Cyr61蛋白在制药中的应用的制作方法

专利名称：：Cyr61蛋白在制药中的应用的制作方法CYR61蛋白在制药中的应用
技术领域：
：本发明涉及CYR61蛋白的用途，尤其涉及CYR61蛋白在制药领域中的应用。
背景技术：
：类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis,RA)是最常见的风湿性疾病之一。不同国家和地区的患病率略有差异。全球RA患病率平均为0.5-1%。在我国，RA患病率为0.45%，患病总人数约为400万左右。RA并不是一种良性病变(benigndisease)，与同龄人相比，RA患者平均寿命可縮短10-15年。RA同时是致残率最高的关节炎之一，未经治疗的患者，其2年和3年的致残率可达50%和70%。RA是一种以关节滑膜炎症为特征的全身性慢性自身免疫性疾病，其临床特点为累及外周关节的侵蚀性滑膜炎，同时具有类似于"局限性恶性肿瘤"的增生性和破坏性的性质，病程为进行性，自行缓解罕见。晚期RA患者由于其关节软骨及骨的破坏，而导致关节畸形和功能障碍。此病发病机制迄今未能完全阐明，且无特效治疗。自20世纪90年代以来，采用模仿治疗恶性肿瘤的联合化学疗法，是该病治疗的一大突破。但目前的药物治疗及滑膜切除、关节置换等手术疗法只能缓解炎症和疼痛，而对软骨和骨的侵袭性破坏无效。因此深入研究RA的发病机制，寻找新的治疗靶点具有重要的理论和实际意义。CYR61(cysteine-rich61)是一种由381个氨基酸残基的相对分子质量为42kDa的分泌蛋白，最早被克隆的CYR61是1985年Lau等在用血清或血小板衍生生长因子(PDGF)剌激小鼠BALB/c3T3成纤维细胞时发现的，因富含半胱氨酸(含10%的半胱氨酸残基)被命名为CYR61。CYR61具有明显的促有丝分裂活性和趋化性，可诱导成纤维细胞增殖和分泌细胞外基质，参与调节细胞增生、分化、胚胎发育形成，是生命活动的基本蛋白。目前，对于CYR61的研究多集中在肿瘤中，而在类风湿关节炎中的作用尚无报道。
发明内容本发明的目的是，提供CYR61蛋白的新用途。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种CYR61蛋白在制备治疗风湿性疾病药物中的应用。所述的风湿性疾病是类风湿性关节炎。依据上述技术方案，本发明的具体实施方法是1、在基因芯片筛查的基础上，运用实时定量PCR方法分析了CYR61在RA患者不同组织中的表达格局。发现CYR61主要表达在RA患者的滑膜组织中，其相对含量是RA患者外周血单个核细胞的8.7倍、是RA关节液单个核细胞的13.3倍、正常人的外周血单个核细胞的125倍。同时用免疫组化的方法比较了RA、OA、正常人的滑膜组织中CYR61的表达情况，发现CYR61在RA滑膜组织中表达明显高于OA患者和正常对照。进一步采用体外培养RA滑膜组织来源的FLS进行研究用实时定量PCR发现CYR61在培养的FLS中表达高于滑膜组织；采用WesternBlot方法比较了培养的RA、0A、正常人的FLS中CYR61蛋白的表达3格局，明确了CYR61在RA患者的成纤维样滑膜细胞中的表达显著高于OA和正常对照，提示CYR61在RA滑膜组织病变中可能发挥着重要的作用。2、采用原代细胞培养的方式研究RAFLS在局部炎症环境中的增殖与CYR61高表达的关系。用RA患者的SF剌激培养的FLS，发现RA患者的SF可以显著剌激FLS的增殖，同时可以剌激FLS中CYR61的表达。而后探讨SF中何种细胞因子能上调CYR61的表达，采用纯化的细胞因子分别剌激RAFLS，发现IFN-Y和TNF-a可以明显上调CYR61的表达。为了进一步研究CYR61的功能，我们制备并筛选了能够与天然CYR61蛋白相结合的单克隆抗体；并采用ELISA的方法检测RA滑膜液中CYR61的含量，发现RA滑膜液中存在高浓度的CYR61。为了明确CYR61蛋白对FLS增殖的作用，采用CYR61单克隆抗体阻断的方法研究CYR61对于FLS增殖的影响。结果显示，在中和了SF中CYR61蛋白后，SF剌激FLS增殖的能力明显下降，表明CYR61蛋白在SF剌激FLS增殖过程中发挥了重要作用。3、用siRNA干扰的方法研究CYR61调控滑膜细胞增殖的机制。用筛选得到的CYR61特异性siRNA沉默FLS中CYR61基因的表达，发现干扰后FLS的增殖能力下降同时凋亡增加，证实CYR61可通过抑制其凋亡而发挥促进增殖的作用。为了探讨凋亡家族分子是否参与CYR61抑制FLS凋亡，采用实时定量PCR的方法检测了CYR61干扰后Bcl_2家族基因表达的变化，发现随着CYR61基因的抑制，凋亡抑制基因Bcl-2mRNA表达水平明显下调；而其它Bcl-2家族基因则没有明显变化，这一结果提示CYR61可通过上调抑凋亡基因Bcl-2而抑制FLS的凋亡，从而促进了FLS的增殖。本发明优点在于1、本发明发掘了CYR61蛋白的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。2、本发明结果表明CYR61具有促进成纤维样滑膜细胞(FLS)增殖的作用，其作用途径之一是抑制滑膜细胞的凋亡和上调金属蛋白酶而参与关节软骨和骨组织破坏，这一结果为寻找生物和小分子药物治疗靶点提供实验依据，具有临床应用价值。图1:RA患者组织及细胞中CYR61基因的相对含量表达格局(P<0.0001***P=0.0054**)。图2:滑膜组织切片HE染色和免疫组化结果，A:正常滑膜组织HE染色(20X)，B:OA滑膜组织HE染色(20X)，C:RA滑膜组织HE染色(20X)，D:正常滑膜组织CYR61组织化学染色(40X)，E:0A滑膜组织CYR61组织化学染色(40X)，F:RA滑膜组织CYR61组织化学染色(40X)。图3A:FLS的体外培养和鉴定，第三代FLS(400X)。图3B:FLS的体外培养和鉴定，FLS的鉴定(<2%CDlIb，<2%CD14+，<1%CD3+，and<5%CD19+，流式细胞仪检测).CYR61在RA滑膜组织和体外培养的滑膜纤维母细胞中的表达。图4A:体外培养的RAFLS中高表达CYR61,RAFLS中CYR61的表达明显高于RA滑膜组织。图4B:体外培养的RAFLS中高达CYR61，CYR61mRNA在RAFLS中的表达明显高于OA和正常人FLS。图4C:体外培养的RAFLS中高表达CYR61，Western-blot:RA，OA和正常人FLS中CYR61蛋白的表达。图5A:不同浓度滑膜液对FLS增殖的影响。图5B:不同浓度滑液对FLSCYR61mRNA表达的影响。图5C:不同浓度滑液对FLSCYR61蛋白水平表达的影响。图6A:IFN-y禾PTNF-a均可上调RAFLS中CYR61的表达，不同细胞因子剌激RAFLS后检测CYR61的表达，细胞因子浓度分别为IL-IOO.lng/ml，IL-120.5ng/ml，IFN_y0.05ng/ml，TNF_a0.05ng/ml。图6B:IFN-y禾PTNF-a均可上调RAFLS中CYR61的表达，阻断抗体anti-IFN-y(10iig/ml)和anti-TNF-a对IFN-y，TNF-a和SF剌激作用的影响。图7:ELISA检测RA和0A滑膜液以及RA外周血中CYR61蛋白的含量RASF中CYR61蛋白的含量明显高于对照OASF、RA患者外周血。图8:RASF中的CYR61蛋白可以剌激FLS的增殖。特异性CYR61单克隆抗体与sf分别以i:25、i:50、i:ioo、i:200的比例混合后加入fls中(见x轴下标注)，无关抗体加入在M+SF组中(黑色柱表示)；FLS的增殖用3H参入的方法检测。图9A:筛选针对CYR61基因的特异性siRNA，光学显微镜观察转染荧光标记小RNA到细胞内的情况，以观察脂质体的转染效率。图9B:筛选针对CYR61基因的特异性siRNA，荧光显微镜观察转染荧光标记小RNA到细胞内的情况，以观察脂质体的转染效率。图9C:筛选针对CYR61基因的特异性siRNA，使用CYR61基因的特异性小RNA干扰人293T细胞株24小时，用realtimePCR检测CYR61基因的情况，其中以第三条(H_3)效率最高。图10:特异性siRNA干扰人CYR61基因的时相分析。使用CYR61基因的特异性小RNA干扰RAFLS24小时，用realtimePCR检测CYR61基因的情况。图11A:CYR61干扰后RAFLS增殖减少。图11B:CYR61干扰后RAFLS凋亡增加。图12A:siRNA干扰后FLS后Bcl_2家族mRNA的表达。图12B:siRNA干扰后FLS后Bcl_2蛋白的表达。具体实施方式下面结合附图对本发明提供的CYR61蛋白在制药中的应用的具体实施方式做详细说明。实施例1:CYR61在类风湿关节炎滑膜组织中的表达格局—、材料与方法1实验材料1.1临床样本研究中所有样本均来自于临床骨科行膝关节置换或滑膜切除术的RA病人和OA患者，所有病例的诊断符合国际诊断标准。正常对照2例来自与创伤患者。患者滑膜组织用于细胞的体外培养，部分组织4%多聚甲醛固定后留作免疫组化，血清和滑膜液(SF)高速离心后获得上清，-S(TC储存。本研究中所用临床样本，均对患者进行知情告知。2实验方法2.1细胞制备2.1.1外周血单个核细胞的制备肝素抗凝全血采用淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离单个核细胞，PBS洗涤2次，细胞备用。2.1.2滑膜液单个核细胞的制备肝素抗凝滑膜液采用淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离单个核细胞，PBS洗涤2次，细胞备用。2.2FLS的制备及原代培养无菌获取滑膜组织，PBS清洗后用无菌手术剪刀剪切成约lmm*lmm*lmm的碎块；用2-3倍体积0.5mg/ml的胶原酶I或胶原酶11，37t:，消化2小时；经200目纱网过滤后，离心去上清后，将细胞重悬于DMEM培养液，置于培养皿中，37t:，5XC02培养。之后待FLS生长成片>80%时，消化传代。并取传至第3代FLS进行表面标记染色(鼠抗人CDpCDm、CD19，CDllb)鉴定。2.3实时定量PCR采用ABI公司提供的软件prism2.0设计CYR61和GADPH(作为内参)引物，序列如下表1.定量PCR检测基因及引物序列基因名称Sequence5'3，GAPDHCYR61ACCCACTCCTCCACCTTTGA(forward)CTGTTGCTGTAGCCAAATTCGT(reverse)TCCAGCCCAACTGTAAACATCA(forward)GGACACAGAGGAATGCAGCC(reverse)按照QIAGEN试剂盒提供的说明抽提RNA并进行逆转录。按照ABI操作说明书进行实时定量PCR。2.4滑膜样本组织病理性和免疫组织化学检查将获得的滑膜样本按照常规病理切片要求制备标本，经脱水、固定、包埋、切片、染色。进行HE染色和CYR61特异性组织化学染色。2.5滑膜组织免疫组化图像分析将图像输入图像分析仪，经去除原图中各种噪声和畸变后进行图像二值化处理后将所获得的测量参数转换到Excel进行分析，获得蛋白表达的相对量。2.6Westernblot检测FLS细胞CYR61蛋白表达按照常规方法进行CYR61蛋白的电泳、转膜、抗体杂交与显色(采用ECL压片法)。二、结果1.RA病人滑膜组织CYR61mRNA表达增高本实验室前期运用基因芯片检测发现CYR61基因在RA滑膜组织中表达增高，为明6确RA病人FLS中CYR61的表达情况，我们应用实时定量PCR分析了10例RA患者外周血、关节液和滑膜组织来源的单个核细胞，以及10例患者完整滑膜组织中CYR61mRNA的表达水平，图1中可见CYR61和内部参照GAPDH均得到了特异性S型扩增曲线，各复孔曲线一致，结果可靠。分析实时定量PCR结果，在RA患者的滑膜组织CYR61基因的相对含量比患者的外周血、关节液和滑膜组织来源的单个核细胞以及正常人的外周血单个核细胞分别高8.7倍、125倍及13.3倍(p<0.05)，证实了基因芯片的结果。2.RA病人滑膜组织中的CYR61表达增高为了进一步验证上述用分子生物学手段检测的结果，我们进一步通过HE染色和免疫组化观察了CYR61在滑膜组织不同细胞中的分布及蛋白表达水平。结果发现，与0A及正常滑膜组织(图2A、B箭头指示血管周围无炎症细胞浸润)相比，可见RA患者滑膜衬里层和衬里下层巨噬细胞样滑膜细胞浸润，血管增生，大量淋巴细胞，浆细胞和单核细胞浸润，淋巴滤泡形成伴纤维素样坏死，FLS增生(图2C箭头指示炎性细胞浸润)。在HE染色的基础上，应用免疫组织化学技术对RA患者手术切除的滑膜组织进行连续切片、ABC染色发现，类风湿关节炎的滑膜衬里层细胞及衬里下层血管内皮细胞、以及FLS中均有CYR61蛋白表达(图2F箭头指示棕褐色颗粒为CYR61蛋白)，主要分布于细胞浆，在滑膜绒毛的近关节腔端尤其多见。而OA患者和正常人的滑膜组织则极少见CYR61蛋白表达(图2D、E箭头指示棕褐色颗粒CYR61蛋白)。3.RA患者滑膜成纤维细胞体外生长和鉴定为了验证免疫组化的结果，我们建立了FLS的体外培养体系。将RA、OA和正常人手术得到的滑膜组织进行消化，37t:培养，待长成片状后进行传代，显微镜下观察，3-5代的RAFLS生长迅速，细胞形态趋向于长梭形，排列整齐，取向一致(图3A)。用特异性淋巴细胞分化抗原如CD3，CD14，CD19，CD11C等标记后用流式细胞仪检测发现上述分子表达为阴性(<2%CDlIb，<2%CD14+，<1%CD3+，and<5%CD19+)，表明所培养的细胞为较为均一的FLS，极少有淋巴细胞污染(图3B)。4.RA病人滑膜成纤维细胞CYR61表达增高为明确RA病人FLSCYR61的表达情况，我们应用实时定量PCR分析了滑膜组织和体外培养的FLS中CYR61mRNA的表达格局。如图4A所示，在RA患者的FLS中CYR61基因的相对含量明显高于滑膜组织(P<0.01)，说明CYR61主要在RA滑膜组织的成纤维样滑膜细胞中表达增高；同时我们还比较了RA、OA和正常人培养至第3代的FLS中CYR61mRNA的表达水平。如图4B所示，在RA患者的FLS中CYR61基因的相对表达量比OA患者和正常人的FLS分别高3.5倍、20倍(p<0.05)，从mRNA水平上证实了CYR61在RA病人FLS表达增高。进一步用Western-blot的方法对RA、OA和正常人的FLS进行CYR61蛋白表达水平检测。我们收集了体外培养的RA、OA、正常人的FLS，加入蛋白裂解液。12%SDS-PAGE电泳、转膜、5X脱脂奶粉封闭过夜、一抗CYR61多克隆抗体(1:200稀释)杂交过夜、HRP标记二抗(l:2000稀释)孵育2h，增强化学发光混合液中自显影。结果可见，RAFLS中CYR61表达水平明显高于OA和正常人FLS，从而验证免疫组化的结果，更加证明CYR61主要表达在滑膜的成纤维样细胞中。这样系统的建立为进一步分析CYR61在FLS生长和在RA的滑膜炎症中的生物学功能奠定了基础。实施例2:类风湿关节炎滑液中CYR61促进FLS的增殖—、材料与方法1.1滑膜液剌激实验将3-5份滑膜液混匀后加入呈对数生长期的FLS继续培养24h后检测CYR61的mRNA及蛋白表达水平，或者FLS增殖(详见下)。1.2细胞增殖和抗体阻断实验取对数生长期的FLS，经O.25%的胰蛋白酶消化后调整细胞浓度1X104cellS/ml，接种于96孔细胞培养板中，加入不同浓度的SF(SF与培养液的比例分别为i:32、i:i6、i:8、i:4、i:2)或细胞因子(il-io，ili2，ifny，TNFa和IL-17)，或纯CYR61蛋白与FLS共同培养。在培养结束前16个小时加入lyCi的3H(每孔)，收集细胞，13液闪仪检测增殖。抗体阻断实验即在上述SF、或者CYR61蛋白及细胞因子作用FLS之前，先用相应中和抗体进行孵育2小时(同时用无关单抗作为对照)，然后再加入FLS的培养中，其余操作同前。1.3ELISA检测滑膜液和外周血中CYR61蛋白收集RA、OA的SF(各30份)和正常人外周血(30份，作为对照)，-8(rC保存。检测时在ELISA板中加入100ill上述待检样品后置37t:，120分钟包被。经充分洗涤后加入制备的抗CYR61抗体(用购买的标准抗CYR61多抗作为校正和阳性对照)，孵育后洗涤再加二抗和底物，中止反应后在ELISA读板机492nm处读取吸光度，根据检测样品和标准品吸光度值计算检测样品中各种细胞因子的2.8CYR61单克隆抗体制备用基因以重组表达的CYR61蛋白按照常规方法与等体积的福氏完全佐剂混匀乳化后，皮下多点注射免疫小鼠。将免疫完成的小鼠脾脏细胞取出与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。然后进行有限稀释和筛选出能够特异性和CYR61基因工程蛋白结合的细胞克隆，获取上清用ELISA方法检测其特异性和效价。其中3号单抗为2006年6月22日制得，另一株为2007年12月7日制得。2.9CYR61单克隆抗体腹水制备和纯化取CYR61杂交瘤细胞注射至68周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔一侧，810d左右后，待小鼠腹腔明显胀大时，无菌下抽取腹水分装于一8(TC保存。二、结果1.RA的滑膜液(SF)剌激FLS增殖与CYR61表达为了观察局部炎症环境对于FLS的生物学效应和CYR61表达的影响，我们将RA患者的滑膜液(SF)加入培养的细胞中，利用tf-TdR掺入法，在DNA合成水平上，观察不同浓度滑液对于RA-FLS增殖的影响。如图5A所示，滑膜液呈剂量依赖性促进RAFLS的DNA合成，与对照组相比，各剂量组滑膜液均明显促进RAFLS的DNA合成(P<0.01)。我们在体外培养中，用RA病人的滑液剌激RA病人的FLS。用不同浓度的RA-SF剌激FLS，随着浓度增高，其剌激CYR61表达的作用也增强。RA的SF的剌激作用呈剂量依赖性。RA-SF稀释到1:32，剌激作用基本消失。本试验分别在mRNA水平和蛋白水平进行了real-timePCR检测(图5B)和westernblot(图5C)分析。2.RASF中IFN-y和TNF-a可上调CYR61表达由于SF中含有高浓度的细胞因子，为了明确这些细胞因子是否与CYR61上调有关，本研究中用纯化的细胞因子分别剌激RAFLS，观察其CYR61的表达情况。为了模拟其在体内的作用，细胞因子的浓度选择为在SF中能够检测到的浓度。结果表明IFN-y8和TNF-a能够上调CYR61的表达。为了明确该两种细胞因子的作用，进而采用阻断抗体anti-IFN-y(10iig/ml)和anti-TNF-a(200ng/ml)分别与SF混匀，在剌激8小时后收集培养的细胞，使用realtimePCR的方法检测其CYR61的表达水平。结果显示细胞因子IFN-y和TNF-a均有上调CYR61表达的作用，混合的细胞因子作用最强，与SF相似(图6A)。而用IFN-y和TNF-a抗体阻断后，SF的剌激作用也明显下降，联合阻断的作用更明显(图6B)。3.RA患者SF中含有高浓度CYR61:由于CYR61是一种分泌性蛋白，具有明显的促有丝分裂活性，可诱导成纤维细胞增殖。而我们的实验也证实RA病人滑膜细胞中高表达CYR61蛋白，为此我们采用本室制备的具有结合天然CYR61蛋白的3号单克隆抗体(3号单克隆抗体制备方法见上述2.8CYR61单克隆抗体制备)，检测RASF(n=30)中CYR61蛋白的含量，并与0ASF和RA患者外周血清相对比。结果显示RASF中CYR61蛋白明显高于对照OASF，RA患者外周血(P<0.0001，图7)。4.RASF中的CYR61蛋白可以剌激FLS的增殖为了研究SF中的CYR61蛋白是否具有剌激滑膜细胞增殖的作用，我们上述3号单抗中和SF中的CYR61蛋白，观察对滑膜细胞增殖的影响。取对数生长期的FLS，接种至96孔培养板中，将抗人cyr61单抗与sf混合，按照i:25、i:sou:ioo、i:200比例加入SF中，同时设无关单抗(1:25)为对照。经与滑膜细胞培养24小时后Thymidine掺入检测FLS的增殖作用。结果发现CYR61单克隆抗体能够中和RA-SF剌激滑膜细胞增殖的作用，并且呈剂量依赖性。当RA-SF稀释到1:200，阻断作用基本消失(图8)。表明CYR61蛋白具有剌激滑膜细胞增殖作用。实施例3:CYR61促进类风湿关节炎FLS增殖的机理研究—、材料与方法1、临床样本、CYR61基因和蛋白表达检测均同"实施例1:CYR61在类风湿关节炎滑膜组织中的表达格局"的材料与方法中所述。2、FLS培养及增殖剌激实验，同"实施例2:类风湿关节炎滑液中CYR61促进FLS的增殖"的材料与方法中所述。3、siRNA干扰实验3.1:siRNA序列与合成根据siRNA设计原理合成3条siRNA，序列如下表2三条siRNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3.2siRNA转染采用转染试剂脂质体(gen印orter)和含抗生素的无血清成分DMEM溶液，转染体系(以24孔板为例)为250ill。将5X1043_5代FLS种于24孔板中，于37°C，5%C02培养箱过夜培养；然后在12iUgen印orter与113iU的DMEM混匀物中加入2illsiRNA并轻轻混匀，室温静置25min。将上述混匀的转染液体加到培养的细胞悬液中(同时设无关SiRNA作为对照)，置37°C，5%C02培养箱中培养5_7小时后，加含等体积的20%FBS和含抗生素的DMEM营养液继续培养，24-48小时后，取培养的细胞做实时定量PCR和WesternBlot，检测干扰的效果。4.0CYR61抑制FLS凋亡机理研究将上述经干扰CYR61的细胞分为三组，即转染100nMNCsiRNA组；转染100nMS3siRNA组；正常细胞组。转染siRNA后24h收集细胞，检测细胞增殖，凋亡细胞比例已经凋亡相关基因Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bad、Bim的表达格局。二、结果1.CYR61基因的特异性小RNA筛选试验我们分别设计了3条针对人CYR61基因的双链小RNA(siRNA)，同时用与哺乳动物无关的siRNA作为阴性对照(siRNAofNegativecontrol,siNC)。用脂质体(gen印orter)将siRNA转染到细胞中，光学显微镜图(见图9A)和荧光显微镜和(见图9B)观察转染了荧光标记siRNA的细胞情况，显示转染率约为80-90%。用RealtimePCR检测干扰24小时后CYR61的表达水平，其中H-3是针对人CYR61的特异性siRNA，抑制率约为70-80%(见图9C)。2.siRNA干扰人CYR61基因表达的时相分析使用特异性siRNA干扰RAFLS中CYR61基因的表达，同时使用无关siRNA作为对照，使用RealtimePCR检测不同时间CYR61基因的表达变化情况对于RAFLS干扰试验，24小时的细胞中CYR61基因的表达是对照的20-30%，48小时时抑制率略有下降，在40%左右(p<0.05，图10)。3.特异性siRNA干扰滑膜细胞CYR61表达后，滑膜细胞增殖减低，凋亡增加前面的试验发现SF可以剌激FLS的增殖，并且呈剂量依赖性；而用CYR61中和抗体可以明显阻断SF剌激FLS增殖的作用，说明CYR61与滑膜细胞的增殖密切相关。为了进一步验证两者间的关系，我们采用siRNA的方法，特异性干扰RAFLS中CYR61基因的表达，同时使用无关siRNA作为对照，使用^参入的方法检测RAFLS的增殖能力发现抑制CYR61基因后RAFLS的增殖能力下降(p〈0.0001，图llA)。为了深入研究CYR61与RAFLS增殖的关系，我们采用FACS的方法检测了RAFLSsiRNA干扰后凋亡细胞的比率(Annexin-V+PI):发现siRNA干扰后RAFLS凋亡细胞的比率增加(p<0.0001，图11B)。4.特异性siRNA干扰滑膜细胞CYR61表达后，细胞凋亡增加的机理前面的试验发现siRNA干扰后RAFLS凋亡增加，说明CYR61与滑膜细胞的凋亡密切相关。为了深入研究CYR61与凋亡相关基因表达的关系，我们采用siRNA干扰的方法，在体外干扰FLSCYR61基因的表达，抑制率大于60%，用实时定量PCR检测凋亡线粒体途径相关基因bcl-2，bcl-xl，bax，bim，bad;发现抑凋亡相关基因Bcl_2mRNA水平下调(p<0.001，图12A)，促凋亡相关基因Bim略增加，而促凋亡基因Bad、Bax和抑凋亡基因Bcl-xl没有明显变化。提示CYR61促进滑膜细胞增殖可能与抑凋亡相关基因Bcl-2表达下调有关。为了验证mRNA水平的结果，我们采用FACS的方法检测Bcl_2的蛋白水平，发现抑制CYR61表达的同时FLS中Bcl-2蛋白表达水平也明显下降(p<0.01，图12B)。从而证实CYR61是通过抑制线粒体途径的Bcl-2家族(主要通过下调Bcl-2蛋白)来发挥抑制FLS细胞凋亡作用的。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
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的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。0107]序列表0108]〈110〉上海市免疫学研究所0109]〈120>CYR61蛋白在制药中的应用0110]〈130>LBJ.HF.90010111]〈160>100112]〈170>PatentInversion3.30113]〈210>SEQIDNo10114]〈211>200115]〈212>DNA0116]〈213〉GAPDH基因前引物0117]〈400>10118]acccactcctccacctttga0119]〈210>SEQIDNo20120]〈211>220121]〈212>DNA0122]〈213〉GAPDH基因后引物0123]〈400>20124]ctgttgctgtagccaaattcgt0125]〈210>SEQIDNo30126]〈211>220127]〈212>DNA0128]〈213>CYR61基因前引物0129]〈400>30130]tccagcccaactgtaaacatca0131]〈210〉SEQIDNo40132]〈211>200133]〈212>DNA0134]〈213>CYR61基因后引物0135]〈400>40136]gg3C3C3g3gg朋tgcagcc0137]〈210>SEQIDNo50138]〈211>210139]〈212>siRNA0140]〈213>S1正义链〈400>21ccagemaugu3皿g皿c朋tt〈210〉SEQIDNo6〈211>21〈212〉siRNA〈213>S1反义链<400>6皿gaac朋imcau皿cuggcc〈210>SEQIDNo7〈211>21〈212〉siRNA〈213>S2正义链<400>7uc朋ggimuc朋ug皿im3tt〈210>SEQIDNo8〈211>1263〈212〉siRNA〈213>S2反义链〈400>8皿gcucgc朋ca朋ucugctc〈210>SEQIDNo9〈211>21〈212>siRNA〈213>S3正义链〈400>9C33Cg3gg3CUgC3gC3朋tt〈210>SEQIDNo10〈211>21〈212〉si薩<213>S3反义链〈400>10U皿gCUgC3gUCCUCg皿g3g权利要求一种CYR61蛋白在制备治疗风湿性疾病药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的风湿性疾病是类风湿性关节炎。全文摘要本发明涉及CYR61蛋白的用途，尤其涉及CYR61蛋白在制药领域中的应用。本发明采取的技术方案是一种CYR61蛋白在制备治疗风湿性疾病药物中的应用，所述的风湿性疾病是类风湿性关节炎。本发明优点在于本发明发掘了CYR61蛋白的医疗用途，开拓了一个新的应用领域，本发明结果表明CYR61具有促进成纤维样滑膜细胞(FLS)增殖及参与关节软骨和骨组织破坏的作用，其作用途径之一是通过抑制滑膜细胞凋亡而促进其增生，另一条途径是通过上调金属蛋白酶而参与关节软骨和骨组织破坏。这一结果为寻找生物治疗和其他小分子药物治疗靶点提供实验依据，具有临床应用价值。文档编号A61P29/00GK101708328SQ200910198380公开日2010年5月19日申请日期2009年11月6日优先权日2009年11月6日发明者李宁丽,欧阳桂林,沈佰华,王利,肖涟波申请人:上海市免疫学研究所