专利名称：异补骨脂查耳酮在制备抗肿瘤，骨质疏松，老年痴呆药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属医药领域，涉及天然化合物在制备抗肿瘤药,骨质疏松，老年痴呆药物方面的 应用。
背景技术：
雌激素是一种由内分泌系统产生的类固醇类激素，它在生殖系统、骨组织、心血管、 免疫系统及中枢神经系统中都发挥着重要的作用[J Cell Sci, 2003; 116 (4): 585-586]。雌激 素信号传递系统在调节细胞生长、分化和凋亡过程中都起到很大的作用。雌激素依赖型肿 瘤，如乳腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌等的发生和发展都与雌激素有着密切的关系[J Steroid Biochem. Mol. Biol" 2002, 81 (1): 1-24， J Mammary Gland Biol. Neoplasia, 1998, 3(1): 49-61， Curr. Drug Targets Immune Endocr. Metabol. Disord; 2001, 1 (1): 1-12， Cancer Res" 1998, 58(23): 5367-5373， J Psychiatry Neurosci， 2002;27(1): 1-27]，因此对雌激素受体的研究具有指 导抗雌激素和雌激素受体拮抗剂等药物的开发和应用和指导对雌激素依赖型肿瘤等疾病的 治疗的重要意义[Nat Rev. Drug Discov., 2004, 3 (11): 950-964]。
目前已知的雌激素受体分为a、 e两种亚型。雌激素受体a在1958年被Toft和 Gorski等人[Proc. Natl. Acad. Sci. t/&4,1966, 55 (6): 1574-1581]率先从老鼠子宫细胞中分离 得到，1986年Green [Nature, 1986， 320 (6058): 134-139]和Greene [Science,1986, 231 (4742): 1150-1154]等人克隆得到第一个分子量为66kDa的人雌激素受体ERa ; 1996年，Kuiper等 [Proc. Natl. Acad. Sci. 1996, 93 (12): 5925-5930]从大鼠前列腺中克隆得到另一种雌激 素受体ER"。此后，Mosselman等人[FEBS Lett. 1996, 392 (1): 49-53]从人睾丸组织中克隆 得到不完整的人ERe ; Ogawa[Biochem. Bi(Dphys. Res. Commun. 1998, 243 (1): 122-126]和 Moore等人[Biochem. Biophys. Res. Commun.， 1998, 247 (1): 75-78]相继克隆得到完整的人 ERe。雌激素受体ERa与ERP亚型具有类似的序列组成[FEBS Lett. 2003， 546: 17-24, Biochem. Soc. Trans. 2003, 31: 56-59];它们都由三个独立但又相互作用的功能区组成位于 N端的A/B区，中间的C区，以及C端的D/E/F区。N端的A/B区是一个不依赖于配体的转 录活化区(AF-1)，负责与共活化因子的结合以及转录激活相关的耙基因(图1)。 C区是DNA 结合区，含有两个锌指结构，对于分子的二聚化以及和特定DNA序列的结合至关重要。C端 的D/E/F区是一个配体结合区，由它介导配体的结合，受体的二聚化，核定位，以及配体依赖的转录活化功能(AF-2)。
根据传统理论，雌激素通过与细胞浆或核内的雌激素受体(ER)结合并通过调节基因转 录而发挥生物功能。近十年来对雌激素信号通路又有了许多新的认识雌激素信号转导途 径包括细胞核途径(经典途径)和细胞膜途径(非经典途径)。因此雌激素的生物效应，并 不完全依赖于配体-受体的细胞核激活途径，还可通过其他信号通路发挥作用。非经典雌激 素信号通路在不同细胞产生的效应各异，例如17 0雌二醇(E2 P )可通过膜信号通路及P38 激酶和PI3K激酶调节心肌细胞调亡，从而对心血管系统具有保护作用[Curr. Treat. Options Cardiovasc. Med. 2001, 3 (1): 67-79];此外，细胞内几个重要的信号传导通路如G-蛋白信号 通路、磷脂酶C,腺苷酸环化酶及MAPK等信号传导通路都和非经典的雌激素膜信号通路有 相互作用[Trends in Endocrinol. Metabol., 2002, 13, 349-354]。人们广泛认为血清中的高水平 雌激素通过经典及非经典雌激素信号传导途径刺激腺管上皮细胞的持续增生，从而参与雌 激素依赖型肿瘤，如乳腺肿瘤、子宫内膜癌及卵巢癌的发生和发展。然而非经典雌激素膜 信号通路的作用目前尚不清楚。
Flouri9t等[EMBO,2001, 19: 4688-4700]的研究发现除了全长的ER-a 66外还有一个 缺失了第一个外显子所编码的173个氨基酸的ER-a同源异构体。这个新发现的分子量为 46kDa的ER-a同源异构体被称为ER-a 46 ，而较早发现的分子量为66kDa的 ER-a [Nature, 1986, 320 (6058): 134-139; Science, 1986， 231 (4742): 1150隱1154]就被称为 ER-a66。该异构体缺失了 AF1功能区，但保持了其他功能区的完整性。进一步研究发现 ER- a 46能竞争性抑制ER- a 66的AF1的功能，而对AF2的作用没有影响。
2005年另一个分子量为36kDa的全新的ER-a的同源异构体被发现并克隆了 ，并将其 命名为ER- a 36[Biochem. Biophy. Res. Commu. 2005， 336: 1023 - 1027; Proc. Natl. Acad. Sci.
2006, 103 (24): 90634068]。该异构体从存在于ER-a 66基因的第一个内含子中的启 动子开始转录，经一小段外显子后，利用ER-a66的外显子2-6进行编码。因此，ER-a36 缺失两个转录功能区AF1和AF2，但保留了 DNA结合功能区和二聚化功能区。重要的是 ER-a36激素配体结合区(ligand binding domain)缺失了 8-12螺旋区(helix)，从而完全 改变了其与激素配体结合的专一性和亲和力(图1 )。因此，ER- a 36具有和ER- a 66及ER- P 完全不同的激素配体结合能力，为筛选针对ER-a36的特异性配体提供了结构基础。
因ER- a 36缺失AF1和AF2功能区，ER- a 36本身缺失任何转录调节功能，但可以有效 地抑制ER-a 66介导的经典的雌激素核信号通路。ER- a 36主要分布在细胞膜和细胞浆中， 少量分布于细胞核中。ER- a 36从而可通过非经典的雌激素膜信号传导通路并经过MAPK/ERK信号传递途径刺激细胞分裂[Proc. Natl. Acad. Sci. L/&4， 2006, 103 (24): 卯63-9068]。
ER-a36在不同的雌激素依赖型肿瘤，如乳腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌中皆有高表达。因此
ER- a 36介导的信号途径可能参与了多种雌激素依赖型肿瘤的形成和发展。
发明内容
本发明的目的是通过对天然有效成分的研究，提供新的可以调节ER-a和-P生物传导 系统的化合物，可以用于抗肿瘤，心脏疾病，骨质疏松和老年痴呆的作用。 式(I)化合物或式(I)化合物的药学上可接受的盐或溶剂合物<formula>formula see original document page 5</formula>
在制备治疗因雌激素受体ER-a亚型和ER-6亚型引起的疾病的药物中的应用，所述ER-a 亚型包括ER- a 36， ER- a 46以及ER- a 66。
所述式(I)化合物或式(I)化合物的药学上可接受的盐或溶剂合物是作为雌激素受体 ER-a和ER-P亚型的调节剂。
所述药，包括片剂，口嚼剂，胶囊剂，悬浮液剂，溶液剂。
所述疾病包括肿瘤，骨质疏松，哮喘，心脏疾病和老年痴呆。
所述肿瘤为乳腺癌，卵巢癌，子宫内膜癌，胃癌，结肠癌，前列腺癌，血癌或肺癌。
所述肿瘤为乳腺癌，前列腺癌。
所述肿瘤为乳腺癌。
式(I)化合物可从豆科植物补骨脂果实中提取分离得到(郭秀芝，刘卫萍，杨杰，补 骨脂的药理活性及其开发利用[J]，中医药学报，2005年05期，56-57:阮博，孔令义，补 骨脂化学成分的研究[J]，中药研究与信息，2005年04期，7-9;刘志林，张相年，赵 树进，周日笑，补骨脂中补骨脂素的提取及纯化[J]，第一军医大学学报，2005年06期， 156-157;陈业高，于丽丽，补骨脂化学成分的研究[J]，云南师范大学学报(自然科学版)， 2005年04期，55-57;张秋海，丁家欣，张玲，刘泓，补骨脂HPLC指纹图谱研究[J]，中 国中医基础医学杂志，2005年12期，48-49+51;王听，秦民坚，黎路，叶文才，马蔺 地下部分的化学成分[J]，中国药科大学学报，2005年06期，40-42;郭江宁，吴侯， 翁新楚，颜建华，毕开顺，补骨脂中活性成分的提取分离与抗癌实验研究[J]，中药材，2003 年03期，32-34;杨彤彤，秦民坚，补骨脂中新异黄酮成分的分离与结构鉴定[J]，药学 学报，2006年01期，76-79;陈业高，于丽丽，黄荣，补骨脂的化学成分的分离与鉴定，云南化工，2005, 32(2), 3-5;吕娟，斑瑞山.补骨脂的化学成分及药理作用研究进展， 沈阳药科大学学报，1996， 13, 220)。补骨脂果实味辛，苦，归肾脾经，具有温肾补阳，纳 气，止泻之功效(国家药典委员会.中华人民共和国药典，北京化学工业出版社， 2005:129-130).但单一的化合物，如式(I)所示的结构式，其对ER受体的生物活性，尤其 对ER亚型ER-a 36的受体的生物活性以及由此产生的药效未见报导。
实验表明正常乳腺上皮细胞表达少量ER- a 36，而在700例乳腺癌的检査中发现大约 39. 9%乳腺癌样品高表达ER- a 36，且40%雌激素受体阴性的乳腺癌样品虽不表达ER- a 66， 但可表达ER-a36。 ER- a 36也表达在100% ER-， PR- and HER-2+乳腺癌样品.上述结果 表明ER-a36不仅参与ER阳性的乳腺癌的形成和发展，而且可能参与过去被认为是ER阴 性的乳腺癌的形成和发展。进一步研究表明，表达ER-a36的乳腺肿瘤预后极差，并对抗 雌激素药物，如他莫昔芬的治疗反应不强。
雌激素受体阴性的乳腺癌细胞系MDA-MB-231不表达ER- a 66，但高表达ER- a 36，而且 雌激素可促进MDA-MB-231细胞快速增殖。因此ER- a 36启动的促细胞生长信号转导可导致 细胞增殖。同时表达ER- a 66和ER- a 36的ER-阳性MCF7细胞，对雌激素刺激可产生更强 增殖反应，并对抗雌激素药物如他莫昔酚有抵抗作用。
此外，研究表明，心脏疾病，骨质疏松和老年痴呆等疾病同ER-a36的生物功能有着 直接的关系'.因此以ER-a 36为靶点筛选药物将提供一种新的筛选抗肿瘤，心脏疾病,骨质 疏松和老年痴呆药物的途径。
通过实验证明，式(I)化合物，在低浓度条件下，不改变ERa66， ERa46和ER a 36 的表达。然而高浓度的化合物(I)能同时抑制三者的表达；同时化合物(I)能杀死表达ER a 66， ERa 46和ER a 36的乳腺癌细胞MCF7细胞。而式(I)化合物也可作为雌激素受体 ERa36的调节剂，用于治疗因雌激素受体ERa36的异常表达而引起的疾病，如肿瘤，骨质 疏松，哮喘，心脏疾病或老年痴呆等病症。
图l雌激素受体的结构分区
图2 ERa 66， ER a 46和ER a 36在6个不同患者的乳腺癌组织中的表达。
1、正常乳腺组织2、浸润性导管癌组织，3、浸润性导管癌组织，4、浸润性导管癌组织，
5、浸润性小叶癌，6、浸润性小叶癌，7、非浸润性导管癌
图3 在乳腺癌细胞MDA-MB-231中，抗ER a 36特异性抗体显色情况a ER-a 36，阳性结果显示为绿色，DAPI，阳性结果显示为蓝色，联合显色者标注为"Merge"。 图4 MCF7细胞经化合物(I)处理后'Western blot检测ER a 66， ER a 46和ER a 36表达的 情况。
图5 MCF7细胞经化合物(I)处理后，存活细胞数量变化情况。
具体实施方法
式(I)化合物2，3-二氢-7-羟基本-2-(4-羟苯基)-6-(3-甲基-丁基-2-烯基)-4H-l-苯并吡喃 -4-酮从上海友思生物技术有限公司购买。
实施例1式(I)化合物的体外生物试验 试验1:
试验方法含有不同患者乳腺癌组织蛋白的pre-blot滤膜片购至ProSci公司(Poway, CA)。 使用ERci 36特异性的抗ERa 36抗体[ER-a36特异抗体(针对ER-a36 C-端的20个氨基 酸)是由Alpha Diagnostic International (San Antonio, TX)制备，可参阅Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 2006， 103 (24): 9063-9068], HRP标记的二抗以及增强化学发光试剂(ECL， AmerSham Pharmacia Biotech)检测滤膜片并显色。该膜洗脱后，使用能同时检测ER三种亚型(ER a 66， ERa46和ERa36)的抗ERa抗体H222 (Novocastra Laboratories Ltd， UK)检测 膜片。(见图2)
试验结果ERa 66, ERa46和ERa36在浸润性导管癌(泳道2)、浸润性小叶癌(泳道5) 和非浸润性导管癌(泳道7)中表达。此外，ERa36在浸润性导管癌(泳道4)和浸润性小 叶癌(泳道6)中表达。泳道2和泳道3是来源于两位不同患者的浸润性导管癌。泳道5和 泳道6是来源于两位不同患者的浸润性小叶癌。该结果显示ER a 36可以在ER a 66和ER a 46表达阴性的乳腺癌中表达，而在正常乳腺组织中无表达(泳道l)。 试验2:
试验方法MDA-MB-231细胞系是公认的缺乏ER a 66和ER a 46表达的乳腺癌细胞系 [Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumors: an update. 5reasf C朋car fesearc力朋d 7yea加e/3f 2004, 83: 249-289] MDA-MB-231细胞(购至ATCC细胞 库)传代置于8孔BI0C0AT玻片(BD Science Discovery Labware)，培养于含10%胎牛血 清的DMEM培养基，并在37'C, 5% C02的条件下培养12小时。使用无菌PBS冲洗两遍，40/o多聚甲醛(PBS配制，PH7. 4)在室温固定30分钟；然后用PBS洗，和0, 5% (v/v) Triton X-100破膜10分钟；PBS洗，3%血清在室温封闭l小时；抗ER a 36特异性抗体在室温孵 育1小时，含0.5% Triton X-100的PBS (PBST)洗三次；异硫氰酸荧光素(FITC)标记 的荧光二抗孵育1小时；PBST洗三次，PBS洗一次；防淬灭封片剂(Molecular Probes, Eugene, OR)封片。于Nikon E600显微镜下观察，使用MRC-1024激光共聚焦显微镜(Bio-Rad)拍 摄图像。(见图3)
试验结果在ERa66和ERa46表达阴性的的乳腺癌细胞MDA-MB-231中，抗ERa36特异 性抗体显色阳性(标注为aER-a36,阳性结果显示为绿色)，并可以被用作免疫的多肽所 阻断。细胞核使用4， 6-联咪-2-苯基-1H-吲哚染色(标注为DAPI，阳性结果显示为蓝色)。 联合显色者标注为"Merge"。(图中的+P印tide表明在实验中加免疫源多肽来阻断抗体) 试验3:
MCF7细胞经浓度为0um至25um的化合物(I)处理后，免疫印迹法(Western blot)检测 ERa66， ERa46和ERa36表达的情况。(见图4)。
试验结果如图所示，随着化合物(I)浓度的上升，ERa 66和ER a 46的表达下降。然而高浓 度的化合物(T)能抑制三者的表达。 试验4:
试验方法:MCF7细胞系是高表达ER a 66， ER a 46和ER a 36的乳腺癌细胞系(Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumors: an update. Marc Lacroix， Guy Leclercq, 5rea" Atesearc/ 朋c/ 7]reat/ne/ t ,加( 《83; 249-289。) MCF7细胞(购
至ATCC细胞库)培养于含10X胎牛血清的DMEM/F12培养基(Invitrogen)，在37。C和5% C02 的条件中培养12小时。化合物(I)(购至上海有思生物技术公司)，通过DMS0溶解稀释。 MCF7细胞按lXl(f的密度接种于100mm直径的培养皿中，由浓度为0 " ra至25 y m的化合 物(I)处理两周后，使用血球计数器在显微镜下对存活的细胞进行计数。按照浓度进行分 组，5个培养皿为一组。(见图5)图示的是MCF7细胞经浓度分别为0um， 5 u m， 10um， 15 um， 20um和25um的化合物(I)处理两周后，细胞数目变化的表现。细胞计数的单位为 lXl(/个。
试验结果如图所示，MCF7细胞经浓度为5ym的化合物(I)处理后活细胞数量明显下降。
试验5:式(I)化合物对仅表达ERa-36或ERa-66的HEK293细胞的ERK的活化(见图6)
试验方法HEK293, HEK 293/ERa-36 (HEK293细胞用ER-a36表达质粒转染并高表达 ER-a36的细胞株)；HEK 293/ERa-66 cells (HEK293细胞用ER-a66表达质粒转染并高表达ER-a66的细胞株)在10%胚胎牛血清(FBS)和无酚红的DMEM中，禾B 5%C02， 37°C培 养箱中培^^。细胞在含5。/。活性碳处理的FBS的DMEM中培养24小时后，以2乂106/培养 皿的密度接种在O100mm培养皿中。细胞在经过24小时后，加到无血清的DMEM介质中 培养18小时。细胞然后DMSO和化合物(I)在10-15, l(r'°禾[I 10^M(图六中标为0,-15, -10, -6)处理10分钟。细胞用PBS洗两次，收获和裂解细胞，用针对磷酸化或非磷酸化ERK 的抗体做Western blotting分析。
试验结果式(I)化合物可活化表达ER-a36的293细胞中的MAPK/ERK磷酸化。这一 结果表明式(I)化合物可和ER-a36特异性结合并活化下游ERK信号通道。
权利要求
1.式(I)化合物或式(I)化合物的药学上可接受的盐或溶剂合物id="icf0001" file="S2008101041516C00011.gif" wi="101" he="31" top= "43" left = "63" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>在制备治疗因雌激素受体ER-α亚型和ER-β亚型引起的疾病的药物中的应用，所述ER-α亚型包括ER-α36，ER-α46以及ER-α66。
2、 权利要求l所述的应用，所述式(I)化合物或式(I)化合物的药学上可接受的盐或 溶剂合物是作为雌激素受体ER-a和ER-P亚型的调节剂。
3、 权利要求l所述的应用，所述药物包括片剂，口嚼剂，胶囊剂，悬浮液剂，溶液剂。
4、 权利要求1所述的应用，所述疾病包括肿瘤，骨质疏松，哮喘，心脏疾病和老年痴呆。
5、 权利要求4所述的应用，所述肿瘤为乳腺癌，卵巢癌，子宫内膜癌，胃癌，结肠癌，前 列腺癌，血癌或肺癌。
6、 权利要求5所述的应用，所述肿瘤为乳腺癌，前列腺癌。
7、 权利要求6所述的应用，所述肿瘤为乳腺癌。
全文摘要
本发明涉及“异补骨脂查耳酮在制备抗肿瘤，骨质疏松，老年痴呆药中的应用”，属医药领域。异补骨脂查耳酮结构式见式(I)，其化学名为(E)-1-(2，4-二羟基-3-(3-甲基-丁基-2-烯基)苯基)-3-(4-羟基苯基)丙烯-2-酮-1。该化合物，在低浓度条件下，不改变ERα66，ERα46和ERα36的表达，高浓度下能同时抑制三者的表达；同时化合物(I)能杀死表达ERα66，ERα46和ERα36的乳腺癌细胞MCF7细胞。而式(I)化合物也可作为雌激素受体ERα36的调节剂，用于治疗因雌激素受体ERα36的异常表达而引起的疾病，如肿瘤，骨质疏松，哮喘，心脏疾病或老年痴呆等病症。
文档编号A61P35/00GK101288666SQ20081010415
公开日2008年10月22日 申请日期2008年4月16日 优先权日2008年4月16日
发明者坤 孟, 靖 李 申请人:北京珅奥基医药科技有限公司