专利名称：片仔癀的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种药物组合物的检测方法，特别涉及中药片仔癀的检测方法。
技术背景
片仔癀为全国独家生产及中保品种，原标准收载于《卫生部药品标准中药成方制剂》第18册(标准号WS3-B-3381-98)，片仔癀为类扁椭圆形块状，块上有一椭圆环。表面棕黄色或灰褐色，有密细纹，可见霉斑。质坚硬，难折断。折断面微粗糙，呈棕褐色，色泽均勻，偶见少量菌丝体。粉末呈棕黄色或淡棕黄色，气微香，味苦、微甘。目前尚需要具备更好稳定性、重现性和专属性的质量检测方法对该品种的质量进行有效的控制。发明内容
本发明目的在于提供中药片仔癀的检测方法。
本发明目的是通过如下技术方案实现的
片仔癀检测方法包括如下鉴别和含量测定中的一种或几种
A、取片仔癀细粉0. 1-0. 4g，置具塞锥形瓶中，加甲醇2_鈿1，超声处理10_20 分钟，放置20-40分钟，时时振摇，放置，取上清液作为供试品溶液；另取三七对照药材 0. 3-0. 7g，同法制成对照药材溶液；再取人参皂苷Rbl、人参皂苷Rgl、三七皂苷Rl对照品， 加甲醇制成每Iml含各对照品均为Img的混合溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2005年一部附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各3yL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G板上，以三氯甲烷-甲醇-水(60-70 30-40 5_15)10°C以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105°C烘至斑点显色清晰；供试品色谱中，分别在与对照药材及对照品色谱的相应位置上，显相同颜色的斑占.
B、取片仔癀细粉0. 1-0. 4g，置具塞锥形瓶中，加二氯甲烷-乙醇(5-8 2_5)混合溶液10ml，依次加入10%亚硫酸氢钠2-3滴，盐酸1_2滴，摇勻，密塞，于暗处放置1_2 小时，时时振摇，滤过，滤液作为供试品溶液；另取胆红素对照品，加二氯甲烷制成每Iml含 0. Img的溶液，作为胆红素对照品溶液；再取胆酸、去氧胆酸对照品，加甲醇分别制成每Iml 含对照品Img的溶液(两种溶液)，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2005年一部附录VI B)试验，吸取胆红素对照品溶液10yL，其余三种溶液各6yL，，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G板上，以甲苯-冰醋酸-水(5-15 5-15 1-2)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干；供试品色谱中，在与胆红素对照品色谱相应位置，显相同的黄色斑点；喷以10%硫酸乙醇溶液，于100-110°C烘至斑点显色清晰；供试品色谱中， 在与胆红素对照品色谱相应位置，显相同的绿色斑点；置紫外光灯(365nm)下检视，在与胆酸、去氧胆酸对照品色谱相应位置，显相同的荧光斑点；
含量测定麝香照气相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI E)测定；
色谱条件与系统适用性试验弹性石英毛细管柱Aguanilent HP-1与HP-5或HP-DB17 (柱长30m，内径0. 32mm,膜厚度0. 25 u m)；程序升温初始温度150°C，保持30分钟，以每分钟20°C的速率升温至250°C，保持15分钟；进样口温度250°C，检测器温度300°C ； 理论板数按麝香酮峰计应不低于5000 ；
校正因子的测定取百秋李醇适量，精密称定，加无水乙醇制成每Iml含0. 2mg的溶液，作为内标溶液；另取麝香酮对照品8-iaiig，精密称定，置50ml量瓶中，加无水乙醇适量溶解并稀释至刻度，摇勻，精密吸取2ml，置5ml量瓶中，精密加入内标溶液2ml，加无水乙醇稀释至刻度，摇勻，吸取2 u L，注入气相色谱仪，计算校正因子；
测定法取片仔癀，研细，取l-2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入内标溶液 l_3ml，再精密加入无水乙醇2-細1，混勻，密塞，称定重量，超声处理8-12分钟，放置1_3小时，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇勻，滤过，取续滤液2 W L，注入气相色谱仪， 测定，计算，即得；片仔癀每Ig含麝香以麝香酮(C16H3tlO)计，不得少于0. 27mg，或不得少于 0. 43—不得少于0. 5 Imgο
本发明质量检测方法优选如下鉴别和/或含量测定的一种或几种
A、取片仔癀细粉0. 3g，置具塞锥形瓶中，加甲醇:3ml，超声处理15分钟，放置30分钟，时时振摇，放置，取上清液作为供试品溶液；另取三七对照药材0. 5g，同法制成对照药材溶液；再取人参皂苷Rbl、人参皂苷Rgl、三七皂苷Rl对照品，加甲醇制成每Iml含各对照品均为Img的混合溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2005年一部附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各3 μ L，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G板上，以三氯甲烷-甲醇-水(65 35 10) 10°C以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开， 取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105°C烘至斑点显色清晰；供试品色谱中，分别在与对照药材及对照品色谱的相应位置上，显相同颜色的斑点；
B、取片仔癀细粉0.3g，置具塞锥形瓶中，加二氯甲烷-乙醇(7 3)混合溶液 10ml，依次加入10%亚硫酸氢钠2滴，盐酸1滴，摇勻，密塞，于暗处放置2小时，时时振摇， 滤过，滤液作为供试品溶液；另取胆红素对照品，加二氯甲烷制成每Iml含0. Img的溶液， 作为对照品溶液；再取胆酸、去氧胆酸对照品，加甲醇分别制成每Iml含对照品Img的溶液 (两种溶液)，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2005年一部附录VI B)试验，吸取胆红素对照品溶液10 μ L，其余三种溶液各6 μ L，，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G板上，以甲苯-冰醋酸-水(10 10 1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干；供试品色谱中，在与胆红素对照品色谱相应位置，显相同的黄色斑点；喷以10%硫酸乙醇溶液，于105°C烘至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与胆红素对照品色谱相应位置，显相同的绿色斑点；置紫外光灯(365nm)下检视，在与胆酸、去氧胆酸对照品色谱相应位置， 显相同的荧光斑点；
含量测定麝香照气相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI E)测定；
色谱条件与系统适用性试验弹性石英毛细管柱(柱长30m，内径0. 32mm,膜厚度0. 25um)HP-5 ；程序升温初始温度150°C，保持30分钟，以每分钟20°C的速率升温至 250°C，保持15分钟；进样口温度250°C，检测器温度30(TC ；理论板数按麝香酮峰计应不低于 5000 ；
校正因子的测定取百秋李醇适量，精密称定，加无水乙醇制成每Iml含0. 2mg的溶液，作为内标溶液；另取麝香酮对照品约10mg，精密称定，置50ml量瓶中，加无水乙醇适量溶解并稀释至刻度，摇勻，精密吸取2ml，置5ml量瓶中，精密加入内标溶液2ml，加无水乙醇稀释至刻度，摇勻，吸取2 u L，注入气相色谱仪，计算校正因子；
测定法取片仔癀，研细，取约lg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入内标溶液 anl，再精密加入无水乙醇:3ml，混勻，密塞，称定重量，超声处理10分钟(功率300W，频率 40KHz)，放置2小时，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇勻，滤过，取续滤液2 u L， 注入气相色谱仪，测定，计算，即得；片仔癀每Ig含麝香以麝香酮(C16H3tlO)计，不得少于0.27mg或不得少于0. 43-不得少于0. 5 Imgo
图1是片仔癀三七薄层色谱图2是五种阴性供试品溶液专属性考察；
图3是片仔癀胆红素、胆酸、去氧胆酸薄层色谱图4样品、对照品及缺麝香阴性色谱图5麝香酮标准曲线图。
下述实验和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例1考察三七的薄层鉴别
原展开剂使用三氯甲烷，曾考察用二氯甲烷-甲醇-水(65 35 10)10°C以下放置过夜的下层溶液为展开剂，但三七皂苷Rl的斑点扩散比较严重，与相邻的斑点分离度达不到要求，见图1A，还曾用正丁醇-乙酸乙酯-水G 4 5)、正丁醇-乙酸乙酯-稀氨水(16 4 20)等展开剂进行试验，分离度均达不到要求，点均散开，故用三氯甲烷-甲醇-水(65 35 10) 10°C以下放置过夜的下层溶液为展开剂，供试品色谱中在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且缺三七的阴性样品无干扰，谱图见图1。
1 3 样品(批号:080627、080628、080731)
4.三七对照药材(批号110941-200304中检所)
5.三七皂苷Rl (批号110745-200415中检所)
6.人参皂苷Rbl (批号110704-200318中检所)
7.人参皂苷Rgl (批号110703-200302中检所)
8.缺三七阴性(来源厂家提供)
薄层板20X10cm(横向展开)，展距8cm，温度18°C，湿度57RH%
实验例2牛黄、蛇胆的薄层鉴别
对胆酸、去氧胆酸鉴别的专属性进行再考察。分别制备①缺牛黄；②缺蛇胆；③缺麝香；④同时缺牛黄、蛇胆的双阴性；⑤同时缺牛黄、蛇胆、麝香的三阴性，五种阴性供试品溶液，展开后荧光下检视，见图2，结果显示仅牛黄、蛇胆干扰鉴别，故采用缺牛黄、蛇胆的双阴性。供试品色谱中，在与胆红素对照品色谱相应位置，显相同的黄色斑点。喷以10% 硫酸乙醇溶液，于105°C烘至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与胆红素对照品色谱相应位置，显相同的绿色斑点。置紫外光灯(365nm)下检视，在与胆酸、去氧胆酸对照品色谱相应位置，显相同的荧光斑点。色谱图见图3。
1、样品(批号080627)6
2、胆酸对照品(批号0078-9312来源中检所)
3、去氧胆酸对照品(批号727-9204来源中检所)
4、胆红素对照品(批号100077-200503来源中检所)
5、缺牛黄阴性供试品(来源厂家)
6、缺蛇胆阴性供试品(来源厂家)
7、缺麝香阴性供试品(来源厂家)
8、同时缺牛黄、蛇胆阴性供试品(来源厂家)
9、同时缺牛黄、蛇胆、麝香阴性供试品(来源厂家)；
薄层板10 X 20cm(横向展开)，展距13cm，温度18°C，湿度57RH%。
1.胆红素对照品(批号100077-200503来源中检所)
2 4 样品(批号:080627、080628、080731)
5.胆酸、去氧胆酸对照品(批号0078-9312,727-9204来源中检所)
6.同时缺牛黄、蛇胆阴性(来源厂家提供)
薄层板10X20(横向展开)，展距9cm，温度18°C，湿度57RH%
实验例3麝香含量测定
片仔癀中含有麝香、牛黄、三七、蛇胆等药材，但由于胆红素在供试品溶液中极其不稳定，供试品溶液在提取20分钟后，即由原溶液的黄色变为绿色，蛇胆等胆汁类药材中也含有胆红素，因此用胆红素作为指标成分缺乏专属性。故建立用气相色谱法测定方中麝香酮含量。
1、仪器与试药仪器=Agilent 6890N气相色谱仪、Agilent 7683自动进样器、氢火焰检测器(FID)、Agilent HP-5毛细管色谱柱(30mX0. 32mmX0. 25 μ m)、LM_ID氢气发生器(山东省化工研究院)、AG-I静音空气发生器(山东省化工研究院)。试药麝香酮[来源中国药品生物制品检定所批号719-200208(方法学考察用)，110719-200512(6批检品含量测定用)]；百秋里醇(来源中国药品生物制品检定所批号110772-200404)；样品由福建漳州片仔癀药业股份有限公司提供。无水乙醇为分析纯。
2、方法与结果
系统适用性试验按本发明方法方法及色谱条件试验，对对照品供试品溶液进行测定，系统适用性以麝香酮峰计，理论板数均能达到5000以上；柱子选择采用Agilent HP-I与HP-5、HP-DB17毛细管色谱柱(30mX0. 32mmX0. 25 μ m)对同一份供试品溶液进行测定，结果系统适用性均良好；试验色谱条件试验中发现供试品溶液杂质较多，如未经过程序升至高温后较长时间的冲洗，会影响序列的连续进样。条件设定为弹性石英毛细管柱 (柱长30m，内径0. 32mm，膜厚度0. 25 um)HP_5 ；程序升温初始温度150°C，保持30分钟， 以每分钟20°C的速率升温至250°C，保持15分钟；进样口温度250°C，检测器温度300°C ；理论板数按麝香酮峰计应不低于10000。检测器FID ；气体流速N2-lml/min ；H2-40ml/min ； 空气-400ml/min ；分流2 1 ；进样量2 μ 1 (自动进样)。
按上述色谱条件，麝香酮峰理论塔板数均大于5000，分离度均大于1. 5。
3、内标物质的选择
曾取水杨酸甲酯、丹皮酚、樟脑、正十四烷、丁香酚、百秋里醇适量，加无水乙醇制成每Iml含Img的溶液作为内标溶液。实验结果表明只有选择百秋里醇为内标物，在上述色谱条件下，样品色谱中与其保留时间相对应处无杂质峰干扰，样品加入内标后，内标物与样品中其它相邻峰达到满意的分离(分离度> 1.5)，所以选择百秋里醇为内标物。见图4。
4、内标溶液、对照品溶液、供试品溶液与阴性对照溶液的制备
内标溶液、对照品溶液及供试品的制备同本发明方法。
阴性对照溶液的制备取缺麝香样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。
5、专属性试验
分别吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液，注入色谱仪进行测定，实验结果阴性样品溶液在与对照品相应的保留时间处，无色谱峰出现(见图4)，表明方中其他各味药材不干扰麝香酮的测定。
6、供试品溶液的制备
提取溶剂的选择曾取样品(0401004)0. 15g，精密称定，分别精密加入无水乙醇、 乙醚、乙酸乙酯等溶剂:3ml，分别超声处理10分钟，放置2小时后，取续滤液进样。具体数据见表1。
表1不同溶剂提取得到麝香酮含量比较__提取溶剂_麝香酮含量(mg/g)Γ πι无水乙醇0.455
兀/Λ oh 2 乙醚 0.441 _3_乙酸乙酯_0. 424_
由以上数据得无水乙醇提取的麝香酮量最高。
提取溶剂用量的选择对不同体积的无水乙醇加入量进行比较。取样品1. 0g，精密称定，分别精密精密加入内标溶液2ml，再精密加入无水乙醇3ml UOml, 15ml，按本发明方法方法提取，取续滤液进样。具体数据见表具体数据见表2。
表2不同体积无水乙醇提取得到麝香酮含量比较序号体积(ml)麝香酮含量(mg/g)
150.4672 12 0.463 _3_17_0. 465_
综合以上试验数据提取所用的无水乙醇用量对提取率无明显影响，故选用加无水乙醇3ml,即定容至5ml,即可。
提取方法的选择
曾取样品0. 15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入内标溶液1ml，再精密加入无水乙醇anl，混勻，密塞，称定重量，分别采用①超声处理30分钟，②超声处理30分钟， 放置2小时，③放置2小时，④超声处理10分钟，放置2小时后，分别用无水乙醇补足减失的重量，摇勻，滤过，取续滤液2 u L，注入气相色谱仪，测定，计算，即得。具体数据见表具体数据见表3。
表3不同提取方法得到麝香酮含量比较
权利要求
1.一种片仔癀的质量检测方法，其特征在于该方法包括如下鉴别和含量测定中的一种或几种A、取片仔癀细粉0.1-0. 4g，置具塞锥形瓶中，加甲醇2-細1，超声处理10-20分钟，放置20-40分钟，时时振摇，放置，取上清液作为供试品溶液；另取三七对照药材0. 3-0. 7g， 同法制成对照药材溶液；再取人参皂苷Rbl、人参皂苷Rgl、三七皂苷Rl对照品，加甲醇制成每Iml含各对照品均为Img的混合溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各3 μ L，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G板上，以 60-70 30-40 5-15的三氯甲烷-甲醇-水10°C以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105°C烘至斑点显色清晰；供试品色谱中，分别在与对照药材及对照品色谱的相应位置上，显相同颜色的斑点；B、取片仔癀细粉0.1-0.4g，置具塞锥形瓶中，加5-8 2-5的二氯甲烷-乙醇混合溶液10ml，依次加入10%亚硫酸氢钠2-3滴，盐酸1_2滴，摇勻，密塞，于暗处放置1_2小时，时时振摇，滤过，滤液作为供试品溶液；另取胆红素对照品，加二氯甲烷制成每Iml含 0. Img的溶液，作为胆红素对照品溶液；再取胆酸、去氧胆酸对照品，加甲醇分别制成每 Iml含对照品Img的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取胆红素对照品溶液 10 μ L，其余三种溶液各6 μ L，，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G板上，以 5-15 5-15 1-2的甲苯-冰醋酸-水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干；供试品色谱中，在与胆红素对照品色谱相应位置，显相同的黄色斑点；喷以10%硫酸乙醇溶液，于 100-110°C烘至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与胆红素对照品色谱相应位置，显相同的绿色斑点；置365nm紫外光灯下检视，在与胆酸、去氧胆酸对照品色谱相应位置，显相同的荧光斑点；含量测定麝香照气相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI E)测定；色谱条件与系统适用性试验弹性石英毛细管柱Aguanilent HP-I与HP-5或HP-DB17 ； 程序升温初始温度150°C，保持30分钟，以每分钟20°C的速率升温至250°C，保持15分钟； 进样口温度250°C，检测器温度30(TC ；理论板数按麝香酮峰计应不低于5000 ；校正因子的测定取百秋李醇适量，精密称定，加无水乙醇制成每Iml含0. 2mg的溶液， 作为内标溶液；另取麝香酮对照品8-12mg，精密称定，置50ml量瓶中，加无水乙醇适量溶解并稀释至刻度，摇勻，精密吸取2ml，置5ml量瓶中，精密加入内标溶液2ml，加无水乙醇稀释至刻度，摇勻，吸取2 W L，注入气相色谱仪，计算校正因子；测定法取片仔癀，研细，取l_2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入内标溶液 l_3ml，再精密加入无水乙醇2-細1，混勻，密塞，称定重量，超声处理8-12分钟，放置1_3小时，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇勻，滤过，取续滤液2 W L，注入气相色谱仪， 测定，计算，即得；片仔癀每Ig含麝香以麝香酮计，不得少于0. 27mg,或不得少于0. 43-不得少于0. 5 Imgο
2.如权利要求1所述的片仔癀的质量检测方法，其特征在于该方法包括如下鉴别和含量测定中的一种或几种A、取片仔癀细粉0. 3g，置具塞锥形瓶中，加甲醇:3ml，超声处理15分钟，放置30分钟， 时时振摇，放置，取上清液作为供试品溶液；另取三七对照药材0. 5g，同法制成对照药材溶液；再取人参皂苷Rbl、人参皂苷Rgl、三七皂苷Rl对照品，加甲醇制成每Iml含各对照品均为Img的混合溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各3 μ L，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G板上，以65 35 10的三氯甲烧-甲醇-水10°C以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液， 于105°C烘至斑点显色清晰；供试品色谱中，分别在与对照药材及对照品色谱的相应位置上，显相同颜色的斑点；B、取片仔癀细粉0.3g，置具塞锥形瓶中，加7 3 二氯甲烷-乙醇混合溶液10ml，依次加入10%亚硫酸氢钠2滴，盐酸1滴，摇勻，密塞，于暗处放置2小时，时时振摇，滤过，滤液作为供试品溶液；另取胆红素对照品，加二氯甲烷制成每Iml含0. Img的溶液，作为对照品溶液；再取胆酸、去氧胆酸对照品，加甲醇分别制成每Iml含对照品Img的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取胆红素对照品溶液10 μ L，其余三种溶液各6 μ L，，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G板上，以10 10 1的甲苯-冰醋酸-水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干；供试品色谱中，在与胆红素对照品色谱相应位置，显相同的黄色斑点；喷以10%硫酸乙醇溶液，于105°C烘至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与胆红素对照品色谱相应位置，显相同的绿色斑点；置365nm紫外光灯下检视，在与胆酸、去氧胆酸对照品色谱相应位置，显相同的荧光斑点； 含量测定麝香照气相色谱法测定；色谱条件与系统适用性试验柱长30m，内径0. 32mm，膜厚度0. 25 Um的弹性石英毛细管柱HP-5 ；程序升温初始温度150°C，保持30分钟，以每分钟20°C的速率升温至250°C，保持 15分钟；进样口温度250°C，检测器温度30(TC ；理论板数按麝香酮峰计应不低于5000 ；校正因子的测定取百秋李醇适量，精密称定，加无水乙醇制成每Iml含0. 2mg的溶液， 作为内标溶液；另取麝香酮对照品约10mg，精密称定，置50ml量瓶中，加无水乙醇适量溶解并稀释至刻度，摇勻，精密吸取2ml，置5ml量瓶中，精密加入内标溶液2ml，加无水乙醇稀释至刻度，摇勻，吸取2 W L，注入气相色谱仪，计算校正因子；测定法取片仔癀，研细，取约lg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入内标溶液ani， 再精密加入无水乙醇:3ml，混勻，密塞，称定重量，功率300W，频率40KHz超声处理10分钟， 放置2小时，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇勻，滤过，取续滤液2 u L，注入气相色谱仪，测定，计算，即得；片仔癀每Ig含麝香以麝香酮计，不得少于0. 27mg或不得少于 0. 43—不得少于0. 5 Imgο
全文摘要
本发明公开一种片仔癀的质量检测方法，其特征在于该方法包括如下鉴别和含量测定，鉴别取片仔癀外用制剂制成供试品溶液；另取胆酸、去氧胆酸对照品制成对照品溶液；照薄层色谱法试验，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；含量测定照高效液相色谱法测定，片仔癀每1g含麝香以麝香酮(C16H30O)计，不得少于0.27mg，或不得少于0.43--不得少于0.51mg。
文档编号A61K35/413GK102475728SQ20091009239
公开日2012年5月30日 申请日期2009年9月11日 优先权日2009年9月11日
发明者于娟, 洪绯, 陈纪鹏 申请人:漳州片仔癀药业股份有限公司