炭疽致死因子结构域(LFn)与炭疽水肿因子结构域(EFn)的融合蛋白及其应用的制作方法

专利名称：炭疽致死因子结构域(LFn)与炭疽水肿因子结构域(EFn)的融合蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及生物技术领域，特别涉及一种融合蛋白及其应用，尤其 涉及炭疽致死卣子的保护性抗原结合结构域(LFn)与炭疽水肿因子的保护性抗 原结合结构域(EFn)的融合蛋白及其用于炭疽毒素的中和。
背景技术：
炭疽毒素包括两种A-B型毒素，每种都有不同的催化部分，既水肿因子(EF， edema factor)和致死因子(LF, lethal factor)。两个催化部分共享一个结 合的B部分，保护性抗原(PA， protective antigen)，结合后的完整毒素称为 水肿毒素(ET, edema toxin)和致死毒素(LT， lethal toxin)。炭疽对机体 的伤害主要是由于ET和LT的共同作用。ET和LT进入细胞发挥作用的过程如下 首先是PA与细雄表面受体(ATR， anthrax toxin rec印tor)在细胞表面结合， 随后furin蛋白酶就将PA降解成20kD和63kD的两个组分。PA63在细胞膜表面形成 七聚体，炭疽致死因子和炭疽水肿因子结合在PA七聚体上，经过受体介导的内 吞进入细胞质与底物接触从而发挥其毒性作用。
根据以上的炭疽毒素进入细胞的机理，人们设计了不同的炭疽毒素抑制剂， 分别将毒素作用过程中涉及的不同分子作为耙标，从而阻断毒素的作用，保护细 胞免受毒素的攻击。
LFn是炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域，负责致死因子与炭疽保护性 抗原的结合。LFn由炭疽致死因子的1-263位残基组成。EFn是炭疽水肿因子的 保护性抗原结合结.构域，负责水肿因子与炭疽保护性抗原的结合。EFn由炭疽水 肿因子的1-254位残基组成。重组表达的LFn和EFn仍然具有结合炭疽保护性抗原的能力，但对细胞无毒性作用。LFn和EFn能够与炭疽致死因子和炭疽水肿 因子竞争结合炭疽保护性抗原，具有作为竞争性毒素抑制剂的潜力。但实验显 示，它们的毒素抑制活性非常低。

发明内容
本发明的目的在LFn和EFn的基础上，提供一种具有更强炭疽毒素抑制 (中和)活性的LFn与EFn的融合蛋白。
本发明的LFn与EFn的融合蛋白，包括炭疽致死因子的保护性抗原结合结构 域(LFn)和炭疽水肿因子的保护性抗原结合结构域(EFn)或上述二区的功能 同等物。
所述的功能同等物是指在不改变融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白部分氨 基酸的取代、缺失或添加所得到的多肽。
在本发明所指的融合蛋白中，可以是炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域 (LFn)的第一区位于融合蛋白的N-末端，炭疽水肿因子的保护性抗原结合结构 域(EFn)的第二区位于融合蛋白的C-末端。也可以是炭疽水肿因子的保护性抗 原结合结构域(EFn)的第二区位于位于融合蛋白的N-末端，炭疽致死因子的保 护性抗原结合结构域(LFn)的第一区位于融合蛋白的C-末端。这两种情况对融 合蛋白的毒素中和活性没有太大的影响。
为了使融合蛋白的两部分尽可能的减少互相干扰，融合蛋白的两个部分之间 设置连接肽，连接肽的通式是(Gly Gly Gly GlySer) n， n为1-10的整数。
编码本发明融合蛋白的DNA序列及氨基酸序列。
该序列包括与炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域氨基酸残基序列相同 的第一区和与炭疽水肿因子的保护性抗原结合结构域氨基酸残基序列相同的第
4二区的融合蛋白的DNA序列。其中第一区与炭疽致死因子的保护性抗原结合结 构域氨基酸残基序列相同，第二区与炭疽水肿因子的保护性抗原结合结构域氨 基酸残基序列相同，中间设有(Gly Gly Gly GlySer) 3连接肽的编码序列。 携带融合蛋白编码序列的重组表达载体(图l)和工程菌。
本发明的重组表达载体包括pET21a-LFnEFn及pET21a-27LFnEFn等。将上 述表达载体转化大肠杆菌感受态细胞BL21 (DE3)得到工程菌BL21 (DE3) -pET21a-LFnEFn和BL21 (DE3) -pET21a-27LFnEFn。
本发明的应用。
本发明将LFn和EFn通过一段(Gly Gly Gly GlySer) 3的柔性Linker序列
融合在一起，，建的融合蛋白经过细胞保护实验和毒素攻毒的动物实验检测， 结果显示其具有的毒素中和活性较单体有很大的提高(图3)，可以有效中和炭
疽毒素的作用。


图1.含融合蛋白编码基因的重组质粒pET21a-LFnEFn及pET21a-27LFnEFn的构
建示意图2.本发明融合蛋白的表达纯化图.
图2-l:融合蛋白LFn/EFn的表达纯化。1，未诱导全菌；2、诱导全菌；3、 离子交换纯化产物；4、 Ni柱和凝胶过滤产物。5、蛋白Marker (kDa)
图2-2:融合蛋白27LFn/EFn的表达纯化。1,未诱导全菌；2、诱导全菌； 3、离子交换纯化产物;4、 Ni柱和凝胶过滤产物。5、蛋白Marker (kDa)
5图3.本发明融合蛋白的细胞保护活性图；
具体实施例方式
实施例l: LFn编码序列的扩增
使用PCR方法从质粒pAS22-LF(本研究室构建)扩增出炭疽致死因子的保护 性抗原结合结构域的编码序列，所用的引物LF5和LFn3-Linker使用DNA合成 仪合成，引物LFn5的5'端添加了 Nde I的酶切位点，弓嗽LFn3-Linker的5， 端添加了 BamHl的酶切位点和编码(Gly Gly Gly GlySer) 3连接肽的编码序列。
LF5: 5， -aaccatatggcgggcggtcatggtgatgta-3， LFn3-Linker:
5' -aagggatccagagcccccgccaccagagcccccgccacc卿gcccccgccacccc--gttgatctttaagttcttd
100 u 1的PCR反应体系中加入1 u 1的Vent DNA聚合酶(NEB)， 20 u M的 LF5和LFn3-Linker各2 u 1 ， 2. 5mM的dNTP加入8 w 1 ， 10 X PCR反应缓冲液加 入10u l.PCR的反应条件为94"预变性5分钟，94。C变性30秒，5rC退火30 秒，72"延伸30秒，然后回到预变性，共进行25个循环，最后延伸7分钟。 通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的条带，然后将目的条带切下，纯化。 实施例2: 27LFn编码序列的扩增
27LFn是指去除了 N端27个氨基酸残基的LFn。使用PCR方法从质粒 pAS22-LF(本研究室构建)扩增出炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域的编码 序列，所用的引物25LFn5和LFn3-Linker使用DNA合成仪合成，引物LFn5的5， 端添加了 Nde I的酶切位点，引物LFn3-Linker的5，端添加了 BaraH I的酶切位 点和编码(Gly Gly Gly GlySer) 3连接肽的编码序列。27LJRn5: 5' - aaccatatgcgaaataagiacacaggaagagc _3， LFn3-Linker:
5' -aagggatccagagcccccgccaccagagcccccgccaccagagcccccgccacccc--gttgatctttaagttcttc-3'
100ii 1的PCR反应体系中加入lu 1的Vent DNA聚合酶(NEB)， 20y M的LF5 和LFn3-Linker各2 u 1 ， 2. 5mM的dNTP加入8 U 1 ， 10XPCR反应缓冲液加入10 iil.PCR的反,条件为94。C预变性5分钟，94。C变性30秒，5rC退火30秒， 72'C延伸30秒，然后回到预变性，共进行25个循环，最后延伸7分钟。通过 琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的条带，然后将目的条带切下，纯化。 实施例3: EFn编码序列的扩增
使用PCR方法从质粒pAS22-EF(本研究室构建)扩增出炭疽致死因子的保护 性抗原结合结构域的编码序列，所用的引物LF5和LFn3-Linker使用DNA合成 仪合成，弓l物LFn5的5，端添加了 Nde I的酶切位点，弓l物LFn3-Linker的5， 端添加了XhoI的酶切位点。
EF5: 5， ， aacggatccatgaatgaacattacactgELgagtgatattaaeiag -3， LFn3-Linker: 5， - aacctcgagaccttctttcttcaaactttcacttattttc -3，
100u 1的PCR反应体系中加入In 1的Vent DNA聚合酶(NEB)， 20iiM的 LF5和LFn3-Linker各2 1， 2. 5mM的dNTP加入8 u 1， IOXPCR反应缓冲液加 入10 u 1. PCR的反应条件为94。C预变性5分钟，94。C变性30秒，5(TC退火30 秒，72'C延伸30秒，然后回到预变性，共进行25个循环，最后延伸7分钟。 通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的条带，然后将目的条带切下，纯化。
实施例4:连接肽为(Gly Gly Gly GlySer) 3时LFn/EFn融合蛋白表达载体的构建。取2U g的LFn的使用实施例1中引物扩增得到的LFn编码序列，设置50 w 1的双酶切体系，具体如下2 u g的LFn编码序列，5 ii 1的NEB酶切反应缓 冲液2， 2 w 1的Nde I禾Q 2ii 1的BaraH I ， 0. 5y 1的100XBSA,加双蒸水至总 体积50ul， 37'C水浴中反应IO小时。10小时后使用凝胶回收试剂盒(BBI) 纯化LFn编码序列的双酶切产物。
取800ng的pET21a (Novagen公司)载体，设置50y 1的双酶切体系，具 体如下800ng的pET21a载体，5 u 1的NEB酶切反应缓冲液2， 2 u 1的Nde I 禾口 2y 1的BaraH I ， 0. 5w 1的IOOXBSA，加双蒸水至总体积50y 1， 37。C水浴 中反应10小时。10小时后使用0. 6%的琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，然后将 目的条蒂切下，'凝胶回收试剂盒(BBI)纯化pET21a的双酶切产物。
连接反应取3 ix 1经过纯化的pET21a的Nde I和BamH I双酶切产物，加 入5 u 1经过纯化的LFn的Nde I和BamH I双酶切产物，1 y 1的T4 DNA连接酶 (TaKaRa)和1 y 1的10XT4 ■连接酶反应缓冲液，16。C水浴中连接13小时.
连接产物转化大肠杆菌ZW5"，然后挑取克隆送公司测序(感受态"#5"的 制备方法及转化方法依照"分子克隆实验指南"第二版所述。J.萨姆布鲁克著)。 所得重组质粒命名为pET2la-LFnLinker。
取2 ti g的使用实施例3中引物扩增得到的EFn编码序列，设置50 w 1的双 酶切体系，'具体如下2 u g的EFn编码序列，5 u 1的NEB酶切反应缓冲液2， 2 li 1的Xho I和2 ii 1的BamH I ， 0. 5 u 1的IOOXBSA，加双蒸水至总体积50 u 1， 37。C水浴中反应10小时。10小时后使用0. 6%的琼脂糖凝胶电泳梦离酶切产物， 然后将目的条带切下，凝胶回收试剂盒(BBI)纯化EFn编码序列的双酶切产物。
取800ng的pET21a-LFnLinker载体，设置50 y 1的双酶切体系，具体如下 800ng的pET2la—LFnLinker载体，5 n 1的NEB酶切反应缓冲液2， 2 u 1的Xho
8I禾口 2u 1的BamH I ， 0. 5u 1的100XBSA，加双蒸水至总体积50iU， 37。C水 浴中反应IO小时。10小时后使用0.6%的琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，然后 将目的条带切下，凝胶回收试剂盒(BBI)纯化pET21a-LFnLinker的双酶切产物。
连接反应取3u 1经过纯化的pET21a-LFnLinker的Xho I和BamH I双酶切 产物，力B入5 u 1经过纯化的EFn的Xho I和BamH I双酶切产物，1 P 1的T4 DNA 连接酶(TaKaRa)和1 w 1的10XT4 DNA连接酶反应缓冲液，16"C水浴中连接 13小时.
连接产物转化大肠杆菌/W5"，然后挑取克隆送公司测序(感受态5ffiT"的 制备方法及转化方法依照"分子克隆实验指南"第二版所述。J.萨姆布鲁克著)。 所得重组质粒命名为pET21a-LFnEFn。
实施例5:'连哮肽为(Gly Gly Gly GlySer) 3时27LFn/EFn融合蛋白表达载体
的构建。
取2y g的27LFn的使用实施例2中引物扩增得到的LFn编碍序列，设置50 w 1的双酶切体系，具体如下g的27LFn编码序列，5u 1的NEB酶切反应 缓冲液2， 2u 1的Nde I禾Q 2w 1的BamH I ， 0. 1的100XBSA，加双蒸水至 总体积50yl， 37'C水浴中反应10小时。10小时后使用凝胶回收试剂盒(BBI) 纯化LFn编码序列的双酶切产物。
连接反应取3 u 1经过纯化的pET21a的Nde I和BamH I双酶切产物(实 施例4)，》卩入5y 1经过纯化的27LFn的Nde I和BamH I双酶切产物，1 u 1的 T4 DNA连接酶'(TaKaRa)禾Ci 1 ii 1的10XT4 DNA连接酶反应缓冲液，16。C水浴 中连接13小时.
连接产物转化大肠杆菌ToplO，然后挑取克隆送公司测序(^受态Top10的制备方法及转化方法依照"分子克隆实验指南"第二版所述。J.萨姆布鲁克著)。 所得重组质粒命名为pET21a-27LFnLinker。
取800ng的pET21a-27LFnLinker载体，设置50 P 1的双酶切体系，具体如 下800ng的pET21a-27LFnLinker载体，5u 1的NEB酶切反应缓冲液2, 1 的Xho I和2 li 1的BamH I ， 0. 5 u 1的IOOXBSA，加双蒸水至总体积50 U 1， 37 'C水浴中反应10小时。10小时后使用0. 6%的琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物， 然后将目的条带切下，凝胶回收试剂盒(BBI)纯化pET21a-LFnLinker的双酶 切产物。
连接反应取1经过纯化的pET21a-LFnLinker的Xho I和BamH I双酶切 产物，力口入5 u 1经过纯化的EFn的Xho I和BamH I双酶切产物(实施例4)， 1 li 1的T4 DNA连接酶(TaKaRa)和1 y 1的10XT4 DNA连接酶反应缓冲液，16 'C水浴中连接13小时.
连接产物转化大肠杆菌/W5a，然后挑取克隆送公司测序(感受态ZW5"的 制备方法及转化方法依照"分子克隆实验指南"第二版所述。J.萨姆布鲁克著)。 所得重组质粒命名为pETMa-"LFnEFn。
实施例6: LFn/EFn和27LFn/EFn融合蛋白融合蛋白的表达纯化。
将所获得的pET21a-LFnEFn和pET21a-27LFnEFn质粒转化￡ 瓜i7 (Novagen公司)感受态细胞(感受态制备方法同Zffi ")。工程菌的诱 导表达:挑取克隆于5ml含100 u g/ml氨苄青霉素的LB培养基中，在37°C 250rpm 培养，培养至0D 0. 5 0. 7，加入IPTG至终浓度l咖ol/L，在28°C 250r/m进 行诱导表达6h， lOOOrpm离心5min离心收集菌体沉淀超声(方法及参数依照超 声仪制造商的说明)。超声所得菌液12000g，室温离心2rain，取上清进行SDS-PAGE 分析，以确定重组蛋白是否表达，SDS-PAGE电泳的样品制备方法、电泳电压、凝胶染色和脱色的方法见"分子克隆实验指南"第二版所述。J.萨姆布鲁克著。
取20ml种子液接种入装有1L LB-Amp培养塞的3L锥形瓶，37。C培养至0D600 为0. 6左右，然后加入终浓度为0. 5mM的IPTG，将温度降为28。C诱导8h后， 8000g离心获得菌体，加入1/10体积的20ramol/LTris (pH8.0)重悬菌体，然 后超声破碎菌体，4'C， 12000g离心10min，收集上清。在上清液中添加咪唑和 NaCl至终浓度为50隱ol/L咪唑，0. 5mol/LNaCl。在AKTA-explorer上将上述超 声溶液上Ni柱。平衡缓冲液为20咖ol/LTris0. 5mol/LNaCl 50咖ol/L咪唑pH8. 0。 上样后使用洗脱液(20咖ol/L Tris 0. 5mol/LNaCl 0. 5mol/L咪唑pH8. 0)洗脱， 收集洗脱峰。纯化蛋白经超滤浓縮，再通过Superdex75凝胶过滤柱进一步纯化， 收集蛋白洗脱峰，得到目的蛋白。BCA法测定蛋白浓度。 实施例7:融合蛋白的细胞保护性检测
小鼠巨噬细胞J774A. 1以K)4个/ml接种于96孔细胞培养板，培养约24小 时，长至90%满。用含有100ng/ml PA和LF的新鲜培养液对各样品进行2倍系 列稀释，然后按顺序加入洁净96孔细胞培养板，每样品2复孔，每孔120ul; 后于细胞培养箱中37'C孵育lh。小心地将.J774A. 1细胞培养上清吸去，将孵育 lh的样品转加于含有J774A. 1细胞的培养板中，于细胞培养箱中37'C孵育3h 后，吸出96孔细胞培养板中的培养液，按100 u 1/孔加入MTT溶液(终浓度lmg/ml， 用培养液配制而成)，37'C孵育30min，吸出MTT溶液，每孔加入100wl盐酸-异丙醇，作用10min，用酶联仪测吸光度0Ds7。，结果取平行的3个孔的平均值。 结果表明融合蛋白的体外毒素中和能力较LFn和EFn单体有较大的提高。 实施例8:融合蛋白保护F344雄性大鼠免受炭疽致死毒素的攻击。
F344雄性大鼠购自维通利华；PA、 LF由本室制备，PA、 LF和27LE均使用注 射用水进行稀释，每只大鼠注射40ug的PA和10wg的LF。注射体积为500ul。试剂经由尾静脉注入，大鼠连续观察48小时以上。结果显示炭疽致死毒素与重 组蛋白27LE以一定的摩尔比同时注入有保护效果，大鼠全部存活(连续观察48 小时以上a )，当摩尔比低于一定值时，大鼠的生存时间得到延长，但出现了 严重的肺部损伤，最终死亡。高摩尔比时，与对照相比大鼠没有出现可见的中
毒症状。
表1:同时注射毒素和融合蛋白27LFn/EFn
组别存活数/总数存活时间
PA+LF(40ug+10ug)0/365士3min
PA+LF+8倍摩尔比27LFn/EFn0/3272士45min
PA+LF+16倍摩尔比27LFn/EFn3/348h以上
12序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 〈120〉炭疽致死因子结构域(LFn)与炭疽水肿因子结构域(EFn) 的融合蛋白及其应用
〈130〉 〈160〉 8 〈210〉 1 〈211〉 789 〈212> DNA , <213> LFn <400> 1
gcgggcggtc atggtgatgt 3ggteitgcac gtaaaagaga aagaga33犯t肪agatgag 60
组aagagaa aagatgaaga acga肪taaa acacaggaag agcatttaaa gga幼tcei"tg 120
a肌cacattg teaaaatags agtsasaggg gaggasgctg tt朋a肪3ga ggc昭C3g肪 180
aagctacttg agaaagtacc atctgatgtt ttagagatgt ataaagcaat tggaggaaag 240
atatatattg tggatggtga tattacaaeia catatatctt tegaagcatt atctg肪gat 300
aagaaa肪肌taaaagacat tt3tggg犯Ei gstgctttst tacstgaaca ttatgtstst 兆O
gcaaaagaag gatatgaacc cgtacttgt8 atcca3tctt cggaeigatta tgtagaaaat 420
actgaaaagg cactgaacgt ttattatgaa ataggtaaga tattatcaag ggatatttta 480
agt肪肪ttei atcaaccats tcagaaattt ttagatgtat taaeiteiccat taaaaatgca 540
tctgattcag atggacaaga tcttttattt actaatcagc ttaaggaaca tcccacagac 600
ttttctgtag aattcttgga eic肌肪t站c肌tg3ggtac aagaagtatt tgcgaaagct 660
tttgcatatt atalcgagcc acagcatcgt gatgttttac agctttatgc accggaagct 720
tttaattaca tggataaatt taacgaacaa gaaataaatc tatccttgga agaacttaaa 780
gatcaacgg 789
〈210〉 2
〈211〉 263
〈212> PRT
〈213> LFn
〈400〉 2Ala Gly 1
Lys Asn 16
Thr Gin 31
lie Glu 46
Lys Leu 61
Ala lie 76
His lie 91
Asp lie 106
Ala Lys 121
Asp Tyr 136
lie Gly 151
Pro Tyr 166
Ser Asp 181 ' Glu His 196
Asn Glu 211
Glu Pro 226
Phe Asn 241
Leu Glu 256
Gly Lys Glu Val Leu Gly Ser Tyr Glu Val Lys Gin Ser Pro Val Gin Tyr Glu
His Asp Glu Lys Glu Gly ILeu Gly Gly Glu lie Lys Asp Thr Gin His Met Leu
Gly
5 Glu
20 His
35 Gly
50 Lys
65 Lys
80 Glu
95 Lys 110 Tyr 125 Asn 140 Leu 155 Phe 170 Gly 185 Asp 200 Glu 215 Arg 230 Asp 245 Lys 260
Asp Asm Leu Glu Val lie Ala Asp Glu Thr Ser Leu Gin Phe Val Asp Lys Asp
Val Lys Lys Glu Pro Tyr Leu Ala Pro Glu Arg Asp Asp Ser Phe Val Phe Gin
Gly
Arg
Glu
Ala
Ser
lie
Ser
Leu
Val
Lys
Asp
Val
Leu
Val
Ala
Leu
Asn
Arg 263
Met
Lys
lie
Val
Asp
Val
Glu
Leu
Leu
Ala
lie
Leu
Leu
Glu
Lys
Gin
Glu
His
10
Asp
25
Met
40
Lys
55
Val
70
Asp
85
Asp
100
His
115
Val
130
Leu
145
Leu
160
Asn
175
Phe
190
Phe
205
Ala
220
Leu
235
Gin
250
Val Glu Lys Lys Leu Gly Lys Glu lie Asn Ser Thr Thr Leu Phe Tyr Glu
Lys Glu His Glu Glu Asp Lys His Gin Val Lys lie Asn Glu Ala Ala lie
Glu Axg lie Ala Met lie L>ys Tyr Ser Tyr lie Lys Gin Gin Tyr. Pro Asn
Lys
Asn
Val
Ala
Tyr
Thr
lie
Val
Ser
Tyr
Asn
Asn
Leu
Asn
Tyr
Glu
Leu
Glu
15 Lys
30 Lys
45 Glu
60 Lys
75 Lys
90 Lys 105 Tyr 120 Glu 135 Glu 150 Gin 165 Ala 180 Lys 195 Ser 210 lie 225 Ala 240 Ser 255
14〈210> 3 〈211〉 45 〈212>廳 〈213> Linker 〈400〉 1 '
ggtggcgggg gctctggtgg cgggggctct ggtggcgggg gctct 45
〈210〉 4 〈211> 15 <212> PRT 〈213〉 Linker <400> 2
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
<210> 5 <211〉 762 〈212〉 DNA 〈213〉 EFn <400> 1
atgaatgssc attacsctgs gagtgatstt a33agaaacc ata肪3ctga aa肌aataaa 60
actga肌aag aaa组ttagi agscagtatt组83ctt3g tt肪幼c8gei stttaccaat 120
gaaactttsg ataaaataca gcsgeicac肌geictt3tt犯aaaagatacc t犯ggatgts 180
ct，gaaattt atagtgaatt aggagg卿a 3tct3tttta c卿tatega ttt昭tagaa 240
c'ata_aggagt tacaagattt肌gtg3ag犯gag幼eiaatei gtatgsateig togaggtg肪 300
aaagttccgt ttgcatcccg ttttgtattt gaeiaagaaeiei gggaaacacc t肪attaatt 360
ataaateitca aagattatgc aattaatagt gaacjiaagta aagsagtata ttatga肌tt 420
ggaaagggga tttctcttga tattataagt肪gg3taBat ctctagatcc agagttttta 柳
aatttaatta agagtttaag cgatgatagt geitagtagcg accttttatt tagtcaaaaa 540
tttaaag￡iga_ agctagaatt ga3t犯t3aa 3gt3t恥at3 taasttttst肪肪gaa肪t 600
ttaactgaat ttcagcatgc gttttcttta gcgttttctt attattttgc acctgaccat GGO
agaacggtat tagagttata tgcccccgac atgtttgagt atatgaataa gttagaaaaa 720
gggggatttg ag3a肪t肌g tgsaagtttg幼gaaaga^g gt 762〈210> 6 〈211〉 254 〈212〉 PRT 〈213〉 EFn 〈400〉 2
Met AsnGlu His TyrThrGluSerAsplieLysArgAsnHisLys
1 , 51015
Thr GluLys Asn LysThrGluLysGluLysPheLysAspSerlie
16202530
Asn AsnLeu Val LysThrGluPheThrAsnGluThrLeuAspLys
31354045
lie GinGin Thr GinAspLeuLeuLysLyslieProLysAspVal
46505560
Leu Glulie Tyr SerGluLeuGlyGlyGlulieTyrPheThrAsp
61657075
lie AspLeu Val GluHisLysGluLeuGinAspLeuSerGluGlu
76808590
Glu LysAsn Ser MetAsnSerArgGlyGluLysValProPheAla
91 ■', 95100105
Ser ArgPhe Val PheGluLysLysArgGluThrProLysLeulie
106110115120
lie Asnlie Lys AspTyrAlalieAsnSerGluGinSer..LysGlu
121125130135
Val TyrTyr Glu lieGlyLysGlylieSerLeuAsplielieSer
136140145150
Lys AspLys Ser LeuAspProGluPheLeuAsnLeulieLysSer
151155160165
Leu SerAsp Asp SerAspSerSerAspLeuILeuPheSerGinLys
166170175180
Phe LysGlu Lys LeuGluLeuAsnAsnLysSerlieAsplieAsn
181 ■', 185190195
Phe lieLys Glu AsnLeuThrGluPheGinHisAlaPheSerLeu
196200205210
Ala PheSer Tyr TyrPheAlaProAspHisArgThrVal..LeuGlu
211215220225<formula>formula see original document page 17</formula><210> 8 <211> 542 <212> PRT
<213> LFn/EFn FUSION PROTEIN 〈400> 2
His Gly Asp Val Gly
Ala 1
Lys
16
Thr
31
lie
46
Lys
61
Ala
76
His
91
Asp
106
Ala
121
Asp
136
lie
151
Pro
166
Ser
181
Glu
196
Asn
211
Gly Asn Gin Glu Leu lie lie lie Lys Tyr Gly Tyr Asp His Glu
Gly Lys Glu Val Leu Gly Ser Tyr Glu Val Lys Gin Ser Pro Val
Asp Glu Lys Glu Gly Leu Gly Gly Glu lie Lys Asp Thr Gin
Gly
5 Glu 20 His 35 Gly 50 Lys 65 Lys 80 Glu 95 Lys 110 Tyr 125 Asn 140 Leu 155 Phe 170 Gly 185 Asp 200 Glu 215
Asn Leu Glu Val lie Ala Asp Glu Thr Ser Leu Gin Phe Val
Lys Lys Glu Pro Tyr Leu Ala Pro Glu Arg Asp Asp Ser Phe
Arg Glu Ala Ser lie .Ser Leu Val Lys Asp Val Leu Val Ala
Met His Val Lys Glu Lys Glu
10 15 Lys Asp Glu Glu Arg Asn Lys
25 30 lie Met Lys His lie Val Lys
40 45 Val Lys Lys Glu Ala Ala Glu
55 60 Asp Val Leu Glu Met Tyr Lys
70 75 Val Asp Gly Asp lie Thr Lys
85 90 Glu Asp Lys Lys Lys lie Lys
100 105 Leu His Glu His Tyr Val Tyr
115 120 Leu Val lie Gin Ser Ser Glu
130 135 Ala Leu Asn Val Tyr Tyr Glu
145 150 lie Leu Ser Lys lie Asn Gin
160 165 Leu Asn Thr lie Lys Asn Ala
175 180 Leu Phe Thr Asn Gin Leu Lys
190 195 Glu Phe Leu Glu Gin Asn Ser
205 210 L>ys Ala Phe Ala Tyr Tyr lie
220 225
18Glu 226 Phe 241 Leu 256 Gly 271 Thr 286 Thr 301 Thr 316 Asp 331 Glu 346 His 361 Asn 376 Glu 391 Tyr 406 Gly 421 Asp 436 Asp 451 Glu 461 Leu 476 Phe 491
Pro Asn Glu Gly Gly Glu Glu leu Leu Lys Sep Lys Ala Lys Pro Ser Ley Thr Ala
Gin Tyr Glu Ser Ser Lys Phe Leu Gly Glu Arg Lys lie Gly Glu Ser Asn Glu Pro
His Met Leu Gly Asp Glu Thr Lys Gly Leu Gly Arg Asn lie Phe Asp Asn Phe Asp
Arg 230 Asp 245 Lys 260 Gly 275 lie 290 Lys 305 Asn 320 Lys 335 Glu 350 Gin 365 Glu 380 Glu 395 Ser 410 Ser 425 Leu 440 Leu 455 Lys 465 Gin 480 His 500
Asp Lys Asp Gly Lys Phe Glu lie lie Asp Lys Thr Glu Leu Asn Leu Ser His Arg
Val Phe Gin Gly Arg Lys Thr Pro Tyr Leu Val Pro Gin Asp Leu Phe lie Ala Thr
Leu Asn Arg Ser Asn Asp Leu Lys Phe Ser Pro Lys Ser lie lie Ser Asp Phe Val
Gin Glu Gly Gly His Ser Asp Asp Thr Glu Phe Leu Lys lie Lys Gin lie Ser Leu
Leu 235 Gin 250 Gly 265 Ser 280 Lys 295 lie 310 Lys 325 Val 340 Asp 355 Glu 370 Ala 385 lie 400 Glu 415 Ser 430 Ser 445 Lys 456 Asn 470 Leu 485 Glu 505
Tyr Glu Gly Met Thr Asn lie L>eu lie Glu Ser lie Val Lys Leu Phe Phe Ala Leu
Ala lie Gly Asn Glu Asn Gin Glu Asp Lys Arg Asn Tyr Asp Ser Lys lie Phe Tyr
Pro Glu Asn Leu Ser Gly Glu His Lys Asn Leu Val Gin Thr lie Tyr
Leu Asn Phe lie Tyr Lys Asp Glu Lys Ser Ala
Val Ser Val Lys Glu Ser Asp Lys Glu Tyr Pro
Ala 240 Ser 255 Gly 270 Tyr 285 Lys 300 Lys 315 Gin 330 Ser 345 Glu 360 Met 375 Phe 390 Asp 405 lie 420 Leu 435 Ser 450 Leu 460 Asn 475 Tyr 490 Asp 510<formula>formula see original document page 20</formula>
权利要求
1. LFn与EFn的融合蛋白，包括炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域(LFn)和炭疽水肿因子的保护性抗原结合结构域(EFn)。
2. 根据权力要求l所述的LFn与EFn的融合蛋白，其序列特征是LFn具有序 列表中SEQ ID No 2氨基酸残基序列，EFn具有序列表中SEQ ID No 6氮基 酸残基序列。或者是将融合蛋白中的LFn或EFn的氨基酸残基在不改变融合 蛋白特性的前提下，进行部分氨基酸的取代、缺失或添加所得到的多肽。
3. 根据权利要求l所述的LFn与EFn的融合蛋白，其特征在于所述的炭疽水 肿因子的保护性抗原结合结构域(EFn)位于融合蛋白的N-末端，所述的炭 疽致宛因子的保护性抗原结合结构域(LFn)位于融合蛋白的C-末端。
4. 根据权利要求l所述的LFn与EFn的融合蛋白，其特征在于所述的炭疽水 肿因子的保护性抗原结合结构域(EFn)位于位于融合蛋白的N-末端，所述 的炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域(LFn)位于融合蛋白的C-末端。
5. 根据权利要求l-4中任何一项所述的LFn与EFn的融合蛋白，其特征在于 所述的炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域(LFn)和炭疽水肿因子的保 护性抗原结合结构域(EFn)之间设有连接肽，所述的连接肽的通式是(Gly GlyGlyGlySer) n， n为1-10的整数；其中优选的是n为1-3的整数。特别是 n为3,时构寧的一个具有SEQ ID No 8氨基酸序列的融合蛋白。
6. 根据权利要求1-5中任何一项所述的LFn与EFn的融合蛋白在中和炭疽毒素中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种炭疽致死因子结构域(LFn)与炭疽水肿因子结构域(EFn)的融合蛋白，编码融合蛋白的DNA序列和融合蛋白的氨基酸残基序列，含有所述编码序列的细菌细胞；本发明的融合蛋白包括炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域(LFn)和炭疽水肿因子的保护性抗原结合结构域(EFn)，在不改变融合蛋白特性的前提下，该融合蛋白可以进行部分氨基酸的替换、插入或缺失；本发明的融合蛋白的第一区和第二区之间设置通式为(Gly Gly Gly GlySer)_n(n为1-10的整数)的连接肽；本发明还提供了融合蛋白的用途中和炭疽毒素。本发明的融合蛋白具有中和炭疽毒素的能力，能够用于炭疽的治疗和预防。
文档编号A61P31/04GK101503475SQ20091011951
公开日2009年8月12日 申请日期2009年3月12日 优先权日2009年3月12日
发明者孔毅荣, 徐俊杰, 董大勇, 剑 赵, 强 郭, 薇 陈 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所