专利名称：：从天然植物番薯藤中提取分离薯藤多糖的制备方法
技术领域：
：本发明属医药
技术领域：
，特别是用于高血脂等疾病降血脂作用的从天然植物番薯藤中提取分离薯藤多糖的制备方法。
背景技术：
：高血脂、糖尿病等疾病已经成为人类健康的头号杀手，其发病率越来越高，发病的年龄越来越低。从天然产物尤其是植物成分中寻找新的活性成分是创新药物的有效途径，不仅对发现新药有很大潜力，而且可为设计更理想的新药提供独特的化学结构。因此，很多国家和制药企业把降脂药物开发的重点逐步转向天然药物。番薯藤又名红召藤、番召藤，系旋花科植物番薯IpomoeabatatasLam.的茎叶。《中药大辞典》记载其"性微凉，味甘涩，无毒，治吐泻、便血、血崩、乳汁不通、痈疮"等。我们通过调查也发现，本省民间用蕃薯藤煎剂单方治疗高脂血症有良效，但存在以下几个问题(1)提取工艺有待改进民间单方系番薯藤水提取后直接服用，成分复杂，有效成分相对含量低，生物利用度低，服用量大。(2)没有一定的质量控制技术。(3)有效成分有待确证。近年来，随着新的提取分离技术的产生，并应用于药物的生产中，从而提高药物的疗效。因此十分有必要对番薯藤降脂、降血糖作用有效成分进行进一步的研究与开发，阐明其中的有效成分或有效部位，这不仅对加快传统中药产业改造，实施中药现代化工程及促进医药产业发展有重要意义，而且对创制具有我国特色、拥有自主知识产权、并符合国际规范的新药有重要的指导意义。
发明内容本发明的目的是通过现代化学和药理手段，从天然植物番薯藤中提取分离出具有降血脂、降血糖作用的多糖类混合物一薯藤多糖(FST)，克服现有技术存在的问题，使工艺简单方便，质量控制标准有针对性，得到的混合物在高血脂、糖尿病等疾病中具有降血脂方面的作用。本发明将番薯藤干品切碎水提醇沉干燥后，得薯藤多糖粗品，经凝胶过滤法除去无机盐和小分子杂质，乙醇或丙酮溶剂法除去大分子杂质，Sevag法除去蛋白质，得到多糖的混合物，即为薯藤多糖(FST);再用葡聚糖凝胶柱层析将粗多糖进行分子量分段分离，得到3种多糖类化合物(Fl，F2，F3);得到的混合物在高血脂、糖尿病等疾病中具有降血脂方面的作用。本发明从番薯藤中提取分离具有降血脂作用的多糖类化合物，得到3种不同分子量段的多糖，分别为Fl，F2，F3，以及包含这3种多糖的混合物一薯藤多糖(FST)。本发明多糖类化合物F1的分子量超过100万，F2的分子量为1一100万，F3的分子量为l万以下，这3种多糖化合物任意组合成混合物。混合物中，一般其多糖的重量含量自50%。薯藤多糖FST的制备方法，该方法包括以下步骤1、将番薯藤干品切碎水提醇沉干燥后，得薯藤多糖粗品；2、凝胶过滤法除去无机盐和小分子杂质，乙醇或丙酮溶剂法除去大分子杂质，Sevag法除去蛋白质，通过上述方法得到多糖的混合物，即为薯藤多糖FST;3、用葡聚糖凝胶柱层析将粗多糖进行分子量分段分离，得到3种多糖类化合物，即为F1，F2，F3;本发明提取的薯藤多糖FST，在动物体内降脂试验中，在食靡性高脂模型中显示出明显的降脂作用，各组分中随分子量增大而作用增强的趋势比较明显；对蛋黄性高脂小鼠血脂略有下降。本发明提供的薯藤多糖FST及多糖F1，F2，F3的制备方法如下将番薯藤干品切碎水提醇沉干燥后，得薯藤多糖粗品；凝胶过滤法除去无机盐和小分子杂质，乙醇或丙酮溶剂法除去大分子杂质，Sevag法除去蛋白质，通过上述方法得到多糖的混合物，即为薯藤多糖FST;用葡聚糖凝胶柱层析将粗多糖进行分子量分段分离，得到3种多糖类化合物，即为F1，F2，F3。本发明的薯藤多糖FST可用于制备治疗降血脂的药物。对本发明中的薯藤多糖FST进行了动物体内降脂实验，包括对食糜性大鼠血脂水平的影响，对炔酮WR—1339(TritonWR-1339)所致大鼠高血脂的影响，对食糜性高脂家兔血脂水平的影响以及对蛋黄乳腹腔注射致高脂模型小鼠血脂的影响。(一)薯藤多糖FST对食糜性大鼠血脂水平的影响试验。l.方法SD大鼠61只，雄性，体重180-200g，随机分成6组，每组10-11只，除正常对照组给予常规饲料外，其余五组给予高脂饲料，并按表中所示剂量灌胃给予FST或力平脂，高脂模型组给予蒸馏水，灌胃体积均为1.0ml/100g体重，每天1次，给药2周时剪尾尖取血，测定血清胆固醇和甘油三酯，给药4周时股动脉放血测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，并计算极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)(VLDL-C=TC—HDL-C—LDL-C)及TC/HDL-C的比值。所得数据用平均值i标准差表示，并用t检验法比较各组间的统计学差异。2.结果见表l、表2表l不同浓度薯藤多糖FST给药2周对大鼠血脂水平的影响(义士SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注1P〈0.05(与高脂模型组比较)；AP〈0.05(与正常对照组比较)表2不同浓度薯藤多糖FST给药4周对大鼠血脂水平的影响(3C士SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注^P〈0.05(与高脂模型组比较)；aP〈0.05(与正常对照组比较)(二)薯藤多糖FST对TritonWR-1339所致大鼠高血脂的影响试验。l.方法SD大鼠62只，雄性，体重170-200g，随机分成6组，每组10-12只。按表3所示剂量给药4天(每天1次)后尾静脉注射20%WR_1339(TritonWR-1339)生理盐水溶液1.0ml/kg，并于6小时后再给药1次。次日(造模后约24小时)尾尖取血，分离血清测定总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)。所得数据用平均值±标准差表示，并用t检验法比较各组间的统计学差异。2.结果见表3表3不同浓度薯藤多糖FST对TritonWR-1339所致大鼠高脂血症的影响(^±SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注^P〈0.05(与高脂模型组比较)；aP〈0,05(与正常对照组比较)说明薯藤多糖FST能显著降低血清胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平，尤其是TG下降幅度较大，且剂量关系明确。(三)薯藤多糖FST对食糜性高脂家兔血脂水平的影响试验。l.方法新西兰种家兔48只，雌雄兼用，体重1.8-2.5kg，单笼饲养，随机留取8只家兔作为正常对照组，给常规饲料200g/只/天，其余40只家兔给予高脂饲料200g/只沃，2周后耳静脉采血，测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)，将高脂模型家兔按TC值搭配再分为5组，除继续给予高脂饲料外，并分别按表4所示开始灌胃给药，给药体积均为2ml/kg，正常对照以及高脂对照给予等容积自来水，每天1次，连续2周后，分别耳静脉采血0.5ml，分离血清，测定TC、TG。2.结果见表4表4不同浓度薯藤多糖FST对食傳性高脂家兔血脂的影响(X土SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>说明薯藤多糖FST400、200mg/kg用药2周，能明显降低食饵性高脂家兔的TC、TG水平，但低剂量作用不明显。(四)薯藤多糖FST对蛋黄乳腹腔注射致高脂模型小鼠血脂的影响试验。l.方法ICR小鼠60只，雄性，体重18-22g，随机分为6组，每组10只，分别为正常对照组、高脂模型组、力平脂60mg/kg组、FST1600、800、400mg/kg组，灌胃给药，每天1次，正常对照组及高脂模型组给予等容积自来水，第3大给药前禁食16h，给药后除正常对照组外，其余各组小鼠均腹腔注射75%新鲜鸡蛋黄生理盐水混悬液0.5ml/只，第4天再给药1次，末次给药后1小时，小鼠取血，测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)。2.结果见表5表5薯藤多糖FST对蛋黄乳腹腔注射所致小鼠高脂血症的影响(X±SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注1P〈0.05(与高脂模型组比较)；aP<0.05(与正常对照组比较说明薯藤多糖FST各剂量组对TC、TG仅有降低趋势。下面对本发明中的薯藤多糖FST进行含量测定来进一步说明本发明。实验薯藤多糖FST及F1、F2、F3的含量测定1.实验仪器与试剂(1)UV-2101PC紫外可见分光光度计(日本岛津)。(2)电子天平Sartorius，BP211D,德国。(3)KQ—250超声波清洗仪(昆山淀山湖仪器厂)。(4)试剂硫酸、葡萄糖、乙醇均为分析纯。(5)对照品葡萄糖为分析纯，经105。C干燥恒重。2.含量测定2.l标准曲线的制备精密称取105。C干燥至恒重的葡萄糖对照品约50mg于50ml量瓶中，加水溶解并加至刻度。分别精密移取该溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0ml于50ml量瓶中，加水稀释并加至刻度。各取1.Oml于25ml具塞刻度试管中，分别加入5X苯酚溶液1.0ml，摇匀，加入5.0ml浓硫酸(加入硫酸时勿沿壁加入，应将移液管口悬于试管口，使浓硫酸垂直冲入液面)，立即摇匀。沸水浴加热10min，冰水浴冷却，放至室温，以蒸馏水同法做空白参比，在485nm处测吸光度(A)。以A为横坐标，浓度为纵坐标，绘制标准曲线，如图1所示，得线性方程Y二177.18X-1.2019，r=0.9983。线性范围20—120ug/ml。2.2供试品溶液的制备精密称取待测样品约200mg，置100ml量瓶中。按200mg加入100ml比例，计算并加入80%乙醇溶液，超声振荡2h，放置至室温，滤过，弃去滤液，用80%乙醇溶液洗涤残渣3次，将残渣连同滤纸一同移入原100ml量瓶中，加入沸水共约80ml，超声振荡lh，放置至室温定容，摇匀，滤过，取续滤液5.0ml于50ml量瓶中，加水定容，即得。2.3精密度试验分别精密吸取4种供试品溶液1.Oml于25ml具塞试管中，按2.1项下方法显色，测定A值，求得其RSD分别为0.65%、0.70%、1.03%、0.63%(n二5)。2.4显色稳定性将4种供试品溶液完成显色后，2h内连续测定，得其A值为一定值不变。2.5重现性试验取4品种供试样品，分别精密称取5份，制备供试品溶液并测定多糖含量，结果FST、Fl、F2、F3的多糖含量分别为51.2%、54.3%、55.8%、53.7%。RSD分别为1.75X、0.87%、0.33%、1.25%(n二5)2.6回收率试验取已知含量的4种供试品溶液，分别加入一定量的葡萄糖对照溶液，混匀后取1.0ml于25ml具塞试管中，依2.1项下方法显色，测定吸光度，计算回收率。结果4种样品的平均回收率及其RSD分别为100.3%，1.25%;99.6%，2.67%;101.9%，2.01%;100.1%,2.11%;99.8%，1.86%(n=5)。2.7样品的测定按上述2.1、2.2项下方法操作，测定了4个样品的多糖，结果见表6。表6薯藤多糖FST及其分离组分的多糖含量测定结果(n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本发明从天然植物番薯藤中提取分离得到的具有降血脂作用的多糖类混合物，这种混合物主要包含有3种不同分子量段的化合物，与现有技术相比，阐明了番薯藤中降血脂的有效成分，去除了现有产品中大量的杂质，工艺简单方便，质量控制标准有针对性。通过对该活性成分的分离、提取及纯化，得到的混合物制备成治疗降血脂的药物，在高血脂、糖尿病等疾病中具有降血脂方面的作用。图l为葡萄糖标准曲线具体实施方式以下通过实施例进一步说明本发明。实施例薯藤多糖FST的制备方法根据正交试验优选结果，确定最佳提取工艺是100kg番薯藤干品切碎加水煎煮2次，每次1小时。合并煎煮液，减压浓縮后，加入3倍体积95%乙醇沉淀，干燥，得薯藤多糖粗品。凝胶过滤法除去无机盐和小分子杂质，乙醇或丙酮溶剂法除去大分子杂质。再用Sevag法除去蛋白质，即精密称取样品适量，加蒸馏水适量超声溶解，加氯仿一正丁醇溶液(4:1)为水溶液的l/4ml，置于分液漏斗中，充分振摇5分钟后，经离心机4000r/min离心lmin，然后将水相与有机相分开。在水相中再加入相当于其体积四分之一的氯仿一正丁醇溶液，重复上述过程。重复3次，分离得水相后冷冻干燥，得到多糖的混合物，即为薯藤多糖FST。用葡聚糖凝胶柱层析将粗多糖进行分子量分段分离，得到3种多糖类化合物，即为F1，F2，F3。权利要求1、一种天然植物番薯藤中提取分离薯藤多糖的制备方法，其特征在于将天然番薯藤干品切碎水提醇沉干燥后，得薯藤多糖粗品，凝胶过滤法除去无机盐和小分子杂质，乙醇或丙酮溶剂法除去大分子杂质，Sevag法除去蛋白质，得到多糖的混合物，即为薯藤多糖；用葡聚糖凝胶柱层析将粗多糖进行分子量分段分离，得到3种多糖类化合物，即为F1，F2，F3。2、根据权利要求1所述的薯藤多糖的制备方法，其特征在于多糖类化合物Fl分子量超过100万，F2分子量为1一100万，F3分子量为l万以下。3、根据权利要求1或2所述的薯藤多糖的制备方法，其特征在于3种多糖类化合物任意组合成混合物。4、根据权利要求1所述的薯藤多糖的制备方法，其特征在于多糖的重量含量大于或等于50%。5、根据权利要求1所述薯藤多糖的制备方法，该方法包括以下步骤1)将番薯藤干品切碎水提醇沉干燥后，得薯藤多糖粗品；2)凝胶过滤法除去无机盐和小分子杂质，乙醇或丙酮溶剂法除去大分子杂质，Sevag法除去蛋白质，得到多糖的混合物，即为薯藤多糖(FST);3)用葡聚糖凝胶柱层析将粗多糖进行分子量分段分离，得到3种多糖类化合物(Fl，F2，F3)。6、根据权利要求1所述的薯藤多糖的制备方法，其特征在于该混合物具有降血脂方面的作用。全文摘要本发明属医药
技术领域：
，特别是用于高血脂等疾病降血脂作用的从天然植物番薯藤中提取分离薯藤多糖的制备方法。本发明将番薯藤干燥后，经凝胶过滤法除去无机盐和小分子杂质，乙醇或丙酮溶剂法除去大分子杂质，Sevag法除去蛋白质，得到多糖的混合物，即为薯藤多糖(FST)；再用葡聚糖凝胶柱层析将粗多糖进行分子量分段分离，得到3种多糖类化合物(F1，F2，F3)；该方法工艺简单方便，质量控制标准有针对性，得到的混合物具有降血脂方面的作用。文档编号A61K135/00GK101332220SQ20081006235公开日2008年12月31日申请日期2008年5月9日优先权日2008年5月9日发明者张信岳,钦李,红陆,陈爱君申请人:浙江省医学科学院