6B和19F。上文揭示内容概括性地阐述了本发明。参考以下具体实例可获得更为全面的理解。这些实例仅用于举例说明的目的而非意欲对本发明的范围加以限制。实例实例l肺炎链球菌荚膜多糖血清型1的制备主细胞库和工作细胞库的制备肺炎链球菌血清型1自美国典型培养物收藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC)获得，菌株6301。制备若干代菌种储备物以扩繁菌株并去除动物源组份(Fl、F2和F3代)。制备额外的两代菌种储备物。额外的第一代由F3小瓶的菌液制备而成，而随后的一代由所述额外的第一代制备而成。以合成甘油作为低温保存剂来冷冻(<-70°C)保存所述菌种小瓶。除冷冻小瓶外，对于F4代也制备经冻千小瓶。对于细胞库制备，使所有培养物生长于以大豆为主的培养基中。冷冻之前，通过离心浓縮细胞，去除余下的培养基并将细胞沉淀重新悬浮于含有低温保存剂(例如，合成甘油)的新鲜培养基中。发酵和收集使用来,工作细胞库的培养物来接种含有以大豆为主的培养基的接种瓶。将各瓶在36"C±2'C(无搅拌)下培育直至满足生长要求为止。使用接种瓶接种含有以大豆为主的培养基的询'种发酵罐。用无菌碳酸钠溶液维持约7.0的pH值。达到目标光密度后，使用菌种发酵罐接种含有以大豆为主的培养基的生产发酵罐。用无菌碳酸钠溶液维持pH。在生长停止后或达到发酵罐工作体积时终止发酵。向培养物中添加适宜量的12%无菌脱氧胆酸钠以裂解细菌细胞并释放细胞结合多糖。裂解后，冷却发酵罐内含物。用乙酸将经裂解培养液的pH调节至约pH6.6。通过连续流动离心接着进行深度过滤及0.45微米微孔过滤来澄清裂解物。在一个替代方法中，用3NNaOH维持约7.0的发酵pH。达到目标光密度后，使用菌种发酵罐接种含有以大豆为主的培养基的生产发酵罐。用3NNaOH维持pH。在生长停止后或达到发酵罐工作体积时终止发酵。向培养物中添加适宜量的12%无菌脱氧胆酸钠以在培养液中得到0.12%的浓度，从而裂解细菌细胞并释放细胞结合多糖。裂解后,边搅拌边在介于7'C至13*€之间的温度下使发酵罐内含物保持8至24小时之间的时间间隔，以确保细胞裂解及多糖释放进行完全。在此保持期间进行搅拌以防止裂解物沉淀沉积于发酵罐壁及pH探头上,从而使所述pH探头能够保持完好。接下来,用50。/。乙酸将裂解培养液的pH调节至约pH5.0。保持一段时间后(无搅拌，时间间隔介于12小时至24小时之间，温度介于151C至25r之间)，大部分先前可溶的蛋白质由溶液中析出成为固体沉淀物，其中留在溶液中的多糖几乎无损失或无降解。通过连续流动离心接着进行深度过滤及0.45微米微孔过滤来澄清含有沉淀物的溶液。纯化肺炎球菌多糖的纯化由若干浓縮/透析过滤操作、沉淀/洗脱、柱色谱和深度过滤步骤构成。除非另有说明，否则，所有程序均在室温下实施。将来自肺炎链球菌血清型1的发酵罐培养物的澄清培养液浓缩并使用100kDaMWCO(千道尔顿分子量截流)过滤器进行透析过滤。使用磷酸钠缓冲液在中性pH下达成透析过滤。通过透析过滤自较高分子量的生物高分子(例如，核酸、蛋白质和多糖)中去除低分子M培养基组份。逝过添加来A储备溶液的十六烷基三甲基溴化铵(HB)达1%1(w/v)终浓度来自经浓縮且经透析过滤的溶液中沉淀出多糖。在深度过滤器上收集多糖/HB沉淀物并弃去滤液。通过使氯化钠溶液循环通过含有沉淀物之深度过滤器来重新溶解及洗脱多糖沉淀物。然后用额外氯化钠溶液漂洗过滤器。将来ANaI储备溶液的碘化钠(Nal)添加至多糖溶液中以达到0.5%的终浓度从而沉淀HB。通过深度过滤去除沉淀物。滤液含有目标多糖。用NaCl/Nal溶液漂洗沉淀容器及过滤器并将漂洗液与经部分纯化的多糖溶液合并。弃去滤液。然后使多糖通过0.2微米过滤器过滤。在30kDaMWCO超滤器上浓縮多糖溶液并用氯化钠溶液透析过滤。通过经由经活性炭浸渍的深度过滤器过滤来进一步纯化经部分纯化的多糖溶液。过滤后，W氯化钠溶液漂洗所述炭过滤器。将漂洗液与多糖溶液合并，然后使之通过0.2微米的过滤器进行过滤。借助30kDaMWCO超滤器浓缩多糖溶液并用1M磷酸钠缓冲液对其加以调节得到0.025M磷酸钠终浓度。检査pH并调节至7.0±0.2。用含有氯化钠的磷酸钠缓冲液平衡陶瓷羟基磷灰石(HA)柱以得到适宜电导率(<15^S)。然后将多糖溶液上样至柱上。在这些条件下，杂质结合于树脂上且可自流经柱的液流中回收多糖。使多糖溶液过滤通过置于柱之前及之后的0.2微米在线过滤器。使用30kDaMWCO过滤器浓縮多糖溶液。然后用注射用水(WFI)透析过滤浓缩物》通过0.2微米膜滤器将经透析过滤的多糖溶液过滤到聚丙烯瓶中。取出样品供测试并将经纯化的多糖冷冻保存于-25"C±5"下。定性通过赋予多糖分子质子的信号的分配可知1H-NMR数据与化学结构相一致。1H-NMR谱显示出一系列解析度良好的信号(质子来自甲基)从而可用于定量多糖中O-乙酰基官能团。通过逆流免疫电泳使用特异性抗血清确认单价多糖的身份。使用偶联有折射率和多角度激光光散射(MALLS)检测器的高效凝胶过滤色谱并结合样品浓度来计算分子量。使用尺寸排除色谱介质(CL4B)展示多糖的相对分子大小分布。实例2血清型1肺炎球菌糖《RMw共轭物的制备活化和共轭结合使含有经纯化多糖的容器解冻且合并于反应容器中。向所述反应器中添加0.2M碳酸钠(pH9.0)以在501C下进行3小时的部分脱乙酰基作用(水解)。将反应物冷却至20'C并通过0.2M乙酸实施中和。通过在2至8'C下培育来实施高碘酸钠存在下的轼化，并将混合物搅拌15至21小时。将活化反应混合物浓缩并用30KMWCO膜以0.9%NaCl过滤透析10x。滞留物经0.2微米过滤器过滤。将经活化的糖填装入100毫升玻璃冻千瓶中且在-75'C下实施滚动冷冻然后进行冷冻干燥。"滚动冷冻"是用于制备供冻干(冷冻干燥)的样品的方法。在含有醇或任一其它适宜流体的冷冻浴中通过电机驱动滚筒自动旋转培养瓶。使一薄层产物在培养瓶"外壳"内侧各处得到均匀冷冻，从而使更大体积的材料在每次冷冻干燥运行期间得到安全加工。这些向动化冷冻装置提供了一种能够同时预冷冻许多培养瓶、在内侧形成期望涂层并为有效冷冻干燥提供足够表面积的简便而有效的方法。使含冇冻T材料的瓶升至室温并以2:1的糖/蛋白质比率重悬于CRMw溶液中。向糖/蛋白质混合物屮加入1M磷酸钠缓冲液以达0.2M最终离子强度及7.5pH值,然后添加氰基硼氢化钠。将反应物在23'C下培育18小时,然后再在37'C下培育72小时。与氰基硼^化物一起培育之后，用冷盐水稀释反应混合物，之后加入1M碳酸钠以将反应混合物pH调节至9.0。通过添加硼氢化钠在23'C下培育3至6小时来淬灭未反应的醛。用盐水将反应混合物稀释2倍并使其通过0.45至5微米预过滤器转移到滞留物容器中。将反应混合物用0.15M磷酸盐缓冲液(pH6)透析过滤30x并用盐水透析过滤1720x。通过0.2微米过滤器过滤滞留物。将共轭物溶液在0.9%盐水中稀释成目标浓度为0.5毫克/毫升,且随后在IOO:级通风橱中将其无菌过滤到最终总体浓缩物(FBC)容器中。将共轭物保存于2卩至8'C下。雄使用尺寸排除色谱介质(CL4B)展示共轭物的相对分子大小分布-通过狭缝印迹分析使用特异性抗血清确认共轭物的身份。分别通过醛糖酸及罗瑞(Lowy)分析测定糖与蛋白质浓度。共价结合的共轭复合物中糖与蛋白质的比率可通过如下计算获得微克/毫升糖比率-_微克/毫升蛋白通过Hestrin法测量O-乙酰基含量(西斯里恩(Hestrin)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)1949,180,第249页)。根据O"乙酰基浓度与总糖浓度的比率得到每毫克糖中O-乙酰基的微摩尔数。实例3肺炎链球菌荚膜多糖血清型3的制备主细胞库和工作细胞库的制备ft罗伯特(Robert)博士(奥地利人(Austrian),宾夕法尼亚大学(UniversityofPennsylvania),费城(Philadelphia),宾夕法尼亚(Pennsylvania))处获得肺炎链球菌的血清型3。有关细胞库系统的制备，参见实例l。发酵和收集使用来自工作细胞库的培养物接种含有以大豆为主的培养基的接种瓶。将各瓶在36t:±2'C(无搅拌)下培育直至满足生长要求为止。使用接种瓶接种含有以大豆为主的培养基的齒种发酵罐。用无菌碳酸钠溶液維持约7.0的pH值。达到目标光密度后，使用菌种发酵罐接种中间菌种发酵罐。达到目标光密度后，使用中间菌种发酵罐接种生产发酵罐。用无—尚'碳酸钠溶液维持pH。达到发酵罐工作体积后终止发酵。向培养物中添加适宜莆的12%无菌脱氧胆酸钠以裂解细菌细胞并释放细胞结合多糖。裂解后，冷却发酵罐内含物。用乙酸将经裂解培养液的pH调节至约pH6.6。通过连续流动离心接着进行深度过滤及0.45微米微孔过滤来澄清裂解物。纯化肺炎球斷多糖的纯化rh若干浓缩/透析过滤操作、沉淀/洗脱、柱色谱和深度过滤步骤构成。除非另冇说明，否则，所有程序均在室温下实施。将来自肺炎链球菌血清型3发酵罐培养物的澄清培养液浓縮并使用100kDaMWCO过滤器进行透析过滤。使用磷酸钠缓冲液在中性pH下达成透析过滤。通过透析过滤自较高分子量的生物高分子(例如，核酸、蛋白质和多糖)中去除低分子量培养基组份。在添加十六烷基三甲基溴化铵(HB)之前，向经浓缩及经透析过滤的多糖溶液中加入经计算体积的NaCl储备溶液以得到0.25MNaCl终浓度。然后通过添加来自储备溶液的HB达1%HB(w/v)终浓度来沉淀多糖。借助深度过滤器收集多糖/HB:沉淀物并弃去滤液。通过使氯化钠溶液循环通过含有沉淀物的深度过滤器来重新溶解及洗脱多糖沉淀物。然后用额外氯化钠溶液漂洗过滤器。将来自NaI储备溶液的碘化钠(Nal)添加至多糖溶液中以达到0.5%终浓度从而沉淀HB。通过深度过滤去除沉淀物。滤液包含目标多糖。用NaCl/Nal溶液漂洗沉淀容器及过滤器并将漂洗液与经部分纯化的多糖溶液合并。弃去滤液。随后使多糖通过0.2微米过滤器过滤。在30kDaMWCO超滤器上浓缩多糖溶液并用氯化钠溶液透析过滤。通过经由经活性炭浸渍的深度过滤器过滤来进一步纯化经部分纯化的多糖溶液。过滤后，用氯化钠溶液漂洗所述炭过滤器。将漂洗液与多糖溶液合并，随后使之通过0.2微米过滤器进行过滤。在30kDaMWCO超滤器上浓缩多糖溶液并用1M磷酸钠缓冲液对其加以调节得到0.025M磷酸钠终浓度。检查pH并调节至7.0i0.2。用含有氯化钠的磷酸钠缓冲液平衡陶瓷羟基磷灰石(HA)柱以得到适宜电导率U5pS)。然后将多糖溶液上样至柱上。在这些条件下，杂质结合于树脂上且可自流经柱的液流屮回收多糖。使多糖流过含有缓冲液的柱并通过0.2微米过滤器过滤。使用30kDaMWCO过滤器浓縮多糖溶液。然后用WFI透析过滤浓縮物。通过0.2微米膜滤器将经透析过滤的多糖溶液过滤到不锈钢容器中。取出样品供释放测试并将经纯化的多糖冷冻保存于—25'C士5'C下。定性通过赋予多糖分子质子的信号的分配可知1H-NMR数据与化学结构相一致。通过逆流免疫电泳使用特异性抗血清确认单价多糖的身份。使用与折射率和多角度激光光散射(MALLS)检测器偶接的高效凝胶过滤色谱并结合样品浓度来计箅分子量。使用尺寸排除色谱介质(CL4B)展示多糖的相对分子大小分布。实例4血清型3肺炎球菌糖"CRM柳共轭物的制备活化和共轭.使含血清奴3糖的容器解冻且合并于反应容器中。向所述反应器中，加入WFI及2M乙酸以达0.2M及2毫克/毫升糖之终浓度。使溶液温度升高至851C保持1小时以水解多糖。将反应物冷却至《5t:并添加lM氯化镁以达0.1M终浓度。通过在23'C下培育16至24小时实施高碘酸钠存在下的氧化。将活化反应混合物浓缩并用100KMWCO膜以WFI透析过滤10x。通过0.2微米过滤器过滤滞留物。对于调合，将0.2M磷酸钠(pH7.0)添加至经活化糖中以达10mM的终浓度及6.0至6.5的pH。将CRMw7载体蛋白与糖溶液混合以得到2克比1克的糖/CR线9比率。将合并的糖/蛋白质溶液填装至l加毫升玻璃冻干瓶中(目标填装量为50毫升)，在-75C下实施滚动冷冻，然后进行冷冻干燥。使含有经一起冻干的糖/蛋白质材料的瓶升温至室温并重新悬浮于0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.0)中以达20毫克/毫升的糖终浓度。将？11调节至.6.5且随后添加0.5摩尔当量的氰基硼氢化钠。将反应物在37C下培育48小时。与氰基硼氢化物"起培育后，用冷的5mM琥珀酸Sl/0.9。/。盐水缓冲剂稀释反应混合物。通过添加硼氢^钠并在23C下培育3至6小时来淬灭未反应的醛。使所述反应混合物通过0.45至5微米前过滤器转移至滞留物容器中。用0.1M磷酸盐缓冲液(pH9)将反应混合物透析过滤30x，用(U5M磷酸盐缓冲液(pH6)透析过滤20x,并用5mM琥珀酸^1/0.9%盐水透析过滤20x。通过0.2微米过滤器过滤滞留物。将共轭物溶液稀释成糖目标浓度为0.5毫克/毫升，并在100级通风橱中将其无菌过滤到FBC容器中。将共轭物保存于2至8t!下。雄使用尺寸排除色谱介质(CL-4B)展示共轭物的相对分子大小分布。通过狭缝印迹分析使用特异性抗血清确认共轭物的身份。分别通过恩荣(Anthrone)及罗瑞(Lowry)分析来测定糖与蛋白质浓度。共价结合的共轭复合物中糖与蛋白质的比率可通过如下计算获得微克庵升糖比率--微克/毫升蛋白实例S肺炎链球菌荚膜多糖血清型S的制备fi纽约州立大学(布哲克林(Brooklyn),纽约)的吉拉德希夫曼(GemldScWffinan)博士处获得肺炎球菌血清型5。有关细胞库系统的制备，参见实例l。有关多糖发酵、收获、纯化及定性，参见实例1。替代发酵方法使用来A工作细胞库的培养物接种含有以大豆为主的培养基及10mM无菌NaHC03溶液的接种瓶。将各瓶在36X:±2'C(无搅拌)下培育直至满足生长要求为止。使用接种瓶接种含有以大豆为主的培养基及10mM无菌NaHC03溶液的菌种发酵罐。用3NNaOH維持约7.0pH。达到目标光密度后，使用菌种发酵罐接种含有以大豆为主的培养棊(其屮NaHC03浓度为10mM)的生产发酵罐。用3NNaOH维持pH。20在生长停止后或达到发酵罐工作体积时终止发酵。向培养物中添加适宜量的12%无菌脱氧胆酸钠以在培养液中得到0.12%的浓度，从而裂解细菌细胞并释放细胞结合多糖。裂解后,边搅拌边在介于7'C至13"C之间的温度下使发酵罐内含物保持8至24小时之间的时间间隔，以确保细胞裂解及多糖释放进行完全。在此保持期间进行搅拌以防止裂解物沉淀沉积于发酵罐壁及pH探头上,从而使所述pH探头能够保持完好。接下来，用50%乙酸将裂解培养液的pH调节至约pH4.5。保持一段时间后(无搅拌，时间间隔介于12小时至24小时之间，温度介于15t:至25t:之间)，大部分先前可溶的蛋白质由溶液中析出成为固体沉淀物，其中留在溶液中的多糖几乎无损失或无降解。通过连续流动离心接着进行深度过滤及0.45微米微孔过滤来澄清含有沉淀物的溶液。.实例6血清型S肺炎球菌糖《RM，共轭物的制备活化和共轭结合使含血清型5糖的容器解冻且合并于反应容器中。向所述反应器中加入0.1M乙酸钠(pH4.7)，之后通过在23t!下培育16至22小时实施高碘酸钠存在下的氧化。将活化反应混合物浓缩并用100KMWCO膜以WFI透析过滤10X。通过Q.2微米过滤器过滤滞留物。将血清型5活化糖与CRM197W0.8:1的比率棍合。将合并的糖/蛋白质溶液填装至100毫升玻璃冻千瓶中(目标填装量为50毫升)，在-75'C下实施滚动冷冻，并一起冷冻乾燥。使含有经--起冻干的材料瓶升温至室温并重新悬浮于0.1M磷酸钠(pH7.5)中且添加氰-站硼氢化钠。将反应物在3(TC下培育72小时，之后再添加一次氰基硼氢化物并在30tF培育20至28小时。与氰基硼贫化物--起培育后，用盐水将反应混合物稀释2倍并通过0.45至5微米前过滤器将其转移m滞衔物容器中。用0.01M磷酸盐缓冲液(pH8)将反应棍合物透析过滤30x，用0.15M磷酸盐缓冲液(pH6)透析过滤20x,并用盐水透析过滤20x。通过0.2微米过滤器过滤滞留物。将共轭物溶液稀释成糖目标浓度为0.5毫克/毫升，并在100级通风橱中将其无菌过滤到FBC容器中。将共轭物保存于2至8D下。有关共轭物的特性，参见实例2。实例7肺炎链球菌荚膜多糖血清型6A的制备fl纽约州立大学(布鲁克林(Brooklyn)，纽约)的吉拉德希夫曼(GeraldSchiffinan)博上处获得肺炎球菌血清型6A。有关细胞库系统的制备，参见实例1。有关多糖发酵、收获及纯化，參见实例l,但在纯化期间，于进行色谱步骤之前省略了30kDaMWCO浓縮歩骤。实例8血清型6A肺炎球自《RM，共轭物的制备活化和共轭结合血清型6A多糖是高分子量聚合物，在氧化前须使之减小。使含血清型6A糖的容器解冻且合并于反应容器中。向所述反应器中，添加2M乙酸以达0.1M的终浓度，在60"下水解1.5小时。将反应物冷却至23"并通过用1MNaOH将反应混合物pH调节至6来实施中和。通过在23t!下培育14至22小时来实施高碘酸钠存在下的氧化。将活化反应混合物浓縮并用100KMWCO膜以WFI透析过滤10X。通过0.2微米过滤器过滤滞留物。将血清型6A与蔗糖调合在一起并填装至100毫升玻璃冻干瓶中(目标填,量为50毫升)并在-75C下实施滚动冷冻且进行冷冻干燥。使含有冻乾材料的瓶升温至室温并以1:1之糖/蛋白质比率重悬于二甲基亚砜(DMSO)中。添加氰基硼氢化钠后，将反应混合物在231C下培育18小时。与氰基硼氢化物一起培育后，用冷的盐水稀释反应混合物。通过添加硼氢化钠在23t:下培育3至20小时来淬灭未反应的醛。将经稀释的反应混合物通过5微米前过滤器转移至滞留物容器中。用0.9%NaCl将反应混合物透析过滤10x并用经琥珀酸盐缓冲的NaCl透析过滤30x。通过0.2微米过滤器过滤滞留物。将共轭物溶液稀释成糖目标浓度为0.5毫克/毫升，并在100级通风橱中将其无菌过滤到FBC容器中。将共轭物保存于2至8'C下。冇关共轭物的特性，参见实例2。实例9肺炎链球菌荚膜多糖血清型7F的制备自纽约州立人学(布鲁克林(Brooklyn)，纽约)的吉拉德希夫曼(G纹aWSchiffman)博士处获得肺炎球菌血清型7F。有关细胞库系统的制备以及有关多糖的发酵及收获，参见实例3。对于替代发酵及收获方法，参见实例1中所述替代方法。纯化肺炎球稱'多糖的纯化由若干浓缩/透析过滤操作、沉淀/洗脱、柱色谱和深度过滤歩骤构成。除:ll;另有说明，否则，所有程序均在室温下实施。将来自肺炎链球菌血清型7F发酵罐培养物的澄清培养液浓縮并使用100kDaMWCO过滤器进行透析过滤。使用磷酸钠缓冲液在中性pH下达成透析过滤。通过透析过滤自较高分子量的生物高分子(例如，核酸、蛋白质和多糖)中去除低分子量培养基组份。血清型7F不与HB形成沉淀。取而代之，通过添加来自储备溶液的HB以达1%HB终浓度来自经浓缩及经透析过滤的溶液中沉淀杂质。在深度过滤器上收集沉淀物并弃去滤液。在滤液中得到多糖。将来自Nal储备溶液的碘化钠(Nal)添加至多糖溶液中以达到0.5%终浓度从而沉淀HB。通过深度过滤去除沉淀物。滤液包含目标多糖。用NaO/Nal溶液漂洗沉淀容器及过滤器并将漂洗液与经部分纯化的多糖溶液合并。弃去滤液。然后通过0.2微米过滤器过滤多糖。借助30kDaMWCO超滤器浓缩多糖溶液并用氯化钠溶液透析过滤。通过经由经活性炭浸渍的深度过滤器过滤来进一步纯化经部分纯化的多糖溶液。过滤后，用氯化钠溶液漂洗所述炭过滤器。将漂洗液与多糖溶液合并，然后使之通过0.2微米过滤器进行过滤。借助30kDaMWCO超滤器浓縮多糖溶液并用1M磷酸钠缓冲液对其加以调节得到0.025M磷酸钠终浓度。检查pH并调节至7.0士0.2。用含有氯化钠的磷酸钠缓冲液平衡陶瓷羟基磷灰石(HA)柱以得到适宜电导率U5(iS)。然后将多糖溶液上样至柱上。在这些条件下，杂质结合于树脂上且可自流经柱的液流中回收多糖。使多糖流过含有缓冲液之柱并通过0.2微米过滤器过滤。使用30kDaMWCO过滤器浓缩多糖溶液。然后用WFI透析过滤浓缩物。通过0.2微米膜滤器将经透析过滤的多糖溶液过滤到不锈钢容器中。取出样品供释放测试并将经纯化的多糖保存于2"C至8C下。有关多糖的特性，参见实例3。实例IO血清型7F肺炎球菌糖-CRMw共轭物的制备活-化和共轭结合通过存:23'C卜'培ft'16辛24小时实施高碘酸钠存在下的氧化。将活化反应混合物浓缩并用IOOKMWCO膜以10mMNaOAc(pH4.5)透析过滤IOX。通过(K2微米过滤器过滤滞留物。将血衍型7F填装至100毫升玻璃冻干瓶中(目标填装量为50毫升)并在-75'C下实施滚动冷冻然后进行冷冻干燥。使含有冻T血洁型7F及CRM柳的瓶升温至室温并以1.5:1之糖/蛋白质比率重悬r-DMSO屮。添加氰基硼氢化钠后，将反应物在23TC下培育8至10小时。通过添加硼氢化钠在23'C下培脅'16小时来淬灭未反应的醛。用冷盐水将反应混合物稀释10倍并使其通过5微米预过滤器转移至滞留物容器中。将反应混合物川0.9%盐水透析过滤10x并用经琥珀酸盐缓冲的盐水透析过滤30x。通过0.2微米过滤器过滤滞銜物。将共轭物溶液存:0.9%盐水中稀释成糖目标浓度为0.5毫克/毫升，且随后在100级通风橱屮将其无齒过滤到FBC容器中。将共轭物保存于2至8'C下。有关共轭物的特性，参见实例4。实例ll肺炎链球菌荚膜多糖血清型19A的制备fej纽约州、'/:大学(布鲁克林(Brooklyn),纽约)的吉拉德希夫曼(GeraldSchiffman)23博士处获得肺炎球菌血清型19A。有关细胞库系统的制备，参见实例1。有关多糖的发酵、收获及纯化，参见实例7。关于定性，参见实例3。实例12血清型19A肺炎球菌糖"CRMw7共轭物的制备靴織轭絲使含血清型19A糖的容器解冻且合并于反应容器中。添加乙酸钠达10mM:(pH5.0)并在高碘酸钠存在下通过在23C下培育16至24小时来实施氧化。将活化反应混合物浓縮并用100KMWCO膜以10mM乙酸盐(pH5.0)透析过滤IOX。通过(K2微米过滤器过滤滞留物。将经活化糖与蔗糖混合，之后添加CRMW。将血清型19A活化糖与CRM,97之混合物(二者比为0.8:1)填装至100毫升玻璃冻干瓶中(目标填装量为50毫升).并在-751C下实施滚动冷冻且进行冷冻干燥。使含有冻千材料的瓶升温至室温并重新悬浮于DMSO中。向糖/蛋白质混合物中添加氰基硼氢化钠(100毫克/亳升)。将反应物在23"下培育15小时。与氰華硼氢化物一起培育后，通过添加硼氢化钠并在23"C下培育3至20小时来淬灭未反应的醛。用冷盐水将反应混合物稀释10倍并使其通过5微米预过滤器转移至裙留物容器中。将反应混合物用0.9%NaCl透析过滤10x,经0.45-微米过滤器过滤，并用5mM琥珀酸盐/0.9MNaCl缓冲液(pH6)透析过滤30x。通过0.2微米过滤器过滤滞留物。用5mM琥珀酸盐/0.9%盐水将共轭物溶液稀释成目标浓度为0.5毫克/毫升，并在100级通风橱中将其无菌过滤到FBC容器中。将共轭物保存于2'C至8"C下。冇关共轭物的特性，参见实例4。实例13肺炎链球菌荚膜多糖的制备血清型4、6B、9V、14，18C、19F及23F肺炎链球菌菌种培养物的制备自纽约州立大学(布鲁克林(Brooklyn),纽约)的吉拉德希夫曼(GeraWSchiffin肌)博士处获得肺炎球菌血清型4、6B、9V、18C、19F及23F。肺炎链球菌的血清型14自ATCC获得，菌株6314。分别使用含冇每一期望的肺炎链球菌血清型的小瓶来开始发酵批次。使用碳酸钠将含有以大:S为主的培养基及酚红的两个瓶的pH调节至7.4±0.2范围内，且随后向两个瓶中添加所需体积的50%葡萄糖/1%硫酸镁溶液。用不同量的菌种接种这两个瓶。在36'C±2'C下培育这两个瓶直到培养基变为黄色为止。培育之后，自每一瓶中取出样品并测试光密度(OD)(0.3至0.9)及pH(4.6至5.5)。选择两瓶之一用于接种菌种发酵罐。将以大豆为.:):的培养基转移至菌种发酵罐中并灭菌。然后向发酵罐中添加一定体积的50%葡萄糖/1°/。硫酸镁溶液。监测并控制菌种发酵罐的pH及搅拌情况(pH6/7至7.4)。将温度维持在36'C±2"。以无菌方式将菌种接种物(瓶)连接至菌种发酵罐上并转移接种物。将发酵罐保持在pH控制下并定期取出样品且进行OD及pH测试。当在幼0纳米处达到0.5期望OD时，用来自菌种发酵罐的发酵培养液接种中向发酵罐o将以大豆为主的培养基转移至中间发酵罐中并灭菌。然后向发酵罐中添加，定体积的50%葡萄糖/1%硫酸镁溶液。监测并控制中间发酵罐的pH及搅拌情况(pH6,7至7.4)。将温度维持在36C±21C。将菌种发酵罐的内含物转移至中间发酵罐中。将发酵罐保持在pH控制下并定期取出样品且进行OD及pH测试。当在600纳米处达到0.5期望OD时，用来自中间发酵罐的发酵培养液接种生产发酵罐。将以大豆为主的培养基转移至生产发酵罐中并灭菌。然后向发酵罐中添加一定体积的50%葡萄糖/1%硫酸镁溶液。监测并控制生产发酵罐的pH及搅拌情况(pH6/7至7.4)。将温度维持在36"C士2t:。将发酵罐保持在pH控制下并定期取出样品且进行OD及pH测试，直至发酵完成为止。将脱氧胆酸钠添加至发酵罐中达约0.12%w/v终浓度。将反应物混合最少30.分钟且将温度设定点降至10t!。将培养物培育过夜，且在确认灭活后，用50%乙酸将培养物的pH调节至6.4至6.8之间(必要时)。使发酵罐的温度升高至20"Cdfc5"C并将内含物转移至澄清储存罐中。使澄清储存罐的内含物(包括细胞碎片)以介于25至6簡升/小时的流速(血清型4除外，其中弃去了细胞碎片且流速固定在25至250升/小时之间)通过离心机加以处理。取!H卜.珩液样品并进行OD测定。离心期间的期望OD为^0.15。起初，使上浩液再循环经过深度过滤器总成，直至达到0.05±0.03的OD。然后使上清液通过深度过滤器总成并通过0.45微米膜滤器直至到达滤液储存罐。接下来，将产物通过闭管转移至用于加工的纯化区。所有上.述操作(离心、过滤及转移)均在10t:至30'C之间实施。.有关血清型4及6B的替代发酵及收获方法，参见实例1中所述替代方法。纯化每一肺炎球菌多糖的纯化由若千浓缩/透析过滤操作、沉淀/洗脱、柱色谱和深度过滤步骤构成。除非另有说明，否则，所有程序均在室温下实施。将来ff期裙肺炎链球菌血清型的发酵罐培养物的澄清培养液浓缩并用100kDaMWCO过滤器透析过滤。使用磷酸钠缓冲液在pIK9下完成透析过滤。通过透析过滤自较]^分了镇的生物高分子(例如，核酸、蛋白质和多糖)中去除低分子量培养基组份。通过添加来自储备溶液的HB以达l。/nHB(w/v)终浓度(血清型23F除外，其具有2.5%终浓度)自经浓缩及经透析过滤的溶液中沉淀多糖。借助深度过滤器收集多糖/HB沉淀物并弃去滤液。(注意血清型14不会沉淀；因此需保留滤液。)通过使氯化钠溶液循环通过含有沉淀物的深度过滤器来重新溶解及洗脱多糖沉淀物。然后用额外氯化钠溶液漂洗过滤器。将来自NW储备溶液的碘化钠(Nal)添加至多糖溶液中达0.5%终浓度以沉淀HB(血清型6B除外，其具有0.25%终浓度)。通过深度过滤去除沉淀物。滤液包含目标多糖。弃去滤液。然后通过0.2微米过滤器过滤多糖。借助30kDaMWCO超滤器浓缩多糖溶液并用氯化钠溶液透析过滤。通过经由经活性炭浸渍的深度过滤器过滤来进一步纯化经部分纯化的多糖溶液。过滤后，用氯化钠溶液漂洗所述炭过滤器。将漂洗液与多糖溶液合并，然后使之通过0.2微米过滤器进行过滤。借助30kDaMWCO超滤器浓缩多糖溶液并用氣化钠溶液漂洗过滤器。检查pH并调节至7.0±0.3。用含有氯化钠的磷酸钠缓冲液平衡陶瓷羟基磷灰石(HA)柱直至pH达7.0士0.3且电导率达26土4^S为止。然后将多糖溶液上样至柱上。在这些条件下，杂质结合于树脂上且可自流经柱的液流中回收多糖。然后通过0.2微米过滤器过滤多糖溶液。使用30kDaMWCO过滤器浓缩多糖溶液。然后用WFI透析过滤浓缩物直至电导率达<15fiS为止。使经透析过滤的多糖溶液通过0.2微米膜滤器过滤到主体容器中并保存于2至8"C下。实例M血清型4、6B、9V、14、18C、19F及23F的肺炎球菌糖-CRM，97共轭物的制备活化方法如木实例所述，不同血清型糖遵循不同的活化途径(活化前进行水解或不进行水解)及共轭结合(水性成DMSO反应)。将多糖ft主体容器转移至反应器中。然后将多糖稀释于WFI及磷酸钠中以使终浓度介于1.6.辛:2.4毫克/毫升之间。对于血清型6B、9V、14、19F及23F,将pH调节至pH6.0士0J。对于血清型4，添加盐酸(O.WM之酸终浓度)并将溶液在45"±21下培育25至35分钟。通过冷却至21至25"C并添加1M磷酸钠达6.7i0.2目标pH来停止水解。实施加工过程中的测试来确认去丙酮酸化的适当水平。对于血清艰18C,添加冰乙酸(0.2M酸终浓度)并在94'C土2t:下将溶液培育205至215分钟。然后将温度降至21至25'C并添加1至2M磷酸钠以达6.8±0.2的服pH。颜2,趣麟做使用总糖含虽(血清型4除外)确定肺炎球菌糖活化所需碘酸钠的摩尔当量。对于血清型4，使用每摩尔糖用0.8至1.2摩尔过碘酸钠的比率。充分混合后，对除19F外的所有血清型使氧化反应在21至25'C下持续进行16至20小时，而对于19F,温度,微将经氧化的糖浓缩并借助100kDaMWCO超滤器(对于18C为5kDa超滤器)用WFI(对于血清型19F为0.01M磷酸钠缓冲液pH6.0)透析过滤。弃去透过液并使滞留物通过0.22微米过滤器过滤。碟请对于血清型4、9V和14，将经浓缩的糖与CRMw7载体蛋白混合，填装至玻璃瓶中，经滚动冷冻并保存于&65C下。将经冷冻的浓缩糖-CRM柳冷冻干燥且随后保存于-25'C士5'C下。对于血清型6B、19F和23F,添加特定量的蔗糖，对所述添加量加以计算以在共轭结合反应混合物中达5%±3%蔗糖浓度。血清型18C不需要添加蔗糖。然后将经浓缩的糖填装至玻璃瓶中，经滚动冷冻并保存于^651C下。将经冷冻的浓縮糖冷冻干燥且随后保存于-25"土5"下。共轭结合方法使用两种共轭结合方法对于血清型4、9V、14和18C使用水性共轭结合且对于血清型6B、19F和23F使用DMSO共轭结合。水性共轭结合对于lfiL消型4、9V和14,使经冻干的活化糖-CRMi97混合物解冻并在室温平衡。然后于(UM磷酸钠缓冲液中重构冻干的经活化糖-CRM柳，按如下典型比例实施-对于血清型4和9V,每16至24克糖用1升缓冲液对于血清型14,6至10克糖用1升缓冲液在37'C±2'(TF培宵反应混合物直至血清型9V完全溶解且对于血清型4及14在23t土2'C下培宵。对于血洁娥18C,以每1升CRMot溶液用(Ul升磷酸钠之典型比例将经冻干的糖重构于CRMw溶于lM磷酸氢二钠之溶液中。在23'C士2'C下培育反应混合物(8至12克/升的糖浓度)直至完全溶解。在此阶段測试pH作为加工过程中的控制。,歡-关激辦厳对亍rflL衍型4和9V，通过添加氰基硼氢化钠溶液U00毫克/毫升)达1.0至1.4摩尔氰基硼S化钠/摩尔糖来开始共轭结合反应。将反应混合物在37'C±2'C下培育44至52小时。然后使温度降至23"±2'0并向反应器中添加0.9%氯化钠。添加硼氢化钠溶液(100毫克/毫升)以达1.8至2.2摩尔当量的硼氢化钠/摩尔糖。将混合物在23'C士2'C下培台-3至6小时。用0.9%氯化钠稀释混合物并漂洗反应器。使用1.2微米前过滤器将经稀释的共轭结合混合物过滤到储存容器中。27xTf血清型14和isc，通iim加iun氨化4m被(柳4E3l^升〉达"至"摩尔的^義化敏摩尔絲开鎗共轆||#反鹰.将M^^M^231C±2"下糖宵i2至24小时，使lta升爽至371C士21C并将fi^l錄宵ra至雜小时，鎗后使敏降至23ic±2ic并向M^器中潘加o.將氣化袖.添加敏化袖絲(柳ii^/断》駄达lJ至2J扉尔当量的Vm化敏摩尔糖，将櫬#|在2310±2t!下錄育3至6小时，用&99^化销##欐##|&^晷，鳙貭l^iUlfc^翁lttMF经稀释的共麟合糖賴mti!傭^m中.将经糖的共糖銷合饞餚鰂維助柳欧MWCO超鄉欲JI小1S糊(血清瘻4)戚40体积(血瘠趣9V、M和18C)的OM化IUt4^过據，对于血淸趣4，衄0.必《^!1驀11^糖物.^Ni中实簾加:C中的lliS(tNNt》翔^股拼众m血糖型4鵷物实鰌雌讎.首先用(KSM,mi缓Hft(碎7.010.3》中和HA,ffiM用&9M親化销使之平攤，将&ltll滩糖物《血糖趣4》以1.0升/##%%±样至柱上，用O.辦氧化钠Ul￡2.0升/分钟怖濂速洗涤柱.瞎后用汰5M麻鹏緩冲壤以S2.0升/分钟的IK^鄉产物，然后将HA部分,并省助,UDBMWCOai,小幼,的d^9^R化销实鏞透微滤.弃去透雌，翔i'微湖使经柳隨MWCO逮f"战濾后鰣菌鄉过0.盟総M^暴微，纖过濾产物实癱龙工过程中的控镧(lNrft、游离蛋白赝、游1PII及银化物》对所过鄉留物实皿程中控制以确^￡资瓣耍1^1^#1^、通^:)1^/来满足FBC)l标，对FBC样品霣复实鰌这^&颧外的獮试.如霱耍，用汰揪氣化钠iHI经过滤的共辗物以达低于0.5Sm的终自.在此阶段实IW^雉，蛋白质#&及糖:蛋白质比率的释放糖试，后'将^P8^H(0》并以2,64l^l毒鍾的典親量壤装至10升不镌销滤鄉屮，在此阶段，产率、irnt、蛋白质錄、pH、新蛋白虜比率&gl絲含量是作为加工过程中控黼加以检鑭，在此阶段实鄉放讕试(外观、游离蛋白虜、游离糖，内毒衆、分7大小獮定、残窗敏化物、糖身份、CRM鹏身份》-DMSO共瓶鎗合翔/..湖在:^i下平麟冻平的链化糖血饞型幼、1F、23F及经冻干的CRM鲫載体蛋白并鹏于DMSO中溶^通常在2至3克糖(2至23克蛋白质》所DMSO范圑内。步凝//,关麟会度座在23'C±2"C下以0.6克至1.0克糖/克CRMl97(对于血清型6B和19F)或1.2至1J克糖/克CRM197(对于血清型23F)的比率范围将经活化的糖与CRM朋载体蛋白混合60至75分钟。通过以0.8至1.2摩尔当量氰基硼氢化钠比1摩尔糖的比率添加氟基硼氢化钠溶液(100毫克/毫升)来开始共轭结合反应。将WFI添加至反应混合物中以达1%(v/v)的目标浓度并将混合物在23"士21C下培育40小时以上。将100毫克/毫升的硼氢化钠溶液(通常为，每摩尔活化糖用1J至2.2摩尔当量的硼氢化钠)和WFI(目标浓度5外v/v)添加至反应物中并将混合物在23卩±2"下培育3至6小时。此程序可还原任何存在于糖上的未反应醛。然后在<15'C下将反应混合物转移至含有0.9%氯化钠的稀释罐中。,瀑瓜/OOikDa邀裙将经稀释的共轭物混合物通过1.2微米过滤器过滤并浓缩且借助lOOkDaMWCO膜以最大15体积的0.9%氯化钠(对于血清型23F使用0.01M磷酸钠/0.05MNaCl缓冲液)实施透析过滤。弃去透过液。通过0.45微米过滤器过滤滞留物。在此阶段采集加工过程中的糖含量样品。步歡K.-編五辦総仅对血清报23F实施此歩骤。用0.01M磷酸钠/0.05M氯化钠缓冲液平衡DEAE柱。将经过滤的滞留物(血淸型23F)上样至柱J:并用0.01M磷酸钠/0.05M氯化钠缓冲液洗绦。然后用0.01M磷酸钠/0，/nNaCl缓冲液洗涤柱。随后用0.01M磷酸钠/0.5M氯化钠缓冲液洗脱产物。,鐶F,/歸iDfl邀游将来自6B和19F的滞留物浓缩并用至少30体积的0.9%氯化钠实施透析过滤。弃去透过液。将来-』lfll.洁型23F的洗脱液浓缩并用最小20体积的0.9%氯化钠实施透析过滤。弃去透过液。步,.匿絲微使经100kDaMWCO透析过滤后的滞留物通过0.22微米过滤器过滤。对经过滤产物实施加工过程中的控制(糖含量、游离蛋白质、游离糖、残留DMSO及残留氰化物)。对所过滤滞留物实施过程中控制以确定是否需要进行额外的浓缩、透析过滤及/或稀释来满足FBC目标。对FBC样品重复实施这些及额外的测试。如需耍，川0.9%氯化钠稀释经过滤的共轭物以达低于0.55克/升终浓度。在此阶段实施有关糖含量、蛋白质含量及糖:蛋白质比率的释放测试。最后，将共轭物过滤(0.22微米)并以2.64克/滤毒罐的量填装至10升不锈钢滤毒罐中。在此阶段，产率、糖含量、蛋白质含量、pH、糖虔白质比率及赖氨酸含量是作为加工过程中控制加以检测。在此阶段实施释放测试(外观、游离蛋白质、游离糖、内毒素、分子大小测定、残留氰化物、残留DMSO、糖身份及CRMw7身份)。实例1S多价肺炎球菌共轭物疫苗的调配13个共轭物的最终主体浓缩物含有0.85%的氯化钠。血清型3、6A、7F及19A的主体浓缩物也含有5mM琥珀酸钠缓冲液(pH5.8)。根据批料体积及主体糖浓度计算所需主体浓縮物体积。向预先标记的调配物容器中添加80%的0.85%氯化钠(生理盐水)及所需量的琥珀酸盐缓冲液后，添加主体浓縮物。随后使用密理博(MilliporeDurapore)膜滤器装置使所述制剂通过0.22微米膜无菌过滤到第二个容器中。用剩余的20%的0.85%氯化钠洗涤第一个容器并使溶液通过相同过滤器且收集至第二个容器中。在添加主体磷酸铝期间及之后轻轻地混合经调配的主体。检査并调节pH(若需要)。将经调配的主体产物保存于2至8"C。将经调配的主体产物填装至购自BectcmDickinson的1型硼硅酸玻璃注射器中。每隔一定间隔检测疫苗的混浊度以确保填装操作的均一性。将经填装的疫苗(终产物)保存在2至8r下。实例1613-价共轭物疫苗的免疫原性迄今为止，ii在兔子巾实施了有关13vPnC疫苗的临床研究。设计研究HT01-0021和HT01-0036来分别检査肺炎链球菌荚膜多糖(PS)与CRM恥的化学共轭结合及磷酸铝(A1P04)佐剂对兔子中应于13vPnC疫苗的免疫反应的影响。这些影响通过检测血清IgG浓度的抗原特异性ELISA及检测抗体功能的调理吞噬分析(OPA)来定性。薪究腳/掘J研究HT01-0021检査含有A1P04佐剂的13vPnC疫苗引发疫苗血清型特异性免疫反应的能力。13vPnC疫苗中出现的肺炎球菌血清型包括血清型K3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。次要目标包括对抗体反应动力学及持续时间的评估。在第0周及第2周用与AlPO4(100微克/剂)调配在一起或未调配在一起的各多糖的计划人类临床剂(每一PS为2微克，仅有6B为4微克)经肌内免疫新西兰白兔。在不同时间点采集血清。通过BLISA测量血清型特异性IgG并通过OPA评定功能活性。表3显示在投与两剂13vPnC疫苗后对采集的样品求取的几何平均滴定度(GMT)。使fflIgGGMT比率来比较第4周与第0周的反应。这些数据证明,在13vPnC调配物中纳入A1P04与不含佐剂的相同疫苗比较可诱发出更高水平的IgG抗体。尽管当调配物中纳入A1P04时抗体反应会更强，但这些增加在统计学上不显著。还在用两个13vPnC调配物免疫后于兔子中评定功能抗体反应(表4)。当对含有或不含佐剂的疫苗调配物进行比较时，在13vPnC+A1P04疫苗处理组中观察到更高的OPAGMT。在两组所有疫苗血清型的第4周血清池中检测OPA滴定度。对于大部30分血清型，在第4周测量的OPA滴定度至少较第0周(基线)的OPA滴定度高4倍。由两个处理组的血清池评估每一13vPnC疫苗血清型的动力学反应。在第O.周及第K2、3、4、8、12、26和39周进行抽血来评估每一血清型的IgG滴定度且磁后进行比较。除血清型1以外，接受经佐剂化疫苗的动物中抗体反应优于那些接受未经佐剂化疫苗动物中的抗体反应且在免疫方案的第2周达到峰值(数据未显示)。综上所述，所述数据表明，与磷酸铝调配在一起的13vPnC疫苗在兔中具有免疫原性，可诱发对納入在疫苗中肺炎球菌荚膜多糖的实质抗体反应且这些反应与功能活性有关。用13vPnC+AH04免疫后在7个核心血清型中观察到的反应与兔子对7价调配物的历史反应一致。表3.用两剂含有ALP04的稀释剂a13vPnCa13vPnC+ALPCV比率第4周比率第4周比率血清型第0周第4周第4周:第0周第0周(95%CI)第4周:第0周第0周(95%Cl)第4周:第0周1<100<1001.0505,926(2,758-12.733)1195011,091(5,327-23,093)2223<100<1001.0506,647(2,773-15.932)1335816，443(7,096-38,106)2844<100<1001.05013,554(8，031-22，875)2715029,183(15,342-55,508)584134<1000.4505.859(2,450-14.009)1175016，714(6,959-40,140)3346A141<1000.47422,415(11,987-41,914)3038363,734(21，14卜192，146)7686B<100<1001.0578,08(3,564-18,444)1425423,505(11,286-48,955)4357F3,8595790.2m43，591(26,931-70,557)44414384,888(46,445-155,151)4969V2899953.420515,780(7,193-34,616)12520843331b(23,256-71,510)217144371770.4616,906(3,416-13,962)1137016,076(9,649-26,785)32218C<100<1001.05021,283(15,770-28,725)4265035,040(24,708-49,692)70119A<100<1001.0121113,599(54,518-236,707)939144280,976(119,587-660,167)1,95119F<100<1001.05014,365(7,346-28.090)2875024,912(9,243-67,141)49823F<100<1001.0505,323(1,894-14,962)1065015,041(4,711-48,018)301a:GMT，该等聚集的血清由来自一组内每一单独兔子的等体积血清构成b:与不含ALP04的处理组在统计学上存在差异(p=0.022)200780047882.5转溢齿被29/41:K表4.用两剂13-价肺炎球菌糖共轭物免疫后NZW兔血清池的肺炎链球菌OPAGMT__WvPnC'13vPnC+ALF04'血清型第o周第4周負比率U周:第O第O周周第4周比率第4周:第0周1<86416<864163<882<81644<8164<83285<812832<85121286A8128168512646B<82566481,0241287F86488128169V864881281614163221632218C825632<825664<825664<§1,024256柳<812832<851212823F8648<825664A:由来自-处理組(n-12)内单个兔子的等体积血清构成的血清池研究HT01-0036比较在用与CRMm蛋白质共轭结合或未与之共轭结合的13vPnC疫苗免疫后兔对纳入疫苗的多糖(PS)的免疫反应。在第0周和第2周以剂量为2.2微克的每一PS(仅有6B为4.4微克)经肌内免疫新西兰白兔。动物接受三种疫苗制剂之一(a)13vPnC(直接与CRM柳共轭结合的PS),(b)13vPnPS,(游离PS)或(c)13vPnPS+CRM197(与CRM^混合的游离PS)。所有疫苗制剂均以A1P04作为佐剂，含量为125微克/剂。在IgGEUSA及测量功能抗体的补体介导的OPA中评估针对所有疫苗制剂的血清型特异性免疫反应。比较处理组之间的免疫反应。表5呈现在抗原特异性IgGELISA中分析的由第4周抽血获得的GMT数据。额外分析显示第4周与第0周的GMT数值的比率。数据表明，共轭物疫苗制剂较游离PS或游离PS+CRMOT疫苗诱发出更高的血清1gG滴定度。除肺炎链球菌血清型14以外，13vPnC疫苗能够在OPA中诱发针对肺炎链球菌代表性菌株的功能抗体(表6)。用13vPnPS或13vPnPS+CRM浙疫苗进行两次免疫后，所测量的13个血清型有10个在第4周不可诱发出较第0周28倍的OPA滴定度(表6)。综上所述，这些结果表明，13-价肺炎球菌疫苗多糖的共轭结合与单独游离多糖或与未共轭结合的CRM所混合的多糖中所见者相比会产生更高的血清IgG滴定度及整体更强的功能抗体活性。表5.用两剂13省肺炎球菌糖共轭物免疫后通过ELISA检测的:fe^fPnPS的IgG反应(GMT)13vPnPS13vPnPS=CRM197但f游离PSiCRM,的港,合的PS)第4周比率第4周比率血清型第O周(9S%CI)第4周第G周第O周(9S%C1)第4周第d周第CJ周13vPnC第4周(95%CI)比率第4周s第0周13456A6B7F9V143785750343154635050662,2卯(843-5，7卯)240(64-卯8)379(150-959)226(113450)466(316-688)727(3沐1，37S)61(39-95)104(48-195)298(117-757)5.84.27.64.53.011.61.22.14.5395895050诉6250501，959(卿-4，739)163(7"58)607(313-1J78)321(147-701)210(95掘)745(384-1局72(47-111)169(74-3卯)195(71-535)5.01.812.16.42.112.01.43.03.947250505016313150505035,970(29,130哉417)10,414(10,41446,676)12，柳(9,117-18^224)35264(24,467-50,824)2343533,599(22,93449,222)35,702(24,350"52局50,033(34,765-72,007)20,121(12,087-32,138)76.2208.3257.8705.31,437.1256.5714.01,000.7402.418C19A挑23F89506173l邻(655-3,688)89(44179)1,362(559-3,317)1,085(487-2,420)17.51.822.3W.9665061121761(300-1，935)80(39掘)991(370-2,654)638(3114,311)1L51.616.35.310150676871,451(32，745-,41)23,485(12,857-42,723)19,358(12,553-33,173)45,972(25,134-84,089)707.4469.7288.9676.1表6.用两剂13-价肺炎球菌疫苗免疫后兔血,的肺炎链球菌OPA滴定度OPA滴定度处理编号13vPnPS(游离PS)WvPiiPS+CRMw713vPnC(与CRMw混合的游离__血清型第o周-第4周比率第4周比率第4周比率第4周第《周第4周第0周第4周第0周141641648323441414844414146454328416646A8648324326646B864832432327F16322M116169V16161322328141616116116218C416416486419A88181166419F4414186423F163221613232a:对于所有組均以此作为第O周数值实例17用于血清型19A肺炎球菌的替代程序糖-CRM彻共轭结合概述下列实例阐述一种制造包含共价连接至载体蛋白的肺炎链球菌血清型19A多糖的免疫原性共轭物的方法。总体来说，在高碘酸氧化(活化)以在所述多糖上产生反应性醛基团后，将血清型19A多糖与载体蛋白一起冻干并借助还原胺化反应作用机制于氰基硼氢化钠存在时在二甲基亚砜(DMSO)中实施共轭结合。与涉及在DMSO中分别冻干多糖与载体蛋白的共轭结合过程或涉及在无DMSO时在水性介质中一起冻干多糖与载体蛋白的过程不同，提供下列过程改良改良的共轭结合效率和对血清型19A多糖稳定性的控制，如通过分子大小和游离糖的百分比测量的。尽管此方法针对血清型19A多糖阐述，但此方法也可以用于在结构上与血清型19A类似且在其两个重复单元之间也含有磷酸二酯键的血清型，例如，6A、6B和19F。活化使含血清型19A多糖的容器解冻且合并于反应容器中。通过添加100mM乙酸钠缓冲液(pH5)在多糖浓度为2毫克/毫升时在10mM乙酸钠(pH5沖实施氧化反应。通过在以150ipm混合时于23±2C下培育16至24小时来在高碘酸钠存在时实施氧化。用30K或100KMWCO波尔森彻梅特(PallCentramate)聚砜1英尺2超滤盒对活化血清型19A多糖进行浓縮和透析过滤。利用2克多糖/英尺2膜面积的耙膜攻击来纯化所述活化多糖-使所述超滤系统在10mM乙酸钠缓冲液(pH5)中达平衡，之后添加氧化反应溶液。随后浓缩所述氧化反应溶液并针对10mM乙酸钠&H5)进行透析过滤。随后将所述活化多糖保存在5±3"下长达14天直到所述材料经调和以供冻干为止。—起冻干和共轭结合过程通过添加1M磷酸氢钠来将活化血清型19A多糖的pH调节至pH6.5±0.2。所述活化多糖与蔗糖以25克蔗糖/克多糖的比率调和在一起，接着以0.8的糖/蛋白质比率与CRM柳调和在一起。在滚动冷冻后，将100毫升玻璃瓶置于-25lC下保存。从-25"C冷冻机取出含有一起冻干的多糖/CRMw7的瓶子并使之在层流通凤橱中于室温下达平衡。从所述瓶子随机取样以供湿份分析。在冻干瓶中，以2毫克/毫升将一起冻干的活化多糖/CRM附材料溶于DMSO中。随后将所述活化多糖/CRMwDMSO溶液转移至共轭结合容器中并在23±2'C下以70-120rpm搅拌60-75分钟。随后边搅拌边添加1摩尔当暨的氰基硼氢化钠，接着添加1%WFI。随后将所述反应瘠液在23±2"C下搅拌8-16小时。向所述共轭结合容器中添加1摩尔当量的硼氮化钠以便进行封端反应并将裕液在23±2"C下搅拌3-16小时。随后将反应溶液在冷(2-8'C)0.9%氯化钠中稀释10倍。使10-倍稀释的反应溶液经过1.2/5.0微米过滤器且随后借助配备有300K或1000KMWCO再生纤维紫1英尺2膜的超滤系统将其浓缩至1-2克/升。使用1-2克多糖/英尺2膜面积的过滤攻击来进行纯化。随后针对0.9%氯化钠对共轭物溶液实施IOX透析过滤。在膜清洁后，随后针对5mM琥珀酸钠/0.9。/。氯化钠缓冲液(pH6)对所述共轭物溶液进行30X透析过滤。随后使经纯化共轭物经过0.22微米过滤器并取出用于pre-FBC测试的试样。随后将共轭物溶液储存在5±3"下长达30天直到制备最终批料浓縮物(FBC)为止。最终批料浓缩物的制备使用5mM琥珀酸钠/0.9%氯化钠缓冲液将pre-FBC共轭物溶液稀释至0.5克/升的目标浓度。将所述溶液在磁力搅拌时混合约15分钟且随后使其经过0.22微米过滤器进入无菌聚丙烯FBC瓶中。随后将FBC共轭物溶液保存在5±3"下。按照实例4所述对共轭物进行定性。在DMSO中一起冻干与分别冻干产生血清型19A共轭物的12个(1-6克)批料其中6个是借助上文所述DMSO方法一起冻干产生且6个是借助在上文实例8中所述DMSO方法分别冻干产生。:按照实例4所述对所述共轭物进行定性，包括使用尺寸排除色谱介质(CL-4B)展示共轭物的相对分子大小分布及借助糖醛酸分析来测量糖浓度。就血清型19A共轭物的长期稳定性来说，预计，分子大小减少约10°/伴随游离糖含量增加约10。/。的血清型19A共轭物在18个月内稳定。因此，在产生血清型19A共轭物中，共轭物分子大小的优选值为约70%0.3Kd,优选游离糖含量为低于约20-25%。如在表7中所示，借助两种方法所产生的血清型19A共轭物的定性显示所提供一起冻干方法与分别冻干方法相比在分子大小以及游离糖百分比方面提供改良共轭物特征。表7.比较在DMSOf起冻干与分别冻干的血清型l狄的关键共轭物特征—起冻干(n-6)分别冻干(n-6)特征平均值标准偏差平均值标准偏差0/0。.3Kd(CL"4B)糖677.25813.0游离糖(％)<18<3.5319.2应了解，上述论述及实例仅给出某些实施例的详细说明。因此那些普通技术人员应明了可使用各种修改及等效内容，此并不偏离本发明的精神和范畴。在本专利申请案中呈现的所有期刊论文、其它参考文献、专利案及专利申请案的全文均以引用方式并入本文中。参考文献1.豪斯多夫(Hausdorff)WP,布莱恩特(Bryant)J，柏拉迪索(Paradiso)PR,西伯(Siber)GR.哪利卿炎球菌血清群造成最严重侵入性疾病关于共轭物疫苗调配物和用途的设想(Whichpneumococcalserogroupscausethemostinvasivedisease:im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