治疗流行性感冒的组合物和方法

专利名称：治疗流行性感冒的组合物和方法
治疗流行性感冒的组合物和方法相关申请案本申请案主张于2008年6月19日申请的PCT专利申请案第PCT/US08/67471号 和于2009年5月四日申请的美国临时申请案第61/1拟614号的优先权和权利。所述优先 权申请案的内容以全文引用的方式并入本文中。
背景技术：
流行性感冒是一种常见的呼吸系统传染性疾病，其与正粘病毒科 (Orthomyxoviridae)家族病毒相关联。由于此病毒具有高度变异性，所以通常每年都需要 用考虑到病毒株变异并经重新调配的疫苗接种。美国(the United States)每年所研制的 疫苗组合物都由食品与药物管理局疫苗和相关生物制剂咨询委员会部门(the Department of Food and Drug Administration Vaccines and the Related Biologicals Advisory Committee)确定。世界卫生组织(World Health Organization, WHO)也类似地运用一 个全球实验室监测网络来检测新的流行性感冒变异体，例如参见拉旺希(Lavanchy)，疫苗 (Vaccine) 17 :S24 (1999)。进行选择的基础是近来分离的流行性感冒病毒的抗原分析、抗原 变异体的传播模式、和近来接种的个体的抗体反应。A和B型流行性感冒是引起流行性人类疾病的两种类型流行性感冒病毒。A型流 行性感冒病毒基于以下两种表面抗原进一步分成亚型血凝素(HA)和神经氨酸酶(N)。B 型流行性感冒病毒未分成亚型。从1977年以来，A型(HlNl)流行性感冒病毒、A型(H3N2) 流行性感冒病毒和B型流行性感冒病毒已在全球范围内进行传播。对于处于由流行性感冒 感染所引起的严重疾病和相关并发症的高风险中的个体来说，接种公认是预防或削弱流行 性感冒的单一最有效方式。接种由灭活流行性感冒病毒制备的抗原可刺激特异性抗体的产 生。但仅仅预防的是那些制成疫苗的病毒株或密切相关的病毒株。每年的疫苗都含有三种病毒株(通常为两种A型和一种B型)，这三种病毒株代表 着认为在即将到来的冬天可能传播的流行性感冒病毒。当前和出现的流行性感冒病毒株的 抗原特征为选择每年的疫苗内所包括的病毒株提供基础。WHO每年都检查世界流行病学情 况，且必要时会基于当前的流行病学证据，提出新的病毒株。尽管重新构成，但疫苗不可能包括世界上在特定季节期间主动感染个体的所有 不同病毒株。另外，调配和制备足量的疫苗剂量以应对流感感染的季节性增加也需要花 费相对较长的时间。通常制备一种疫苗要花费6个月以上。因此，新的或忽略的流行性 感冒病毒株可在这6个月时间内突显，引发一场流行病。2009年4月，首次检测到新的猪 源性A(HlNl)型流行性感冒病毒。相较于先前所述的Hmi亚型，其为四重基因重配病毒 (quadruple reassortant)。病毒开始是爆发于墨西哥(Mexico)，但此流行病穿过边界迅速 席卷美国和加拿大(Canada)，目前几乎所有国际上的国家都报道有新的病例。所属领域中 对治疗流行性感冒的改良组合物和方法仍然存在需要。明确地说，需要针对WHO所提出的 季节性流行性感冒病毒株和新出现的大流行性感冒病毒株(例如新的猪源性A(HlNl)型流 行性感冒病毒)具有广泛免疫原性的组合物。

发明内容
本申请案提供可用于治疗流行性感冒的组合物和方法。如本文所述，所述组合物 和方法是基于对流行性感冒显示免疫原性的肽和肽组合的研制。在一些实施例中，肽组合诱发针对多个流行性感冒病毒株，例如季节性流行性感 冒病毒株或甚至新的猪源性A(HlNl)型大流行性感冒病毒的保护性反应。在一些实施例中，组合物不经肠投予(例如通过肌肉内注射)。在一些实施例中， 不经肠组合物包括包含非离子型表面活性剂的微脂粒(vesicle)。在一些实施例中，不经 肠组合物包括TLR-4激动剂佐剂。在一些实施例中，不经肠组合物中所存在的至少一部分 TLR-4激动剂佐剂与微脂粒物理缔合。虽然目前流行性感冒疫苗局限于上述不经肠投药途径(例如肌肉内注射)，但我 们已经鉴别出经口投予时诱发保护性反应的组合物。因此，在一些实施例中，组合物经口投 予。在一些实施例中，口服组合物包括胆汁盐体(bilosome)。在一些实施例中，口服组合物 包括TLR-3激动剂佐剂。在一些实施例中，口服组合物中所存在的至少一部分TLR-3激动 剂佐剂与胆汁盐体物理缔合。


图IA-B展示如竞争微量中和分析所检测，示范性肽组合物的特异性。稀释人类血 清，并与所选肽组合物一起培育，随后与流行性感冒病毒一起培育。培育后，加入MDCK(马 丁-达比狗肾(Madin-Darby Canine Kidney))细胞，且培养板在18-22个小时后显影。 (A)使用人类血清，检测针对新喀里多尼亚流行性感冒(influenza New Caledonia) (A/ NC/20/99)的竞争微量中和。(B)使用人类血清，检测针对威斯康星流行性感冒(influenza Wisconsin) (A/ffis/67/05)的竞争微量中和。图2展示如IFN γ-ELISP0T分析所检测，由示范性肽组合物所引发的细胞介导的 免疫反应，表示为每百万个细胞的斑点形成细胞(SFC)。在所选肽存在下培养流行性感冒
接种个体的周围血液单核细胞(PBMC)。2天后，培养板显影，且放大并计数每孔中的斑点数目。图3展示相较于未接种的对照动物，接种肽组合物INF-61P的动物中用IX IO6个 空斑形成单位(Pfu)的H3N2(A/威斯康星/200 病毒激发后10天时间内的中值日发热计 数。发热计数定义为动物每分钟的体温为40°C或40°C以上；每3小时计算每组4只动物的 中值发热计数。对照和接种动物具有类似的起始体温(参见第0天)。图4展示相较于未接种的对照动物，接种肽组合物INF-61P的动物中用IX IO6个 Pfu的H3N2(A/威斯康星/200 病毒激发后10天时间内的重量损失。图5展示在经肽组合物INF-61P免疫的雪貂的直肠洗液(上图)和鼻洗液样品 (下图)中可见的针对流行性感冒病毒的粘膜IgA反应(流感灵(FLUVIRAL))。资料表示 为每只动物中相对于接种前反应的增加倍数，且相对于不同样品中所存在的IgA总量标准 化。还提供用市售流行性感冒疫苗(流感灵)获得的比较资料。图6展示在经肽组合物SFV2免疫的雪貂血清中可见的针对B型流行性感冒(俄 亥俄州(Ohio))的重组HA蛋白质的血清IgA反应。成对的左列和右列分别展示每只动物
13接种前和接种后血清样品中通过ELISA所测得的反应(报道为光学密度)。在动物4850号 和4860号中可以看到强阳性反应。图7展示以脂质化肽组合物INF-09L-A诱发的广泛反应性细胞(CTL)免疫。用组 合物接种成年(> 12个月)HLA(A*0201)转基因小鼠三次，此组合物靶向A型流行性感冒的 核蛋白中的可变区。组合物还包括明矾(alum)佐剂。对照组仅仅接收佐剂。用多个亚型 的不同流行性感冒病毒株来感染脾细胞H3N2(A/HK/1/18、A/维多利亚(Victoria)/3/75) 和Hmi (A/NC/20/99、A/PR/8/34)。斑点表示对各病毒株具有特异性的IFN γ分泌T细胞 的频率，且误差线表示每组小鼠中的标准偏差(n = 3)。结果从左至右如下呈现Η3Ν2(Α/ ΗΚ/1/18)、Η3Ν2 (A/ 维多利亚 /3/75)和 Hmi (A/NC/20/99)和 Hmi (A/PR/8/34)。图8展示在有或者没有TLR-3激动剂佐剂(poly I:C)下对经口投予的肽组合物 的免疫反应。小鼠(每组η = 4)经口免疫4次(第0、3、14和17天)。接种后收获脾细 胞，并在活体外用相同肽组合物刺激。使用IFN γ ELISP0T分析测量反应。如图8中所示， 接收佐剂的动物反应比接收单独疫苗的动物反应大得多。图 9 展示 SEQ ID NO 16、17 禾口 18 的序列。图10Α-Β展示针对A型流行性感冒以下亚型的重组血凝素(rHA)蛋白质的血清 IgG反应(通过ELISA来测量):(A/所罗门岛(Solomon Island)/03/06) Hmi或(A/威斯 康星/67/05) H3N2，在经肌肉内投予的肽组合物SFV2免疫的雪貂中测量。免疫后血清显示， 对于经肌肉内投予的肽组合物SFV2免疫的雪貂，ELISA中对rHA所罗门㈧与威斯康星⑶ 的免疫反应均为显著的。未检测到针对B型流行性感冒(B/马来西亚(Malaysia)/2506/04) 的rHA的IgG反应(资料未示)。还提供用市售流行性感冒疫苗(凡尔灵(VAXIGRIP))获 得的比较资料。图11展示经肌肉内投予的肽组合物SFV2免疫，接着经受病毒激发的雪貂鼻洗液 的病毒载量。用免疫原性肽组合物SFV2接种动物，且用2 X IO5个pfu Hmi (A/所罗门岛 /03/06)激发，并在病毒血症最高峰(第2天)时通过空斑分析来测量鼻洗液样品的病毒载 量。各符号表示个别动物中所测得的病毒载量。还提供用市售流行性感冒疫苗(凡尔灵) 获得的比较资料。图12展示经肌肉内投予的肽组合物SFV2免疫的雪貂中针对潜在大流行性感冒病 毒株的体液免疫。在接种两周后(在病毒激发前)从动物中收集血清，并通过ELISA来测 试样品与假定大流行性猪(H1N1/加利福尼亚(California)/2009)分离株的重组血凝素 (rHA)蛋白质的反应性。还提供用市售流行性感冒疫苗(凡尔灵)获得的比较资料。图13展示示范性TLR-4激动剂佐剂PHAD(来自亚拉巴马州(AL)阿拉巴斯特市 (Alabaster)的雅凡蒂极性脂质公司(Avanti Polar Lipids, Inc.)的磷酸化己酰二糖)的 化学结构。图14展示另一示范性TLR-4激动剂佐剂(来自亚拉巴马州阿拉巴斯特市的雅凡 蒂极性脂质公司)二 [3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酰基]-脂质A (铵盐)的化学结构。
具体实施例方式定义整个本申请案中，采用若干个如以下段落中所定义的术语。
如本文所用的术语“免疫反应”是指在动物中引起的反应。免疫反应可指细胞免 疫、体液免疫或可包含两者。免疫反应也可限于免疫系统的一部分。举例来说，在一些实施 例中，免疫原性组合物可诱发IFNy反应增加。在一些实施例中，免疫原性组合物可诱发粘 膜IgA反应(例如在鼻和/或直肠洗液中测量)。在一些实施例中，免疫原性组合物可诱发 全身性IgG反应(例如在血清中测量)。如本文所用的术语“免疫原性”意指能够使在宿主动物中对非宿主实体(例如流 行性感冒病毒)产生免疫反应。在一些实施例中，此免疫反应构成由针对特定传染性有机 体(例如流行性感冒病毒)的疫苗引起的保护性免疫的基础。如本文所用的术语“肽”是指一串至少三个通过肽键连接在一起的氨基酸。一般 说来，肽中氨基酸的数目没有上限。肽一般仅含有天然氨基酸；然而，可包括非天然氨基酸 (即天然不存在，但可并入多肽链中的氨基酸)。本发明肽中的一个或一个以上氨基酸也可 以例如通过添加例如碳水化合物基团、磷酸酯基、法呢基、异法呢基、脂肪酸基、用于结合、 官能化或其它修饰的连接子等化学实体来修饰。在各个实施例中，修饰可产生更稳定的肽 (例如活体内半衰期更长)。合适的修饰可包括环化肽、并入D-氨基酸等。在各个实施例中， 修饰可产生免疫原性更强的肽。合适的修饰可包括共价连接一个或一个以上脂质(例如 但不限于软脂酰基、肉豆蔻酰基、硬脂酰基、月桂酰基、辛酰基、癸酰基等)、融合于载体蛋白 (例如但不限于结核菌素纯蛋白衍生物(purified protein derivative of tuberculin, PPD)、破伤风类毒素(tetanus toxoid)、霍乱毒素(cholera toxin)和其B亚单位、卵白蛋 白、牛血清白蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂、胞壁酰二肽和其类似物、细胞因子或其片段等)寸。如本文所用的术语“同源性百分比”是指如本申请案中所定义的最佳比对后两 种序列之间的序列一致性百分比。如果在经比对以达成如下所述的最大对应时两种序列 中的氨基酸序列相同，那么可以说两种氨基酸序列“一致”。通常通过在一个区域或“比较 窗”上比较两种最佳比对序列的序列以鉴别和比较序列相似性区域，进行两种氨基酸序列 之间的序列比较。用于比较的序列可以通过史密斯(Smith)和沃特曼(Waterman)，应用 数学进展(Ad. App. Math.) 2 =482(1981)的局部同源性算法，通过尼德曼(Neddleman)和 伍兹(Wunsch)，分子生物学杂志(J. Mol. Biol.) 48 =443(1970)的同源性比对算法，通过皮 尔森(Pearson)和李普曼(Lipman)，美国国家科学院院刊(Proc. Natl. Acad. ki. USA) 85 2444(1988)的相似法探究，通过这些算法的计算机化执行或通过目测来进行最佳比对。通过在比较窗上比较两个最佳比对的序列来测定“序列一致性百分比”，其中比较 窗中的部分氨基酸序列可包含相较于参考序列(不包含添加或缺失)的添加或缺失(即间 隙)，以最佳比对两个序列。此百分比如下计算通过测定两个序列中相同氨基酸残基所在 位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中总位置数并将此结果 乘以100，得到序列一致性百分比。以上所给出的序列一致性定义是所属领域的技术人员所 使用的定义。定义自身不需要任何算法的帮助。所述算法仅仅是有助于促进序列的最佳比 对，而不是计算序列一致性。由所述定义可见两个比较序列之间只存在明确的一个序列一 致性值，此值对应于针对最佳比对所获得的值。如本文所用的术语“治疗有效量”是指足以在所治疗个体中展示有意义益处的量。 免疫原性组合物的治疗有效量可视例如所需生物学终点、组合物的性质、投药途径、所治疗个体的健康、体型和/或年龄等因素而变化。如本文所用的术语“治疗”是指免疫原性组合物投予患有流行性感冒、具有流行性 感冒症状或具有发展成流行性感冒的诱因的个体，以达到缓和、减轻、改变、改善、好转或影 响流行性感冒、流行性感冒症状或发展成流行性感冒的诱因的目的。在一些实施例中，术语 “治疗”是指接种个体。一些实施例的详细描述本申请案提供可用于治疗流行性感冒的组合物和方法。如本文所述，所述组合物 和方法是基于对流行性感冒显示免疫原性的肽和肽组合的研制。在一些实施例中，肽组合诱发针对多个流行性感冒病毒株，例如季节性流行性感 冒病毒株或甚至新的猪源性A(HlNl)型大流行性感冒病毒的保护性反应。在一些实施例中，组合物不经肠投予(例如通过肌肉内注射)。在一些实施例中， 组合物包括TLR-4激动剂佐剂。在一些实施例中，组合物包括包含非离子型表面活性剂的 微脂粒。在一些实施例中，组合物中所存在的至少一部分TLR-4激动剂佐剂与微脂粒物理
φ π O虽然目前流行性感冒疫苗局限于上述不经肠投药途径(例如肌肉内注射)，但我 们已经鉴别出经口投予时诱发保护性反应的组合物。因此，在一些实施例中，组合物经口投 予。在一些实施例中，组合物包括TLR-3激动剂佐剂。在一些实施例中，组合物包括胆汁盐 体。在一些实施例中，组合物中所存在的至少一部分TLR-3激动剂佐剂与胆汁盐体物理缔
口 OI.肽一方面，本申请案提供可单独或组合使用，产生用于治疗流行性感冒的免疫原性 组合物的肽。应了解，任何所述肽都包括在免疫原性组合物中，且本申请案涵盖包括所述肽 的任何排列或组合的组合物。下文第II部分将描述一些示范性肽组合。A型流行性感冒血凝素(HA)亚型1 (Hl)肽实例中的表2-6描述来源于A型流行性感冒血凝素(HA)亚型1 (Hl)蛋白质的若 干种肽的氨基酸序列。如表2-5和序列表中所示，一些肽是常见一致序列的变异体。在一些实施例中，本申请案提供包含SEQ ID NO. 2 (参见表2)的至少20个相邻氨 基酸的肽。应了解，涵盖由SEQ ID NO. 2的一致序列所描述的任一变异序列的任何20个相 邻氨基酸。在一些实施例中，肽可包含SEQ ID而.2的至少21、22、23、24、25或沈个相邻 氨基酸。本申请案还提供包含两种或两种以上所述肽的免疫原性组合物。因此，在一些实 施例中，免疫原性组合物可包含2、3、4、5、6、7或8种包含SEQ IDN0. 2的至少20个相邻氨 基酸的不同肽。在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID NO. 2的不 同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1-3。在一些实施例中，η = 1。在一些实施例中，η = 2。 在一些实施例中，η = 3。在一些实施例中，本申请案提供包含SEQ ID NO. 3 (参见表3)的至少20个相邻氨 基酸的肽。应了解，涵盖由SEQ ID NO. 3的一致序列所描述的任一变异序列的任何20个 相邻氨基酸。在一些实施例中，肽可包含SEQ ID N0. 3的至少21、22、23、24、25、26、27、28、 四、30、31、32或33个相邻氨基酸。本申请案还提供包含两种或两种以上所述肽的免疫原性 组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、4、5、6、7或8种包含SEQ ID
16NO. 3的至少20个相邻氨基酸的不同肽。在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各 自包含SEQ ID NO. 3的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1_3。在一些实施例中，η = 1。 在一些实施例中，η = 2。在一些实施例中，η = 3。在一些实施例中，本申请案提供包含SEQ ID NO. 4 (参见表4)的至少20个相邻氨 基酸的肽。应了解，涵盖由SEQ ID NO. 4的一致序列所描述的任一变异序列的任何20个相 邻氨基酸。在一些实施例中，肽可包含SEQ ID NO. 4的至少21、22、23、24、25、26、27、28、29 或30个相邻氨基酸。本申请案还提供包含两种或两种以上所述肽的免疫原性组合物。因 此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3或4种包含SEQ ID N0. 4的至少20个相 邻氨基酸的不同肽。在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID N0. 4 的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1-2。在一些实施例中，η = 1。在一些实施例中，η =2。在一些实施例中，本申请案提供包含SEQ ID NO. 5 (参见表5)的至少20个相邻氨 基酸的肽。应了解，涵盖由SEQ ID N0. 5的一致序列所描述的任一变异序列的任何20个相 邻氨基酸。在一些实施例中，肽可包含SEQ ID N0. 5的至少21、22、23、M、25J6、27J8或 四个相邻氨基酸。本申请案还提供包含两种或两种以上所述肽的免疫原性组合物。因此， 在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、4、5、6、7或8种包含SEQ ID N0. 5的至少20 个相邻氨基酸的不同肽。在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID N0. 5的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1-3。在一些实施例中，η = 1。在一些实施例 中，η = 2。在一些实施例中，η = 3。在一些实施例中，本申请案提供包含与SEQ ID NO. 6 (参见表6)的至少40个相邻 氨基酸具有至少80%同源性的区域的肽。在一些实施例中，同源性可为至少85^、卯1^、 95%或 99%。在一些实施例中，本申请案提供包含SEQ ID N0. 6的至少40个相邻氨基酸的肽。 在一些实施例中，本申请案提供包含SEQ ID N0. 6的至少50、60、70或80个相邻氨基酸的 肽。因此，肽可包含SEQ ID N0. 6的氨基酸1-81。肽也可包含SEQ ID N0. 6的氨基酸82-88。 在一些实施例中，肽可包含SEQ ID N0. 6的整个序列。在其它实施例中，肽可基本上由SEQ ID N0. 6组成。在其它实施例中，肽可由SEQ ID N0. 6组成。除上述外，本申请案还提供包含与SEQ ID NO. 16(参见图9)的20-100个相邻氨基 酸具有至少80%同源性的区域的肽种类，其中所述肽包括来自A型流行性感冒血凝素(HA) 蛋白质的少于100个的相邻氨基酸。此种类涵盖上述其它Hl肽。在一些实施例中，肽可包 含与SEQ ID N0. 16的20-100个相邻氨基酸具有至少85%、90%、95%或99%同源性的区 域。在一些实施例中，肽可包含与SEQ ID N0. 16的20-50个相邻氨基酸具有至少80%同源 性的区域。在一些实施例中，肽可包含与SEQ ID N0. 16的50-100个相邻氨基酸具有至少 80%同源性的区域。在一些实施例中，任何上述Hl肽都可包含少于30个的氨基酸。然而，如本文所讨 论，在一些实施例中，包含任一确定区域的肽也可以包含在较大肽中。A型流行性感冒血凝素(HA)亚型3 (H3)肽实例中的表9-11描述来源于A型流行性感冒血凝素(HA)亚型3 (H3)蛋白质的若 干种肽的氨基酸序列。如表9-11和序列表中所示，这些肽都是SEQ ID NO. 17(参见图9)的一致序列的变异体。在一些实施例中，本申请案提供包含SEQ ID W). 17的序列的肽。应了解，涵盖由 SEQ ID NO. 17的一致序列所描述的任一变异序列。在一些实施例中，本申请案提供包含SEQ ID NO. 9 (参见表9)的序列的肽。应了 解，涵盖由SEQ ID NO. 9的一致序列所描述的任一变异序列。本申请案还提供包含两种或 两种以上所述肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种包含SEQ ID NO. 9的序列的不同肽。在一些实施例 中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID NO. 9的不同氨基酸序列的不同肽，其中η =1-4。在一些实施例中，η = 1。在一些实施例中，η = 2。在一些实施例中，η = 3。在一 些实施例中，η = 4。应了解本申请案还提供基本上由SEQ ID Ν0. 9的氨基酸序列组成、或 由SEQ ID N0. 9的氨基酸序列组成的肽。在一些实施例中，本申请案提供包含SEQ ID NO. 10(参见表10)的序列的肽。应 了解，涵盖由SEQ ID NO. 10的一致序列所描述的任一变异序列。本申请案还提供包含两种 或两种以上所述肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 或 16 种包含 SEQ ID NO. 10 的序列的不同肽。在一些实 施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID NO. 10的不同氨基酸序列的不同肽， 其中n = 1-40在一些实施例中，η = 1。在一些实施例中，η = 2。在一些实施例中，η =
3。在一些实施例中，η= 4。应了解本申请案还提供基本上由SEQ ID NO. 10的氨基酸序列 组成、或由SEQ ID NO. 10的氨基酸序列组成的肽。在一些实施例中，本申请案提供包含SEQ ID NO. 11 (参见表11)的序列的肽。应 了解，涵盖由SEQ ID NO. 11的一致序列所描述的任一变异序列。本申请案还提供包含两种 或两种以上所述肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或 16 种包含 SEQ ID NO. 11 的序列的不同肽。在一些实 施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID W). 11的不同氨基酸序列的不同肽， 其中n = 1-40在一些实施例中，η = 1。在一些实施例中，η = 2。在一些实施例中，η = 3。在一些实施例中，η = 4。应了解本申请案还提供基本上由SEQ ID NO. 11的氨基酸序列 组成、或由SEQ ID NO. 11的氨基酸序列组成的肽。在一些实施例中，任何上述H3肽都可包含少于30个的氨基酸。然而，如本文所讨 论，在一些实施例中，包含任一确定区域的肽也可以包含在较大肽中。实例中的表7描述来源于A型流行性感冒血凝素(HA)亚型3 (H3)蛋白质的另一 种肽的氨基酸序列。本申请案提供包含与SEQ ID N0. 7的至少20个相邻氨基酸具有至少 80%同源性的区域的肽，其中所述肽包括来自A型流行性感冒血凝素蛋白质的少于100个 的相邻氨基酸。在一些实施例中，肽可包含与SEQ ID N0. 7的至少20个相邻氨基酸具有至 少85%、90%、95%或99%同源性的区域。在一些实施例中，肽可包含与SEQ ID N0. 7的至 少50、60、70或80个相邻氨基酸具有至少80%同源性的区域。在一些实施例中，肽可包含 SEQ ID N0. 7的整个序列。在其它实施例中，肽可基本上由SEQ ID N0. 7组成。在其它实施 例中，肽可由SEQ ID N0. 7组成。在一些实施例中，肽可包含少于100个的氨基酸，例如少 于90、80、70、60、50或40个的氨基酸。然而，如本文所讨论，在一些实施例中，包含任一确 定区域的肽也可以包含在较大肽中。
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B型流行性感冒血凝素(HA)肽实例中的表8和12描述来源于B型流行性感冒血凝素(HA)蛋白质的若干种肽的
氨基酸序列。在一些实施例中，本申请案提供包含与SEQ ID NO. 18(参见图9)的位置2_49或 68-121的至少20个相邻氨基酸具有至少80%同源性的区域的肽，其中所述肽包括来自B 型流行性感冒血凝素蛋白质的少于100个的相邻氨基酸。在一些实施例中，肽可包含与SEQ ID NO. 18的位置2-49或68-121的至少20个相邻氨基酸具有至少85%、90%、95%或99% 同源性的区域。在一些实施例中，肽可包含与SEQ ID NO. 18的位置2_49或68-121的至少 25、30、35、40或45个相邻氨基酸具有至少80%同源性的区域。在一些实施例中，肽可包含与SEQ ID NO. 12 (参见表12)的整个序列具有至少 80%同源性的区域。在一些实施例中，同源性程度可为至少85%、90%、95%或99%。在一 些实施例中，肽可包含SEQ ID NO. 12的整个序列。在一些实施例中，肽可基本上由SEQ ID N0. 12组成。在一些实施例中，肽可由SEQ ID N0. 12组成。在一些实施例中，肽可包含与SEQ ID N0. 13 (参见表12)的整个序列具有至少 80%同源性的区域。在一些实施例中，同源性程度可为至少85%、90%、95%或99%。在一 些实施例中，肽可包含SEQ ID N0. 13的整个序列。在一些实施例中，肽可基本上由SEQ ID N0. 13组成。在一些实施例中，肽可由SEQ ID N0. 13组成。在一些实施例中，肽可包含与SEQ ID N0. 18的位置2_49的至少20个相邻氨基酸 具有至少80%同源性的第一区域和与SEQ ID N0. 18的位置68-121的至少20个相邻氨基酸 具有至少80%同源性的第二区域。在一些实施例中，同源性可更高，例如至少85^^90%, 95%或99%。在一些实施例中，第一和/或第二区域中的同源性可覆盖SEQ ID N0. 18的位 置2-49或68-121的至少25、20、35、40或45个相邻氨基酸。在一些实施例中，肽可包含与SEQ ID NO. 8 (参见表8)的整个序列具有至少80% 同源性的区域。在一些实施例中，同源性程度可为至少85^^90^^95%或99%。在一些实 施例中，肽可包含SEQ ID N0. 8的整个序列。在其它实施例中，肽可基本上由SEQ ID N0. 8 的序列组成，或由SEQ ID N0. 8的序列组成。在一些实施例中，任何上述的B型HA肽都可包含少于100个的氨基酸，例如少于 90、80、70、60、50或40个的氨基酸。然而，如本文所讨论，在一些实施例中，包含任一确定区 域的肽也可以包含在较大肽中。A型流行性感冒核蛋白(NP)肽实例中的表13和14描述来源于A型流行性感冒核蛋白(NP)的若干种肽的氨基酸 序列。表13中的肽是SEQ ID N0. 14的一致序列的变异体。表14中的肽是SEQ ID N0. 15 的一致序列的变异体。在一些实施例中，本申请案提供包含SEQ ID N0. 14(参见表13)的序列的肽，其 中所述肽包括来自A型流行性感冒核蛋白的少于20个的相邻氨基酸。应了解，涵盖由SEQ ID N0. 14的一致序列所描述的任一变异序列。本申请案还提供包含两种或两种以上所述肽 的免疫原性组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15或16种包含SEQ ID N0. 14的序列的不同肽。在一些实施例中，免疫原性 组合物可包含2n种各自包含SEQ ID N0. 14的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1_4。在一些实施例中，η = 1。在一些实施例中，η = 2。在一些实施例中，η = 3。在一些实施例 中，η = 4。应了解本申请案还提供基本上由SEQ ID NO. 14的氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO. 14的氨基酸序列组成的肽。在一些实施例中，本申请案提供包含SEQ ID NO. 15 (参见表14)的序列的肽，其 中所述肽包括来自A型流行性感冒核蛋白的少于20个的相邻氨基酸。应了解，涵盖由SEQ ID NO. 15的一致序列所描述的任一变异序列。本申请案还提供包含两种或两种以上所述肽 的免疫原性组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15或16种包含SEQ ID NO. 15的序列的不同肽。在一些实施例中，免疫原性 组合物可包含2n种各自包含SEQ ID N0. 15的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1_4。在 一些实施例中，η = 1。在一些实施例中，η = 2。在一些实施例中，η = 3。在一些实施例 中，η = 4。应了解本申请案还提供基本上由SEQ ID Ν0. 15的氨基酸序列组成、或由SEQ ID N0. 15的氨基酸序列组成的肽。在一些实施例中，任何上述NP肽都可包含少于30个的氨基酸。然而，如本文所讨 论，在一些实施例中，包含任一确定区域的肽也可以包含在较大肽中。其它流行性感冒肽本申请案提供包括来自一种以上流行性感冒蛋白质的序列的其它肽。因此，在一 些实施例中，本申请案提供包含SEQ ID N0. 1(参见表1)的氨基酸序列的肽。如表1和序 列表中所示，SEQ ID NO. 1为一致序列。一致序列来源于B型流行性感冒HA蛋白质和A型 流行性感冒HA H3蛋白质中的序列。应了解，涵盖由SEQ ID NO. 1的一致序列所描述的任一 变异序列。本申请案还提供包含两种或两种以上所述肽的免疫原性组合物。因此，在一些 实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种包含SEQ ID NO. 1的序列的不同肽。在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID NO. 1的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1-4。在一些实施例中，η = 1。在一些实施例 中，η = 2。在一些实施例中，η = 3。在一些实施例中，η = 4。应了解本申请案还提供基 本上由SEQ ID NO. 1的氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO. 1的氨基酸序列组成的肽。还应 了解，在一些实施例中，肽可包含少于30个的氨基酸。然而，如本文所讨论，在一些实施例 中，包含任一确定区域的肽也可以包含在较大肽中。II.肽组合—方面，本申请案提供包括第I部分中所描述肽的组合的免疫原性组合物。应了 解，以下示范性组合没有限制性，且本申请案涵盖第I部分中所描述肽的所有变更和组合。 还应了解，其它肽(包括现有流行性感冒疫苗中发现的传统流行性感冒蛋白质抗原)可加 入本文所述的任何免疫原性组合物中。在一些实施例中，免疫原性组合物中的每种肽都独 立地具有免疫原性。在一些实施例中，至少一种肽包含具有20个或20个以上来自非流行性感冒蛋白 质的相邻氨基酸的区域。在一些实施例中，每种肽都包含具有20个或20个以上来自非流 行性感冒蛋白质的相邻氨基酸的区域。在一些实施例中，组合物的至少两种肽存在于单个 蛋白质内。在一些实施例中，本申请案提供包括来自第I部分的一种或一种以上A型流行性 感冒HA Hl肽和一种或一种以上A型流行性感冒HA H3肽的免疫原性组合物。
在一些实施例中，本申请案提供包括来自第I部分的一种或一种以上A型流行性 感冒HA Hl肽和一种或一种以上B型流行性感冒HA肽的免疫原性组合物。在一些实施例中，本申请案提供包括来自第I部分的一种或一种以上A型流行性 感冒HA H3肽和一种或一种以上B型流行性感冒HA肽的免疫原性组合物。在一些实施例中，本申请案提供包括来自第I部分的一种或一种以上A型流行性 感冒HA Hl肽、一种或一种以上A型流行性感冒HA H3肽和一种或一种以上B型流行性感 冒HA肽的免疫原性组合物。在一些实施例中，来自第I部分的一种或一种以上A型流行性感冒NP肽可包括在 任一上述组合中。在一些实施例中，本申请案提供包含以下的免疫原性组合物第一肽，其包含与 SEQ ID NO. 16的20-100个相邻氨基酸具有至少80%同源性的区域，其中第一肽包括来自A 型流行性感冒血凝素蛋白质的少于100个的相邻氨基酸；第二肽，其包含SEQ ID NO. 17的 氨基酸序列；和第三肽，其包含与SEQ ID NO. 18的位置2_49或68-121的至少20个相邻氨 基酸具有至少80%同源性的区域，其中第三肽包括来自B型流行性感冒血凝素蛋白质的少 于100个的相邻氨基酸。在一些实施例中，第一肽和第三肽包含少于100个的氨基酸，且第 二肽包含少于30个的氨基酸。在一些实施例中，还包括包含SEQ ID NO. 14或15的氨基酸序列的第四肽，其中第 四肽包括来自A型流行性感冒核蛋白的少于20个的相邻氨基酸。示范性第一肽(A型流行性感冒HA Hl)在一些实施例中，第一肽可包含与SEQ ID NO. 16的20-100个相邻氨基酸具有至 少85%、90%、95%或99%同源性的区域。在一些实施例中，第一肽可包含与SEQ ID N0. 16 的20-50个相邻氨基酸具有至少80%同源性的区域。在一些实施例中，第一肽可包含与SEQ ID N0. 16的50-100个相邻氨基酸具有至少80%同源性的区域。在一些实施例中，第一肽可包含SEQ ID N0. 2(参见表2)的至少20个相邻氨基酸。 应了解，涵盖由SEQ ID N0. 2的一致序列所描述的任一变异序列的任何20个相邻氨基酸。 在一些实施例中，第一肽可包含SEQ ID N0. 2的至少21、22、23、24、25或沈个相邻氨基酸。 本申请案还提供包含两种或两种以上所述第一肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施例 中，免疫原性组合物可包含2、3、4、5、6、7或8种包含SEQ ID N0. 2的至少20个相邻氨基酸 的不同第一肽。在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID N0. 2的不 同氨基酸序列的不同第一肽，其中η = 1-3。在一些实施例中，η = 1。在一些实施例中，η =2。在一些实施例中，η = 3。在一些实施例中，第一肽可包含SEQ ID Ν0. 3(参见表3)的至少20个相邻氨基酸。 应了解，涵盖由SEQ ID N0. 3的一致序列所描述的任一变异序列的任何20个相邻氨基酸。 在一些实施例中，第一肽可包含 SEQ ID N0. 3 的至少 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32或33个相邻氨基酸。本申请案还提供包含两种或两种以上所述第一肽的免疫原性组合 物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、4、5、6、7或8种包含SEQ ID N0. 3 的至少20个相邻氨基酸的不同第一肽。在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自 包含SEQ ID N0. 3的不同氨基酸序列的不同第一肽，其中η = 1_3。在一些实施例中，η = 1。在一些实施例中，η = 2。在一些实施例中，η = 3。
在一些实施例中，第一肽可包含SEQ ID NO. 4(参见表4)的至少20个相邻氨基酸。 应了解，涵盖由SEQ ID NO. 4的一致序列所描述的任一变异序列的任何20个相邻氨基酸。 在一些实施例中，第一肽可包含SEQ ID NO. 4的至少21、22、23、24、25、26、27、28、四或30个 相邻氨基酸。本申请案还提供包含两种或两种以上所述第一肽的免疫原性组合物。因此， 在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3或4种包含SEQ ID NO. 4的至少20个相邻氨 基酸的不同第一肽。在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID NO. 4 的不同氨基酸序列的不同第一肽，其中η = 1-2。在一些实施例中，n = I0在一些实施例 中，η = 2。在一些实施例中，第一肽可包含SEQ ID Ν0. 5(参见表5)的至少20个相邻氨基酸。 应了解，涵盖由SEQ ID N0. 5的一致序列所描述的任一变异序列的任何20个相邻氨基酸。 在一些实施例中，第一肽可包含SEQ ID N0. 5的至少21、22、23、24、25、洸、27、沘或四个相 邻氨基酸。本申请案还提供包含两种或两种以上所述第一肽的免疫原性组合物。因此，在 一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、4、5、6、7或8种包含SEQ ID N0. 5的至少20个 相邻氨基酸的不同第一肽。在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID N0. 5的不同氨基酸序列的不同第一肽，其中η = 1-3。在一些实施例中，η = 1。在一些实 施例中，η = 2。在一些实施例中，η = 3。在一些实施例中，第一肽可包含与SEQ ID NO. 6 (参见表6)的至少40个相邻氨 基酸具有至少80%同源性的区域。在一些实施例中，同源性可为至少85^^90^^95%或 99%。在一些实施例中，第一肽可包含SEQ ID N0. 6的至少40个相邻氨基酸。在一些实施 例中，第一肽可包含SEQ ID N0.6的至少50、60、70或80个相邻氨基酸。因此，第一肽可包 含SEQ ID N0. 6的氨基酸1-81。第一肽也可包含SEQ ID N0. 6的氨基酸82-88。在一些实 施例中，第一肽可包含SEQ ID N0. 6的整个序列。在其它实施例中，第一肽可基本上由SEQ ID N0. 6组成。在其它实施例中，第一肽可由SEQ ID N0. 6组成。在一些实施例中，任何上述第一肽都可包含少于30个的氨基酸。然而，如本文所 讨论，在一些实施例中，包含任一确定区域的第一肽也可以包含在较大肽中。示范性第二肽(A型流行性感冒HA H3)在一些实施例中，第二肽可包含SEQ ID N0. 17的序列。应了解，涵盖由SEQ ID N0. 17的一致序列所描述的任一变异序列。在一些实施例中，第二肽可包含SEQ ID NO. 9 (参见表9)的序列。应了解，涵盖由 SEQ ID N0. 9的一致序列所描述的任一变异序列。本申请案还提供包含两种或两种以上所 述第二肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15或16种包含SEQ ID N0. 9的序列的不同第二肽。在一些实施例 中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID N0. 9的不同氨基酸序列的不同第二肽， 其中n = 1-40在一些实施例中，η = 1。在一些实施例中，η = 2。在一些实施例中，η = 3。在一些实施例中，η = 4。应了解本申请案还提供基本上由SEQ ID Ν0. 9的氨基酸序列 组成、或由SEQ ID N0. 9的氨基酸序列组成的第二肽。在一些实施例中，第二肽可包含SEQ ID NO. 10(参见表10)的序列。应了解，涵盖 由SEQ ID NO. 10的一致序列所描述的任一变异序列。本申请案还提供包含两种或两种以 上所述第二肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、4、
225、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种包含SEQ ID NO. 10的序列的不同第二肽。在一些
实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID NO. 10的不同氨基酸序列的不同 第二肽，其中η = 1-4。在一些实施例中，η = 1。在一些实施例中，η = 2。在一些实施例 中，η = 3。在一些实施例中，η = 4。应了解本申请案还提供基本上由SEQ ID NO. 10的氨 基酸序列组成、或由SEQ ID NO. 10的氨基酸序列组成的第二肽。在一些实施例中，第二肽可包含SEQ ID NO. 11(参见表11)的序列。应了解，涵盖 由SEQ ID NO. 11的一致序列所描述的任一变异序列。本申请案还提供包含两种或两种以 上所述第二肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种包含SEQ ID NO. 11的序列的不同第二肽。在一些 实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列的不同 第二肽，其中η = 1-4。在一些实施例中，η = 1。在一些实施例中，η = 2。在一些实施例 中，η = 3。在一些实施例中，η = 4。应了解本申请案还提供基本上由SEQ ID NO. 11的氨 基酸序列组成、或由SEQ ID NO. 11的氨基酸序列组成的第二肽。在一些实施例中，任何上述第二肽都可包含少于30个的氨基酸。然而，如本文所 讨论，在一些实施例中，包含任一确定区域的第二肽也可以包含在较大肽中。示范性第三肽(B型流行性感冒HA)在一些实施例中，第三肽可包含与SEQ ID N0. 18的位置2_49或68-121的至少20 个相邻氨基酸具有至少85%、90%、95%或99%同源性的区域。在一些实施例中，第三肽可 包含与SEQ ID N0. 18的位置2_49或68-121的至少25、30、35、40或45个相邻氨基酸具有 至少80%同源性的区域。在一些实施例中，第三肽可包含与SEQ ID NO. 12(参见表12)的整个序列具有至 少80%同源性的区域。在一些实施例中，同源性程度可为至少85%、90%、95%或99%。在 一些实施例中，第三肽可包含SEQ ID N0. 12的整个序列。在一些实施例中，第三肽可基本 上由SEQ ID N0. 12组成。在一些实施例中，第三肽可由SEQ ID N0. 12组成。在一些实施例中，第三肽可包含与SEQ ID NO. 13(参见表12)的整个序列具有至 少80%同源性的区域。在一些实施例中，同源性程度可为至少85%、90%、95%或99%。在 一些实施例中，第三肽可包含SEQ ID N0. 13的整个序列。在一些实施例中，第三肽可基本 上由SEQ ID N0. 13组成。在一些实施例中，第三肽可由SEQ ID N0. 13组成。在一些实施例中，第三肽可包含与SEQ ID N0. 18的位置2_49的至少20个相邻氨 基酸具有至少80%同源性的第一区域和与SEQ ID N0. 18的位置68-121的至少20个相邻 氨基酸具有至少80%同源性的第二区域。在一些实施例中，同源性可更高，例如至少85%、 90^^95%或99%。在一些实施例中，第一区域和/或第二区域中的同源性可覆盖SEQ ID N0. 18的位置2-49或68-121的至少25、20、35、40或45个相邻氨基酸。在一些实施例中，第三肽可包含与SEQ ID N0. 8的整个序列具有至少80%同源性 的区域。在一些实施例中，同源性程度可为至少85%、90%、95%或99%。在一些实施例中， 第三肽可包含SEQ ID N0. 8的整个序列。在其它实施例中，第三肽可基本上由SEQ ID N0. 8 的序列组成，或由SEQ ID N0. 8的序列组成。在一些实施例中，免疫原性组合物可包括两种不同的第三肽，其中一者包含与SEQ ID N0. 18的位置2-49的至少20个相邻氨基酸具有至少80%同源性的区域，而另一者包含与SEQ ID NO. 18的位置68-121的至少20个相邻氨基酸具有至少80%同源性的区域。在 一些实施例中，所述肽的一或两者中同源性程度可为至少85 %、90 %、95 %或99 %。在一些实施例中，任何上述第三肽都可包含少于100个的氨基酸，例如少于90、 80、70、60、50或40个的氨基酸。然而，如本文所讨论，在一些实施例中，包含任一确定区域 的第三肽也可以包含在较大肽中。示范性第四肽(A型流行性感冒NP)在一些实施例中，任选的第四肽可包含SEQ ID NO. 14(参见表13)的序列。应了 解，涵盖由SEQ ID NO. 14的一致序列所描述的任一变异序列。本申请案还提供包含两种或 两种以上所述第四肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 或 16 种包含 SEQ ID NO. 14 的序列的不同第四肽。在 一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ IDN0. 14的不同氨基酸序列的不 同第四肽，其中η = 1-4。在一些实施例中，η = 1。在一些实施例中，η = 2。在一些实施 例中，η = 3。在一些实施例中，η = 4。应了解免疫原性组合物也可包括基本上由SEQ ID NO. 14的氨基酸序列组成、或由SEQ ID N0. 14的氨基酸序列组成的第四肽。在一些实施例中，任选的第四肽可包含SEQ ID NO. 15(参见表14)的序列。应了 解，涵盖由SEQ ID N0. 15的一致序列所描述的任一变异序列。本申请案还提供包含两种或 两种以上所述第四肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 或 16 种包含 SEQ ID N0. 15 的序列的不同第四肽。在 一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID N0. 15的不同氨基酸序列的不 同第四肽，其中η = 1-4。在一些实施例中，η = 1。在一些实施例中，η = 2。在一些实施 例中，η = 3。在一些实施例中，η = 4。应了解免疫原性组合物也可包括基本上由SEQ ID Ν0. 15的氨基酸序列组成、或由SEQ ID N0. 15的氨基酸序列组成的第四肽。在一些实施例中，任何上述第四肽都可包含少于30个的氨基酸。然而，如本文所 讨论，在一些实施例中，包含任一确定区域的第四肽也可以包含在较大肽中。示范性肽组合在一些实施例中，免疫原性组合物可包括包含与SEQ ID N0. 6具有至少80%同源 性的区域的第一肽、包含与SEQ ID N0. 8具有至少80%同源性的区域的第三肽、和2n种各 自包含SEQ ID W).9、10或11的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中η = 1_4。在一个实施 例中，第二肽各自包含SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列。在一个实施例中，η = 4。在一个 实施例中，组合物另外包含2m种各自包含SEQ ID N0. 14的不同氨基酸序列的不同第四肽， 其中m= 1-4。在一个实施例中，组合物另外包含2m种各自包含SEQ ID N0. 15的不同氨基 酸序列的不同第四肽，其中m= 1-4。在一个实施例中，m = 4。在一些实施例中，免疫原性组合物可包括包含与SEQ ID N0. 6具有至少90%同源 性的区域的第一肽、包含与SEQ ID N0. 8具有至少90%同源性的区域的第三肽、和2n种各 自包含SEQ ID W).9、10或11的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中η = 1_4。在一个实施 例中，第二肽各自包含SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列。在一个实施例中，η = 4。在一个 实施例中，组合物另外包含2m种各自包含SEQ ID N0. 14的不同氨基酸序列的不同第四肽， 其中m= 1-4。在一个实施例中，组合物另外包含2m种各自包含SEQ ID N0. 15的不同氨基 酸序列的不同第四肽，其中m= 1-4。在一个实施例中，m = 4。
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在一些实施例中，免疫原性组合物可包括包含与SEQ ID NO. 6具有至少95%同源 性的区域的第一肽、包含与SEQ ID NO. 8具有至少95%同源性的区域的第三肽、和2n种各 自包含SEQ ID W).9、10或11的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中η = 1_4。在一个实施 例中，第二肽各自包含SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列。在一个实施例中，η = 4。在一个 实施例中，组合物另外包含2m种各自包含SEQ ID NO. 14的不同氨基酸序列的不同第四肽， 其中m= 1-4。在一个实施例中，组合物另外包含2m种各自包含SEQ ID NO. 15的不同氨基 酸序列的不同第四肽，其中m= 1-4。在一个实施例中，m = 4。在一些实施例中，免疫原性组合物可包括包含SEQ ID NO. 6的第一肽、包含SEQ ID NO. 8的第三肽、和2n种各自包含SEQ ID NO. 9、10或11的不同氨基酸序列的不同第二肽， 其中n =丨-4。在一个实施例中，第二肽各自包含SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列。在一 个实施例中，η = 4。在一个实施例中，组合物另外包含2m种各自包含SEQ ID NO. 14的不同 氨基酸序列的不同第四肽，其中m= 1-4。在一个实施例中，组合物另外包含2m种各自包含 SEQ ID NO. 15的不同氨基酸序列的不同第四肽，其中m = 1_4。在一个实施例中，m = 4。在一些实施例中，免疫原性组合物可包括基本上由SEQ ID N0. 6组成的第一肽、基 本上由SEQ ID N0. 8组成的第三肽、和2"种各自基本上由SEQ ID N0. 9、10或11的不同氨 基酸序列组成的不同第二肽，其中η = 1-4。在一个实施例中，第二肽各自基本上由SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列组成。在一个实施例中，η = 4。在一个实施例中，组合物另外包 含2-种各自基本上由SEQ ID W). 14的不同氨基酸序列组成的不同第四肽，其中m= 1-4。 在一个实施例中，组合物另外包含2-种各自基本上由SEQ ID N0. 15的不同氨基酸序列组 成的不同第四肽，其中m = 1-4。在一个实施例中，m = 4。在一些实施例中，免疫原性组合物可包括由SEQ ID N0. 6组成的第一肽、由SEQ ID N0. 8组成的第三肽、和2"种各自由SEQ ID N0. 9、10或11的不同氨基酸序列组成的不同第 二肽，其中η= 1-4。在一个实施例中，第二肽各自由SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列组 成。在一个实施例中，η = 4。在一个实施例中，组合物另外包含2-种各自由SEQ ID Ν0. 14 的不同氨基酸序列组成的不同第四肽，其中m= 1-4。在一个实施例中，组合物另外包含2m 种各自由SEQ ID N0. 15的不同氨基酸序列组成的不同第四肽，其中m = 1_4。在一个实施 例中，m = 4。III.肽合成本文所述的肽可使用所属领域中的任何已知方法(包括重组方法)合成。在各个 实施例中，肽可通过固相肽合成法(SPPS)来合成。在SPPS中，C端氨基酸通过与连接分子 所形成的酸不稳定键连接于固相(通常为交联树脂，例如含聚苯乙烯或聚乙二醇的树脂)。 所用固相一般不溶于合成所用的溶剂中，从而可相对简单且快速地冲洗掉过量的试剂和副 产物。N端用在酸中稳定，但可通过碱来除去的保护基(例如Fmoc基团)保护。侧链官能 团用碱稳定而酸不稳定的基团保护。SPSS技术接着包含将N-α上经保护的氨基酸并入生 长肽链中，而C端仍然连接于固相。实例1描述示范性SPSS工艺。一般说来，此工艺可自动操作，且市售装置可用于常规合成长度为20个或20个以 上氨基酸的肽。当制备长肽(例如长度超过40个氨基酸)时，可证明适宜在一系列通过使 用适当保护基接合的片段中产生肽。如本文所述，某些肽组合物可包括单个肽序列的多个变异体(例如在相同序列中的2个或2个以上位置具有2个或2个以上不同氨基酸)。虽然指定组中的各变异体可个 别合成，但通常适宜在单一合成中合成变异体子集或整组变异体。在各个实施例中，此可使 用分开-组合法(split-combine method)实现。因此，如果此组变异体经设计以在指定位 置包括两种不同氨基酸的一种，那么树脂可分成两个同等部分，且各部分可与两种氨基酸 的一种偶合，形成两种不同的肽链。一旦偶合结束，即可将两个部分重新组合，以便后来的 氨基酸可加入两链中。或者，可使用一锅法，其中两个替代性氨基酸加入同一反应中。通常 两种氨基酸以等摩尔量加入；然而，在某些情况下(例如在其各别反应动力学差异显著的 情况下)，优选非等摩尔量。接着可使用凯撒茚三酮试验(Kaiser ninhydrin test)监测肽 反应是否结束。以下参考文献描述制备肽混合物的一些示范性方法霍顿(Houghten)，美国国家 科学院院刊82 =5131 (1985)；盖森(Geysen)等人，美国国家科学院院刊81 :3998(1984)和 美国专利第5，010，175号。IV.佐剂在一些实施例中，免疫原性组合物可包括一种或一种以上佐剂。如所属领域中所 熟知，佐剂是增强免疫反应的试剂。佐剂为所属领域中所熟知(例如参见“疫苗设计亚单 位和佐剂方法(Vaccine Design :The Subunit and Adjuvant Approach) ”，制药学生物技 术(Pharmaceutical Biotechnology)，第 6 卷，鲍威尔(Powell)和纽曼(Newman)编，普莱 南出版社(Plenum Press)，纽约(New York)和伦敦(London)，1995)。示范性佐剂包括完全弗氏佐剂(complete Freund' s adjuvant, CFA)、不完全弗 氏佐剂(IFA)、角鯊烯、角鯊烷和明矾(氢氧化铝)，所述佐剂都是所属领域中熟知的物质且 可从若干来源购得。在一些实施例中，铝或钙盐(例如氢氧化物或磷酸盐)可用作佐剂。明 矾(氢氧化铝)已用于许多现有的疫苗中。通常每一剂量可包括约40至约700 μ g的铝。在各个实施例中，水包油乳液或油包水乳液也可用作佐剂。举例来说，油相可包括 角鯊烯或角鯊烷和表面活性剂。在各个实施例中，可使用非离子型表面活性剂，例如脱水山 梨糖醇和二缩甘露醇(marmide)的单-和二-C12-Cm脂肪酸酯。油相优选占免疫原性肽的 约0.2重量％至约15重量％ (例如约0. 2%至)。PCT公开案第WO 95/17210号描述 示范性乳液。命名为QS21的佐剂是一种具有佐剂活性的免疫活性皂苷部分，其来源于南美树 木智利皂荚树(Quillaja Saponaria Molina)的树皮，且其生产方法揭示于美国专利第 5，057，540号中。智利皂荚树皂苷的半合成和合成衍生物也是适用的，例如美国专利第 5，977，081号和第6，080, 725号中所述的皂苷衍生物。TLR是与果蝇Toll受体同源的蛋白质家族，其识别病原体相关分子模式，因此帮 助身体区分自身分子与非自身分子。病毒病原体中常见的物质通过TLR识别为病原体相关 分子模式。举例来说，TLR-3识别双股RNA中的模式，TLR-4识别脂多糖中的模式，而TLR-7/8 识别病毒和细菌RNA和DNA中含有腺苷的模式。当通过此模式识别引发TLR时，发生一系 列信号传导事件，引起发炎和先天性和适应性免疫反应的活化。大量含有各种TLR所识别 的分子模式的合成配体正研制成为佐剂，且可包括在如本文所述的免疫原性组合物中。举例来说，聚核糖肌苷酸聚核糖胞苷酸或poly(I:C)(得自加利福尼亚州(CA) 圣地亚哥市(San Diego)的英孚杰公司(InvivoGen))是双股RNA(病毒感染相关分子模式)的合成类似物，并且为示范性TLR-3激动剂佐剂(例如参见菲尔德(Field)等 人，美国国家科学院院刊58 :1004(1967)和拉维(Levy)等人，美国国家科学院院刊62 357(1969))。下文实例11将证明此佐剂用于示范性口服肽组合物的益处。在一些实施 例中，poly(I:C)可与其它试剂组合，以提高稳定性(例如通过核糖核酸酶的活性来减 少降解)。举例来说，美国专利第3，952，097号、第4，024，241号和第4，349，538号描述 poly (I:C)与聚L-赖氨酸的复合物。聚精氨酸加入到poly (I:C)中也已展示通过核糖核 酸酶的活性来减少降解。美国专利公开案第20090041809号描述具有一种或一种以上锁核 酸(LNA)核苷的双股核酸，其可充当TLR-3激动剂。所属领域的技术人员将能够鉴别其它 适合的TLR-3激动剂佐剂。诸如单磷酰基脂质A(MPL)和3-脱酰基单磷酰基脂质A(3D-MPL)等减毒脂质A 衍生物(ALD)是示范性TLR-4激动剂佐剂。ALD是类脂质A分子，其经改变或构筑，以使分 子显示更少或不同的脂质A的不良影响。这些不良影响包括致热性、局部什瓦茨曼反应性 (Shwarzman reactivity)和毒性，如鸡胚50%致死剂量分析(CELD5tl)中所评估。MPL和 3D-MPL分别描述于美国专利第4，436，727和4，912，094号中。MPL最初来源于作为肠细菌 脂多糖(LPQ的组分的脂质A，脂多糖是一种有效但毒性高的免疫系统调节剂。3D-MPL与 MPL的不同之处在于酯连接于位置3的还原末端葡糖胺的酰基残基已选择性地除去。应了 解，MPL和3D-MPL可包括脂肪酸链长变化的大量脂肪酸取代型式(即庚酰基、己酰基、戊酰 基等)的混合物。因此，本发明涵盖MPL和3D-MPL的各种形式，包括其混合物在内。在一些实施例中，这些ALD可与海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)组 合于例如2%角鯊烯/Tween 80乳液中(例如参见英国专利第2122204号)。以PHAD (磷 酸化己酰基二糖)，可从亚拉巴马州阿拉巴斯特市的雅凡蒂极性脂质公司获得MPL。图13 展示PHAD的化学结构。下文实例13证明此佐剂用于示范性不经肠肽组合物的益处。图 14中展示另一示范性TLR-4激动剂佐剂二 [3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酰基]-脂质A(铵 盐)的化学结构(也来自亚拉巴马州阿拉巴斯特市的雅凡蒂极性脂质公司)。所属领域的 技术人员将能够鉴别其它适合的TLR-4激动剂佐剂。举例来说，其它脂多糖已经描述于WO 98/01139、美国专利第6，005，099号和欧洲专利第729473号中。咪喹莫特(Imiquimod) (1_异丁基_1Η_咪唑并W，5_c]喹啉_4_胺)是小分子 TLR-7/8激动剂，其也适宜包括在如本文所述的免疫原性组合物中。V.微脂粒在一些实施例中，组合物中的一种或一种以上肽可与微脂粒组合。如所属领域中 所熟知，微脂粒一般具有经一个或一个以上包括亲水脂分子(例如脂肪酸、脂质、类固醇 等)的双层围住的水性隔室。一种或一种以上肽可存在于微脂粒的水性核心中。视肽的疏 水性而定，肽也可以与双层缔合(例如通过疏水性相互作用和/或氢键或离子键)。应了 解，任何微脂粒都可用于如本文所述的免疫原性组合物，且双层的亲水脂分子可为离子型 和/或非离子型。在一些实施例中，微脂粒可包含非离子型两性分子(例如非离子型表面活性剂)。 具有适当两性分子特性的任何非离子型表面活性剂都可用以形成此类微脂粒。适合的表面 活性剂的实例包括但不限于基于甘油的酯连接表面活性剂。所述甘油酯可包含例如各酰基 部分中含有至少10个碳原子的两种高级脂族酰基的一种。基于所述甘油酯的表面活性剂
27可包含一个以上甘油单元，例如多达5个甘油单元。可使用甘油单酯，例如含有C12-C2tl烷酰 基或烯酰基部分，例如己酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、软脂酰基、油酰基或硬脂酰基的甘油 单酯。一个示范性表面活性剂为ι-单棕榈酰基甘油。醚连接的表面活性剂也可用作非离子型表面活性剂。举例来说，适合的是基于甘 油或具有含至多4个碳原子的低级脂族二醇的二醇的醚连接表面活性剂。基于所述二醇的 表面活性剂可包含一个以上二醇单元，例如多达5个二醇单元(例如二乙二醇鲸蜡基醚和 /或聚氧乙烯-3-月桂基醚)。可使用二醇或甘油单醚，包括含有C12-C2tl烷基或烯基部分， 例如辛基(capryl)、月桂基、肉豆寇基、鲸蜡基、油基(oleyl)或硬脂基的二醇或甘油单醚。 可使用的环氧乙烷缩合产物包括PCT公开案第W088/06882号中所揭示的环氧乙烷缩合产 物(例如聚氧乙烯高级脂族醚和胺表面活性剂)。示范性的醚连接表面活性剂包括ι-单鲸 蜡基甘油醚和二乙二醇鲸蜡基醚。在一些实施例中，包含非离子型表面活性剂的微脂粒可另外包含离子型两性分 子，例如使微脂粒带负电荷。举例来说，此可有助于稳定微脂粒并提供有效分散。不受限制 地，例如高级链烷酸和链烯酸(例如棕榈酸、油酸)的酸性物质或包括磷酸酯(例如二烷基 磷酸酯(例如二鲸蜡基磷酸酯或磷脂酸或磷脂酰丝氨酸))和硫酸单酯(例如高级烷基硫 酸酯(例如鲸蜡基硫酸酯))在内的含有酸基的其它化合物都可用于达成此目的。离子型 两性分子如果存在，那么其通常占非离子型表面活性剂的1重量％与30重量％之间。例如 2重量％与20重量％之间或5重量％与15重量％之间。在一些实施例中，微脂粒组分可与具有高分子量且能够形成双层的适当疏水性物 质(例如类固醇，例如固醇，例如胆固醇)混合。在一些实施例中，类固醇的存在可有助于 形成决定微脂粒物理性质的双层。类固醇如果存在，那么其通常占非离子型表面活性剂的 20重量％与120重量％之间。例如25重量％与90重量％之间或35重量％与75重量％之 间。在一些实施例中，微脂粒可为胆汁盐体(参见例如美国专利第5，876，721号)。如 本文所用的“胆汁盐体”是包含非离子型表面活性剂和促进类脂质分子传输穿过粘膜的传 输增强分子的微脂粒。如美国专利第5，876，721号中所述，多种分子可用作传输增强剂。举 例来说，侧链的C23碳原子携带羧酸和/或其衍生物的胆固醇衍生物可以用作传输增强剂。 所述衍生物包括(但不限于)“胆汁酸”胆酸和鹅脱氧胆酸、其与甘氨酸或牛磺酸的结合产 物(例如甘氨胆酸和牛磺胆酸)、包括脱氧胆酸和熊脱氧胆酸在内的衍生物、和这些酸各自 的盐。其它传输增强剂包括酰氧化氨基酸，例如酰基肉碱和其盐。举例来说，诸如棕榈酰 基肉碱等含有C6_2(l烷酰基或烯酰基部分的酰基肉碱可以用作传输增强剂。如本文所用的术 语酰氧化氨基酸意欲涵盖一级、二级和三级氨基酸以及α、β和Y氨基酸。酰基肉碱为酰 氧化Y氨基酸的实例。应了解，免疫原性组合物所包括的胆汁盐体可包含一种以上类型的传输增强剂， 例如一种或一种以上不同胆汁盐和一种或一种以上酰基肉碱。还应了解，胆汁盐体也可以合并离子型两性分子，例如使胆汁盐体带负电荷。举例 来说，此可有助于稳定胆汁盐体并提供有效分散。不受限制地，例如高级链烷酸和链烯酸 (例如棕榈酸、油酸)的酸性物质或包括磷酸酯(例如二烷基磷酸酯(例如二鲸蜡基磷酸酯或磷脂酸或磷脂酰丝氨酸))和硫酸单酯(例如高级烷基硫酸酯(例如鲸蜡基硫酸酯))在 内的含有酸基的其它化合物都可用于达成此目的。在一些实施例中，胆汁盐体组分可与具有高分子质量且能够形成双层的适当疏水 性物质(例如类固醇，例如固醇，例如胆固醇)混合。在一些实施例中，类固醇的存在可有 助于形成决定胆汁盐体物理性质的双层。胆汁盐体内所存在的传输增强剂的存在量一般以非离子型表面活性剂计介于40 重量％与400重量％之间(例如60重量％与100重量％之间或70重量％与90重量％之 间)。类固醇如果存在，那么其通常占非离子型表面活性剂的20重量％与120重量％之间 (例如25重量％与90重量％之间或35重量％与75重量％之间)。离子型两性分子如果 存在，那么其通常占非离子型表面活性剂的1重量％与30重量％之间(例如2重量％与20 重量％之间或5重量％与15重量％之间)。存在多种已知用于制备包含非离子型表面活性剂的微脂粒的技术，例如PCT公 开案第WO 1993/019781号中所提及的技术。应了解，任何这些已知的方法可用以制备适 合的微脂粒且可以通过修改任何这些技术来制备胆汁盐体。一种示范性技术为旋转膜 蒸发法，其中通过从有机溶剂(例如烃或氯化烃溶剂，诸如氯仿)中旋转蒸发来制备非 离子型表面活性剂膜，例如参见拉塞尔(Russell)和亚历山大(Alexander)，免疫学杂志 (J. Immunol.) 140 1274 (1988)。所得薄膜接着在传输增强剂存在下在碳酸氢盐缓冲液中再 水合。另一种用于产生用以制备胆汁盐体的微脂粒的方法为柯林斯(Collins)等人，药 学与药理学杂志(J. Pharm. Pharmacol.) 42 :53(1990)所揭示的方法。此方法包含使非离子 型表面活性剂、类固醇(在使用的情况下)和离子型两性分子(在使用的情况下)的混合 物熔融，及在用力混合下在水性缓冲液存在下水合。传输增强剂可通过与其它组分一起包 括在熔融混合物中(即通过共熔融)或伴随用以截留肽的过程中并入微脂粒中。另一种方法包含在剪切力存在下水合。可用于施加所述剪切力的设备为熟知的适 合装置(参见例如PCT公开案第W088/06882号)。声波处理和超声波处理也是形成微脂粒 或改变其粒径的有效手段。一种或一种以上肽可与微脂粒以任何方式组合。举例来说，在旋转膜蒸发技术 中，此可通过在肽连同传输增强剂存在下膜的水合来实现。在其它方法中，一种或一种以 上肽可与预先形成的微脂粒通过脱水-再水合法组合，在所述方法中存在于水相中的肽通 过闪冻、接着冻干来截留，例如参见卡比(Kirby)和格雷格狄斯(Gregoriadis)，生物技术 (Biotechnology) 2 :979(1984)。或者，可使用冻融技术，其中微脂粒与肽混合，并在液氮中 重复闪冻，且升温至约例如60°C的温度(即超过有关表面活性剂的转变温度)，例如参见皮 克(Pick)，生物化学与生物物理学集刊(Arch. Biochem. Biophys. )212 :195(1981)。除截留 肽外，脱水-再水合法和冻融技术也能够将其它传输增强剂伴随并入微脂粒中。在每一所述方法中，微脂粒组分的悬浮液可在足以维持微脂粒形成混合物处于熔 融状态的高温下若干次挤压通过微孔聚碳酸酯膜。此过程的优点在于可产生尺寸均一的微 脂粒。根据本发明可使用的微脂粒(包括胆汁盐体)可具有任何直径。在一些实施例中，组 合物可包括直径在约IOnm至约ΙΟμπι范围内的微脂粒。在一些实施例中，微脂粒的直径在 约IOOnm至约5 μ m之间。在一些实施例中，微脂粒的直径在约500nm至约2 μ m之间。在一些实施例中，微脂粒的直径在约SOOnm至约1. 5 μ m之间。VI.剂量和投药本发明的方法适用于治疗包括成人和儿童在内的人类的流行性感冒。然而，一般 说来，其可适用于任何动物。在一些实施例中，本文中的方法可用于兽医学应用，例如犬科 和猫科应用。必要时，本文中的方法也可以用于农畜，例如羊、禽、牛、猪和马等种类。本文所述的组合物一般以诱发免疫反应所需或足以诱发免疫反应的量和次数投 予。给药方案可由一段时间内单个剂量或多个剂量组成。待要投予的肽组合物的精确量可 随各个体而变化，且可视若干因素而定。因此，应了解，一般说来，所用的准确剂量将由执业 医师确定，且不仅取决于个体的体重和投药途径，而且也取决于个体的年龄和症状的严重 程度和/或感染的风险。在一些实施例中，免疫原性组合物中肽的剂量可在约0. 01至50mg 范围内。举例来说，在一些实施例中，范围可在0. 1与5mg之间，例如0. 1与2mg之间。实 例14描述示范性投药方案，其包含两次连续肌肉内注射0. 2或Img肽剂量(第0天和第观 天)。一般说来，组合物可通过任何途径投予个体。实例中的结果证明本文所述的免疫 原性肽组合物不仅在通过传统的不经肠途径投予时可诱发保护性反应，而且在经口投予时 也诱发保护性反应。因此，在一些实施例中，组合物可经口(包括经颊、舌下和通过洗胃或 其它人工供应手段)投予。所述经口传递可使用例如呈片剂、胶囊、多颗粒、凝胶、膜、胚珠 (ovule)、酏剂、溶液、悬浮液等形式的固体或液体组合物实现。在一些实施例中，当使用液 体组合物时，组合物可结合碱性组合物(例如碳酸氢盐溶液)投予以中和胃的PH值。在一 些实施例中，碱性组合物可在肽组合物之前和/或之后投予。在一些实施例中，碱性组合物 可在投药之前与肽组合物组合，或与肽组合物同时服用。应了解，考虑到经口传递优于任何形式的注射，所以尤其期望口服途径。还应了 解，根据所有已知的流行性感冒疫苗迄今都是不经肠投予的事实，结果是令人意外的。根据 本文所述的免疫原性组合物中所包括的肽比当前流行性感冒疫苗中所用的标准蛋白质抗 原短得多的事实，能够通过经口传递诱发保护性反应尤其是出乎意外。实际上，长期以来所 属领域中对短肽用作免疫原与经口传递蛋白质疫苗两者存在着偏见。在一些实施例中，口服组合物包含一种或一种以上肽、胆汁盐体和佐剂。在一些实 施例中，佐剂为TLR-3激动剂。在一些实施例中，佐剂可与胆汁盐体混合。在一些实施例中， 佐剂可与胆汁盐体缔合(例如通过将佐剂与一种或一种以上肽和/或胆汁盐体组分在用以 产生胆汁盐体的过程中合并)。在一些实施例中，组合物经调配，用于例如通过注射等方式不经肠传递。在所述实 施例中，可例如通过静脉内、肌肉内、皮内或皮下或通过输注或无针注射技术投药。对于所 述不经肠投药，组合物以常规冻干组合物形式制备和维持，并在投药前用医药学上可接受 的盐水溶液(例如0.9%盐水溶液)复原。如所属领域中已知，可用例如甲烷磺酸等医药 学上可接受的酸调整可注射组合物的PH值。可采用的其它可接受的媒剂和溶剂包括林格 氏溶液(Ringer' s solution)和U. S. P。此外，无菌的不挥发性油常规用作溶剂或悬浮介 质。出于此目的，可采用包括合成单酸甘油酯或二酸甘油酯在内的任何无刺激性的不挥发 性油。此外，例如油酸等脂肪酸用于制备注射剂。可例如通过经过细菌截留过滤器过滤或 者通过并入杀菌剂，将可注射调配物杀菌，呈无菌固体组合物形式，这些无菌固体组合物可在临使用前溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中。在一些实施例中，不经肠组合物包含一种或一种以上肽、包含非离子型表面活性 剂的微脂粒和佐剂。在一些实施例中，佐剂为TLR-4激动剂。在一些实施例中，佐剂可与微 脂粒混合。在一些实施例中，佐剂可与微脂粒缔合(例如通过将佐剂与一种或一种以上肽 和/或微脂粒组分在用以产生微脂粒的过程中合并)。组合物也可以通过鼻内或通过吸入投予，且宜以干粉吸入物(dry powder inhaler)形式或在使用或不使用适合推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟 乙烷、氢氟烷、二氧化碳或其它适合的气体)下从加压容器、泵、喷雾器、雾化器或喷洒器产 生的气雾剂喷雾呈现形式传递。在加压气雾剂的状况下，单位剂量可通过提供阀传递计量 的量来确定。加压容器、泵、喷雾器、雾化器或喷洒器可含有抗体的溶液或悬浮液，所述溶液 或悬浮液例如使用乙醇与推进剂的混合物作为溶剂，且可另外含有润滑剂，例如脱水山梨 糖醇三油酸酯。用于吸入器或吹入器的胶囊及药筒(例如由明胶制成)可经调配，以含有 肽组合物与适合粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。供直肠投药的组合物优选是栓剂，其可通过将肽与适合的无刺激性赋形剂或载剂 (例如可可油、聚乙二醇或栓剂蜡)混合来制备，这些赋形剂或载剂在周围温度下是固体但 在体温下是液体，因此在直肠穹(rectal vault)中融化并释放抗体。如所属领域中已知， 也可使用保留灌肠和直肠导管。诸如羟丙基纤维素等粘度增强载剂也是供直肠投药的某些 本发明载剂，因为其有助于组合物保留在直肠内。一般说来，所选择的加入到组合物中的载 剂体积应使组合物最大程度地保留。明确地说，体积不应大到危及所投组合物保留在直肠 穹中。VII.示范性组合物在一些实施例中，本发明提供的免疫原性组合物包括TLR-3激动剂佐剂以及包含 非离子型表面活性剂和促进类脂质分子传输穿过粘膜的传输增强剂的微脂粒。在一些实施 例中，所述组合物可经口投予。在一些实施例中，TLR-3激动剂佐剂包含poly (I: C)。在一 些实施例中，传输增强剂为胆汁酸、其衍生物或任何前述物质的盐(例如脱氧胆酸钠)。在 一些实施例中，非离子型表面活性剂为甘油酯(例如1-单棕榈酰基甘油)。在一些实施例 中，微脂粒另外包含离子型两性分子(例如二鲸蜡基磷酸酯)。在一些实施例中，微脂粒另 外包含类固醇(例如胆固醇)。在一些实施例中，微脂粒包含1-单棕榈酰基甘油、二鲸蜡基 磷酸酯、胆固醇和脱氧胆酸钠。在一些实施例中，组合物另外包含明矾。在一些实施例中，本发明提供的免疫原性组合物包括TLR-4激动剂佐剂以及包含 非离子型表面活性剂的微脂粒。在一些实施例中，所述组合物可不经肠投予(例如通过肌 肉内注射)。在一些实施例中，TLR-4激动剂佐剂包含单磷酰基脂质A或3-脱酰基单磷酰 基脂质A。在一些实施例中，非离子型表面活性剂为甘油酯(例如1-单棕榈酰甘油)。在 一些实施例中，微脂粒另外包含离子型两性分子(例如二鲸蜡基磷酸酯)。在一些实施例 中，微脂粒另外包含类固醇(例如胆固醇)。在一些实施例中，微脂粒包含ι-单棕榈酰基甘 油、二鲸蜡基磷酸酯和胆固醇。在一些实施例中，组合物另外包含明矾。在一些实施例中，上述免疫原性组合物包括第一肽，其包含与SEQ ID NO. 16的 20-100个相邻氨基酸具有至少80%同源性的区域，其中第一肽包括来自A型流行性感冒血 凝素蛋白质的少于100个的相邻氨基酸；第二肽，其包含SEQ ID NO. 17的氨基酸序列；第三
31肽，其包含与SEQ ID NO. 18的位置2_49或68-121的至少20个相邻氨基酸具有至少80% 同源性的区域，其中第三肽包括来自B型流行性感冒血凝素蛋白质的少于100个的相邻氨 基酸；和第四肽，其包含SEQ ID NO. 14的氨基酸序列，其中第四肽包括来自A型流行性感冒 核蛋白的少于20个的相邻氨基酸。在一些实施例中，第一肽包含SEQ ID NO. 6的至少40个相邻氨基酸。在一些实施 例中，第一肽包含SEQ ID NO. 6的氨基酸1-88。在一些实施例中，第二肽包含SEQ ID NO. 11的氨基酸序列。在一实施例中，组合 物包含2n种各自包含SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中η = 1_4。在一 些实施例中，η = 4。在一些实施例中，第三肽包含与SEQ ID Ν0. 18的位置2_49或68-121的至少20个 相邻氨基酸具有至少90%同源性的区域。在一些实施例中，第三肽包含与SEQ ID N0. 18的 位置2-49的至少20个相邻氨基酸具有至少80%同源性的第一区域和与SEQ ID N0. 18的 位置68-121的至少20个相邻氨基酸具有至少80%同源性的第二区域。在一些实施例中， 组合物包含两种不同的第三肽，其中一者包含与SEQ ID N0. 18的位置2_49的至少20个相 邻氨基酸具有至少80%同源性的区域，而另一者包含与SEQ ID N0. 18的位置68-121的至 少20个相邻氨基酸具有至少80%同源性的区域。在一些实施例中，组合物包含两种不同的 第三肽，其中一者包含SEQ ID N0. 12的氨基酸序列，而另一者包含SEQ ID N0. 13的氨基酸 序列。在一些实施例中，组合物包含2n种各自包含SEQ ID N0. 14的不同氨基酸序列的 不同第四肽，其中η = 1-4。在一些实施例中，η = 4。在一些实施例中，第一肽包含SEQ ID Ν0. 6的氨基酸1_88 ；组合物包含2n种各自 包含SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中η = 4 ；组合物包含两种不同的 第三肽，其中一者包含SEQ ID Ν0. 12的氨基酸序列，而另一者包含SEQ ID N0. 13的氨基酸 序列；且组合物包含2m种各自包含SEQ ID N0. 14的不同氨基酸序列的不同第四肽，其中m =4。在一些实施例中，上述组合物用以治疗患季节性流行性感冒或处于季节性流行性 感冒风险中的个体。在一些实施例中，上述组合物用以治疗患有猪源性A(HlNl)型流行性感冒病毒所 引起的流行性感冒或处于此流行性感冒风险中的个体。实例以下实例描述制造和实践本文所述的某些组合物和方法的一些示范性方式。应了 解，所述实例仅仅是出于示范性的目的，且不欲限制本文所述的组合物和方法的范围。实例1:肽合成本文所述的所有肽都通过固相肽合成(SPPQ来合成。一般说来，C端氨基酸通过 与连接分子所形成的酸不稳定键连接于交联聚苯乙烯(或基于PEG)树脂。此树脂不溶于 合成所用的溶剂中，从而可相对简单且快速地冲洗掉过量的试剂和副产物。N端用在酸中稳 定，但可通过碱来除去的Fmoc基团保护。任何侧链官能团都用碱稳定而酸不稳定的基团保 护。合成接着是基于将Ν-α上经Fmoc保护的氨基酸并入生长肽链中，其中链的一端仍然 连接于固相。
32
以下为一种用以制造本文所述肽的示范性SPPS法。为开始各偶合，用含20%哌 啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)除去NovaPEG树脂结合的氨基酸/肽上的Fmoc基团。接 着清洗，并加入经保护的氨基酸，此氨基酸已在其α -羧基上经四氟硼酸2-(1Η-苯并三 唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲活化。使经活化的氨基酸和树脂结合的氨基酸在碱存在下 反应，形成新的肽键。虽然肽通过分步法合成，但诸如偶合试剂四氟硼酸2-(1Η-苯并三 唑-1-基)-1，1，3，3_四甲基脲(TBTU)、碱、二异丙基乙胺(DIPEA)和去阻断剂哌啶等所有 可溶性试剂都可通过在各偶合步骤结束时过滤和清洗，从肽-固体支撑基质中除去。重复 此过程，直到将所需的肽组装在树脂上为止。用含有至少85%三氟乙酸(TFA)的裂解溶液， 使肽从树脂上裂解并脱除肽的保护基后，通过从乙醚中沉淀，接着离心来收集粗肽。接着通 过HPLC和质谱分析纯化和表征肽。如本文所述，某些肽组合物可包括单个肽序列的多个变异体(例如在相同序列中 的2个或2个以上位置具有2个或2个以上不同氨基酸)。虽然指定组中的各变异体可个 别合成，但通常适宜在单一合成中合成变异体子集或整组变异体。举例来说，此可使用分 开-组合法实现。因此，如果此组变异体经设计以在指定位置包括两种不同氨基酸中的一 种，那么树脂可分成两个同等部分，且各部分可与两种氨基酸中的一种偶合，形成两种不同 的肽链。一旦偶合结束，即可将两个部分重新组合，以便后来的氨基酸可加入两链中。或者， 可使用一锅法，其中两个替代性氨基酸加入同一反应中。通常两种氨基酸以等摩尔量加入； 然而，在某些情况下(例如在其各别反应动力学差异显著的情况下)，优选非等摩尔量。接 着可使用凯撒茚三酮试验监测肽反应是否结束。实例2 竞争微量中和分析在本实例中，评估各种肽组合物结合流行性感冒中和抗体的能力。用伊斯科夫 改良杜尔贝科培养基(Iscove' s Modified Dulbecco' s Medium, IMDM)稀释不同的肽 组合物(参见图1和下表1-9)为SOyg/ml，且50μ1加入96孔平底微量滴定板(纳克 (Nunc))中的不同孔中。适当时，各肽组合物可包括所有变异体(例如表1中所示的8个 INF-HA-3-V3肽变异体、表4中的4个INF-H1-4-V4肽变异体等)。用IMDM以1/40稀释市 售抗流行性感冒血清和人类血清，且50 μ 1加入各孔中，接着培养板在37°C下培育1小时。 将50 μ 1含1 X IO5个pfu流行性感冒病毒株威斯康星(A/Wis/67/05)或新喀里多尼亚(A/ NC/20/99)的IMDM加入各孔中，且培养板在37°C下再培育1小时。随后，将5 X IO4个补充 有2%胎牛血清(FCS)的马丁达比狗肾(MDCK)细胞加入各孔中。每个培养板都含有4个 细胞和4个病毒对照孔。培养板在37°C下培育18-22小时。每孔用50 μ 1 70%乙醇固定 细胞10分钟，且在室温下空气干燥。用含有0. 05% Tween-20的PBS洗涤培养板5次，且 用10% FCS阻断各孔。在4°C下90分钟后，50 μ 1经阻断缓冲液以1/500稀释的针对A型 流行性感冒核衣壳抗原的单克隆抗体(凯美空(Chemicon))加入各孔中。在4°C下再培育 1小时后，洗涤培养板5次，且在4°C下将100μ 1山羊抗小鼠IgG过氧化酶结合的亲和力纯 化的抗体(1/10，000)加入各孔中，历时30分钟。洗涤培养板5次，且通过100 μ 1邻苯二 胺(0PD 密苏里州(MO)圣路易斯市(St. Louise)的西格玛(Sigma))显影，并在20分钟后 用INHCl停止酶反应。通过ELISA板式读数器(伯乐公司(Bio-Rad))在490nm波长下测 量0D，来定量反应。图1中展示关于包含表1、2、3、4、5、6、7、8和9中肽的组合物的结果。如图1中所示，市售或免疫血清的加入可抑制活体外细胞的流行性感冒病毒感染，可通过ELISA进行光学密度(OD)测量来定量。因此，在免疫血清存在下约0.6的OD值 (参见病毒对照)减少至约0. 2 (参见病毒+血清对照)。用血清培育各种肽组合物可使肽 结合于血清中所存在的一些中和抗体，从而逆转其中和活性(例如约0. 3或0. 3以上的OD 值)。表I-SEQ ID NO. 权利要求
1.一种免疫原性组合物，其包含第一肽，其包含与SEQ ID NO. 16的20-100个相邻氨基酸具有至少80%同源性的区域， 其中所述第一肽包括来自A型流行性感冒血凝素蛋白质的少于100个的相邻氨基酸； 第二肽，其包含SEQ ID NO. 17的氨基酸序列；和第三肽，其包含与SEQ ID NO. 18的位置2-49或68-121的至少20个相邻氨基酸具有至 少80%同源性的区域，其中所述第三肽包括来自B型流行性感冒血凝素蛋白质的少于100 个的相邻氨基酸。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一肽包含与SEQID NO. 16的20-100个 相邻氨基酸具有至少90%同源性的区域。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一肽包含与SEQID NO. 16的20-100个 相邻氨基酸具有至少95%同源性的区域。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一肽包含与SEQID N0. 16的20-50个相 邻氨基酸具有至少80%同源性的区域。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一肽包含与SEQID N0. 16的50-100个 相邻氨基酸具有至少80%同源性的区域。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一肽包含SEQID N0. 2的至少20个相邻 氨基酸。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一肽包含SEQID N0. 3的至少20个相邻氨基酸。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一肽包含SEQID N0. 4的至少20个相邻氨基酸。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一肽包含SEQID N0. 5的至少20个相邻氨基酸。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含2n种各自包含SEQID N0. 2 的不同氨基酸序列的不同第一肽，其中η = 1-3。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含2η种各自包含SEQID Ν0. 3 的不同氨基酸序列的不同第一肽，其中η = 1-3。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含2η种各自包含SEQID Ν0. 4 的不同氨基酸序列的不同第一肽，其中η = 1-2。
13.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含2η种各自包含SEQID Ν0. 5 的不同氨基酸序列的不同第一肽，其中η = 1-3。
14.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一肽包含SEQID Ν0. 6的至少40个相 邻氨基酸。
15.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一肽包含SEQID N0. 6的至少60个相邻氨基酸。
16.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一肽包含SEQID N0. 6的至少80个相邻氨基酸。
17.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一肽包含SEQID N0. 6的氨基酸1-81。
18.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一肽包含SEQID N0. 6的氨基酸82-88。
19.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一肽包含SEQID NO. 6的氨基酸1-88。
20.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一肽包含少于100个的氨基酸。
21.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第二肽包含SEQID NO. 9的氨基酸序列。
22.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第二肽包含SEQID NO. 10的氨基酸序列。
23.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第二肽包含SEQID NO. 11的氨基酸序列。
24.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含2n种各自包含SEQID NO. 9 的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中η = 1-4。
25.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含2η种各自包含SEQID NO. 10 的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中η = 1-4。
26.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含2η种各自包含SEQID NO. 11 的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中η = 1-4。
27.根据权利要求M至沈中任一权利要求所述的组合物，其中η= 4。
28.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第二肽包含少于30个的氨基酸。
29.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第三肽包含与SEQID Ν0. 18的位置2_49 或68-121的至少20个相邻氨基酸具有至少90%同源性的区域。
30.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第三肽包含与SEQID N0. 18的位置2_49 或68-121的至少40个相邻氨基酸具有至少80%同源性的区域。
31.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第三肽包含与SEQID N0. 18的位置2_49 的至少20个相邻氨基酸具有至少80%同源性的第一区域和与SEQ ID N0. 18的位置68-121 的至少20个相邻氨基酸具有至少80%同源性的第二区域。
32.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第三肽包含与SEQID N0. 8具有至少80% 同源性的区域。
33.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第三肽包含与SEQID N0. 8具有至少90% 同源性的区域。
34.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第三肽包含与SEQID N0. 8具有至少95% 同源性的区域。
35.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含两种不同的第三肽，其中一者 包含与SEQ ID N0. 18的位置2_49的至少20个相邻氨基酸具有至少80%同源性的区域，而 另一者包含与SEQ ID N0. 18的位置68-121的至少20个相邻氨基酸具有至少80%同源性 的区域。
36.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第三肽包含少于100个的氨基酸。
37.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物另外包含第四肽，其包含SEQ ID N0. 14的氨基酸序列，其中所述第四肽包括来自A型流行性感 冒核蛋白的少于20个的相邻氨基酸。
38.根据权利要求37所述的组合物，其中所述组合物包含2n种各自包含SEQID N0. 14 的不同氨基酸序列的不同第四肽，其中η = 1-4。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中η= 4。
40.根据权利要求37所述的组合物，其中所述第四肽包含少于30个的氨基酸。
41.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物另外包含第四肽，其包含SEQ ID NO. 15的氨基酸序列，其中所述第四肽包括来自A型流行性感 冒核蛋白的少于20个的相邻氨基酸。
42.根据权利要求41所述的组合物，其中所述组合物包含2n种各自包含SEQID NO. 15 的不同氨基酸序列的不同第四肽，其中η = 1-4。
43.根据权利要求42所述的组合物，其中η= 4。
44.根据权利要求41所述的组合物，其中所述第四肽包含少于30个的氨基酸。
45.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一肽包含与SEQID NO. 6具有至少80% 同源性的区域，所述第三肽包含与SEQ ID NO. 8具有至少80%同源性的区域，且所述组合物 包含2n种各自包含SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中η = 1_4。
46.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一肽包含与SEQID Ν0. 6具有至少90% 同源性的区域，所述第三肽包含与SEQ ID N0. 8具有至少90%同源性的区域，且所述组合物 包含2n种各自包含SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中η = 1_4。
47.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一肽包含与SEQID Ν0. 6具有至少95% 同源性的区域，所述第三肽包含与SEQ ID N0. 8具有至少95%同源性的区域，且所述组合物 包含2n种各自包含SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中η = 1_4。
48.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一肽包含SEQID Ν0. 6，所述第三肽包 含SEQ ID N0. 8，且所述组合物包含2n种各自包含SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列的不同 第二肽，其中η = 1-4。
49.根据权利要求45至48中任一权利要求所述的组合物，其中η= 4。
50.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一肽基本上由SEQID Ν0. 6组成，所述 第三肽基本上由SEQ ID N0. 8组成，且所述组合物包含2"种各自基本上由SEQID NO. 11的 不同氨基酸序列组成的不同第二肽，其中η = 1-4。
51.根据权利要求50所述的组合物，其中所述组合物另外包含2m种各自包含SEQ IDN0. 14的不同氨基酸序列的不同第四肽，其中m = 1_4。
52.根据权利要求51所述的组合物，其中η和/或m= 2。
53.根据权利要求51所述的组合物，其中η和/或m= 3。
54.根据权利要求51所述的组合物，其中η和/或m= 4。
55.根据前述权利要求中任一权利要求所述的组合物，其中每个肽都具有免疫原性。
56.根据前述权利要求中任一权利要求所述的组合物，其中至少一种肽另外包含具有 20个或20个以上来自非流行性感冒蛋白质的相邻氨基酸的区域。
57.根据前述权利要求中任一权利要求所述的组合物，其中每个肽都另外包含具有20 个或20个以上来自非流行性感冒蛋白质的相邻氨基酸的区域。
58.根据前述权利要求中任一权利要求所述的组合物，其中至少两种肽存在于单个蛋 白质内。
59.根据前述权利要求中任一权利要求所述的组合物，其中所述第一肽和所述第三肽 包含少于100个的氨基酸，且所述第二肽包含少于30个的氨基酸。
60.根据前述权利要求中任一权利要求所述的组合物，其中所述组合物另外包含佐剂。
61.根据前述权利要求中任一权利要求所述的组合物，其中所述佐剂为明矾(alum)。
62.根据前述权利要求中任一权利要求所述的组合物，其中所述佐剂为具有佐剂活性的免疫活性皂苷部分，其来源于南美树木智利皂荚树(Quillaja Saponaria Molina)的树 皮。
63.根据前述权利要求中任一权利要求所述的组合物，其中所述佐剂为TLR-3激动剂。
64.根据权利要求63所述的组合物，其中所述佐剂为聚核糖肌苷酸聚核糖胞苷酸。
65.根据前述权利要求中任一权利要求所述的组合物，其中所述佐剂为TLR-4激动剂。
66.根据权利要求65所述的组合物，其中所述佐剂含有单磷酰基脂质A或3-脱酰基单 磷酰基脂质A。
67.根据前述权利要求中任一权利要求所述的组合物，其中所述佐剂为TLR-7/8激动剂。
68.根据权利要求67所述的组合物，其中所述佐剂为1-异丁基-IH-咪唑并[4，5-c] 喹啉-4-胺。
69.根据前述权利要求中任一权利要求所述的组合物，其中至少一种肽与微脂粒缔合。
70.根据权利要求69所述的组合物，其中所述微脂粒包含非离子型表面活性剂。
71.根据权利要求70所述的组合物，其中所述微脂粒包含甘油酯。
72.根据权利要求70所述的组合物，其中所述微脂粒包含二醇或甘油醚。
73.根据权利要求70所述的组合物，其中所述微脂粒包含促进类脂质分子传输穿过粘 膜的传输增强剂。
74.根据权利要求73所述的组合物，其中所述微脂粒包含侧链的C23碳原子携带羧酸 的胆固醇衍生物。
75.根据权利要求73所述的组合物，其中所述微脂粒包含胆酸、鹅脱氧胆酸或其盐。
76.根据权利要求73所述的组合物，其中所述微脂粒包含甘氨胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆 酸、熊脱氧胆酸或其盐。
77.根据权利要求73所述的组合物，其中所述微脂粒包含酰氧化氨基酸或其盐。
78.根据权利要求73所述的组合物，其中所述微脂粒包含含有C6_2(l烷酰基或烯酰基部 分的酰基肉碱或其盐。
79.根据权利要求73所述的组合物，其中所述微脂粒包含离子型表面活性剂。
80.根据权利要求73所述的组合物，其中所述微脂粒包含链烷酸或链烯酸。
81.根据权利要求73所述的组合物，其中所述微脂粒包含磷酸酯。
82.根据权利要求73所述的组合物，其中所述微脂粒包含二鲸蜡基磷酸酯、磷脂酸或 磷脂酰丝氨酸。
83.根据权利要求73所述的组合物，其中所述微脂粒包含硫酸单酯。
84.根据权利要求73所述的组合物，其中所述微脂粒包含鲸蜡基硫酸酯。
85.根据权利要求73所述的组合物，其中所述微脂粒包含类固醇。
86.根据权利要求73所述的组合物，其中所述微脂粒包含胆固醇。
87.根据权利要求73所述的组合物，其中所述微脂粒的直径在约IOnm至约IOym范围内。
88.根据权利要求73所述的组合物，其中所述微脂粒的直径在约SOOnm至约1.5μπι范 围内。
89.根据权利要求73所述的组合物，其中至少一种肽囊封在所述微脂粒的水性核心内。
90.一种免疫原性组合物，其包含包括与SEQ ID NO. 16的20-100个相邻氨基酸具有至 少80%同源性的区域的肽，其中所述肽包括来自A型流行性感冒血凝素蛋白质的少于100 个的相邻氨基酸。
91.根据权利要求90所述的组合物，其中所述肽包含SEQID NO. 2的至少20个相邻氨基酸。
92.根据权利要求90所述的组合物，其中所述肽包含SEQID NO. 3的至少20个相邻氨基酸。
93.根据权利要求90所述的组合物，其中所述肽包含SEQID NO. 4的至少20个相邻氨基酸。
94.根据权利要求90所述的组合物，其中所述肽包含SEQID NO. 5的至少20个相邻氨基酸。
95.根据权利要求90所述的组合物，其中所述组合物包含2n种各自包含SEQID N0. 2 的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1-3。
96.根据权利要求90所述的组合物，其中所述组合物包含2η种各自包含SEQID Ν0. 3 的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1-3。
97.根据权利要求90所述的组合物，其中所述组合物包含2η种各自包含SEQID Ν0. 4 的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1-2。
98.根据权利要求90所述的组合物，其中所述组合物包含2η种各自包含SEQID Ν0. 5 的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1-3。
99.根据权利要求90所述的组合物，其中所述肽包含SEQID Ν0. 6的至少40个相邻氨 基酸。
100.根据权利要求90所述的组合物，其中所述肽包含SEQID N0. 6的至少60个相邻氨基酸。
101.根据权利要求90所述的组合物，其中所述肽包含SEQID N0. 6的至少80个相邻氨基酸。
102.根据权利要求90所述的组合物，其中所述肽包含与SEQID N0. 6具有至少90% 同源性的区域。
103.根据权利要求90所述的组合物，其中所述肽包含与SEQID N0. 6具有至少95% 同源性的区域。
104.根据权利要求90所述的组合物，其中所述肽包含SEQID N0. 6的氨基酸1_81。
105.根据权利要求90所述的组合物，其中所述肽包含SEQID N0. 6的氨基酸82-88。
106.根据权利要求90所述的组合物，其中所述肽包含SEQID N0. 6。
107.根据权利要求90所述的组合物，其中所述肽基本上由SEQID N0. 6组成。
108.根据权利要求90所述的组合物，其中所述肽由SEQID N0. 6组成。
109.根据权利要求90所述的组合物，其中所述肽包含少于30个的氨基酸。
110.一种免疫原性组合物，其包含包括SEQ ID N0. 17的氨基酸序列的肽。
111.根据权利要求110所述的组合物，其中所述肽包含SEQID N0. 9的氨基酸序列。
112.根据权利要求110所述的组合物，其中所述肽包含SEQID NO. 10的氨基酸序列。
113.根据权利要求110所述的组合物，其中所述肽包含SEQID NO. 11的氨基酸序列。
114.根据权利要求110所述的组合物，其中所述组合物包含2n种各自包含SEQID NO. 9的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1-4。
115.根据权利要求110所述的组合物，其中所述组合物包含2η种各自包含SEQID NO. 10的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1-4。
116.根据权利要求110所述的组合物，其中所述组合物包含2η种各自包含SEQID NO. 11的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1-4。
117.根据权利要求116所述的组合物，其中所述组合物包含2"种各自基本上由SEQID NO. 11的不同氨基酸序列组成的不同肽。
118.根据权利要求114至117中任一权利要求所述的组合物，其中η= 4。
119.根据权利要求110所述的组合物，其中所述肽包含少于30个的氨基酸。
120.一种免疫原性组合物，其包含包括与SEQ ID Ν0. 18的位置2_49或68-121的至少 20个相邻氨基酸具有至少80%同源性的区域的肽，其中所述肽包括来自B型流行性感冒血 凝素蛋白质的少于100个的相邻氨基酸。
121.根据权利要求120所述的组合物，其中所述肽包含与SEQID N0. 18的位置2_49 或68-121的至少20个相邻氨基酸具有至少90%同源性的区域。
122.根据权利要求120所述的组合物，其中所述肽包含与SEQID N0. 18的位置2_49 或68-121的至少40个相邻氨基酸具有至少80%同源性的区域。
123.根据权利要求120所述的组合物，其中所述肽包含与SEQID N0. 18的位置2_49 的至少20个相邻氨基酸具有至少80%同源性的第一区域和与SEQ ID N0. 18的位置68-121 的至少20个相邻氨基酸具有至少80%同源性的第二区域。
124.根据权利要求120所述的组合物，其中所述肽包含与SEQID N0. 8具有至少80% 同源性的区域。
125.根据权利要求120所述的组合物，其中所述肽包含与SEQID N0. 8具有至少90% 同源性的区域。
126.根据权利要求120所述的组合物，其中所述肽包含与SEQID N0. 8具有至少95% 同源性的区域。
127.根据权利要求120所述的组合物，其中所述肽包含SEQID N0. 8。
128.根据权利要求120所述的组合物，其中所述肽基本上由SEQID N0. 8组成。
129.根据权利要求120所述的组合物，其中所述肽由SEQID N0. 8组成。
130.根据权利要求120所述的组合物，其中所述肽包含与SEQID N0. 18的位置2_49 的至少20个相邻氨基酸具有至少80%同源性的区域，且所述组合物另外包含包括与SEQ ID N0. 18的位置68-121的至少20个相邻氨基酸具有至少80%同源性的区域的不同肽。
131.根据权利要求120所述的组合物，其中所述肽包含少于100个的氨基酸。
132.—种免疫原性组合物，其包含包括SEQ ID N0. 14的氨基酸序列的肽，其中所述肽 包括来自A型流行性感冒核蛋白的少于20个的相邻氨基酸。
133.根据权利要求132所述的组合物，其中所述组合物包含2n种各自包含SEQID N0. 14的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1-4。
134.根据权利要求133所述的组合物，其中η= 4。
135.根据权利要求132所述的组合物，其中所述肽包含少于30个的氨基酸。
136.一种免疫原性组合物，其包含包括SEQ ID NO. 15的氨基酸序列的肽，其中所述肽 包括来自A型流行性感冒核蛋白的少于20个的相邻氨基酸。
137.根据权利要求136所述的组合物，其中所述组合物包含2n种各自包含SEQID NO. 15的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1-4。
138.根据权利要求137所述的组合物，其中η= 4。
139.根据权利要求136所述的组合物，其中所述肽包含少于30个的氨基酸。
140.—种免疫原性组合物，其包含包括SEQ ID NO. 1的氨基酸序列的肽。
141.根据权利要求140所述的组合物，其中所述组合物包含2n种各自包含SEQID NO. 1的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1-4。
142.根据权利要求141所述的组合物，其中η= 4。
143.根据权利要求140所述的组合物，其中所述肽包含少于30个的氨基酸。
144.一种免疫原性组合物，其包含包括与SEQ ID NO. 7的至少20个相邻氨基酸具有至 少80%同源性的区域的肽，其中所述肽包括来自A型流行性感冒血凝素蛋白质的少于100 个的相邻氨基酸。
145.根据权利要求144所述的组合物，其中所述区域与SEQID N0. 7的区域具有至少 90%同源性。
146.根据权利要求144所述的组合物，其中所述区域与SEQID N0. 7的区域具有至少 95%同源性。
147.根据权利要求144所述的组合物，其中所述肽包含SEQID N0. 7的至少40个相邻氨基酸。
148.根据权利要求144所述的组合物，其中所述肽包含SEQID N0. 7的至少60个相邻氨基酸。
149.根据权利要求144所述的组合物，其中所述肽包含SEQID N0. 7的至少80个相邻氨基酸。
150.根据权利要求144所述的组合物，其中所述肽包含SEQID N0. 7。
151.根据权利要求144所述的组合物，其中所述肽基本上由SEQID N0. 7组成。
152.根据权利要求144所述的组合物，其中所述肽由SEQID N0. 7组成。
153.根据权利要求144所述的组合物，其中所述肽包含少于100个的氨基酸。
154.一种治疗患流行性感冒或处于流行性感冒风险中的个体的方法，所述方法包含向 所述个体投予治疗有效量的根据前述权利要求中任一权利要求所述的组合物。
155.根据权利要求巧4所述的组合物，其中所述组合物经口投予。
156.根据权利要求IM所述的组合物，其中所述组合物不经肠投予。
157.根据权利要求IM所述的组合物，其中所述组合物通过肌肉内注射投予。
158.根据权利要求IM所述的组合物，其中所述组合物经鼻内或通过吸入投予。
159.根据权利要求IM所述的组合物，其中所述组合物经直肠投予。
160.根据权利要求IM所述的组合物，其中所述个体患季节性流行性感冒或处于季节 性流行性感冒风险中。
161.根据权利要求IM所述的组合物，其中所述个体患有猪源性A(HlNl)型流行性感冒病毒所引起的流行性感冒或处于所述流行性感冒风险中。
162.一种免疫原性组合物，其包含TLR-3激动剂佐剂；微脂粒，其包含非离子型表面活性剂和促进类脂质分子传输穿过粘膜的传输增强剂；第一肽，其包含与SEQ ID NO. 16的20-100个相邻氨基酸具有至少80%同源性的区域， 其中所述第一肽包括来自A型流行性感冒血凝素蛋白质的少于100个的相邻氨基酸；第二肽，其包含SEQ ID NO. 17的氨基酸序列；第三肽，其包含与SEQ ID NO. 18的位置2-49或68-121的至少20个相邻氨基酸具有至 少80%同源性的区域，其中所述第三肽包括来自B型流行性感冒血凝素蛋白质的少于100 个的相邻氨基酸；和第四肽，其包含SEQ ID NO. 14的氨基酸序列，其中所述第四肽包括来自A型流行性感 冒核蛋白的少于20个的相邻氨基酸。
163.根据权利要求162所述的组合物，其中所述TLR-3激动剂佐剂包含poly(I:C)。
164.根据权利要求162至163中任一权利要求所述的组合物，其中所述传输增强剂为 胆汁酸、其衍生物或任何前述物质的盐。
165.根据权利要求164所述的组合物，其中所述传输增强剂为脱氧胆酸钠。
166.根据权利要求162至165中任一权利要求所述的组合物，其中所述非离子型表面 活性剂为甘油酯。
167.根据权利要求166所述的组合物，其中所述非离子型表面活性剂为1-单棕榈酰基 甘油。
168.根据权利要求162至167中任一权利要求所述的组合物，其中所述微脂粒另外包 含离子型两性分子。
169.根据权利要求168所述的组合物，其中所述离子型两性分子为二鲸蜡基磷酸酯。
170.根据权利要求162至169中任一权利要求所述的组合物，其中所述微脂粒另外包含类固醇。
171.根据权利要求170所述的组合物，其中所述类固醇为胆固醇。
172.根据权利要求162所述的组合物，其中所述微脂粒包含1-单棕榈酰基甘油、二鲸 蜡基磷酸酯、胆固醇和脱氧胆酸钠。
173.根据权利要求162至172中任一权利要求所述的组合物，其中所述组合物另外包 含明矾。
174.一种治疗患流行性感冒或处于流行性感冒风险中的个体的方法，所述方法包含向 所述个体经口投予治疗有效量的根据权利要求162至173中任一权利要求所述的组合物。
175.一种免疫原性组合物，其包含TLR-4激动剂佐剂；微脂粒，其包含非离子型表面活性剂；第一肽，其包含与SEQ ID NO. 16的20-100个相邻氨基酸具有至少80%同源性的区域， 其中所述第一肽包括来自A型流行性感冒血凝素蛋白质的少于100个的相邻氨基酸；第二肽，其包含SEQ ID N0. 17的氨基酸序列；第三肽，其包含与SEQ ID N0. 18的位置2-49或68-121的至少20个相邻氨基酸具有至少80%同源性的区域，其中所述第三肽包括来自B型流行性感冒血凝素蛋白质的少于100 个的相邻氨基酸；和第四肽，其包含SEQ ID NO. 14的氨基酸序列，其中所述第四肽包括来自A型流行性感 冒核蛋白的少于20个的相邻氨基酸。
176.根据权利要求175所述的组合物，其中所述TLR-4激动剂佐剂包含单磷酰基脂质 A或3-脱酰基单磷酰基脂质A。
177.根据权利要求175至176中任一权利要求所述的组合物，其中所述非离子型表面 活性剂为甘油酯。
178.根据权利要求177所述的组合物，其中所述非离子型表面活性剂为1-单棕榈酰基 甘油。
179.根据权利要求175至178中任一权利要求所述的组合物，其中所述微脂粒另外包 含离子型两性分子。
180.根据权利要求179所述的组合物，其中所述离子型两性分子为二鲸蜡基磷酸酯。
181.根据权利要求175至180中任一权利要求所述的组合物，其中所述微脂粒另外包含类固醇。
182.根据权利要求181所述的组合物，其中所述类固醇为胆固醇。
183.根据权利要求175所述的组合物，其中所述微脂粒包含1-单棕榈酰基甘油、二鲸 蜡基磷酸酯、胆固醇和脱氧胆酸钠。
184.根据权利要求175至183中任一权利要求所述的组合物，其中所述组合物另外包 含明矾。
185.—种治疗患有流行性感冒或处于流行性感冒风险中的个体的方法，所述方法包含 向所述个体不经肠投予治疗有效量的根据权利要求175至184中任一权利要求所述的组合 物。
186.根据权利要求185所述的组合物，其中所述组合物通过肌肉内注射投予。
187.根据权利要求162至173或175至184中任一权利要求所述的组合物，其中所述 第一肽包含SEQ ID NO. 6的至少40个相邻氨基酸。
188.根据权利要求162至173或175至184中任一权利要求所述的组合物，其中所述 第一肽包含SEQ ID NO. 6的氨基酸1-88。
189.根据权利要求162至173或175至184中任一权利要求所述的组合物，其中所述 第二肽包含SEQ ID NO. 11的氨基酸序列。
190.根据权利要求162至173或175至184中任一权利要求所述的组合物，其中所述 组合物包含2n种各自包含SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中η = 1_4。
191.根据权利要求190所述的组合物，其中η= 4。
192.根据权利要求162至173或175至184中任一权利要求所述的组合物，其中所述 第三肽包含与SEQ ID Ν0. 18的位置2_49或68-121的至少20个相邻氨基酸具有至少90% 同源性的区域。
193.根据权利要求162至173或175至184中任一权利要求所述的组合物，其中所述 第三肽包含与SEQ ID N0. 18的位置2_49的至少20个相邻氨基酸具有至少80%同源性的 第一区域和与SEQ ID N0. 18的位置68-121的至少20个相邻氨基酸具有至少80%同源性的第二区域。
194.根据权利要求162至173或175至184中任一权利要求所述的组合物，其中所述 组合物包含两种不同的第三肽，其中一者包含与SEQ ID NO. 18的位置2_49的至少20个相 邻氨基酸具有至少80%同源性的区域，而另一者包含与SEQ ID NO. 18的位置68-121的至 少20个相邻氨基酸具有至少80%同源性的区域。
195.根据权利要求162至173或175至184中任一权利要求所述的组合物，其中所述 组合物包含两种不同的第三肽，其中一者包含SEQ ID NO. 12的氨基酸序列，而另一者包含 SEQ ID NO. 13的氨基酸序列。
196.根据权利要求162至173或175至184中任一权利要求所述的组合物，其中所述 组合物包含2n种各自包含SEQ ID NO. 14的不同氨基酸序列的不同第四肽，其中η = 1_4。
197.根据权利要求196所述的组合物，其中η= 4。
198.根据权利要求162至173或175至184中任一权利要求所述的组合物，其中所述第一肽包含SEQ ID Ν0. 6的氨基酸1-88 ；所述组合物包含2n种各自包含SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中η =4 ；所述组合物包含两种不同的第三肽，其中一者包含SEQ ID Ν0. 12的氨基酸序列，而另 一者包含SEQ ID N0. 13的氨基酸序列；且所述组合物包含2m种各自包含SEQ ID N0. 14的不同氨基酸序列的不同第四肽，其中m =4。
全文摘要
本申请案提供可用于治疗流行性感冒的组合物和方法。如本文所述，所述组合物和方法是基于对流行性感冒显示免疫原性的肽和肽组合的研制。在一些实施例中，所述肽组合诱发针对多个流行性感冒病毒株(例如季节性流行性感冒病毒株或甚至新的猪源性A(H1N1)型大流行性感冒病毒)的保护性反应。
文档编号A61K38/03GK102123724SQ200980132130
公开日2011年7月13日 申请日期2009年6月19日 优先权日2008年6月19日
发明者乔斯·V·托里斯, 安德烈·奥格雷尔, 弗朗西斯科·迪亚兹-米托马, 戴维·E·安德森 申请人:变异生技公司