专利名称：可诱导细胞介导免疫的疟疾疫苗组合物和组分的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及疟疾疫苗。具体的，本发明提供基于多抗原决定簇结构的疟疾疫 苗，该疟疾疫苗可诱导细胞介导的免疫，对抗多种恶性疟原虫寄生种的可被大部分HLA等 位基因所识别的环子孢子蛋白。
背景技术：
疟疾是一种媒介传染病，广泛分布于热带和亚热带地区，包括美洲、亚洲和非洲的 部分地区。每年，它引起的疾病约为6亿5千万人，并杀死其中的1到3百万，大部分是撒 哈拉以南的非洲的青少年。该疾病是由疟原虫(/^a^oi/i )属的原生寄生虫所引起的。该疾病的大部分严重 形式是由恶性疱原虫O0Za1SWotZiiffl 和疱原虫 rii^r (.Plasmodium ν ναχ)^\ feW iiL^^litB^Wft {Plasmodium ο vale ^Plasmodium malariae, ^kJkM 納 Plasmodium knowlesi)同样可以感染人类。疟疾寄生虫是通过雌疟蚊U/^OMWM fflo^w^/iioM)的叮咬，将寄生虫以孢子的形 式转移到人类宿主而传播的。孢子通过血液转移到肝，孢子在肝细胞繁殖，并发育到生命周 期的下一形态，裂殖子(merozoites)。当感染的肝细胞破裂后，裂殖子最终释放到血流中。 裂殖子然后感染红血球，部分在红血球内转变为雌雄配子体。当另一个蚊子叮咬被感染的 宿主，它吸入雌雄配子体，雌雄配子体在雌蚊体内融合成为孢子。然后当蚊子下次吸食时， 孢子被转移到另一宿主，如此循环。疟疾感染引起的主要症状为贫血(头昏、呼吸短促、心动过速等)，以及其它的一般 症状，比如发烧、冷颤、恶心；类流感症状，严重情况下，昏迷和死亡。通过防止蚊虫叮咬可以 减少疟疾的传播，这虽然相当有效，但是具有需要分配和恰当的持续性使用的不利因素。其 它措施包括通过在室内喷洒杀虫剂和排干蚊子排卵外的死水来控制蚊虫。不幸的是，杀虫 剂的使用存在环境风险，在一些区域，排干所有的死水实际上是不可能的。在自然感染疟原虫后，人类宿主会生产抗疟原虫的抗体。然而，单一通过抗体产生 (体液免疫性)中和寄生虫的能力既不会作为惯性的、抵御性的免疫持续，也不是具有足够 记忆特征诱导的细胞性免疫。因此，感染可能会发生多次，使疾病的治疗和预防复杂化。已有多次努力以生产有效的抗疟疾疫苗。Hui等人的美国专利6660498，公开了使 用杆状病毒系统生产重组用于疫苗的主要裂殖性孢子表面蛋白1 ；Knapp等人的美国专利 5393523，公开了制备和使用在重组疫苗的A falciparum的富组氨酸蛋白；Patarroyo的 美国专利4957738和4735799公开了可诱导对抗晚期A falciparum malaria的抗体的合 成肽混合物；Asakura的美国专利4643896公开了一种新型的疟疾相关抗原，CRA，该抗原被 描述为与疟疾疫苗一样有用。不幸的是，尽管有先前的努力，现在依然没有可以有效对抗疟疾的疫苗。特别的， 没有开发出可以诱导细胞介导的免疫，对抗所有或大部分疟疾寄生虫菌株的疫苗。代为替 换，预防性药物比如奎宁或青蒿素衍生物必须持续的使用以减少感染的风险。这些预防性CN 101969991 A
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药物治疗对生活在地方病地区的大多数人来说，一般也过于昂贵。此外，该寄生虫的耐药菌 株也普遍增长。编码或由环子孢子蛋白(在此简写为CSP)的蛋白片段构建的疫苗，在人和动物模 型中都显示有免疫原性以有一些有限的保护力。第一个成功的，虽然无法实用的抗疟疾疫 苗由带有孢子的辐照过的蚊子组成。值得注意的，疫苗亚单位分散在助剂以诱导细胞免疫 反应可以在人类提供比单独使用CSP或助剂更大的保护。含有可被人类的多种HLA型所识 别的抗原决定簇的羧基和氨基端的可变区已被确认。迄今为止，基于CSP疫苗的主要缺点 是结合到任意具体CSP序列的抗原决定簇的HLA型的宽度，以及细胞和体液免疫反应的持 续时间。现有技术在提供一种安全的、有效的疟疾疫苗方面远未成功，特别是一种可以有 效诱导持续细胞介导的对抗大部分寄生虫菌株的免疫反应。
发明内容
本发明基于多抗原决定簇疫苗的设计和开发，该疫苗可以表达源自多种恶性疟原 虫菌株的CSP的T细胞抗原决定簇，该抗原决定簇可以被绝大多数人类具有的I型HLA超 型(supertype)所识别。该疫苗能诱导重要的体液性免疫，以及对抗源自存在于易感人群 中的几乎所有恶性疟原虫菌株的CSP的细胞性免疫。本发明提供新型的具有多个抗原决定簇的多肽，以及编码这些多肽的遗传序列， 用于对抗疟疾的疫苗。该多肽中的多个抗原决定簇源自恶性疟原虫的环子孢子蛋白(CSP)， CSP已知在疟疾在肝中阶段具有特别的重要性。在常见的疫苗设计中，抗原决定簇选自蛋白 的保守区域，与常见的疫苗设计相反，运用在本发明的抗原决定簇选自CSP的高度变化的， 已知包含CD4和CD8T细胞抗原决定簇区域，以及已知CD4和CD8T细胞抗原决定簇的高度 保守区域。进一步的，选择的该抗原决定簇在人类中可以诱导T细胞与许多人类白细胞抗 原(HLA)组产生免疫反应，并可表征全世界大部分普通疟疾寄生虫菌株。特别的，在一个实 施例，设计的多抗原决定簇多肽在抗原决定簇之间具有间隔肽，以影响多肽从实际羧基末 端(C末端)剪切的水解。因此，通过蛋白质水解从本多肽释放的肽的氨基酸序列，一般是选 定的抗原决定簇的氨基酸序列的准确匹配者，也就是说，源自间隔序列的包括氨基酸的肽 的产生是最低限度的，或根本就未发生。当抗原决定簇沿着多肽链纵向排列时，没有添加间 隔肽，“原始的”序列使原决定簇位于抗下游，确保真实的羧基末端切割位点。
图 1，源自 A falciparum Asembo Bay 菌株的 CSP 的蛋白序列(SEQ ID NO: 14)。图2，具有示范性的末端重复多抗原决定簇的氨基酸序列(SEQ ID N0:13)的示意 图。图3，存在于CSP蛋白的可变区的T细胞抗原决定簇。图4，使用公知的可以识别12个超型中的任何一个的9、10和ll-mer肽对CSP多 肽的扫描绘图(Mapping along)。图5，簇1-4 “热点”的图示。图6，包括簇1和簇4 二者序列的示范性多抗原决定簇的氨基酸序列(SEQ IDN0:39)。图7，示范性的第一重复多抗原决定簇的氨基酸序列(SEQ ID N0:40)。图8，编码图7所示的示范性第一重复多抗原决定簇的核酸序列(SEQ ID N0:41)。
具体实施例方式本发明基于含有多种疟疾CSP源的抗原决定簇的新型多肽的开发，以及编码多肽 的遗传序列，用于抗疟疾疫苗。选择源自CSP的抗原决定簇是因为这种蛋白已知在疟疾的 肝阶段具有特别的重要性。源自A falciparum Asembo Bay菌株的CSP的蛋白序列如图 1所示(SEQ ID N0:14)。之前的抗疟疾疫苗显示有部分效力，这些疫苗引起的免疫反应主 要是体液性的，在持续期和菌株专一性的原因，都被显著减弱。相反，本疫苗用以诱导细胞 性免疫。选择用于本发明的抗原决定簇的方法包括生物信息学和数据分析两者。传统的疫 苗设计一般仅针对蛋白序列的保守区域，以求提高疫苗的适用性，以对抗有机体的许多种 菌株。与这一常规操作相反，就本发明而言，CSP的高度可变区与选定的保守序列一起被包 括在内，这是一种非常规的和出人意料的方法。包括在多肽的抗原决定簇是已知的，或预期可以诱导CD-8细胞免疫反应。本领域 的普通技术人员将认识到，为成功对抗并清除细胞内的寄生虫，CD-8反应是必需的；体液 性抗体反应显然是不足的。更为重要的，选定的抗原决定簇可在人类白细胞抗原(HLA)组 共同诱导CD-8免疫反应以提供覆盖大部分( 98%)的人口。因此，本疫苗在大部分可能暴 露于疟原虫的人类中是有效的。此外，选定的抗原决定簇可表征大部分的普通疟疾寄生虫 菌株，提供一种广谱的防护，对抗这种传染媒的大部分普通种类。重要的，本发明的多抗原决定簇多肽的抗原决定簇之间一般设有“间隔”或“连接” 肽，影响多肽因为真实的羧基末端(C末端)剪切造成的蛋白水解。“间隔”或“连接”肽，指 抗原决定簇下游的最短缩氨酸序列，至少约3个氨基酸，这些肽含有肽剪切(蛋白水解)位 点，并使肽可被剪切的连接在一起。换言之，间隔肽不介入选定的抗原决定簇的C末端蛋白 水解过程，因此，通过蛋白水解从多肽释放的肽的羧基端与CSP在宿主细胞处理(蛋白水解) 时从蛋白释放的肽相一致。优选的，没有(或极少数)通过在间隔肽之内剪切而产生的新的， 不定的羧基端。因为抗原决定簇肽的羧基终点是真实的(即与CSP在宿主细胞的活体内剪 切产生的一样)，源自多抗原决定簇多肽的肽被认为是可与HLA蛋白相结合并诱导CD-8细 胞性免疫反应。选定的用于本发明的抗原决定簇列于表1。表1，用于多抗原决定簇的抗原决定簇抗KI决定SfSEQ I.D noCSP :.<MIvKPKDEI .OYEM)!1B44KPK DHLN VEND!2ii.变B44KPIC DHLD YAXm3ιΓ'|·2!■；■!KSIvNFI.OYEM)!4B44K5iKDHIJ)YEXi:)l5ii, ; <R44KPKNi￡LDVEMDl6i￥r>f <KPKDEIJiYEMDI711；4；<B44XDIEK KIC KM8S CC 购A26ILSVSSFIJ*9m-m 7A24.B58.B6Λ!,FQEYQCY10保守ft 18U. \ ν \·.- Π ·LlM VLSFLF11保守ft 402\24.B58JM'lIM VLX FI ,FL12保守呔-103Λ2.Λ24Ε62
由表可见，最初的八个抗原决定簇源自CSP的可变区。进一步，抗原决定簇中的7个已 知或预知可以结合MHC超型B44，第八个可以结合超型A26。这些抗原决定簇和连接序列的 选择的详细说明提供在例1和4中。简言之，与R falciparum Asembo Bay菌株的288-412 序列相当的可变区被分析，以确定已知T细胞抗原决定簇的存在与否。发现一个22个氨基 酸的序列含有高浓度的这种抗原决定簇，并使用这一序列从含有源自其他A falciparum 菌株CSP蛋白的序列的数据库中检索高度同源序列。比较检索到的序列，可以从所有主要 P. falciparum菌株中选择相关的(即高度一致性)但不是相同的代表可变区的T细胞抗原 决定簇肽序列。在本发明的操作中，在此描述的抗原决定簇可以以多种不同的组合方式应用。 例如，在本发明的一些实施例，源自疟原虫CSP的可变区(一般而非必需，P. falciparum CSP)的抗原决定簇被单独作为抗原性序列用于疫苗中。“CSP的可变区”的例子，是与A falciparum Asembo Bay菌株的288到412残余(下划标记在图1中)相一致的CSP蛋白的 原始序列的部分，尽管源自其它疟原虫种的同源区域也可使用。在这种疫苗构建中，至少 包括一个来自可变区的抗原决定簇，在一些情况下超过一个来自可变区的抗原决定簇。这 样一个抗原决定簇的长度一般为大约5到15氨基酸，将代表毗连氨基酸的序列，将是一种 T细胞抗原决定簇。如果包含有来自可变区的多抗原决定簇，它们可作为相邻的，Btt连的序 列，或如本文所描述的，通过间隔或连接序列分隔，或混合组合，即部分序列是相邻的而其 他通过连接序列分隔的形式存在于多抗原决定簇的结构中。这种类型的示范性抗原决定簇 包括如SEQ ID NO: 1-8所列的序列的。一般的，这种抗原决定簇的长度至少约为5到约25 个氨基酸，优选的为5到少于约20个，或更少个数的氨基酸(即6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18或19个氨基酸)。在其它实施例，一种或多种来自CSP的保守区域的(在此称为“保守抗原决定簇”) T细胞抗原决定簇包括在疫苗的结构中。特别的，如由表1中SEQ ID N0:9-12所示的保守 T细胞抗原决定簇也可能被使用，这些抗原决定簇提供结合到超型A1、A2、A3、A24、A26、B58 和B62的能力。这种保守抗原决定簇的选择在下述的例2中有详细的描述。简言之，使用 生物信息学计划，明确的，与多个(例如至少3个)超型结合的T细胞抗原决定簇，高度保守 的(例如100%保守)覆盖多个来自不同A falciparum菌株(例如，覆盖至少60种不同的CN 101969991 A
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菌株)的CSP序列被选择。因此，在本发明的一些实施例，至少一个来自可变区的抗原决定 簇，与至少一个保守的CSP T细胞抗原决定簇一起，包括在疫苗的结构中。在一个实施例， 表1中的每一个抗原决定簇的一个包括在单一的多抗原决定簇中。当以这种方式共同包括 时，本发明的抗原决定簇对98%的人类来说是有反应活性的。这种类型的示范性多抗原决 定簇如图2 (SEQ ID NO: 13)所示。此外，进一步的抗原性序列如在例3中详细地描述被识别。简言之，生物信息学工 具被用于识别在具有高浓度的9、10和1 Imer的，针对所有12种超型的T细胞抗原决定簇序 列簇。具有抗原决定簇的最大数字的簇，簇1和4，分别包括i)Asemb0 Bay菌株的1_29氨 基酸(SEQ ID N0:37);W&ii)Asembo Bay 菌株的 385-411 氨基酸(SEQ ID N0:38)。这些序 列两者中的任意一个或两者也可以包括在本发明的多抗原决定簇结构中。在一个实施例， 簇1和4两者都存在于一个多抗原决定簇中，且是以单一的毗连序列(例如SEQ ID NO: 39， 见例3)存在。在这种情况下，加上在此描述的另一个抗原决定簇，这种序列的单独拷贝可 用于构建，或，作为替换，多个拷贝也可被使用，如从约2到约10个或更多拷贝(例如，2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多拷贝)。此外，序列SEQ ID NO:37-39中的一个或多个拷贝 可被用于同样含有表1中抗原决定簇的一个或多个抗原决定簇，即如上和例1所述的，来自 CSP的可变区的抗原决定簇，和/或如上和例2所述的，来自CSP的一个或多个保守抗原决 定簇的结构中。在本发明的一个实施例，表1中的12抗原决定簇中的每一个的至少一个拷贝存在 于多抗原决定簇中。一个包括12抗原决定簇中的每一个的至少一个拷贝的示范性多抗原 决定簇如图2 (SEQ ID NO: 13)所示，其中单独的抗原决定簇用方框和下线性标记。本领域 的技术人员将认识到，在构建这种类型时，其他结构的抗原决定簇存在于该多抗原决定簇 也是可能的。例如，抗原决定簇可以以不同的秩序排列，或可能存在一个或更多抗原决定簇 的多个拷贝(例如，可能存在从1到约10个或更多拷贝)，和/或可包括额外的免疫原性序 列，如簇 1 (SEQ ID N0:37)和簇 4 (SEQ ID NO: 38)，或其组合(SEQ ID N0:39)。一般的， 在多抗原决定簇中的所有抗原决定簇将作为单一的多肽链从一个单一的启动子开始表达， 如果需要，(任选的)通过间隔或连接序列分隔。但是，在一些实施例，一个抗原决定簇或一 组抗原决定簇可能从分开的启动子表达，即作为单独的肽或多肽。在一些实施例，多抗原决 定簇(例如，包括所有抗原决定簇和抗原决定簇之间的间隔序列)可能包含在一个更大的多 肽内，即多抗原决定簇的两侧存在不是抗原决定簇或间隔序列的氨基酸序列。这种旁侧序 列可能是任意类型，并可能具有特殊功能，如，引导多肽转运到预定位置的序列(例如信号 肽)；易化结合到目标分子的序列；提高特定构象的获得的序列；对定位、识别或分离多肽有 用的序列，等。在一些实施例，在本发明的多抗原决定簇中的每一个抗原决定簇要么是直接相邻 的，要么是通过间隔或连接肽将相邻的抗原决定簇分隔。间隔肽的功能是提高精确的多抗 原决定簇的羧基末端剪切(蛋白水解)，以释放真实的抗原决定簇(即与通过体内CSP蛋白的 蛋白水解产生的肽的序列相同的肽序列)。除了在此图示的示范性多抗原决定簇中的间隔 序列，本领域的普通技术人员将认识到还存在其他可用于本发明的间隔肽。本领域的技术 人员同样熟悉数据库和分析计划，以实现蛋白水解中心的预测和/或含有优选切割位点的 多肽的设计。只要使多肽被剪切后可释放足够数量的精确处理的抗原决定簇，以诱导对抗CN 101969991 A
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抗原决定簇的保护性免疫反应，可以使用任何的间隔或连接序列。在一个实施例，本发明提供一种含有至少一个来自恶性疟原虫Asembo Bay菌株 的环子孢子蛋白(CSP)的可变区的抗原决定簇的重组抗原性多肽，CSP的氨基酸序列如图 1所示，并公开在SEQ ID N0:14中。根据其原始氨基酸序列，这一 CSP蛋白的分子量约为 44361。根据本发明，含有至少一个来自CSP的可变区抗原决定簇的重组抗原性多肽，具有 的分子量约为CSP的30%或更少，例如，约13500kDa或更少，如从约IOOOkDa到12000kDa。就本发明的抗原决定簇而言，例如，如图2所示的示范性多抗原决定簇，本领域的 技术人员将认识到可以对该序列进行一定的变化，但仍会接种的宿主体内引起适当的抗原 决定簇的提供。例如，可使用其它的间隔肽，以代替保守氨基酸等，只要可以诱导适当的免 疫反应就可以了。本发明包括的如在本文所描述的抗原决定簇及其编码核酸序列(如DNA、RNA等)， 一般优选连接有表达控制序列。这种核酸序列可能是，例如，存在于运载工具或载体，比如 减毒分支杆菌属或其它的菌株、各种病毒载体(如减毒腺病毒载体)、质粒，或其它本领域技 术人员所能想到的适当载体的DNA序列。只要应用到接种的宿主的载体会引起在宿主体内 产生本发明的多抗原决定簇，并在一定条件下允许多抗原决定簇的正确蛋白酶切处理，在 本发明的一些实施例，多抗原决定簇是直接(即作为多肽)应用在适当的组合物中。本发明提供用于诱导免疫反应和/或接种使个体抗疟疾的组合物。该组合物包括 一种或多种如本文所描述的纯化抗原决定簇，或编码这种抗原决定簇的核酸序列，以及适 当的药用载体。用作疫苗的这种组合物的制备是本领域普通技术人员所熟知的。一般的， 这种组合物要么被制成液体溶液，要么为悬浮液，但是，固态，如药片、药丸、粉末等也是可 预料到的。适用于在使用之前溶解，悬浮在液体的固体制剂也是可行的。制剂还可以乳化 的。活性成分可以与可接受的，并不与活性成分反应的药用赋形剂混合。适当的赋形剂是， 例如，水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，或其组合。此外，组合物可含有少量的助剂，如润湿或 乳化剂，PH缓冲剂等。此外，组合物可包含其它的助剂。如果要求组合物以口头方式使用， 可添加各种增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂等。本发明的组合物可以含 有任何额外的成分，以便提供方便使用的剂型的组合物。制剂中多抗原决定簇或编码核酸 的最终数量是可变的。但是，一般来说，制剂中的量将在1-99%之间。本发明还提供诱导抗疟疾的免疫反应的方法，以及接种哺乳动物抗疟疾的方法。 该方法主要包括确定适当的疫苗受体，将含有如本文所述的，存在于可接受的药用载体中 的抗原决定簇或编码核酸的组合物施加要受体。本发明的疫苗制备可以通过任意一种为本 领域技术人员所熟知的方法使用，包括但不限于注射、经口、经鼻、通过摄取含有抗原的食 品等。在特定实施例，使用的方法是皮下或肌内注射。“诱导免疫反应”意味着本发明的疫苗制剂的使用引起特异性抗体的合成(以1到 lxlO6，优选的lxlO3，更佳的在IxlO3到IxlO6之间，最佳大于IxlO6滴定度)和/或细胞增 殖，测量时，可例如通过细胞试验确定IFN- γ的产量或通过3H胸腺嘧啶脱氧核苷结合等进 行。在优选实施例，免疫反应是保护性免疫反应，即免疫反应保护接种个体免于未来疟原虫 的感染，但是，这并不是所有情况下都必需的，因为提供部分保护的免疫反应仍是极为有益 的。该方法包括使用在可接受的/兼容的药用载体中的含有本发明结构的组合物。用于包含在本发明的多抗原决定簇的适当抗原决定簇的选择和分析，可以使用各种易为本领域技术人员获得的数据库和生物信息学分析工具进行。这种例子(例如，用于细 胞毒素T淋巴抗原决定簇预测和分析)包括但不限于NetCTL、NetMHC, Epijen、MAPPP, MHC 通路、WAAP,免疫抗原决定簇数据库和分析源(IEDB)等。以下是用于进一步说明本发明的非限制性例子。
实施例例子1，可变抗原决定簇的选择CSP可变区的分析
对来自恶性疟原虫3D7的CSP蛋白的可变区288到412 (图3中的SEQ ID NO: 15)的 进行分析，根据IEDB数据库，以确定序列之间的异同，是否为T细胞抗原决定簇。识别的T 细胞抗原决定簇如图3中的SEQ ID N0:16-21所示。分析结果显示，在这一可变区识别的 22个氨基酸序列(SEQ ID NO: 15的368-389残余，在图3中的CSP序列中框内，编号为SEQ ID N0:38)包含T细胞抗原决定簇的重要的部分，可被用于查询NCBI数据库以识别含有显 示与该22氨基酸肽(KPKDELDYANDIEKKICKMEKC，SEQ ID NO:38)高度相关氨基酸序列的蛋 白。这些具有高度同一性的序列进一步通过IEDB分析。结果列于表2。从表中可见，在10 个来自多种P. falciparum的序列识别出相似的抗原决定簇，抗原决定簇之间显示有高度 的同一性，预测或已知为T细胞抗原决定簇。表2，所有22氨基酸序列的保守性分析
权利要求
一种重组抗原性多肽，含有两个或更多个选自由KPKDELDYENDI (SEQ ID NO:1)，KPKDELNYENDI (SEQ ID NO:2)，KPKDELDYANDI (SEQ ID NO:3)，KSKNELDYENDI (SEQ ID NO:4)，KSKDELDYENDI (SEQ ID NO:5)，KPKNELDYEMDI (SEQ ID NO:6)，KPKDELEYEMDI (SEQ ID NO:7)，NDIEKKICKM (SEQ ID NO:8)，ILSVSSFLF (SEQ ID NO:9)，ALFQEYQCY (SEQ ID NO:10)，LIMVLSFLF (SEQ ID NO:11)，和IMVLSFLFL (SEQ ID NO:12) 构成的组中的氨基酸序列，其中所述两个或更多的氨基酸序列肽是i)彼此直接相邻；或ii)通过间隔肽彼此分隔，间隔肽允许在所述重组抗原性多肽内发生真实的羧基末端蛋白水解剪切。
2.一种重组抗原性多肽，含有，i)3个或更多个选自由 KPKDELDYENDI (SEQ ID N0:1), KPKDELNYENDI (SEQ ID NO:2)， KPKDELDYANDI (SEQ ID NO:3)， KSKNELDYENDI (SEQ ID NO:4)， KSKDELDYENDI (SEQ ID NO:5)， KPKNELDYEMDI (SEQ ID NO:6)，和KPKDELEYEMDI (SEQ ID NO:7)构成的组中的氨基酸序列，ii)具有NDIEKKICKM(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的肽;iii)具有ILSVSSFLF(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的肽iv)具有ALFQEYQCY(SEQ ID NO: 10)的氨基酸序列的肽；以及ν) 一个或多个选自由 LIMVLSFLF (SEQ ID NO: 11)禾口 IMVLSFLFL (SEQ ID NO: 12)构 成的组中的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列的肽是i)彼此直接相邻；或ii)通过间隔肽彼此分隔，间隔肽允 许在所述重组抗原性多肽内发生真实的羧基末端蛋白水解剪切。
3.编码抗原性多肽的核酸序列，所述抗原性多肽含有两个或更多个选自由 KPKDELDYENDI (SEQ ID N0:1),KPKDELNYENDI (SEQ ID NO:2)， KPKDELDYANDI (SEQ ID NO:3)， KSKNELDYENDI (SEQ ID NO:4)， KSKDELDYENDI (SEQ ID NO:5)， KPKNELDYEMDI (SEQ ID NO:6)， KPKDELEYEMDI (SEQ ID NO:7)，NDIEKKICKM (SEQ ID NO:8)， ILSVSSFLF (SEQ ID NO:9)， ALFQEYQCY (SEQ ID NO:10)， LIMVLSFLF (SEQ ID NO:11)，禾口IMVLSFLFL (SEQ ID NO: 12)构成的组中的氨基酸序列， 其中所述两个或更多的氨基酸序列的肽是i)彼此直接相邻的；或ii)通过间隔肽彼此 分隔，间隔肽允许在所述重组抗原性多肽内发生真实的羧基末端蛋白水解剪切。
4.编码抗原性多肽的核酸序列，该抗原性多肽含有 i) 3个或更多个选自由KPKDELDYENDI(SEQIDNO::1)，KPKDELNYENDI(SEQIDNO::2)，KPKDELDYANDI(SEQIDNO::3)，KSKNELDYENDI(SEQIDNO::4)，KSKDELDYENDI(SEQIDNO::5)，KPKNELDYEMDI(SEQIDNO::6)，和KPKDELEYEMDI(SEQIDNO:7)构成的组中的氨基酸序列ii)具有NDIEKKICKM(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的肽;iii)具有ILSVSSFLF(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的肽；iv)具有ALFQEYQCY(SEQ ID NO: 10)的氨基酸序列的肽；以及ν) 一个或多个选自由 LIMVLSFLF (SEQ ID NO: 11)禾口 IMVLSFLFL (SEQ ID NO: 12)构成 的组中的氨基酸序列；其中所述氨基酸序列的肽是i)彼此直接相邻；或ii)通过间隔肽彼此分隔，间隔肽允 许在所述重组抗原性多肽内发生真实的羧基末端蛋白水解剪切。
5. 一种免疫个体对抗疟疾的方法，包括对所述个体施用重组抗原性多肽，该抗原性多 肽含有两个或更多个选自由KPKDELDYENDI(SEQIDNO::1)KPKDELNYENDI(SEQIDNO::2)KPKDELDYANDI(SEQIDNO::3)KSKNELDYENDI(SEQIDNO::4)KSKDELDYENDI(SEQIDNO::5)KPKNELDYEMDI(SEQIDNO::6)KPKDELEYEMDI(SEQIDNO::7)NDIEKKICKM (SEQ ID NO:8)， ILSVSSFLF (SEQ ID NO:9)， ALFQEYQCY (SEQ ID NO:10)， LIMVLSFLF (SEQ ID NO:11)，禾口IMVLSFLFL (SEQ ID NO: 12)构成的组中的氨基酸序列， 其中所述两个或更多的氨基酸序列的肽是i)彼此直接相邻；或ii)通过间隔肽彼此分 隔，间隔肽允许在所述重组抗原性多肽内发生真实的羧基末端蛋白水解剪切，或编码所述重组抗原性多肽的核酸序列，其中，所述重组抗原性多肽或编码所述重组抗原性多肽的核 酸序列以足以免疫所述个体的量施用。
6.一种免疫个体对抗疟疾的方法，包括对所述个体施用重组抗原性多肽，该抗原性多 肽含有i)3个或更多个选自由 KPKDELDYENDI (SEQ ID N0:1), KPKDELNYENDI (SEQ ID NO:2)， KPKDELDYANDI (SEQ ID NO:3)， KSKNELDYENDI (SEQ ID NO:4)， KSKDELDYENDI (SEQ ID NO:5)， KPKNELDYEMDI (SEQ ID NO:6)，和KPKDELEYEMDI (SEQ ID NO:7)构成的组中的氨基酸序列；ii)具有NDIEKKICKM(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的肽;iii)具有ILSVSSFLF(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的肽；iv)具有ALFQEYQCY(SEQ ID NO: 10)的氨基酸序列的肽；以及ν)—个或多个选自由 LIMVLSFLF (SEQ ID NO: 11)和 IMVLSFLFL(SEQ ID NO: 12)构成 的组中的氨基酸序列；其中所述氨基酸序列的肽是i)彼此直接相邻；或ii)通过间隔肽彼此分隔，间隔肽允 许在所述重组抗原性多肽内发生真实的羧基末端蛋白水解剪切，或编码所述重组抗原性多 肽的核酸序列，其中，所述重组抗原性多肽或编码所述重组抗原性多肽的核酸序列以足以 免疫所述个体的量施用。
7.一种重组抗原性多肽，含有氨基酸序列MMRKLAILSVSSFLFVEALFQEYQCYGSSKMEKCSSV FNVVNSSIGLIMVLSFLFLN (SEQ ID NO:38)的一个或多个拷贝。
8.根据权利要求7所述的重组抗原性多肽，其中氨基酸序列存在多个拷贝，多个拷贝 是i)彼此直接相邻的；或ii)通过间隔肽彼此分隔，间隔肽允许在所述重组抗原性多肽内 发生真实的羧基末端蛋白水解剪切。
9.编码抗原性多肽的核酸序列，所述抗原性多肽含有氨基酸序列MMRKLAILSVSSFLFVE ALFQEYQCYGSSKMEKCSSVFNVVNSSIGLIMVLSFLFLN (SEQ ID NO:38)的一个或多个拷贝。
10.根据权利要求9所述的核酸序列，其中氨基酸序列存在多个拷贝，多个拷贝是i)彼 此直接相邻的；或ii)通过间隔肽彼此分隔，间隔肽允许在所述重组抗原性多肽内发生真 实的羧基末端蛋白水解剪切。
11.一种免疫个体对抗疟疾的方法，包括对所述个体施用含有氨基酸序列MMRKLAILSV SSFLFVEALFQEYQCYGSSKMEKCSSVFNVVNSSIGLIMVLSFLFLN (SEQ ID NO: 38)—个或多个拷贝的 重组抗原性多肽。
12.根据权利要求1所述的重组抗原性多肽，进一步含有氨基酸序列MMRKLAILSVSSFLF VEALFQEYQCYGSSKMEKCSSVFNVVNSSIGLIMVLSFLFLN (SEQ ID NO:38)的一个或多个拷贝。
13.根据权利要求2所述的重组抗原性多肽，进一步含有氨基酸序列MMRKLAILSVSSFLF VEALFQEYQCYGSSKMEKCSSVFNVVNSSIGLIMVLSFLFLN (SEQ ID NO:38)的一个或多个拷贝。
14.根据权利要求3所述的核酸序列，其中所述核酸序列进一步编码氨基酸序列MMRKLAILSVSSFLFVEALFQEYQCYGSSKMEKCSSVFNVVNSSIGLIMVLSFLFLN (SEQ38)的一个或多个拷贝。
15.根据权利要求4所述的核酸序列，其中所述核酸序列进一步编码氨基酸序列MMRKL AILSVSSFLFVEALFQEYQCYGSSKMEKCSSVFNVVNSSIGLIMVLSFLFLN (SEQ38)的一个或多个拷贝。
16.根据权利要求5所述的方法，其中所述重组抗原性多肽进一步含有氨基酸序列MMR KLAILSVSSFLFVEALFQEYQCYGSSKMEKCSSVFNVVNSSIGLIMVLSFLFLN (SEQ ID NO:38)的一个或 多个拷贝。
17.根据权利要求6所述的方法，其中所述重组抗原性多肽进一步含有氨基酸序列MMR KLAILSVSSFLFVEALFQEYQCYGSSKMEKCSSVFNVVNSSIGLIMVLSFLFLN (SEQ ID NO:38)的一个或 多个拷贝。
18.一种重组抗原性多肽，含有至少一个来自恶性疟原虫Asembo Bay菌株的环子孢子 蛋白(CSP)可变区的抗原决定簇，其中所述重组抗原性多肽的分子量为13500kD或更小。
19.根据权利要求18所述的重组抗原性多肽，其中所述至少一个来自CSP可变区的抗 原决定簇是T细胞抗原决定簇。
20.根据权利要求18所述的重组抗原性多肽，其中所述至少一个来自CSP可变区的抗 原决定簇的氨基酸序列选自由KPKDELDYENDI(SEQIDNO1)，KPKDELNYENDI(SEQIDNO2)，KPKDELDYANDI(SEQIDNO3)，KSKNELDYENDI(SEQIDNO4)，KSKDELDYENDI(SEQIDNO5)，KPKNELDYEMDI(SEQIDNO6)，KPKDELEYEMDI(SEQIDNO7)；和NDIEKKICKM (SEQ ID NO:8)构成的组中。
21.根据权利要求18所述的重组抗原性多肽，其中所述重组抗原性多肽进一步含有一 个或多个保守的CSP抗原决定簇。
22.根据权利要求21所述的重组抗原性多肽，其中所述一个或多个保守的CSP抗原决 定簇选自由 SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 构成的组中。
23.根据权利要求18所述的重组抗原性多肽，其中所述重组抗原性多肽进一步含有一 个或多个选自由SEQ ID NO: 36,SEQ ID NO: 37和SEQ ID NO: 38构成的组中的抗原决定簇。
全文摘要
本发明提供基于多抗原决定簇结构的疟疾疫苗，该疫苗可诱导细胞介导的对抗许多种疟疾寄生虫并覆盖大多数HLA等位基因的免疫。多抗原决定簇结构中的抗原决定簇来自已知含有CD4和CD8T细胞抗原决定簇的恶性疟原虫环子孢子蛋白(CSP)的区域，并含有来自CSP的高度可变和高度保守的区域两者的抗原决定簇。
文档编号A61P33/06GK101969991SQ200980107256
公开日2011年2月9日 申请日期2009年1月12日 优先权日2008年1月18日
发明者A·兹维, A·谢弗曼, J·C·萨多夫, J·富尔克松 申请人:Aeras全球Tb疫苗基金会