治疗的制作方法

专利名称：治疗的制作方法
治疗本发明涉及以炎性成分为特征之病症的治疗，特别是用来源于可食用植物的提取物和可来源于这些植物的活性剂的治疗。许多医学病症的特征为具有炎性成分，其可表现为白细胞、血小板或内皮细胞不适当地分泌炎症介质(例如高毒性活性氧中间体(reactive oxygen intermediate, ROI) 或颗粒酶或细胞因子)进入受影响组织中。炎症是有助于许多癌症(例如肠癌、前列腺癌和白血病)的发展和病变的主要因素，并且其是糖尿病(1型和2型)和动脉粥样硬化疾病的特征。具有炎症特征的其它病症的实例包括但不限于炎性肠病(IBD)、类风湿性关节炎 (RA)、贝切特氏病、ANCA相关性血管炎、系统性血管炎、囊性纤维化、哮喘、皮炎和银屑病。炎性肠病(IBD)是用于描述胃肠道的特发性慢性炎症的术语，其包括两种主要表型克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)。克罗恩病的特征是肉芽肿性炎症，其影响胃肠道的任何部分，尤其是回盲区。溃疡性结肠炎是结肠特异性的，并且伴有广泛的上皮损伤、隐窝脓肿和大量的粘膜嗜中性粒细胞。患有广泛UC或结肠克罗恩病的患者发生结肠直肠癌的风险增加约10倍，结肠直肠癌代表IBD相关死亡的主要原因。考虑到IBD的使人虚弱的性质，以及与IBD相关的死亡，需要提供这些病症的新的和改进的治疗。作为其它实例，类风湿性关节炎(RA)是一种特征为关节滑膜发炎的炎性病症，关节滑膜发炎导致组织损伤，并最终导致关节破坏。减少炎性损伤的能力是有吸引力的。然而，目前对于RA的治疗无论是在充分抑制疾病活性的能力方面还是在其不可接受的副作用方面都是不够的。当今的治疗可以认为是传统(常规)治疗和生物治疗。“传统”药物一般而言是意外发现的，其中发现为完全不同的病症而研发的药物对于RA也有益。生物治疗剂的生产昂贵，并且生物制品的生产能力不能满足需要。异硫氰酸酯(ITC)是来源于植物的有机分子，其包含化学基团N = C = S。ITC是通过用硫替代异氰酸酯基中的氧而形成的。异硫氰酸烯丙酯是ITC的一个实例，其发现于芥子油中，决定了芥子油的辛辣味。芸苔属(Brassica)植物可富含ITC。例如，花椰菜在其小花中积聚4_甲基亚磺酰基丁基和3-甲基亚磺酰基丙基葡糖异硫氰酸酯。这些葡糖异硫氰酸酯分别在组织损伤后被植物硫葡糖苷酶(“黑芥子酶”，myrosinase)转化为ITC 莱菔硫烷(sulforaphane，SF)、 芥酸精(erucin，ER)和iberin (IB)，或者，如果该黑芥子酶已在冷冻之前通过烹煮或漂白而变性，则通过已摄入所述植物的对象结肠中的微生物硫葡糖苷酶进行上述转化(参见图 1)。SF和IB被肠细胞被动吸收，与谷胱甘肽缀合，并经由巯基尿酸途径被转运至体循环进行代谢，主要作为N-乙酰半胱氨酸缀合物在尿中排泄。在摄入花椰菜之后，血浆中45%的 SF作为游离SF存在而不是硫醇缀合物，SF及其硫醇缀合物的峰浓度低于2 μ Μ,在几小时内下降至低(ηΜ)水平。ITC(比如异硫氰酸苯乙基酯(PEITC)和SF)已经显示出抑制癌发生和肿瘤发生， 因此可用作对抗癌症发生和增殖的化学预防剂。它们可以在多种水平上起作用。最值得注意的是，它们已经显示出通过抑制细胞色素Ρ450酶来抑制癌发生，细胞色素Ρ450酶将化合物(如苯并[a]芘及其它多环芳烃(PAH))氧化成极性更高的环氧二醇，其随后可引起突变和诱导癌症发生。在某些癌细胞系中，PEITC还显示出诱导凋亡，并且在某些情况下，甚至能够诱导对某些目前使用的化疗药物有抗性的细胞发生凋亡。仍需要开发可用于预防或治疗具有炎性成分的医学病症的新的和改进的组合物， 满足这一需要是本发明的一个目的。根据本发明的第一个方面，提供了一种用于预防或治疗以具有炎性成分为特征的医学病症的组合物，其包含治疗有效量的异硫氰酸酯(ITC)或其前体。根据本发明的第二个方面，提供了治疗有效量的异硫氰酸酯(ITC)或其前体，用作用于预防或治疗以具有炎性成分为特征的医学病症的药物。根据本发明的第三个方面，提供了一种用于治疗以具有炎性成分为特征的医学病症的方法，包括向需要此治疗的对象施用治疗有效量的ITC或其前体。“以具有炎性成分为特征的医学病症”意指至少部分特征为不适当地分泌炎症介质(例如高毒性活性氧中间体(ROI)或颗粒酶或细胞因子)的任何医学病症。这些病症的实例包括但不限于炎性肠病(IBD)、类风湿性关节炎(RA)、贝切特氏病、ANCA相关性血管炎、系统性血管炎、囊性纤维化病、哮喘、皮炎和银屑病。炎症也是有助于许多癌症的发生和病变的主要因素。因此，具有炎性成分的癌症(例如，肠癌、前列腺癌和白血病)也包括在所述医学病症的定义之内。炎症也是糖尿病(1型和2型)和动脉粥样硬化疾病的特征，这些病症也涵盖在所述术语中。“异硫氰酸酯(ITC)，，意指包含化学基团N = C = S的可来源于植物的有机分子。 ITC是通过用硫替代异氰酸酯基中的氧而形成的。“ITC”还包括可容易地代谢而形成ITC 的葡糖异硫氰酸酯前体。优选的ITC可来源于芸苔(例如花椰菜或芝麻菜(rocket))，包括莱菔硫烷(SF)Uberin(IB)和芥酸精(ER，4_甲基硫丁基异硫氰酸酯)。优选的ITC (比如 SF和IB)不具有与某些饮食性ITC (例如来自芥菜的异硫氰酸烯丙酯)相关的刺激性味觉性质。“其前体”意指可以由植物天然产生的植物化学物质，其可以转化为活性ITC。特别地，我们意指可以在芸苔(比如芝麻菜或花椰菜)中发现的葡糖异硫氰酸酯和葡糖异硫氰酸酯衍生物(例如葡糖异硫氰酸酯的吲哚衍生物)，其可以被植物硫葡糖苷酶(例如在植物组织损伤后)或已摄入了包含所述前体之组合物的对象结肠中的微生物硫葡糖苷酶转化为ITCoITC的来源应当理解，根据本发明使用的ITC可以是化学合成的，或者可以来源于任何天然或非天然(例如遗传修饰的微生物或细胞系)来源。然而，根据本发明的一个优选实施方案，所述ITC或其前体来源于植物，优选十字花科(Brassicaceae)或山柑科(Capparaceae)的植物。优选地，所述ITC可来源于芸苔属 (Brassica)植物，更优选地，所述ITC来源于芥菜、花椰菜或芝麻菜。最优选地，所述ITC可来源于芝麻菜(例如Eruca和Diplotaxis spp)。应当理解，当ITC来源于芸苔时，可以从植物中分离并纯化该化合物。在某些情况下(例如当活性ITC需要药物级纯度时)，这样的纯化可能是所期望的。然而，在许多情况下，比如在食品、饮料或营养品中，制备富含ITC的植物提取物可能是优选的。植物提取物代表本发明的一个重要实施方案，根据本发明的第四个方面，提供了一种用于预防或治疗以具有炎性成分为特征的医学病症的植物提取物，其中所述植物提取物富含ITC或其前体。根据本发明的第五个方面，提供了富含ITC或其前体的植物提取物，用作用于预防或治疗以具有炎性成分为特征的医学病症的药物。根据本发明的第六个方面，提供了一种用于预防或治疗以具有炎性成分为特征的医学病症的方法，包括向需要此预防或治疗的对象施用治疗有效量的富含ITC或其前体的植物提取物。“富含ITC的植物提取物”意指植物已经过处理，从而使ITC和其前体在所述提取物中保持活性形式。可以将所述植物进行处理，使得与未处理的植物中的浓度相比，提取物中ITC的浓度升高。或者，所述提取物可以包含基本上为活性的ITC或其前体，其浓度可以与未处理的植物中的约相同(或者如果进行了实质性稀释，则其浓度甚至更低)。尽管我们不希望受到任何假说的束缚，但是基于对这一科学领域的理解，特别是考虑到实施例1中的研究工作，本发明人认为本发明的化合物、提取物和组合物可用于治疗和预防以具有炎性成分为特征的医学病症。发明人证实了 ITC与细胞因子结合；促进抗炎信号传导通路(例如Smad活化)；和减少促炎细胞因子IL-6的表达。这证实了 ITC及其前体、以及富含ITC和/或其前体的植物提取物可用于调节本发明的病症。富含ITC的棺物提取物的制备优选地，所述富含ITC的植物提取物是基于十字花科或山柑科的植物(包含葡糖异硫氰酸酯的植物)。优选地，所述植物提取物来自十字花科芸苔属。优选的提取物来源于植物比如芥菜、花椰菜或芝麻菜。最优选地，所述植物提取物为芝麻菜(例如Eruca和Diplotaxis spp)提取物。应当理解，可以通过压碎植物叶、茎或种子(优选地在最高25°C的温度下)来制备植物粗提取物。然后，可以在水溶液中将压碎的叶勻浆，以形成本发明的液体植物提取物。 可以通过离心使植物固体沉淀，并且可以使用上清液(包含ITC)作为本发明的提取物。优选地，从来自幼小植物(例如观-42天的芝麻菜植物)和/或幼苗(例如至多 14天的芝麻菜植物)的鲜叶制备所述植物提取物。包含ITC的优选提取物来源于干燥的鲜叶或幼苗(例如通过风干或急速冷冻 (snap freezing)干燥和冷冻干燥)。然后可以通过如下方法加工所述干燥的物质(a)研磨成细粉。(b)通过用水或其它水溶液混合粉末而制备该磨碎粉末的悬浮液，得到含有最少 10%固体和最多50%固体的混合物。(c)然后从该悬浮液中提取ITC。这可以使用逆流提取器或索氏(Soxhlet)型提取器来实现，所述逆流提取器装有用于使萃取的挥发物保持在溶液中的蒸汽捕集器，所述索氏型提取器在减压下操作并装有回流冷凝器。提取应进行直到来自芝麻菜的最少50%、 优选> 70%的天然葡糖异硫氰酸酯在天然酶的作用下已转化成ITC。(d) —旦提取完成，就可以通过离心分离或倾析从所述悬浮液中除去固体。可以通过化学或酶方法、或者过滤(例如超滤)使富含ITC的上清液脱蛋白，并通过低温高真空蒸发进行浓缩，或者通过反渗透除去水。(e)最终提取物可以作为液体冷冻贮存，或者喷雾干燥得到粉末，或者包囊(例如，包囊在脂肪基质中，或多糖基质中，或聚合物基质中)以提高稳定性。在另一个优选的实施方案中，可以使用种子(例如芥菜或芝麻菜种子)作为起始原料。在种子的情形下，风干是足够的制备方法，然后，在水的存在下将干种子(例如，使用封闭式压机)压碎，得到高固体糊状物(例如，75%至90%之间的固体)。压碎应进行直到形成均勻的糊状物；此后可如上所述进行提取(参见(c)-(e))。应当理解，可以使用幼苗/叶/种子的混合物作为起始原料，以确保制备包含多种结构的ITC提取物。叶和幼苗包含比种子更高水平的4-巯基丁基GLS，种子中的4-甲基硫丁基GLS更高。本发明的另一种优选植物提取物可以富含葡糖异硫氰酸酯(即，根据本发明的 ITC前体)。起始原料可以是如上所述的种子、幼苗或叶子(优选在提取前干燥的)。然后， 可以在乙醇溶液(例如70%-85%的乙醇)中制备经干燥研磨的起始原料的悬浮液，得到含有最少10%固体、最多50%固体的混合物。使用的乙醇优选为食品级的。然后，在反应器(优选装有捕集挥发物的冷凝器的连续逆流提取器或索氏型提取器)中在约70°C下加热该乙醇溶液，直到70%至90%的天然葡糖异硫氰酸酯已被提取到乙醇溶液中。然后可以通过离心分离或倾析从所述悬浮液中除去固体，并通过例如减压蒸发或者通过首先将上清液稀释至乙醇<40%然后进行反渗透(使用渗滤法)而从上清液中除去乙醇。最终溶液应当包含< 5%的乙醇。该富含葡糖异硫氰酸酯的溶液可以冷冻贮存，或者可以将其喷雾干燥， 以得到不含乙醇的粉末。为了将葡糖异硫氰酸酯转化成ITC，可以将该富含葡糖异硫氰酸酯的提取物溶于20-30°C的水中，并通过加入纯化形式或作为粗芝麻菜种子/芥菜种子糊状物的一部分的黑芥子酶来进行该转化。该混合物应孵育直到最少50%、优选> 70%的天然葡糖异硫氰酸酯已经转化为ITC。可以通过过滤(例如微滤或超滤)从富含ITC的溶液中除去固体物质和蛋白质，然后可以如前所述浓缩提取物。本发明组合物的制剂临床需要可能决定了上述植物提取物有可能需要基本上“纯的”或甚至仅仅稀释在水溶液中使用。当情况如此时，可将上清液(无论稀释与否)与多种其它试剂混合，所述其它试剂可因营养原因、医学原因或甚至用于调节所治疗对象摄入之该提取物的可口性的目的而加入。例如，可以将该提取物与奶制品(例如牛奶、奶昔或酸奶)或果汁(例如葡萄汁、 橘子汁等)一起配制，以得到包含ITC或其前体的具有这一额外益处的适口饮料，因此，其作为炎性病症患者的点心是高度合适的。或者，可以将该植物提取物包含在用于肠道进食的营养液中。例如，可以将上清液与盐水或水溶液(可以包含其它维生素、矿物质和营养素)混合用于对象的肠道进食。优选地，包含ITC的液体具有的ITC的浓度在1至1000 μ M之间，优选地在10至 100 μ M之间。本发明组合物可以配制成用于掺入到胶囊中的粉末、颗粒或半固体。对于半固体形式而言，可以将ITC或富含ITC的植物提取物溶解或悬浮在粘性液体或半固体赋形剂 (如聚乙二醇)或液体载体(如二醇例如丙二醇、或甘油或植物油或鱼油，例如选自橄榄油、 葵花油、红花油、月见草油、豆油、冷肝油(cold liver oil)、鲱鱼油等的油)中。然后可以将其填充到硬明胶或软明胶类型的胶囊中，或者由硬明胶或软明胶等同物制备的胶囊中，对于粘性液体或半固体填充物而言，软明胶或凝胶化等同物的胶囊是优选的。根据本发明，包含ITC或富含ITC的植物提取物的粉末剂特别地可用于制备可用于预防或治疗至少部分特征为炎症之病症的药物或营养品。冷冻干燥或喷雾干燥代表了用于制备本发明粉末的优选方法。喷雾干燥产生自由流动的颗粒状粉末混合物，其具有良好的流动性和快速溶解特征。应当理解，通过上述方案制备的喷雾干燥的或冷冻干燥的粉末代表了根据本发明的优选粉末组合物。一种优选的粉末来自富含ITC的重构植物提取物，其随后被冷冻干燥或喷雾干燥。粉末组合物可以重构成澄清的/半透明的低粘度饮料。可以重构在水中或上述奶制品或果汁中。应当理解，粉末剂可以包装扁药囊(sachet)中，并且当需要或者期望时，由对象重构成饮料。粉末混合物代表着本发明的优选实施方案。这些混合物包括粉末状ITC或粉末状的富含ITC的植物提取物与其它成分的混合物。为了营养或医学原因或者为了改善可口性，可以加入这些成分。所述粉末组合物可以与不同粒径的砂糖混合，得到不同甜度的自由流动的粉末混合物。或者，可以将天然甜味料或人工甜味料(例如阿司帕坦、糖精等)与所述粉末组合物混合，用于重构成低热量/热量降低的甜味饮料。所述粉末混合物可以包含矿物质补充剂。所述矿物质可以是钙、镁、钾、锌、钠、铁及其不同组合中的任一种。粉末混合物还可包含缓冲剂(比如柠檬酸盐和磷酸盐缓冲剂)和由碳酸盐(例如碳酸氢盐，比如碳酸氢钠或碳酸氢铵)和固体酸(例如柠檬酸或柠檬酸盐)形成的泡腾剂。ITC或富含ITC的植物提取物可以作为食品补充剂或食品添加剂存在，或者可以掺入到食品(例如功能食品或营养品)中。这样的产品可用作主食以及可能是临床需要的环境下的食品。可以将所述粉末剂加入到点心块(snack food bar)中，例如水果块、坚果块和谷物块。对于点心块形式而言，可以将所述粉末与任一种或多种选自干果(比如晒干的番茄、 葡萄干和无籽葡萄干、磨碎的坚果)或谷类(比如燕麦和小麦)的成分混合。应当理解，根据本发明的组合物可以有利地配制成用作药物的药品(需要处方或者不需要)。还可以将富含ITC的粉末组合物或浓缩液体提取物掺入到用于口服摄取的片剂、 锭剂、甜味剂或其它食品材料中。还应当理解，可以将这样的粉末组合物或浓缩液体提取物掺入到可以摄取且能够长时间将ITC释放到肠中的缓释胶囊或装置中。还可将本发明的组合物微囊化。例如，可以通过藻酸钙凝胶包囊形成来进行包囊。 κ-角叉菜胶、结冷胶、明胶和淀粉可以用作微囊化的赋形剂。联合治疗应当理解，根据本发明的组合物、药物和提取物可以单独使用，或者还可以与其它提取物、组合物或化合物混合(前提是那些化合物不抑制本发明ITC的抗炎性质)。因此， 本发明还包括含有有效量的ITC和其它活性剂的组合物。本发明的组合物、药物和提取物可以与用于治疗本发明医学病症的已知治疗剂联合。因而，所述组合物可用于非常有效的联合治疗中。应当理解，所述组合物溶液可以作为用于治疗所述病症的其它治疗剂的理想载体。可以与本发明的组合物、药物和提取物联合的其它活性剂的实例包括非留体抗炎药(NSAID)和皮质类固醇。所述组合物、药物和提取物还可以与靶向特定病症的其它治疗剂联合。例如，当根据本发明预防或治疗RA时，联合治疗可以包括口服活性“改善疾病的” 抗风湿药物(DMARD)或用于治疗RA的生物物质(例如，抗细胞因子抗体和细胞因子受体拮抗剂)。ITC或富含ITC的植物提取物也可以包括在包含益生菌(probiotic)部分的组合 /合成生物治疗剂中。在本发明的一个最优选的实施方案中，可以将包含ITC或富含ITC或其前体的植物提取物的组合物与多酚组合。本发明人出乎意料地发现ITC和多酚在用于治疗本发明的医学病症的联合治疗中非常有效(参见实施例4)。包含ITC和多酚的组合物、或者富含ITC 的植物提取物和多酚代表着本发明的一个重要特征。因此，根据本发明的第七个方面，提供了一种包含治疗有效量的ITC和多酚的组合物。这样的组合物特别地可用于治疗本文所述的医学病症。所述多酚优选地可来源于水果，更优选地可来源于果皮或果实种子。优选地，所述果品为Vinus spp.。因此，多酚的一个优选的来源可以是葡萄皮或葡萄籽，多酚的最优选的来源是已经过加工使得将来自葡萄皮和籽中的多酚保留在汁液中的葡萄汁。所述多酚优选为原花青素(procyanadin)。或者，所述多酚可以是黄酮类化合物 (例如黄烷醇(flaVan3ol))。最优选的组合治疗包含富含ITC的芝麻菜提取物和富含多酚的葡萄提取物。包含多酚的优选植物提取物包含原花青素并且来源于葡萄皮和/或葡萄籽。可以使用本领域已知的方法制备粉末化葡萄皮/籽提取物。在根据本发明使用之前，可以将这些粉末进一步加工。例如，可以将粉末化葡萄皮/籽提取物溶于MeOH中；加热到约70°C (例如10-30分钟)；离心(例如在约4500rpm下15分钟)；并过滤至0. 45 μ。这得到了包含原花青素(procyanidin)的溶液，可以将其浓缩、粉末化或稀释(根据需要)，并根据本发明使用。包含多酚的最优选植物提取物是使用红或白葡萄皮(理想地与其籽和茎一起)作为提取起始原料制备的。葡萄酿酒加工固体废物代表理想的起始原料。新鲜的葡萄(优选结实的)是另一种合适的起始原料。最理想的起始原料包含比皮比例更多的籽和茎。如果是新鲜获得的，例如葡萄酿酒固体废物，则可以通过风干(例如在热带式干燥机上)干燥葡萄皮/籽混合物。然后，应当将干燥的起始原料细细研磨，得到粒径<250 微米的粉末。可以通过连续提取，优选地通过逆流提取器在乙醇/水混合物或丙酮/乙醇 /水混合物中进行包含高比例原花青素的高级多酚提取物的制备。如果存在高比例的葡萄皮，则可以通过加入例如盐酸、柠檬酸或酒石酸来酸化提取物，使得pH范围在1. 5至4之间，以提高回收率。这并不总是必需的，特别是如果籽的比例高的话。所述提取物应当包含 45%至65%的乙醇，并且可以另外包含至多15%的丙酮。提取可以进行一次，但优选地可以进行两次或三次连续的提取过程，以使回收率最大。一旦提取完成，可以通过离心分离或倾析从所述悬浮液中除去固体。可以通过化学或酶方法，或者通过过滤(例如超滤)使富含原花青素的上清液脱蛋白，并通过低温高真空蒸发进行浓缩，或者通过反渗透除去水。最终提取物可作为液体冷冻贮存，或者喷雾干燥得到粉末，或者包囊(例如，包囊在脂肪基质中，或多糖基质中，或聚合物基质中)以提高稳定性。包含多酚的优选提取物中原花青素的浓度为0. 1至10g/l，优选为0. 5至1. 5g/l。根据本发明的第七个方面，一种优选的组合物包含富含多酚(如原花青素)的葡萄汁和富含SF或ER的芝麻菜提取物。本发明人发现这样的组合物对于预防或减少炎症反应特别有效。或者，可以根据本发明的第七个方面开发包含多酚的液体制剂和粉末。根据本发明的第七个方面的最优选组合物包含治疗有效量的原花青素(来源于葡萄皮或葡萄籽)和治疗有效量的ITC(例如来源于芝麻菜)。这样的组合物可以包括含有粉末的食品或饮料，所述粉末包含原花青素和ITC。然而，最优选的组合物包含含有原花青素和ITC的包囊液体、半固体或粉末(如上所述)。最优选地，所述组合物是包含ITC和原花青素的明胶包囊的液体，ITC的浓度在1至1000 μ M之间，优选在10至100 μ M之间，原花青素的浓度在0. 1至10g/l之间，优选地在0. 5至1. 5g/l之间。可以进行富含ITC的提取物/富含原花青素的提取物的包囊，以便a)通过防止暴露于氧化而提高所述提取物的稳定性，和b)改变所述提取物/混合物的感觉特征(例如减少臭味)。可以通过首先制备所述提取物在乙醇溶液中的溶液(浓度为在50%至70%的干物质)来进行包囊。乙醇的浓度可以为0%至10%。ITC提取物与原花青素提取物的比例可以是3 1或5 1或10 1。应当将制备的溶液与合适的包囊用壳基质等体积混合。 例如，脂肪混合物、或多糖(如藻酸盐)的溶液、或聚合物材料(如壳聚糖)的溶液。该混合物应当在不超过90°C的温度下充分地勻浆化，并通过喷雾干燥、或通过形成气雾剂和冷却，或通过其它已知的包囊技术形成颗粒。最终粒径应当不超过100微米。得到的胶囊可以是硬壳的或软壳的，应当包含最少10% w/w的提取物，优选20%至50% w/w的提取物。剂量方案本发明的组合物可以以单位剂型的形式存在，所述单位剂型包含(a)确定浓度的ITC(或其前体)或包含ITC或其前体的植物提取物，如在本发明的第一至第六个方面中所定义的；或(b)确定浓度的ITC (或其前体)或包含ITC或其前体的植物提取物，和确定浓度的多酚或包含多酚的植物提取物，所述多酚或包含多酚的植物提取物如在本发明的第七个方面所限定的。可以选择这样的单位剂型，从而获得期望水平的生物活性。对象所需的本发明组合物的量由生物活性和生物利用度决定，所述生物活性和生物利用度进而取决于剂型、施用方式、ITC或植物提取物的物理化学性质以及ITC或提取物是作为单一治疗还是联合治疗(例如，与根据本发明的第七个方面的多酚)使用。通常，成年人的日剂量应当为0. Ig至IOOg冷冻干燥的或喷雾干燥的粉末(无论以何种方式制备的)，更优选地，所述日剂量为Ig至30g (例如约5g、IOg或15g，根据需要而定)。本发明的固体或半固体剂型可以包含多达约IOOOmg的包含ITC或其前体的干提取物。施用频率还受到上述因素的影响，特别是所述ITC或其前体在所治疗对象体内的半衰期、以及所述多酚(如果使用)在所治疗对象体内的半衰期。例如，半衰期将受到对象的健康状态、肠运动及其它因素的影响。本发明的组合物可以包含在药物制剂(比如片剂或胶囊)中。这样的剂型可能需要包肠衣，如果生物利用度需要如此的话。可以使用已知的方法，比如制药工业常规采用的那些(例如体内实验、临床试验等)来确定药物组合物的具体剂型和确切治疗方案(比如日剂量和施用频率)。应当理解，可以采用常规营养学方法制备包含所述组合物的液体饮料、粉末混合物和食品。日剂量可以作为单次施用(例如，口服摄入的每日片剂或作为单次液体饮料)给予。或者，可能需要在一天期间施用两次或更多次。作为一个实例，可以在一整天期间以固定间隔使用包含0. l_20g喷雾干燥的植物提取物(优选0. 3-10g喷雾干燥的芝麻菜提取物，更优选0.5-3. Og)的IOOml橙饮料或葡萄饮料，从而递送推荐剂量。应当理解，葡萄和芝麻菜提取物的组合将代表根据本发明第七个方面的最优选组合物。应当理解，补充有本发明ITC(和/或多酚)或植物提取物的营养品代表着给患有具有炎性成分之医学病症、或处于发生该医学病症之风险中的对象提供保护性或治疗有效量的ITC的理想方式。因此，根据本发明的第八个方面，提供了一种用于预防或治疗以具有炎性成分为特征的医学病症的营养品，其中所述营养品补充有ITC或其前体；或富含ITC或其前体的植物提取物。所述营养品可以包含(a)澄清、低粘度、水样、稳定的、即用、瓶装的碳酸饮料或非碳酸饮料；或用于重构的浓澄清液体，其包含根据本发明第四个方面的植物提取物；(b)用水或任何其它口服可摄取液体重构成可饮用液体的粉末/颗粒混合物，其包含根据本发明第四个方面的植物提取物；或(c)混合到食品中的粉末/颗粒混合物(例如巧克力块、锭剂等)。所述营养品可以是如上所述的，可以包含或不包含水溶性维生素、其它矿物补充剂、营养化合物、抗氧剂或调味剂。优选的营养品可以包含本发明的第七个方面定义的活性成分。本发明将通过实施例并参照附图进一步举例说明，在附图中

图1为阐明4-甲基亚磺酰基丁基葡糖异硫氰酸酯和莱菔硫烷的代谢的示意图。当进入肠细胞时，莱菔硫烷(SF)快速缀合谷胱甘肽，输出进入体循环中，并通过硫醚氨酸途径代谢。在血浆的低谷胱甘肽环境中，SF-谷胱甘肽缀合物可以裂解(可能由GSTMl介导)， 导致游离SF在血浆中循环。该游离SF可以修饰血浆蛋白，包括信号分子，比如TGFi3、EGF 和胰岛素。图2为显示独立前列腺微阵列数据集的线性判别分析(LDA)的曲线图，使用实施例1所述的良性(B)和恶性(M)TURP前列腺组织作为训练样品以分类激光俘获显微切割 (LCD)上皮前列腺细胞样品(GEO Accession ⑶S1439)，其由良性(Be)、原发癌(PCa)和转移癌(MCa)样品组成。在判别实施例1的方法部分中所述的良性和恶性TURP样品的基因列表上进行LDA。在此，显示第一个线性判别式(LDl)。图3为代表饮食介入对基因转录的影响的图，如在实施例1中所述。a，在来自良性(Ben)和恶性(MaI)前列腺的TURP组织中，以及来自介入前(Pre)、富含椰菜的饮食(Broc)6个月后和富含豌豆的饮食(Peas)6个月后的志愿者的TRUS导引的活检组织中，在 GSTMl阳性和空白基因型之间不同(P彡0.005，Welch修正的两样品t检验)的探针的数目，b，在预介入TRUS导引的活检样品和富含椰菜的饮食6个月后(6B)、富含豌豆的饮食6 个月后(6P)、富含椰菜的饮食12个月后(12B)、富含豌豆的饮食12个月后(12P)之间不同 (P < 0.005，Welch修正的两样品配对t检验)的探针的数目。阴影表示如实施例1所述采用的不同倍数截断值(cutoff)。图4代表在与或不与人血浆中SF —起孵育下的胰岛素的LC-MS谱图，如实施例 1中所述。在(A)人血浆对照中未修饰的胰岛素(20yg/ml)和(B)在37°C下与胰岛素 (20 μ g/ml)和50 μ M SF 一起孵育4小时的人血浆的两种情况下，胰岛素-SF MH55+的提取离子LC-MS色谱(m/z 1183. 6-1184. 1)表明存在保留时间为6. 46和7. 08分钟的两种不同的胰岛素-SF缀合物。这两种胰岛素-SF缀合物的增强产物离子(EPI)-MS光谱显示在图 5中。图5代表实施例1中所述的两种胰岛素-SF缀合物的增强产物离子(EPI) -MS光谱。来自在37°C下与牛胰岛素和50 μ M SF —起孵育4小时的人血浆的LC-MS分析的峰值保留时间为(Α)6. 46分钟和(B) 7. 08分钟的MS2产物离子光谱。在(A)和(B)中，m/z 1183.9 对应于胰岛素-SF MH55+,在(A)中，m/z 235. 0对应于胰岛素A链的N末端氨基酸Gly-SF， 在(B)中，m/z 325. 2对应于胰岛素B链的N末端氨基酸Wie-SF。图6图解与或不与SF —起孵育的TGF β 1的LC-MS，如实施例1所述。前体物质的提取离子色谱(MS)代表TGF β 1的未修饰的N末端肽(m/z 768. 5)和经修饰的N末端肽 (m/z 877. 2)。A 来自 DMSO 处理的 TGF β 1 的 m/z768. 2-769. 2，B 来自 SF 处理的 TGF β 1 的 m/z 768. 2-769. 2，C 来自 DMSO 处理的 TGF β 1 的 m/z 876. 7-877. 7，和 D 来自 SF 处理的 TGF β 1 的 m/z876. 7-877. 7。图7图解SF对TGF β 1的N末端修饰。m/z 768. 7的MS/MS光谱代表保留时间为 23. 43分钟的TGFi3 1的未修饰的N末端肽㈧，m/z 877. 2代表仅在SF处理的样品中看到的保留时间为30. 85分钟的TGFi3 1的经修饰形式(B)。注意y离子系列保持不变，而b离子系列迁移(Δ)，指示质量为217 士 0. SDa的N末端修饰。图S2提供质量增加217而不是 177的说明。图8图解如实施例1所述的SF对TGFi3 1/Smad所介导转录的活化。用单独的 TGF^ U TGF^ 1+lOmM DTT (其破坏活性 TGF β 1 二聚物)、或 TGF β 1+2 μ M SF 处理包含 CAGA12-luc质粒的ΝΙΗ3Τ3细胞。预孵育所有的样品30分钟，进一步透析4小时，使得SF 的最终浓度为:ΜηΜ。作为另外的阴性对照，细胞不接受处理或仅仅用34nM SF处理，这两种情形都没有诱导萤光素酶。将化学发光针对每种样品的蛋白质浓度进行归一化(详述请参见方法部分)。这是所进行的总共四个类似实验中的一个代表性实验。显示的数据为三次重复的平均值(s. e. m)。图9代表在用如实施例2所述的与SF —起孵育0小时和21小时后的EGF在220nm 波长下的UV光谱(实验1)。*由于柱平衡，与21小时的样品(23. 822秒)相比，0小时样品的未修饰EGF运行得更迟630秒)。图10代表如实施例2所述的在0小时未修饰和经修饰EGF的提取离子质谱(实验1)。*因为柱平衡，与21小时的样品(图11，上图)相比，0小时样品(图10，上图)的未修饰EGF运行得更迟。图11代表如实施例2所述的21小时的未修饰和经修饰EGF的提取离子质谱(实验1)。图12代表如实施例2所述的未修饰EGF的质谱(实验1)。显示多个带电的EGF 分子。图13代表经修饰的EGF的质谱。显示如实施例2讨论的多个带电的经修饰EGF 分子(实验1)。图14代表(a)凝胶的图片；和(b)在条形图中定量的数据，其对应于表6中的数据，如实施例2所述(实验2)。该数据图解ITC如何调节Smad活性。该实验包括将TGF3 1 与和不与莱菔硫烷(SF) —起预孵育30分钟，之后处理PC3细胞1小时，然后测量Smad2磷酸化(即TGFiil活性的函数)。图15代表凝胶图片；并对应于表7中所定量和给出的数据，如实施例2所述(实验2)。该数据阐明ITC如何调节Smad活性。该实验包括将TGF β 1与或不与芥酸精(ER) 一起预孵育30分钟，之后处理PC3细胞1小时，然后测量Smad2磷酸化(即TGF β 1活性的函数)。图16代表显示磷酸化EGF受体(p_EGFR)在BPHl细胞(增生性前列腺细胞)中表达的条形图，如实施例2所述(实验3)。该实验包括将BPH细胞与10 μ mol/L莱菔硫烷一起预孵育，在10分钟的时间中导致10mg/L EGF可诱导的EGF受体磷酸化减少约三倍。图17代表图解将HUVEC细胞与高原花青素提取物和芥酸精一起孵育对IL_6表达之影响的条形图，如实施例3所述。实施例1本发明基于本发明人进行的工作，其研究了摄入十字花科植物对前列腺癌发生和发展成侵袭性前列腺癌之风险的影响，特别是对导致这样的癌症的潜在作用机制的影响。 在本研究中，本发明人对在12个月富含椰菜的饮食之前、期间和之后的人前列腺中总体基因表达模式的变化进行了定量，并然后解释了该变化。结果使本发明人意识到，植物中存在的ITC调节控制炎症反应和调节前列腺癌发生的信号转导机制。这一认识使得本发明人开发了本文所涉及的组合物和植物提取物以及其在治疗具有炎性成分的病症中的用途。给志愿者随机地分配富含椰菜或富含豌豆的饮食。六个月后，对于富含豌豆的饮食而言，谷胱甘肽S-转移酶μ I(GSTMl)阳性和空白(null)的个体之间的基因表达没有差异；但是对于富含椰菜的饮食而言，GSTMl基因型之间存在显著差异，这与转化生长因子 β KTGFβ 1)和表皮生长因子(EGF)信号传导途径有关。介入前和介入后获得的活组织检查的比较表明，与富含豌豆的饮食的个体相比，在富含椰菜的饮食的个体中出现的基因表达的变化更多。虽然不管饮食如何雄激素信号传导都存在变化，但花椰菜饮食的男性还具有除mRNA加工和TGFi3 1、EGF和胰岛素信号传导之外的其他变化。本发明人还确定了，莱菔硫烷(SF 来源于在花椰菜中累积的4-甲基亚磺酰基丁基葡糖异硫氰酸酯的异硫氰酸酯) 与TGFi3 UEGF和胰岛素肽发生化学作用而形成硫脲，增强了 TGFi3 Ι/Smad介导的转录。前列腺癌是西方国家男性人群中最常诊断的非皮肤癌。流行病学研究提出，富含十字花科植物(比如花椰菜)的饮食除了可以减少其它部位的癌症和心肌梗死的风险之外，还可以减少前列腺癌的风险。某些研究特别证实，每周摄入一份或多份的花椰菜可以降低前列腺癌的发病率，以及降低前列腺癌从局部形式发展为侵袭性形式。该风险的减少可被谷胱甘肽S-转移酶yl(GSTMl)基因型调节，具有至少一个GSTMl等位基因的个体(即约50%的人群)获得比具有GSTMl纯合缺失的个体更多的益处。因此，本研究的一个目的是研究花椰菜的保护作用的机制基础和与GSTMl基因型的相互作用。这些发现使本发明人认识到，摄入花椰菜与GSTMl基因型相互作用，引起与前列腺中炎症和癌发生相关之信号途径的复杂变化。本发明人认为这些变化可能是通过ITC与血浆中信号肽的化学相互作用而介导的。该研究首次提供了在人类中获得的支持如下观察研究的实验证据富含十字花科植物的饮食可以减少发生具有炎性成分之病症的风险和/ 或对其进行治疗。而且，本发明人接着证实(参见随后的实施例)包含ITC或包含富含ITC 之植物提取物的产品可用于治疗这些病症。1. 1 方法1.1.1对象和研究设计招募年龄为57-70岁(表1)、具有高级前列腺上皮内瘤形成(HGPIN，前列腺腺癌的侵入前原位阶段)的前述诊断的二十二名男性进行饮食介入试验，以研究富含花椰菜的饮食和富含豌豆的饮食对前列腺基因表达的影响。由对前列腺病理学具有特殊兴趣的两名会诊组织病理学家进行组织学诊断。该试验获得伦理学批准，并且所有参与者都签署了书面的知情同意书。如果志愿者正在进行化学预防性治疗、接受睾酮替代药物疗法或5 α还原酶抑制剂、具有需要治疗的活跃期感染、 体重指数(BMI) < 18. 5或>35或者患有糖尿病，则将其排除。将对象分配进入12个月的平行饮食介入试验中，其由两个饮食介入组组成除了其正常饮食之外，(i)每周摄入400g 花椰菜或(ii)每周摄入400g豌豆。该试验从2005年4月至2007年4月进行。在本介入研究之前及6个月和12个月之后，在诺福和诺维奇大学(Norfolk and Norwich University) 医院使用总PSA免疫测定来定量前列腺特异性抗原(PSA)的水平。在每次活组织检查时间点之前48小时，志愿者避免已知含有葡糖异硫氰酸酯的食物，以避免急性效应。除了对在临介入研究之前以及六个月和十二个月之后从志愿者获得的前列腺经直肠超声扫描(TRUQ导引的针刺活组织检查之外，还从诺福和诺维奇大学医院合作者癌症研究人组织库(Cancer Research Human Tissue Bank)获得了 18个良性和14个恶性的经尿道前列腺切除(TURP)组织。1.1. 2饮食介入按月将蔬菜递送给志愿者。向他们提供蒸笼，并且由食物研究所(the Institute of Food Research)的厨师给志愿者就如何烹煮所述蔬菜进行示范。蒸煮花椰菜部分 4-5分钟，蒸煮豌豆部分2-3分钟。冷冻的豌豆(Birds Eye Garden Peas，http://www. birdseye.co.uk/)购自本地零售渠道。为了保证提供给志愿者的冷冻的花椰菜中葡糖异硫氰酸酯含量的一致性，将本介入研究所需的椰菜按一批次种植在邻近英国King' s Lynn ^Terrington 白勺 ADAS ^ !^ (http//www. adas. co. uk/) ±， ^ Christian Salvesen (Bourne, Lincolnshire, UK, http: //www. salvesen. co. uk/)力口工。将其在 90. 1°C 漂白74秒，在-30°C冷冻，并包装成IOOg部分，然后在_18°C贮存，直到志愿者蒸煮。花椰菜是一种葡糖异硫氰酸酯含量高的品种。4-甲基亚磺酰基丁基葡糖异硫氰酸酯和3-甲基亚磺酰基丙基葡糖异硫氰酸酯(分别为SF和IB的前体)的水平平均值(SD)分别为10.6(0. 38)和3.6(0. 14)微摩尔每克干重，与之相比，购自本地零售渠道的花椰菜分别为 4.4(0. 12)和0. 6(0. 01)微摩尔每克干重。尽管葡糖异硫氰酸酯的水平高于标准花椰菜，但在冷冻之前的漂白使植物黑芥子酶变性，因此来源于高葡糖异硫氰酸酯含量花椰菜饮食的 SF和IB的水平类似于或低于从含有功能性黑芥子酶的鲜椰菜煮获得的。在高葡糖异硫氰酸酯含量的花椰菜和标准花椰菜中，吲哚葡糖异硫氰酸酯的水平相似。1.1.3顺应性监测和饮食评价在12个月介入期间，志愿者完成每周勾选表(tick sheet)，以确定何时食用蔬菜部分。每2周电话联系志愿者并询问饮食的坚持情况。在基线时和六个月后，由志愿者使用家用度量作为每份份量的指标来完成七天的评估食物摄取饮食日志。将来自该日志的食物摄取输入至Ij Diet Cruncher vl. 6. 1 (www. waydownsouthsoftware. com/)中，并分析在基线时和介入后六个月两个介入组之间营养组成的差异。1.1. 4基因分型使用具有RNase处理的Qiagen QIAamp DNA小型试剂盒，根据制造商的说明 (http://www. qiagen. co. uk/)，从全血或组织样品提取基因组DNA。使用基于Covault及同事的实时PCR方法，使用基因特异性引物和探针测定了 GSTMl (NM_000561)基因型，并相对于两拷贝基因对照(乳腺癌1的IVS10区域，早期发病(BRCA1，匪007四4)基因)进行定量(Covault ^A, (2003)Biotechniques 35 :594-596,598) 使用 Applied Biosystems Primer Express 来设计弓I物禾口探针(http://www. appliedbiosystems. com/),并赋予表 1 中的 PCR 条件。采用 Applied Biosystems Absolute Quantification 软件分析数据。在表1中显示了用于测定GSTMl基因缺失的正向(F)引物和反向(R)引物以及荧光探针(CP)的序列和浓度。探针用5'报告基因染料即FAM(6-羧基荧光素)和3'淬灭剂染料即TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)进行标记。在由Universal MasterMix、引物和探针以及50ng DNA组成的总体积25 μ L的孔中一式三份地进行反应。在95°C进行Amplitaq Gold活化10分钟，然后进行95°C变性15秒并在60°C退火/延伸1分钟的40个PCR循环。
权利要求
1.一种用于预防或治疗以具有炎症成分为特征的医学病症的组合物，其包含治疗有效量的异硫氰酸酯(ITC)。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述ITC来源于芸苔属(Brassica)植物。
3.根据权利要求2的组合物，其中所述植物为芝麻菜物种。
4.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述ITC为莱菔硫烷(SF)、iberindB) 或芥酸精(ER，4-甲基硫丁基异硫氰酸酯)中的至少一种。
5.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述ITC在富集了ITC或ITC前体的植物提取物内。
6.根据权利要求5的组合物，其中所述植物提取物来源于芸苔属植物。
7.根据权利要求6的组合物，其中所述植物为芝麻菜物种。
8.根据前述权利要求中任一项的组合物，其与其它抗炎剂联合使用。
9.根据权利要求7的组合物，其中所述抗炎剂为NSAID或皮质类固醇。
10.根据权利要求7的组合物，其中所述抗炎剂为多酚。
11.根据权利要求10的组合物，其中所述抗炎剂为富集了多酚的植物提取物。
12.根据权利要求10或11的组合物，其中所述多酚为原花青素。
13.根据权利要求10或11的组合物，其中所述多酚为黄酮类化合物。
14.根据权利要求13的组合物，其中所述黄酮类化合物为黄烷醇。
15.根据权利要求10-14中任一项的组合物，其中所述多酚来源于果皮或种子。
16.根据权利要求10-15中任一项的组合物，其中所述多酚来源于Vinusspp.。
17.根据前述权利要求中任一项的组合物，用于治疗类风湿性关节炎。
18.根据权利要求1-16中任一项的组合物，用于治疗炎性肠病。
19.饮料，其包含如权利要求1-18中任一项定义的组合物。
20.营养品，其包含如权利要求1-18中任一项定义的组合物。
21.药品，其包含如权利要求1-18中任一项定义的组合物。
全文摘要
本发明涉及可用于预防或治疗以具有炎性成分为特征的医学病症的组合物。所述组合物包含治疗有效量的异硫氰酸酯(ITC)。所述组合物可以包含其它抗炎剂(例如源自植物的多酚)。
文档编号A61P29/00GK102186472SQ200980134267
公开日2011年9月14日 申请日期2009年6月25日 优先权日2008年7月1日
发明者尼亚夫·奥肯尼迪, 理查德·米滕 申请人:普罗维斯天然产物有限公司, 植物生物科学有限公司