专利名称：细胞修饰方法和细胞修饰设备的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞修饰方法和细胞修饰设备，其修饰人或动物血液的细
胞组分，尤其是机体天然免疫防御机制的细胞(例如T细胞、NK细胞、 单核细胞、巨噬细胞或小胶质细胞)，以使所述细胞在引入人或动物体内 尤其是哺乳动物体内后发挥治疗作用，例如抗癌症(如肺或胰或卵巢、乳 腺或脑的癌症)或者抗其它疾病，或者发挥诊断作用。本发明还涉及经相 应修饰的免疫细胞。
背景技术：
很久以来，人们就了解通过活性成分进行医学治疗的方法。在这些 方法中，经常将活性成分递送到人或动物的全身。例如，可经口或通过 注射施用活性成分；然后所述活性成分使其自身均匀分布在人或动物体 的整个机体中。可见，之前治疗方法的决定性缺点在于人或动物机体中 未患病的区域也可受到活性成分的影响，并且仅有一小部分活性成分可 在靶区域中发挥作用。因此，相应的高活性成分剂量是可以避免的。
发明内容
本发明的主要目的是使用免疫细胞作为活性物质或药剂(例如药 物、RNAi等)和/或诊断剂的耙向性运载体。为了改善把向性自主运载 (即对疾病组织的乾向)，使用了再靶向(retargeting)策略，例如双特 异性抗体，与TCR相关的遗传转化细胞等。由于其作为活的运载体使 用，免疫细胞导向转移处(例如肺瘤)，并首先发挥内在的细胞毒性功 能。然后释放药剂或活性物质以进行强化。所述释放由特定的在内部或 外部施加的物理或生理因素(例如pH、温度)触发，或者以时间依赖 性方式释放，例如通过如细胞质或溶酶体/内体中的酶或通过pH造成颗 粒/物质或外壳降解来导致释放。药剂或活性物质提高了免疫细胞的天 然作用(内在的细胞裂解/细胞毒性特征)。
此处和以下章节中，所述的细胞组分也简称为细胞。所述细胞还可包括例如人或动物体内其它的已分化天然细胞，或者未分化细胞，例如 干细胞。其后作为药物引入哺乳动物体内的经修饰细胞的治疗作用可包 括例如受控的活性成分释放或组织再生等等。
如此修饰细胞的治疗作用可包括
-释放药剂或活性物质，例如细胞抑制药物和/或血管发生抑制剂，
-释放基于抗体的治疗剂，
-释放用于转染的治疗性DNA,
-释放基于RNAi的治疗剂，其选择性地靶向致病的基因和病毒；和
/或
-释放趋化因子，例如细胞因子或蛋白质肽或糖蛋白，即促进免疫系 统的其他细胞或造成凋亡的调节剂，例如TNFa;
或者，就诊断目的而言
-使细胞负栽造影剂，例如铁磁颗粒(例如用于NMR诊断)。
治疗或诊断剂还可一起使用，例如在免疫细胞中组合，或者通过应 用载有治疗剂或诊断剂的免疫细胞级分来进行。
因此，本发明的任务是开发这样的方法和设备，其允许修饰人或动物 细胞，以使这些细胞在重新引^^A或动物体时被递送到主动靶向的期望机 体部分或细胞，并在那里发挥治疗或诊断作用。通过以这种方式修饰动物 或人细胞，有可能例如以耙向方式用低剂量对抗疾病，或者以乾向方式增 强或强化组织，而不影响机体中未患病的区域，和/或检测;^体中的患病部 位，例如肺瘤和转移的部位。
本发明的目的通过权利要求1的方法、权利要求10的经修饰免疫细胞 以及权利要求13的装置来实现。在从属权利要求中描述了有利的实施方 案。本发明的用途描述于权利要求14和15中。
本发明对上述问题所提供的解决方案的基本方面是提供细胞修饰方 法，其中在第一步骤中，将一种经包封的物质(或多于一种经包封的物质)(优选活性药物成分)引入分离的人或动物免疫细胞中和/或置于其上；以 及其中在引入所述至少一种经包封的物质之前或之后的第二步骤中，增强 所述分离的免疫细胞的细胞毒性效应器(cytotoxic effector)的功能和/或 分别增强所述分离的免疫细胞的靶向能力或靶标寻找能力。
所包封的物质可引入细胞中；但是，也可以将此物质置于、连接或粘 附于细胞的外表面。后者可例如借助静电相互作用技术、借助模印所包封 物质表面的(例如双特异性、单特异性或三特异性的)抗体或分子(以允 许将所述物质置于或固定在细胞表面)来实现。
"增强所述分离的免疫细胞的细胞毒性效应器功能和/或增强所述分 离的免疫细胞的靶向能力，，的含义在本发明中以通常方式理解其增强根 据本发明待修饰的免疫细胞在人或动物机体内识别和/或找寻靶细胞(例如 肿瘤细胞)之能力的每种细胞免疫治疗方法(尤其是过继性免疫疗法)都 认为是在相应表述的范围内。换言之，为了实施所述第二步骤(或者为了 在根据本发明修饰的免疫细胞中实现相应修饰)，可4吏用每种用于增强在 人或动物机体中识别患病靶细胞的再靶向策略。特别地，"增强细胞毒性 效应器功能"的含义还应以如下方式理解，即包括对免疫细胞的修饰，该 修饰使得当这些免疫细胞(载体细胞)到达所述患病靶标处时，所述载体 细胞在把标(例如肿瘤)处的细胞毒性效应器功能会增强.特别地，可以 通it^把标处释放所包封的物质来增强细胞毒性效应器功能。如下文进一 步描述地，可通过多种方式实现在第二步骤中对所述分离免疫细胞靶向能 力的增强例如，可使用利用带有嵌合受体的T细胞进行的再靶向策略， 或者可实现所述免疫细胞与双特异性抗体的组合等。其中，可能有利的是， 修饰该免疫细胞，以使得重新输注入体内之后这##"饰/处理的细胞在患病 部位的细胞毒性效应器功能被增强。
何免疫细胞类型，例如自体或同种异体细胞。例如，可以修饰T细胞，除 了患者自身或供体细胞之夕卜，还可使用细胞系，例如细胞毒T细胞细胞系， 如TALL-104细胞或C CURE 709细胞。还可以修彿NK细胞，例如NK 细胞系，如NK-92。
因此，待修饰的细胞可以是T细胞(单克隆及多克隆T细胞)，尤其 是再靶向的多克隆T细胞(如上所述或通过其它方式再靶向)、肿瘤抗原特异性T-淋巴细胞、经遗传修饰的T淋巴细胞或细胞毒T细胞。
所述第二步骤可在所述第一步骤之前进行，或者在所述第一步骤之后 进行。可通过多种不同方式实现对之前分离自人或动物体的免疫细胞的细 胞毒性效应器功能进行增强，这在下文更详细地进行描述。
基本上，可以借助于公知的细胞分离试剂盒(例如Stem Cell Technologies, 5070 West Seventh Avenue, Vancouver, BC， Canada'的 RosetteSepTM试剂盒)来分离特定的免疫细胞，从而实现本发明的细胞修 饰方法。将治疗剂或活性物质或者诊断物质加载到所分离的免疫细胞上。 这可通过共孵育来进行；但是，也可通过电穿孔来支持所述加载。然而， 作为替代地，本发明的细胞修饰方法也可4吏用本发明的细胞^^设备来实 施，所述设备也在下文进一步描述。
为了根据本发明在应用免疫学或肿瘤学领域中应用和/或用于诊断肿 瘤，增强免疫细胞的效应器功能的方法着眼于增强或提高该免疫细胞的抗 病效应，所述免疫细胞例如细胞毒T细胞，尤其是(优选活化的)细胞毒 T淋巴细胞，例如自然杀伤细胞(NK细胞)，例如单核细胞或例如单核细 胞来源的巨噬细胞，例如小胶质细胞。经相应修饰的免疫细胞可用于过继 性免疫疗法或诊断中。
作为人或动物免疫系统的一部分，这些效应细胞能够识别患病组织或 肺瘤组织，并在其细胞毒性效应器功能的帮助下破坏这些组织。这些细胞 在病毒或抗肿瘤应答过程中在非淋巴组织中主动迁移以及浸润患病组织 的天然能力决定了将这些细胞用于自主的主动物质靶向或者用于诊断。肿 瘤逃a制例如angery、对免疫细胞的凋亡诱导或者效应器功能的抑制经 常阻止免疫系统破坏肿瘤本身。
为了增强这种效应器功能并阻止肿瘤逃逸机制，使用上述两步式方法， 其中额外地将一种或多种暂时包封的物质(尤其是活性药物成分)引入免 疫细胞中或者置于所述免疫细胞上。对所述物质进行包封，以使所述物质 不会在免疫细胞中或在免疫细胞上立即释放，而是在至少数小时后(优选 1天至25天后)释放。这通常对于免疫细胞到达耙组织而不在免疫细胞到 达把组织并通过内在的细胞毒作用破坏肺瘤细胞之前被所负载物质损伤 或破坏来说是必需的。所包封物质或所包封药物的尺寸为约10纳米至1微米。例如，这样的
包封可以借助于脂质体、包封的脂质体(例如，使用藻酸盐如藻酸钡来包
封)、多层月旨质体、嚢质体(vesosome )、病毒颗粒( virosome )或者包含 多孔材料或由其組成的微球(例如通过将物质引入其中)实现，所述多孔 物质为例如聚乳酸(polylactide)或聚乙醇酸-乳酸(polyglycolic-lactic acid， PGLA)聚合物、淀粉、磷灰石和/或压制聚合物(带有或不带有外部包衣 等)葡聚糖、琼脂糖、白蛋白、壳聚糖、二氧化硅或中空二氧化硅颗粒、 聚乙烯亚胺(polyethylenimin)、聚^^丙烯B基酯、聚曱基丙烯酸曱酯 颗粒、核壳纳米颗粒、树枝状聚合物和树枝化聚合物，其核心分子通常是 胺或糖，表面上带有数个相同的壳分子结合位点。所述壳经常在酸和胺 之间改变。
用于包封药剂/物质的上述小体(脂质体等)也可以是经修饰的小体 可分别在抗体或抗体片段或肽(除了分别负载所述物质或引入所述物质之 外)的帮助下修饰小体(脂质体等)，以确保对患病细胞(尤其肿瘤细胞) 的识别、与此类细胞的结合和/或掺入此类细胞中。在这种情况下，将相应 修饰的小体/脂质体加载到待修饰的免疫细胞，当释放物质/药物时，载体 细胞的膜完整性被破坏，脂质体离开细胞，其后分别可结合癌细胞或者可 掺入这些癌细胞中(例如，借助于受体等)。
为了增强掺入免疫细胞(载体细胞)中的效率，可使用免疫细胞表面 所表达受体的配体来修饰所述包封，所述配体例如所谓的细胞穿透肽(cell penetrating peptide, CPP )。 CPP是短的聚阳离子序列，其简化携带此序列 的肽或蛋白质的摻入。如果这些CPP与纳米颗粒或脂质体共价结合，则增 强向细胞中的掺入。这些CPP的实例是TAT和penetrine——HIV病毒的 肽。
经修饰以改善向癌细胞中掺入的经包封活性物质或药剂的释放尤其胜 任于将用于转染的治疗性DNA或基于RNAi的治疗剂掺入载体细胞中。
可通过使用双特异性脂质体进行向载体细胞中的负载来进一步增强此 方法的效率；特别地，后一脂质体既可装载药剂和/或治疗性DNA和/或基 于RNAi的治疗剂等等，又可以用抗体进行修饰、用其衍生物进行修饰(针 对肿瘤特异性表面标志物，尤其是M内化的肿瘤相关抗原(TAA))和/ 或用肽进行修饰(用于基于受体进行的掺入等)。还有可能使用装载有所述物质/药物的脂质体，所述脂质体更早地释放所述物质/药物，其惟一目 的是杀伤载体细胞，以允许上述脂质体以更容易的方式从细胞中释放。相 比于所述脂质体的释放，所述物质/药物从上述脂质体中的释放可实现时间 延迟，以使得待释放的药物精确地在患病组织(例如肿瘤)处释放。
在用于生产药物或诊断剂的细胞修饰方法中，免疫细胞(例如前体细 胞或终末分化的效应细胞)可以例如提取自或分离自哺乳动物的外周血或 者哺乳动物的肿瘤组织。在制备和分离这些免疫细胞以使其可用于负载已 包封的物质之后，可以多种不同方式在负载所述物质之前或之后进行增强 (分离的)免疫细胞的效应器功能和/或靶向能力(优选在重新输注在耙部 位之后)的第二步骤，以增强经修饰细胞找寻患病组织或肺瘤组织的能力 等。
实现增强细胞毒性效应器功能和/或靶向能力的所述第二步骤的第一
种可能是将来自肿瘤相关抗原(TAA)特异性免疫细胞(尤其是TAA特 异性T细胞)的免疫细胞受体基因(例如T细胞受体基因、TCR基因) 引入所分离的免疫细胞中。优选地，可通it&因转移进行此引入。如何进 行相应的基因转移是本领域普通技术人员公知的(参见例如Timothy M. Clay， Mary C. Custer等"Efficient Transfer of a Tumor Antigen-Reactive TCR to Human Peripheral Blood Lymphocytes Confers Anti-Tumor Reactivity", The Journal of Immunology, 1999， 163: 507-513)。
这具有以下优点(这也适用于下文所述的可能性)与使用未通过引入 /安置至少一种已包封物质进行修饰的免疫细^目比，可提高杀伤患病组织 的比率(例如肿瘤杀伤率)。
在所述第二步骤中增强细胞毒性效应器功能和/或靶向能力的第二种 可能是使分离的免疫细胞具有经遗传修饰的或嵌合的免疫细胞受体，其中 优选地，所述分离的免疫细胞是细胞毒T淋巴细胞(CTL)或自然杀伤细 胞(NK细胞)。特别地，所述第二步骤使用嵌合免疫球蛋白(T细胞受体) 的基因转移来进行。这得到了 "设计的免疫细胞，，，例如具有经遗传修饰 或嵌合的免疫细胞受体的细胞毒T淋巴细胞或自然杀伤细胞，所述受体适 于借助结合于与表面上预定标志物的结合来提高癌症识别，从而活化免疫 细胞和/或杀伤癌细胞。在这种情况下，可如下实施所述两步式方法首先 活化这些具有已增强细胞毒性效应器功能的免疫细胞，然后将相应物质或药物引入细胞内，最后将相应活化并负载的细胞引入哺乳动物体内。如何
具体实施相应的基因转移本领域公知的，参见例如Claudia R6ssig和 Malcolm K. Brenner "Chimeric T-cell Receptors for the Targeting of Cancer Cells", 2003, Acta Haematologica; 110: 154-159。
分别增强细胞毒性效应器功能和/或把向能力或者实施所述第二步骤 的另一种可能是将分离的免疫细胞与抗体和/或抗体片段结合，其中优选 使用双特异性抗体、三特异性抗体、双抗体(diabody )、三抗体(triabody ) 和/或四抗体(tetrabody)或其片段，以改善所述免疫细胞识别患病组织的 能力。其中优选地，使分离自哺乳动物机体的多克隆T细胞在第一步骤中 负载所述物质/药物，之后负载抗体，例如负载双特异性或三特异性抗体、 双抗体、三抗体和/或四抗体或其片段。在一个有利的实施方案中，在第一 步骤之前离体活化所分离的T细胞。在所述步骤之前，可进行T细胞扩增。 或者，未活化的免疫细胞也负载至少一种已包封的物质/药物。在此情况下， 抗体(尤其是双特异性抗体或双抗体或其它抗体)分开注射(优选在注射 所述细胞之前)，以使所述细胞的活化在体内进行。这些细胞的体内活化 优选在肿瘤处进行例如，其后抗体可首先与肿瘤结合，其后已负载的细 胞可借助于所述抗体的双特异性功能而与肿瘤结合。最后，可重新将经修 饰免疫细胞引入哺乳动物体内，以提高癌症识别率和/或使所述免疫细胞保 持在活化态。
如何实施相应的组合是本领域技术人员公知的，参见例如Sergey M. Kipriyanov等"Bispecific CD3 x CD19 diabody for T cell-mediated lysis of malignant human B cells", Int. J. Cancer (77), 1998, 763-772页。
最后，进行增强所分离免疫细胞的细胞毒性效应器功能和/或靼向能力 的第二步骤的第四种方法是，从患者提取的免疫细胞中特异性选择预定的 免疫细胞群，其中已知在所述患者中这些免疫细胞群高效地迁移到患病组 织和/或肺瘤处尤其可选择T细胞，例如肿瘤抗原特异性！^淋巴辆胞或 与再靶向策略结合的T细胞或单核细胞(或来源于其的巨噬细胞)等。
在所有上述情况中，在负载所述药物/物质和/或增强细胞毒性效应器功 能之前以及在修饰之后^重新引/^A或动物体内之前，必要时可扩增所 选择的/分离的免疫细胞。对于与抗体(尤其是双特异性抗体或双抗体)组 合的情况，有可能使用多克隆T细胞。扩增仅在特定的例子中是必要的。引入和/或安置经包封的物质之后，将抗体与T细胞组合；之后，重新输注 这样修饰的免疫细胞。或者，首先负载抗体，然后进行所述物质/药物的负 载。
或者，可如下进行两步式方法，其中首先将双特异性抗体等引入体内， 所述双特异性抗体其后修饰胂瘤等，之后将T细胞引入体内，T细胞通过 双特异性抗体停留在肿瘤处。
在所有本发明所述方法中，用经包封的物质/药物负载细胞(即将所 述物质/药物引入哺乳动物免疫细胞内或将经包封的物质置于哺乳动物免 疫细胞上)可通过将所述细胞和颗粒一起孵育优选5分钟至2小时(取决 于所选择的包封)或者通过转染或电穿孔来进行。
在将经修饰免疫细胞重新输注之后，所述免疫细胞会首先根据其天然 功能在哺乳动物体内移动而不受其载荷的影响，并会在患病组织处累积。 在那里，所述细胞会发挥其内在的细胞裂解/细胞毒性作用，即杀伤癌细胞。 然后所述物质/药物从包封中释放(优选3至14天后)导致在载体细胞中 起始凋亡，由此促进所述物质/药物从载体细胞释放进患病组织中。除了细 胞抑制剂之外，其它物质例如血管发生抑制剂也可作为经包封物质载入免 疫细胞中。
用于诊断目的时，可将例如纳米颗粒(即平均直径约为数纳米至约数 微米的颗粒)如铁氧体载入免疫细胞中作为造影剂等，用于MRI等。通 过将这些纳米颗粒引入免疫细胞内，可对肿瘤或转移进行定位。
本发明的经修饰免疫细胞、本发明的细胞修饰方法以及本发明的细胞 修饰i殳备可优选地用于治疗癌症，例如用于治疗^^巴瘤、结肠癌、肺癌和 /或胰腺癌，和/或卵巢癌，和或乳腺癌和/或脑癌等；用于治疗病毒感染的 细胞，用于治疗慢性炎症，即用于慢性炎症治疗中，和/或用于治疗阿尔茨
本发明的经#>饰细胞(以^u目应的细胞修饰方法和细胞修饰设备)具
有以下优点与现有技术的经修饰细胞相比，具有提高的癌症治疗能力， 尤其是提高的肿瘤杀伤作用。
特别地，通过使T细胞负载所述药剂/物质以及通过在T细胞中释it^者，起始了T细胞凋亡，其导致膜完整性增强以及药物释放提高。
图1显示本发明细胞修饰设备的一个实例。
具体实施例方式
下文中，给出本发明细胞修饰设备的实例，其中可产生本发明的经修 饰免疫细胞，或者其中可进行本发明的细胞修饰方法。
在图1中，血液储库1 (例如，AA流)以示意图显示，血液从其中 通过过滤设备3a提供给细胞分离设备4。在细胞分离设备4中，以公知方 式选择期望的细胞，即待#~饰细胞。附图标记3显示过滤流体储库3，过 滤流体可以从其中通过阀2加到过滤设备3a。以>^知的方式(例如在用于 阻抗测量的设备中)借助于计数设备5来确定分离设备4中所分离的分离 细胞的数量。在笫一负载设备6a中，孵育所分离的细胞并负载期望物质/ 期望活性成分在这里，活性成分/物质被包封在脂质体中，所述脂质体是 从活性成分/脂质体储库8a通过锁7a加入的。
因此，此处所用的载体种类^IJ旨质体，所用的脂质体配方可以为以下 月旨质体
(1) DPPC30%、胆固醇40%、 DPPG30%，
(2) DPPC30%、胆固醇40%、 DODAC30%, (3 ) DOPE 70%、 N-琥珀跣DOPE 30% ，
(4) DOPE 69.5%、 N画琥珀酰DOPE 30%和PEG0.5%,或
(5) 胆固醇10至60 mol%、卵磷脂10至60 mol%、 5至25%的选 自以下的带负电载体磷脂酰一甘油、磷脂酰二甘油、磷脂酰三甘油或磷 月旨酰四甘油、砩酸一甘油胆固醇(cholesterol phosphomonoglycerol)或者 磷^^聚甘油胆固醇(cholesterol phosphooligoglycerol )。
所述载体还可以是核壳型纳米颗粒，例如聚(DL-丙交酯乙交酯共聚 物)(poly(DL-lactide-co-glycolide)，或者带有葡聚糖共聚物接枝。或者具有卵磷脂脂质核心及药物(例如依达比星或多柔比星)以及三嵌段共聚物 聚合物表面的核壳型纳米颗粒。所述载体还可以是聚合物-药物-缀合物，
例如依达比星或多柔比星-PLGA寡聚体缀合物。
待包封的物质可以是蒽环霉素类，例如多柔比星、依达比星、柔红霉 素或相关化合物，例如依达比星醇(idarubicinol)，或者待包封的物质还 可以是喜树碱和类似物、博来霉素、顺铂和/或血管发生抑制剂和/或血管 抑素、制管张素(angiostatin )、内皮抑素(endostatin )、 vitaxin、 bevacizuma、 rcccntin。
负载所述物质/活性成分之后，在第二加载步骤中在第二负载设备6b 中增强载有物质的分离免疫细胞的细胞毒性效应器功能。这通过使双特异 性抗体与所分离的已载有物质的免疫细胞的细胞表面相结合(基于相应表 位和/或eptiope)来进行，这借助于包含相应双特异性抗体的第二储库8b 通过第二锁7b来进行。
在测量设备6b中，可测定已两次负载的细胞中活性成分的浓度。最后 借助置于出口 10上游侧的微泵9，通过出口 IO将经修饰的细胞输回人的 血流中。
本发明所述方法可以与所有过继性免疫疗法和/或细胞免疫疗法相组合。
权利要求
1、用于在人或哺乳动物体外修饰人或哺乳动物免疫细胞、尤其是效应细胞的细胞修饰方法，其中在第一步骤中，将至少一种经包封的物质、优选活性药物成分引入分离的人或哺乳动物免疫细胞中和/或置于其上，和其中在引入所述至少一种物质之前或之后的第二步骤中，增强所分离免疫细胞的细胞毒性效应器功能和/或靶向能力，优选增强所述分离的免疫细胞的靶标找寻能力。
2、 根据权利要求l的细胞修饰方法，其特征在于为了增强细胞毒性效应器功能和/或靶向能力，在所述第二步骤中向所 述分离的免疫细胞的基因组中引入来自肿瘤相关抗原(TAA)特异性免疫 细胞尤其是TAA特异性T细胞的至少一种免疫细胞受体基因，尤其是T 细胞受体基因(TCR基因)，其中优选地，所述至少一种免疫细胞受体基 因是通it^因转移引入的。
3、 根据任一项前述权利要求的细胞修饰方法，其特征在于为了增强细胞毒性效应器功能和/或靶向能力，在所述第二步骤中向所 述分离的免疫细胞提供经遗传修饰的或嵌合的免疫细胞受体，其中优选 地，所述分离的免疫细胞是细胞毒T淋巴细胞(CTL )或自然杀伤细胞(NK 细胞)，其中优选地，所述嵌合免疫细胞受体是嵌合免疫球蛋白T细胞受体， 和/或其中优选通过基因转移向所述分离的免疫细胞提供经遗传修饰的或 嵌合的免疫细胞受体。
4、 根据任一项前述权利要求的细胞修饰方法，其特征在于为了增强细胞毒性效应器功能和/或耙向能力，在所述第二步骤中将所 述分离的免疫细胞与至少一种抗体和/或其至少一种片段组合，优选与至少 一种双特异性抗体、三特异性抗体、双抗体、三抗体和/或四抗体和/或其 片段组合，其中优选地，所述至少一种抗体和/或其片段被引入所述分离的 免疫细胞中和/或置于其上，和/或其中优选地，所述分离的免疫细胞是单克隆T细胞或多克隆T 细胞，优选活化的多克隆T细胞。
5、 根据任一项前述权利要求的细胞修饰方法，其特征在于为了增强细胞毒性效应器功能和/或靼向能力，在所述第二步骤中选择 下列特定类型的分离免疫细胞作为所述分离的免疫细胞T细胞，尤其是 肿瘤抗原特异性T淋巴细胞，和/或其中所述分离的免疫细胞是自体细胞、同种异体细胞或前体细胞、终末分化的效应细胞、T细胞、细胞毒T细胞尤其是活化的细胞毒T细胞、 TALL-104细胞、C CURE 709细胞和/或细胞毒T淋巴细胞、肿瘤抗原特 异性T淋巴细胞、NK细胞尤其是NK-92细胞、单核细胞和/或巨噬细胞 尤其是单核细胞来源的巨噬细胞。
6、 根据任一项前述权利要求的细胞修饰方法，其特征在于 在引入和/或安置所述至少一种经包封的物质之前扩增所述分离的免疫细胞。
7、 根据任一项前述权利要求的细胞修饰方法，其特征在于 至少一种所述经包封的物质用于治疗，其包括细胞抑制药物和/或血管发生抑制剂和/或基于抗体的治疗剂和/或治疗性DNA和/或基于 RNAi的治疗剂， 和/或至少一种所述经包封的物质用于诊断，包括金属性纳米颗粒尤其是 铁氧体纳米颗粒，即平均直径约数十纳米至约数微米的颗粒。
8、 根据任一项前述权利要求的细胞修饰方法，其特征在于 在所述第二步骤中，孵育所分离的免疫细胞，优选孵育约5分钟至约2小时，以引入和/或安置所述至少一种经包封的物质，和/或以进行 用于增强所述分离的免疫细胞的效应器功能的引入和/或安置， 和/或其中所述至少一种经包封的物质通过电穿孔和/或转染引入所述分离 的免疫细胞和/或安置于其上，和/或其中所述第二步骤中用于增强所述 分离的免疫细胞的效应器功能的引入和/或安置通过电穿孔和/或转染来 进行，和/或其中所述至少一种物质被包封，以使该物质在约1天至25天之后 释放。
9、 根据任一项前述权利要求的细胞修饰方法，其特征在于 通过以下材料包封所述至少一种物质脂质体，优选包封的脂质体和/或多层脂质体，优选使用藻酸盐、尤其是藻酸钡包封的脂质体；嚢质体、 病毒颗粒和/或包含多孔材料的微球，优选聚乳酸或者聚乙醇酸-乳酸共聚 物(PGLA)、淀粉、磷灰石和/或压制聚合物葡聚糖、琼脂糖、白蛋白、 壳聚糖、二氧化硅或中空二氧化硅颗粒、聚乙烯亚胺、聚氰基丙烯^基酯、聚甲基丙烯酸曱酯颗粒、核壳型纳米颗粒、树枝状聚合物和树枝化聚 合物，其中优选其核心分子是胺或糖，在表面上带有数个相同的用于壳分 子的成键位点的树枝状聚合物和树枝化聚合物，其中优选地所述壳经常在 酸和胺之间变换。
10、 经修饰的人或哺乳动物免疫细胞，优选效应细胞，其包含被引入人或哺乳动物细胞中和/或置于其上的至少一种经包 封的物质，优选活性药物成分，并且显示增强的细胞毒性效应器功能和/或增强的靶向能力，优选增强 的靶标找寻能力。
11、 根据权利要求10的经修饰免疫细胞，其特征在于 所述经修饰免疫细胞中增强的细胞毒性效应器功能和/或增强的靼向能力通过以下来实现向该待修饰免疫细胞的基因组中引入来自肿瘤 相关抗原(TAA)特异性免疫细胞、尤其是TAA特异性T细胞的至少一 种免疫细胞受体基因，尤其是T细胞受体基因(TCR基因)， 和/或其中所述经修饰免疫细胞中增强的细胞毒效应器功能和/或增强的 靶向能力通过以下来实现为待修饰的免疫细胞提供经遗传修饰的免疫 细胞受体或嵌合的免疫细胞受体，和/或其中所述经修饰免疫细胞中增强的细胞毒性效应器功能和/或增强 的靶向能力通过以下来实现将待修饰的免疫细胞与至少一种抗体和/或 其至少一种片段相组合，优选与至少一种双特异性抗体、三特异性抗体、 双抗体、三抗体和/或四抗体和/或其片段相组合。
12、 根据权利要求10或11的经修饰免疫细胞，其特征在于 所述免疫细胞是自体细胞、同种异体细胞或前体细胞、终末分化的效应细胞、T细胞、细胞毒T细胞尤其是活化的细胞毒T细胞、优选TALL-104 细胞或C CURE 709细胞和/或细胞毒T淋巴细胞、肿瘤抗原特异性T淋 巴细胞、NK细胞尤其是NK-92细胞、单核细胞和/或巨噬细胞尤其是单核 细胞来源的巨噬细胞。
13、 用于在人或哺乳动物体外修饰人或哺乳动物免疫细胞、尤其是 效应细胞的细胞修饰设备，所述细胞修饰设备包含用于分离所述免疫细胞的至少一种装置(4)，和 至少一种装置(6, 7, 8)，其适于将至少一种经包封的物质引入所 述分离的免疫细胞中和/或置于其上，还适于增强所述分离的免疫细胞的细胞毒性效应器功能和/或增强其靶向能力，优选增强其靶标找寻能 力，其中所述设备优选地还包含用于在引入和/或安置所述至少 一种经 包封的物质之前和/或在增强细胞毒性效应器功能之前固定所述分离的免疫细胞的装置(6)， 和/或其中优选地，所述细胞修饰设备适于实施根据权利要求1至9中任 一项的细胞修饰方法。
14、 根据任一项前述权利要求的细胞修饰设备和/或细胞修饰方法 用于以下目的的用途用于增强人或哺乳动物免疫细胞的效应器功能和 /或用于癌症治疗，优选结肠癌治疗、淋巴瘤治疗、肺癌治疗、卵巢癌治疗、 乳腺癌治疗、脑瘤和/或胰腺癌治疗；用于慢性炎症治疗；用于阿尔茨海默 病治疗，和/或应用免疫学或肺瘤学领域和/或物质的主动和/或自主靶向领 域，和/或用于诊断，如肿瘤诊断、阿尔茨海默病诊断。
15、 根据权利要求10至12中任一项的经修饰免疫细胞用于制备药物 的用途，所述药物是用于癌症治疗、结肠癌治疗、淋巴瘤治疗、肺癌治疗、 胰腺癌治疗、慢性炎症治疗和/或阿尔茨海默病治疗的药物。
全文摘要
本发明涉及细胞修饰方法和细胞修饰设备。更具体地，本发明涉及用于在人或哺乳动物体外修饰人或哺乳动物免疫细胞尤其是效应细胞的细胞修饰方法，其中在第一步骤中，将至少一种经包封的物质(优选活性药物成分)引入分离的人或哺乳动物免疫细胞中和/或置于所述免疫细胞上；其中在引入所述至少一种物质之前或之后的第二步骤中，增强了所述分离的免疫细胞的细胞毒性效应器功能。本发明还涉及相应修饰的人或哺乳动物免疫细胞，还涉及细胞修饰设备。
文档编号A61K35/14GK101508970SQ20091000722
公开日2009年8月19日 申请日期2009年2月13日 优先权日2008年2月15日
发明者乌特·施泰因费尔德, 李爀熙 申请人:基斯特-欧洲研究协会