专利名称：(3aR,5R,11bR)-3,3a,5,11b-四氢-7-羟基-5-甲基-2H-呋[3,2-b]萘并[2,3-d]吡喃-2,6 ...的制作方法
技术领域：
本发明属医药技术领域，具体说是(3aR， 5R, 11bR)-3， 3a， 5， llb-四氢 -7-羟基-5-甲基-2H-吹[3, 2-b]萘并[2， 3-d]吡喃-2， 6， 11-三酮的应用。
背景技术：
据统计，从1981年l月到2006年6月总共开发新药1184种，天然产 物或天然产物来源的药物占42%。从1940年以来，155个小分子化疗药中， 47%为天然药物或半合成天然药物(Newman, D. J. ， et a7. , Natural products as sources of new drugs over the last 25 years, /. iV".尸rocf. 2007， 70: 461-477 )。该结果表明大自然是重要的药物宝库。
在耐药菌广泛出现后，尤其是近年来由于环境恶化和人口流动造成抗 药性产生周期日趋缩短的问题，加之耐受药物的种类日益增多，使得人们 对新型抗生素的需求比以往任何时候都更加迫切。随着恶性肿瘤发病率的 不断提高，对新型抗肿瘤抗生素的需求也日益迫切。二十世纪人们将目光 转向蕴藏着丰富微生物资源的海洋，海洋生态环境的特殊性和多样性，决 定了海洋微生物种类及其次级代谢产物的多样性，从海洋微生物发现具有 抗肿瘤和抑菌作用的先导化合物，成为发现新生物活性物质的一条解决途 径。分别来自意大利撒丁岛和日本相模湾的两株海洋微生物所贡献的头孢 霉素C和小诺(相模)霉素，充分说明了海洋微生物在产生活性先导化合 物方面的潜力。(Marwick， J. D. , et aL , Bioprocess intensif icat ion f or production of novel marine bacterial antibiotics through bioreactor operation and design, Marine 5iotechno2ogy, 1999， 1 ( 5 ): 495—507; Jensen, P. R. ， ， Strategies for the discovery of secondary
metabol i tes f rom mar ine bacteria: ecologica 1 perspect ives, i!]肌i ev. MicroWo!， 1994, 48: 559-584 )。
同陆地放线菌产生抗生素相似，海洋微生物中的海洋放线菌也是新型 抗生素的重要来源。从海洋链霉菌S"印to/Hyces sioyae"sis SA-1758中 分离到的结构新颖、含硫和氮的生物碱altemicidin，具有单薛骨架，显示 强体外抗L1210淋巴瘤和IMC癌细胞活性，ICs。分别为0. 84和0. 82 (ig/raL， 但它对小鼠也有毒性(LD5 = 0.3 (ig/mL)。 (Takahashi， A. ， et a2.， Altemicidin， a new acaricidal and antitumor substance I, taxonomy, fermentation ， isolation and physico—chemical and biological properties,丄y^"Wot. , 1989, 42 ( 11 ): 1556-1561; Takahashi, A., ai. , Altemicidin, a new acaricidal and antitumor substanceII， Structure determination,丄ht^fot. , 1989, 42 ( 11 ): 1562-1566 )。 稀有放线菌Saihwspora strain CNB-392是从经过热处理的海洋沉积物样 品中分离出来的，利用含海水的琼脂平板进行培养，并通过细胞毒活性跟踪分离，得至U了化合物salinosporamide A。 Salinosporamide A对NCI的 60株肿瘤细胞系显示出强烈而有选择性的活性，平均GL。小于10nM,并且 抗性细胞株和敏感细胞株的差异大于4 log LC5。。该化合物对NCI-H226、 SF-539 CNS、 SK-MEL-28和MDA-MB-435细胞株抑制作用最强烈(L"都小于 10 nM),对人类结肠癌细胞株HCT-116的ICs。为11 ng/mL (Feling RH," a7. Salinoaporamide A: highly cytotoxic proteasome inhibitor from a novel microbial source, a marine bacterium of the new genus Sa"愿pora. 细ezo a扁丑tl 2003, 42: 35 )。 分离自珊瑚 Pa"Hgotgio sp.体表的链霉菌PG-19,从中得到两个八元环内酯 octalactins A和B, octalactins A在体外对B16-F10黑色素瘤细胞及人 结肠癌HCT-116细胞有显著细胞毒性(I"分别为7. 2xl(T3 lag/mL, 0.5 |Lig/mL)，而octalactins B无细胞毒性(Fenical, W. , and Jensen, P. R., In Marine 5iotecn]oJogy， Volume 1: Pi〗ar/naceutica2 Sioacd.ve "'ra7 Rroduc"; Attaway, D. H. , Zaborsky， 0. R. , Eds.; Plenum Press: New York, 1993; pp 419-457 )。Lomaiviticins A禾口 B是由一株分离自——种海銷(PoJysyi!crato" h'〃〗ostroa训)体内的嗜盐性小单孢菌新种 Micro膨nospora 2o鹏！'W "e力sis LL-371366产生的。通过BIA (biochemical induction assay)法跟踪活性分离，发现Lomaivi t icins A和B显示出强烈的DNA破 坏性，能够在特定条件下切断DNA双螺旋，两个化合物的最小作用浓度都 小于或等于每孔0.1 ng。 Lomaiviticin A还显示强烈的细胞毒性(I"为 0.01-98 ng/mL)。 (He， H. ， aL , Lomaiviticins A and B. , potent antitumor antibiotics from Microfflonospora Jo/Haivfteusis. /. 乂ffl. CAe/h. Soc. 2001, 123: 5362-5363 )。本发明目的在于提供一种(3aR, 5R， llbR)-3， 3a， 5， lib-四氢-7-羟基 -5-甲基-2H-呋[3， 2-b]萘并[2， 3-d]吡喃-2， 6, ll-三酮的应用。 为实现上述目的，本发明釆用的技术方案为(3aR, 5R， llbR)-3, 3a, 5, llb-四氢-7-羟基-5-甲基-2H-p夫[3, 2-b]萘并 [2, 3-d]吡喃-2，6, 11-三酮在制备抗肿瘤抗生素的药中的应用。所述(3aR， 5R， 11bR)-3， 3a, 5, llb-四氢-7-羟基-5-甲基-2H-p夫[3, 2-b] 萘并[2， 3-d]吡喃-2， 6, 11-三酮的制备方法为将链霉菌M097接种于M2琼脂 平板培养基上，于25-35。C下培养3-4天，而后釆用接种环将一环孢子接种 到200-300mL豆粉液体培养基上于25 - 30°C，以90-120 rpm摇床培养3-4 天；培养产物过滤而后用乙酸乙酯萃取3-4次浓缩得粗提物，浓缩得粗提发明内容物经硅胶柱层析，用环己烷和二氯甲烷梯度洗脱，待洗脱组分中釆用二氯甲烷作为展开剂 ^ = 0.40-0.60 时，该组分即为 (3aR, 5R， llbR) -3， 3a， 5， lib-四氢-7-羟基-5-甲基-2H-吹[3， 2-b]萘并 [2，3-d]吡喃-2,6,11-三酮；其中链霉菌M097保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 2445。所述M2琼脂平板培养基成份为大麦提取物9-11 g,酵母粉3-5 g, 葡萄糖3-5 g,琼脂粉12-18 g, 1 L天然海水，pH 7.5-8.0;所述豆粉液 体培养基为大豆粉19-21 g,甘露醇19-21 g， 1L天然海水，pH 7.5-8.0。所述过滤后的培养产物分成菌体和菌液两部分，菌液用乙酸乙酯萃取， 菌体在超声波下处理10-20分钟，用乙酸乙酯抽提。所述乙酸乙酯抽次数 为2-5次，每次10 L;所述梯度范围为2L环己烷，2L环己烷/5(T/。二氯甲 烷。所述洗脱组分经环己烷洗涤1-3次，保存。 本发明具有如下优点1. 本发明化合物具有很强的细胞毒性，对37株人体肿瘤细胞的平均半 致死浓度为0.06 jig/mL，可作为抗肿瘤药物活性强的化合物。2. 本发明充分利用丰富的海洋微生物资源，得到可作为抗肿瘤药物活 性强的化合物，其对多种人体肿瘤细胞如膀胱癌细胞1218L, T24;宫颈 癌细胞498NL, SF268;结肠癌细胞HCT116， HT29;胃癌细胞251L; 头颈癌细胞536L;肺癌细胞1121L, 289L, 526L， 529L, 629L, H460; 乳腺癌细胞401NL， MCF7, MDA231等37株人体肿瘤细胞有抑制作用，可作 为临床药物或先导化合物。3. 釆用选用价格低廉的大豆粉和甘露醇为原料发酵微生物，乙酸乙酯 抽提制备粗提物，操作步骤简单，具有可重复性，并且成本低廉，对环境 不造成损害。
具体实施方式
下面结合具体实施例详述本发明。 实施例1制备(3aR， 5R， llbR)-3, 3a, 5, 11b-四氢-7-羟基-5-甲基-2H-p夫[3， 2-b] 萘并[2, 3-d]吡喃-2，6, ll-三酮1. 菌株釆集从青岛胶州湾釆集海泥样品，进行梯度稀释(1(T3, 10-2， 10—0划线培养，利用高氏一号培养基，纯化得到海洋链霉菌(S"印t哪yc" sp. ) M097，海洋链霉菌M097保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心CGMCC,保藏编号为CGMCC No. 2445。所述高氏一号培养基 为可溶性淀粉20 g，硝酸钾l g,磷酸二氢钾O. 5 g,硫酸镁O. 5 g，氯化 钠0. 5 g,硫酸亚铁0. 01 g,重铬酸钾0. 1 g，琼脂粉15 g,天然海水1 L， pH 7. 2。2. 链霉菌M097的平板培养将海洋链霉菌M097接种于M2琼脂平板培养基上，于28°C下培养3-4天，其中M2琼脂平板培养基大麦提取物10 g， 酵母粉4 g，葡萄糖4 g，琼脂粉15 g, 1 L天然海水，pH 7.8。3.摇床培养将平板种子接种到100个1000 mL的Erle腿eyer三角瓶 中，每个三角瓶含有250 mL豆粉液体培养基置于28。C下以90 rpm往复式 摇床培养3天；其中豆粉液体培养基大豆粉20 g，甘露醇20 g, 1 L天然 海水，pH 7. 8。4. 萃取将摇床培养产物，利用板式过滤器过滤，分成菌体和菌液两 部分。菌液用乙酸乙酯萃取3次；菌体在超声波下处理15分钟，用乙酸乙 酯抽提3次，菌体和菌液萃取后的有机相用旋转蒸发仪浓缩蒸干，合并即5. 纯;七将浓缩粗提物经硅胶柱层析，用环己烷/二氯甲烷梯度洗脱， 按照10 mL/min的流速，首先釆用2 L环己烷洗脱去掉粗提物中的油脂类 组分，再用2L环己烷/50y。二氯甲烷洗脱，组分A和B。组分B含有一黄色 条带，经6N的碱处理变红色(用毛吸管吸取碱溶液，滴加到TLC层析板上 的黄色条带)，釆用二氯甲烷作为展开剂Af = 0. 51，该条带即为 (3aR, 5R, llbR) -3， 3a， 5, lib-四氢-7-羟基-5-甲基-2H-吹[3, 2_b]萘并 [2,3-d]吡喃-2， 6,11-三酮。所得化合物用环己烷洗涤该组分2次，弃油， 保存。实施例2(3aR， 5R, 11bR)-3， 3a， 5， lib-四氢-7-羟基-5-甲基-2H-p夫[3， 2-b]萘并 [2，3-d]吡喃-2， 6,11-三酮的抗肿瘤活性实验抗肿瘤活性实验由德国 Oncotest生物公司进行测定，选用人体肿瘤细胞系(Human Cancer Cell Lines),包括膀胱癌细胞1218L, T24;宫颈癌细胞498NL, SF268;结 肠直肠癌细胞HCT116, HT29;胃癌细胞251L;头颈部肿瘤536L;肺 癌细胞1121L, 289L, 526L, 529L, 629L， H460;乳腺癌细胞術NL， MCF7, MDA231;黑瘤细胞276L, 394NL, 462NL, 514L, 520L;卵巢癌细 胞1619L, 899L， 0VCAR3;胰腺癌细胞1657L, PANC1;前列腺癌细胞 22RV1, DU145, LNCAP, PC3M;胸膜瘤1752L;肾癌细胞1781L, 393NL, 486L, 944L;子宫癌细胞1138L。釆用细胞荧光染色法，对每一细胞株分 别测定五个化合物浓度梯度，重复测定两次，计算IC5Q、 IC,。和IC9 。实验 结果kalamycin的有效浓度平均ICs。分别为0. 06 pg/mL。实施例3与实施例1不同之处在于所述(3aR， 5R， llbR)-3， 3a, 5, llb-四氢-7-羟基-5-甲基-2H-吹[3， 2-b] 萘并[2， 3-d]吡喃-2， 6, 11-三酮的制备方法为将链霉菌M097接种于M2琼脂 平板培养基上，于25。C下培养3-4天，而后釆用接种环将一环孢子接种到 200 mL豆粉液体培养基上于25°C,以120 rpm摇床培养3-4天；培养产物 过滤而后用乙酸乙酯萃取4次浓缩得粗提物，浓縮得粗提物经硅胶柱层析，用环己烷和二氯甲烷梯度洗脱，待洗脱组分中釆用二氯甲烷作为展开剂^^ =0. 40时，该组分即为(3aR, 5R， llbR)-3， 3a, 5， lib-四氢-7-羟基-5-甲基-2H-吹[3, 2-b]萘并[2， 3-d]吡喃-2， 6, ll-三酮;所述M2琼脂平板培养基成份为大麦提取物9g,酵母粉3g，葡萄糖 3 g，琼脂粉12 g， 1 L天然海水，pH 7.5;所述豆粉液体培养基为大豆粉 19 g，甘露醇19 g， 1 L天然海水，pH 7.5。所述过滤后的培养产物分成菌体和菌液两部分，菌液用乙酸乙酯萃取， 菌体在超声波下处理IO分钟，用乙酸乙酯抽提。所述乙酸乙酯抽次数为2 次，每次10L;所述洗脱组分经环己烷洗涤l次，保存。 实施例4与实施例l不同之处在于所述(3aR, 5R, 11bR)-3， 3a， 5， llb-四氢-7-羟基-5-甲基-2H-呔[3, 2-b] 萘并[2， 3-d]吡喃-2，6, 11-三酮的制备方法为将链霉菌M097接种于142琼脂 平板培养基上，于35。C下培养3-4天，而后釆用接种环将一环孢子接种到 300 mL豆粉液体培养基上于3(TC,以100 rpm摇床培养3-4天；培养产物 过滤而后用乙酸乙酯萃取4次浓缩得粗提物，浓縮得粗提物经硅胶柱层析，用环己烷和二氯甲烷梯度洗脱,待洗脱组分中釆用二氯甲烷作为展开剂i /^ 0. 60时，该组分即为(3aR, 5R， llbR)-3, 3a， 5， lib-四氢-7-羟基_5-甲基-2H-呋[3， 2-b]萘并[2， 3-d]吡喃-2, 6, 11-三酮；所述M2琼脂平板培养基成份为大麦提取物11 g，酵母粉5 g,葡萄 糖5 g,琼脂粉18 g, 1 L天然海水，pH 8.0;所述豆粉液体培养基为大豆 粉21 g，甘露醇21 g, 1 L天然海水，pH 8.0。所述过滤后的培养产物分成菌体和菌液两部分，菌液用乙酸乙酯萃取， 菌体在超声波下处理20分钟，用乙酸乙酯抽提。所述乙酸乙酯抽次数为5 次，每次10L;所述洗脱组分经环己烷洗涤3次，保存。
权利要求
1.(3aR，5R，11bR)-3，3a，5，11b-四氢-7-羟基-5-甲基-2H-呋[3，2-b]萘并[2，3-d]吡喃-2，6，11-三酮的应用，其特征在于所述化合物在制备抗肿瘤抗生素的药中的应用。
2. 按权利要求1所述的(3aR, 5R, llbR)-3, 3a， 5, lib-四氢-7-羟基-5-甲 基-2H-吹[3, 2-b]萘并[2，3-d]吡喃-2，6, ll-三酮的应用，其特征在于所 述(3aR， 5R， llbR)-3, 3a, 5， lib-四氢-7-羟基-5_甲基-2H-吹[3， 2-b]萘并 [2， 3-d]吡喃-2, 6， 11-三酮的制备方法为将链霉菌M097接种于M2琼脂平板 培养基上，于25-35 。C下培养3-4天，而后釆用接种环将一环孢子接种到 200-300 mL豆粉液体培养基上于25 - 30°C，以90-120 rpm摇床培养3-4 天；培养产物过滤而后用乙酸乙酯萃取3-4次浓缩得粗提物，浓縮得粗提 物经硅胶柱层析，用环己烷和二氯甲烷梯度洗脱，待洗脱组分中釆用二氯 甲烷作为展开剂 ^ = 0.40-0.60 时，该组分即为 (3aR， 5R， llbR)-3, 3a, 5， lib-四氢_7-羟基-5-甲基-2H-吹[3, 2-b]萘并 [2，3-d]吡喃-2，6, 11-三酮；其中链霉菌M097保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 2445。
3. 按权利要求2所述的(3aR， 5R, llbR)-3， 3a, 5， 11b-四氢-7-羟基-5-甲 基-2H-p夫[3,2-b]萘并[2，3-d]吡喃-2,6,ll-三酮的应用，其特征在于所 述M2琼脂平板培养基成份为大麦提取物9-11 g，酵母粉3-5 g，葡萄糖 3-5 g,琼脂粉12-18 g, 1 L天然海水，pH 7.5-8.0;所述豆粉液体培养 基 为大豆粉19-21 g,甘露醇19-21 g, 1 L天然海水，pH 7.5-8.0。
4.按权利要求2所述的(3aR, 5R， 11bR)-3， 3a， 5， llb-四氢-7-羟基-5-甲 基-2H-吹[3，2-b]萘并[2,3-d]吡喃-2，6，11-三酮的应用，其特征在于所 述过滤后的培养产物分成菌体和菌液两部分，菌液用乙酸乙酯萃取，菌体 在超声波下处理10-20分钟，用乙酸乙酯抽提。
5. 按权利要求2所述的(3aR， 5R， 11bR)-3， 3a， 5， llb-四氢-7-羟基-5-甲 基-2H-吹[3，2-b]萘并[2，3-d]吡喃-2，6，ll-三酮的应用，其特征在于所 述乙酸乙酯抽次数为2-5次，每次10L;所述梯度范围为2 L环己烷，2L 环己烷/50%二氯甲烷。
6. 按权利要求2所述的(3aR, 5R, 11bR)-3， 3a, 5， llb-四氢-7-羟基-5-甲 基-2H-p夫[3，2-b]萘并[2，3-d]吡喃-2,6, ll-三酮的应用，其特征在于所 述洗脱组分经环己烷洗涤l-3次，保存。
全文摘要
本发明属医药技术领域，具体说是(3aR，5R，11bR)-3，3a，5，11b-四氢-7-羟基-5-甲基-2H-呋[3，2-b]萘并[2，3-d]吡喃-2，6，11-三酮的应用。所述化合物在制备抗肿瘤抗生素的药中的应用。本发明化合物具有很强的细胞毒性，对37株人体肿瘤细胞的平均半致死浓度为0.06μg/mL。可作为抗肿瘤药物活性强的化合物，其对多种人体肿瘤细胞有抑制作用，可作为临床药物或先导化合物。
文档编号A61K31/352GK101317836SQ200810017159
公开日2008年12月10日 申请日期2008年6月27日 优先权日2008年6月27日
发明者玲 丁, 哈特穆特·拉赤, 张伟杰, 李富超, 松 秦 申请人:中国科学院海洋研究所