包含弹性蛋白样肽的治疗剂的制作方法

专利名称：包含弹性蛋白样肽的治疗剂的制作方法
技术领域：
本申请公开了包含弹性蛋白样肽的治疗剂，并与国际申请日为2007年9月6日的 PCT/US2007/077767(2008年3月13日以WO 2008/030968公布)有关。本申请还与国际 申请日为 2006 年 12 月 20 日的 PCT/US2006/048572 (2007 年 6 月沘以 WO 2007/073486 公 布)有关。W02008/030968和WO 2007/073486通过引用其整体结合到本文中。电子提交文本文件的描述电子提交文本文件的内容通过引用其整体结合到本文中序列表的计算机可读格 式副本(文件名PHAS_010_01US_kqList_ST25. txt，录入日期2009年6月洸日，文件大 小 50kb)。
背景技术：
天然状态或重组产生的治疗性蛋白质或肽可能是不稳定分子，特别是在机体内具 有短周期的血清稳定性、血清半寿期(即循环半寿期)或有限的持久性。在配制时这类分 子还可能极不稳定，例如在水溶液中配制时。在某些情况下，聚乙二醇(PEG)与蛋白质性分子缀合产生疗效较久、活性持续的 分子。然而，PEG连接常常可大大降低甚至破坏蛋白质的治疗活性。治疗性蛋白质和/ 或肽还通过与能够延长血清半寿期的某些蛋白质融合而得以稳定。例如在某些情况下， 与非融合状态的治疗性蛋白质相比，与白蛋白、运铁蛋白和抗体片段融合的治疗性蛋白 质的血清半寿期延长。参见美国专利号7，238，667(尤其是白蛋白缀合物)、美国专利号 7，176，278 (尤其是运铁蛋白缀合物)和美国专利号5，766，883，所述专利均通过引用其整 体结合到本文中。本领域仍需要更稳定、更长作用时间和/或有效的蛋白质分子。发明概述本发明提供包含弹性蛋白样肽(ELP)成分和治疗性蛋白质性成分的治疗剂。ELP 成分含有结构性肽单元，其可以是重复单元，其在结构上与弹性蛋白序列有关或来源于弹 性蛋白序列。这类ELP成分为治疗剂提供某些治疗优势，例如治疗性蛋白质性成分的相对 更好的稳定性、溶解度、生物利用度、半寿期、持久性和/或生物作用。例如可与治疗成分的 未融合或未缀合对应物比较来确定这类性质。在一些实施方案中，ELP成分可进行可逆的 逆相变，其可提供其它实用优势和/或治疗优势。本发明还提供编码本发明的治疗剂的多 核苷酸，以及治疗或预防某些生物学病症的方法。第一方面，本发明提供包含弹性蛋白样肽(ELP)成分和治疗性蛋白质性成分的治 疗剂，以及含有所述治疗剂的用于递送给有需要的受治疗者或患者的药物组合物。治疗成 分可选自表1所列的治疗性蛋白质的活性部分或其功能类似物。在某些实施方案中，治疗成分是GLP-I受体激动剂，例如GLP-1、毒蜥外泌肽-4或其功能类似物。一般来说，这类治 疗成分包括但不限于以葡萄糖依赖性方式有效用于增加胰腺的胰岛素分泌。在其它实施方 案中，治疗成分是胰岛素或其功能类似物，其一般有效用于促进从血液中摄取葡萄糖并贮 存在细胞内。在另一些实施方案中，治疗成分是因子Vll/VIIa或其功能类似物，其一般通 过激活因子X或因子IX而有效促进凝血。ELP和治疗成分可以通过不同方法共价偶联，包括化学偶联(例如接合/缀合)和 重组融合技术。此外，每分子ELP或治疗成分的数目及其在分子内相应的位置都可按需要 改变。治疗剂还可包括一个或多个间隔基或接头部分，其除了提供所需要的ELP与治疗成 分的功能独立性以外，还可任选提供其它的功能性，例如蛋白酶敏感特征，从而提供蛋白酶 水解性释放或激活的治疗成分。治疗剂还可包括一个或多个寻靶成分，例如使治疗剂靶向 特定细胞类型(例如癌细胞)或特定器官的肽或蛋白质。第二方面，本发明提供多核苷酸，这类多核苷酸包含编码本发明的治疗剂的核苷 酸序列。例如核苷酸序列编码具有表1所列的至少一种治疗性蛋白质的功能部分(或其功 能类似物)的ELP融合物。在某些实施方案中，治疗成分是GLP-I受体激动剂(包括GLP-I 和毒蜥外泌肽-4)、胰岛素、因子Vll/VIIa或其功能类似物。这类多核苷酸还可包含与核苷 酸序列有效连接的其它调控元件，例如启动子元件和/或其它转录或表达相关信号。可将 多核苷酸插入各种载体中，载体可用于在宿主细胞(包括例如细菌和真核宿主细胞)中产 生治疗剂。第三方面，本发明提供用于治疗或预防患者(例如哺乳动物患者，包括人类患者) 的疾病、障碍或病症的方法。所述方法包括将有效量的本发明的治疗剂(或含有本发明治 疗剂的药物组合物)给予需要它的受治疗者或患者。例如，患者可能需要具有表1所列的 生物活性或优选适应症的药剂。在使用GLP-I受体激动剂/ELP化合物或使用胰岛素/ELP 化合物的某些实施方案中，本发明提供用于治疗一种或多种障碍的方法，包括1型或2型糖 尿病、高血糖症和葡萄糖耐量减低。在使用因子VII/VIIa/ELP化合物的某些其它实施方案 中，本发明提供用于治疗一种或多种障碍的方法，包括血友病、手术后出血、抗凝血诱发性 出血、血小板减少、因子VII缺乏症、因子XI缺乏症和颅内出血。根据下面的公开内容和随附权利要求书，本发明的不同的其它方面、特征和实施 方案将更清楚明了。附图简述

图1图示编码具有10单元VPGXG(SEQ ID NO :3)重复基序的ELP成分的质粒 pET24d-ELPl-90，其中客体位置(guest position)X 为 V、G 和 A，比例为 5 3 2。该基 序重复8次加上最终C端的10单元重复，其中X为V、G、A和W，比例为4 3 2 1。该 ELP成分一般表示为[(VPGXG) 10]9。图2A图示质粒pET24d-Ex-4ELPl-90，其编码具有与N端毒蜥外泌肽_4成分符 合读框克隆的VPGXG(SEQ ID NO 3)重复基序(见图1)的ELP成分。图2B图示毒蜥外泌 肽-4/ELP融合物(SEQ ID N0:23和24)的核苷酸和氨基酸序列。标明了引物序列(SEQ ID NO 35-40)。图3A图示具有N端Tev(烟草蚀斑病毒半胱氨酸蛋白酶)切割位点的毒蜥外泌 肽-4构建体的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID而25和沈)。标明了引物序列(SEQ ID NO38、41、42)。图;3B还显示具有N端Tev切割位点而且Tev切割位点的N端还具有另外的序 列以提供更好地靶向蛋白酶的毒蜥外泌肽-4构建体的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO 27和沘)。标明了引物序列(SEQ ID NO :38、43、44)。图4A图示图1-3中所示毒蜥外泌肽-4/ELP融合物而且还具有DsbA前导序列以 指导分泌到周质间隙的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO : 和30)。标明了引物序列(SEQ ID NO :38、45、46)。图 4B 图示编码图 4A 融合物的质粒 pET24d-DsbA-Ex-4ELPl_90。图5A图示pPB0868，其编码GLP-1 (A8G，7_37)ELP1_90。图5B图示该编码融合蛋 白的核苷酸和氨基酸序列(分别为SEQ ID NO 53和54)。图6A图示pPB1022，其编码GLP-1(A8G，7-37)ELP1-120。图6B图示该编码融合蛋 白的核苷酸和氨基酸序列(分别为SEQ ID NO 55和56)。图7A图示pPB0788，其编码因子VII-ELP1-90。图7B图示该编码融合蛋白的核苷 酸和氨基酸序列(分别为SEQ ID NO 57和58)。图8A图示具有符合读框克隆的ELP成分的胰岛素(B链、C链和A链)的核苷酸 和氨基酸序歹Ij (SEQ ID N0:31禾口 32)。标明了引物序列(SEQ ID NO :47和48)。图8B图示 表达图8A的胰岛素/ELP融合物的质粒pET24d胰岛素-ELP1-90。图9是图示用小鼠抗人FVII单克隆抗体检测的得自瞬时转染的Freestyle HEK293的FVII-ELP1-90的蛋白质印迹。泳道为(1)培养基；(2)通过相变纯化后的FVII ELP1-90 ；和 FVII 对照。图10是图示重组产生的毒蜥外泌肽-4/ELP4-60融合物的SDS-PAGE。泳道为(M) 蛋白质标记；(1)得自总裂解物的毒蜥外泌肽-4ELP4-60 ;(幻得自不溶性裂解物的毒蜥外 泌肽-4ELP4-60 ； ( 得自可溶性裂解物的毒蜥外泌肽-4 ELP4-60 ； (4)第一次相变的毒蜥 外泌肽-4 ELP4-60(等体积)；( 得自第二次相变的毒蜥外泌肽-4 ELP4-60 (富集)；(6) 得自第三次相变的毒蜥外泌肽-4 ELP4-60 (富集)。图11图示被因子VIIa-ELPl-90激活的因子X，被因子VIIa激活的因子X作为对 照。正如所显示的一样，因子VIIa-ELP保持完全活性。图12图示因子VIIa-ELPl-90静脉内给予大鼠时具有长的冊。与因子VIIaWTv2 约45-60分钟相比，因子VIIar的T1/2约690分钟。图13图示与毒蜥外泌肽的活性相比，GLPl-ELP和毒蜥外泌肽_4_ELP的体外活性高。图14图示当通过静脉内给予大鼠时，GLPl-ELP的T1/2约为12. 9小时，当皮下(SQ) 给予时，1/2约为8.6小时。图15图示当静脉给予兔时，GLP-IELP具有长的半寿期约20小时，当皮下给予时 约24小时。图16图示GLP-I-ELP在糖尿病小鼠的持续血糖控制。发明详述本发明提供包含弹性蛋白样肽(ELP) ( “ELP成分”)和治疗性成分的治疗剂。治 疗成分可选自表1 (例如选自表1所列的治疗性蛋白质或其功能部分或功能类似物)。在某 些实施方案中，治疗成分是GLP-I受体激动剂，例如GLP-I或毒蜥外泌肽_4，或可以是胰岛 素、因子Vll/VIIa或其功能类似物。ELP成分含有与弹性蛋白序列有关或来源于弹性蛋白序列的结构单元，其提供某些治疗优势，例如治疗成分相对更好的持续性、稳定性、溶解度、 生物利用度、半寿期和/或生物作用。根据例如治疗成分的未融合或未缀合对应物来确定 这类性质。本发明还提供编码本发明的治疗剂的多核苷酸，以及治疗或预防某些生物学病 症的方法，包括表1所列的优选适应症，并且尤其包括糖尿病(例如I型和II型糖尿病)、 高血糖症、流血(bleeding)、血友病和出血(hemorrhage)等。为了便于接下来的论述，下面给出在论述中出现的某些术语的定义。本文使用的术语“治疗剂”或“治疗成分”是指能够在体内和/或体外诱导生物效 应的药剂或成分。生物效应可用于治疗和/或预防受治疗者或患者的病症、障碍或疾病。本文使用的术语“偶联”是指特定成分或者彼此直接共价结合(例如通过化学缀 合或重组融合技术)，或者通过一个或多个间插部分(例如桥连基、间隔基或接头)彼此间 接共价连接(例如通过化学缀合或重组融合技术)。本文使用的“半寿期”(一般是指体内半寿期或循环半寿期)是活性剂的生物活性 减少50%所需要的时间。术语“半寿期”不同于“持续性”，后者是指活性剂在机体内的总 的持续时间；其也不同于“清除率”，“清除率”为与半寿期和持续性的数值可能相关或不相 关的动力学变量。术语“功能类似物”是指这样的蛋白质其是天然蛋白质的活性类似物(例如化 学类似物或蛋白质类似物)、衍生物、片段、截短同工型等。例如，功能类似物可以是表1所 列的治疗性蛋白质的功能类似物，或者可以是GLP-I受体激动剂(例如GLP-1、毒蜥外泌 肽)、胰岛素或因子Vll/VIIa的功能类似物。当多肽保持相应的天然多肽的一些或全部生 物活性(活性体内或者体外一种或多种指示性的测定法测定)时，该多肽是有活性的。测 定活性的、某些治疗性蛋白质的示例性活性测定法见表1。此外，本文其它部分详细描述了 GLP-I受体激动剂、胰岛素和因子Vll/VIIa的这类生物活性及测定给定分子是否是“功能 类似物”的测定法。本文使用的术语“天然(的)”当用来指氨基酸序列时，是指天然存在的蛋白质的
氨基酸序列。本文使用的术语“间隔基”是指可插入ELP成分和治疗成分之间的任何部分、肽或 其它化学实体。例如，间隔基可以是在一端与ELP成分共价结合且在另一端与治疗成分共 价结合的二价基团。因此，治疗剂可包括不会妨碍所述药剂的预期目标功效的其它化学结 构。例如，间隔基可以是提供控制药剂的药代动力学特征的蛋白酶敏感性间隔基部分，或间 隔基可以是蛋白酶抗性部分。治疗成分和ELP成分可以任何合适的共价方式(包括化学偶联和重组技术)彼此 偶联，使得治疗剂有效用于其预期目的，并使得存在的ELP成分在一些功能、治疗或生理方 面强化治疗成分。例如，ELP偶联的治疗成分可提高例如其生物利用度、生物不可利用度、 治疗有效量、生物作用、制剂相容性、对蛋白酶解或其它降解方式的抗性、溶解度、半寿期或 给药后在机体内的持续性的其它测量值、给药后从机体排除的清除率等。例如，可根据相应 的未缀合或未融合对应治疗药来测定这类加强作用(例如根据天然GLP-1、毒蜥外泌肽、胰 岛素或因子Vll/VIIa或表1所列治疗性蛋白质来测定)。在一些实施方案中，本发明的治疗剂以可溶性形式在机体内循环或存在，并逃避 肾滤过从而以活性形式保持在机体内。在一些实施方案中，本发明治疗剂的分子量小于普遍公认的肾滤过截止值，例如小于约60kD，或者，在一些实施方案中小于约55、50、45、40、 30或20kDa，并且在机体内的持续时间比未偶联的(例如未融合的或未缀合的)治疗剂对 应物长至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍或100倍。每分子的ELP和/或治疗成分的数目及其在分子内的相应位置在本发明的实施方 案可以不同。例如，在其中药剂是重组融合物的实施方案中，至少一个ELP成分可位于N端 和C端的一端或两端。当ELP成分位于融合物的N端和C端两端时，ELP成分邻接治疗成 分。或者，治疗成分可位于N端和C端的任一端或两端。当治疗成分在N端和C端两端时， 治疗成分邻接ELP成分。在进一步的实施方案中，不同的治疗成分位于分子的N端和C端。 正如本文详细论述的一样，在某些实施方案中，可通过蛋白酶解分隔ELP和治疗成分的间 隔基部分而释放这类治疗成分。在某些实施方案中，治疗成分在融合状态下可能是无活性 的，而在蛋白酶解由ELP成分释放时变得有活性。或者，治疗成分在融合状态下保持活性， 使得不必为了生物活性而对治疗剂进行蛋白酶解处理。当作为重组融合物制备时，可通过已知的重组表达技术制备治疗剂。例如，为了重 组产生治疗剂，将编码嵌合基因的核酸序列与合适的启动子序列有效连接，使得编码这类 融合蛋白的核酸序列可以在宿主细胞内转录和/或翻译成所需要的融合蛋白。优选的启动 子是用于在大肠杆菌(E.coli)内表达的启动子，例如T7启动子。可以使用任何常用的表 达系统，包括真核或原核系统。具体实例包括酵母(例如酵母菌(Saccharomyces spp.)、 毕赤酵母(Pichia spp.))、杆状病毒、哺乳动物和细菌系统(例如大肠杆菌)和柄杆菌属 (Caulobacter)0在下面各节中将更详尽地描述本发明的各个方面和实施方案。弹件蛋白样肽(ELP)成分本发明的治疗剂可包含一种或多种ELP成分。ELP成分包含与弹性蛋白有关或来 源于弹性蛋白的结构性肽单元或序列，或者由与弹性蛋白有关或来源于弹性蛋白的结构性 肽单元或序列组成。这类序列可用于在以下的一个或多个方面改进治疗性蛋白质例如表1 所列的治疗性蛋白质以及GLP-I受体激动剂(例如GLP-I或毒蜥外泌肽-4)、胰岛素和因 子Vll/VIIa的性质生物利用度、治疗有效量、生物作用、制剂相容性、对蛋白酶解的抗性、 溶解度、半寿期或给药后在机体内的持久性的其它测量值和/或从机体排除的清除率。ELP成分由3个至约20个氨基酸的结构单元构建，或者在一些实施方案中，由4个 至10个氨基酸构建，例如5个或6个氨基酸。在具体的ELP成分中，各个结构单元的长度 可以不同或者相同。在某些实施方案中，ELP成分由重复性结构单元的聚四肽、聚五肽、聚 六肽、聚七肽、聚八肽和聚九肽基序构建。示例性结构单元包括由SEQ ID NO :1-12定义的 单元(见下文)，其可用作重复性结构单元，包括串联重复单元，或者可用于某些组合以产 生有效改进治疗成分的性质的ELP。因此，ELP成分可包含以下单元或者基本由以下单元组 成选自如下定义的SEQ ID NO 1-12的结构单元。包含这类结构单元的ELP成分可以是不同大小。例如，ELP成分可包含以下单元 或者基本由以下单元组成约10-约500个结构单元，或者在某些实施方案中约15-约150 个结构单元，或者在某些实施方案中约20-约100个结构单元，或约50-约90个结构单元， 包括由SEQ ID NO 1-12定义的一个单元或单元的组合。因此，ELP成分的长度为约50-约 2000个氨基酸残基，或约100-约600个氨基酸残基，或约200-约500个氨基酸残基，或约200-约400个氨基酸残基。在一些实施方案中，ELP成分(或在某些情况下为治疗剂)的大小小于约65kDa， 或小于约60kDa，或小于约55kDa，或小于约50kDa，或小于约40kDa，或小于约30或25kDa。 已经开发出延长蛋白质和肽的半寿期以改进治疗用途的三种主要血液蛋白质即人血清白 蛋白(HSA)、运铁蛋白(Tf)和IgG或其糖基化形式的IgG的Fc部分。这些分子的长度分别 为585、679和480个氨基酸，分子量为约66、77和约75kDa (包括糖基化)。它们各为球状 且相对致密。这些分子的半寿期取决于多种因素，包括电荷分布、通过新生Fc受体(Fcfoi) (HSA和Fe)的分子拯救或通过Tf受体(TfR)的Tf循环及防止经肾小球滤过的分子大小。 HSA略低于普遍认可的经肾滤过的截止值(约70kDa)，但其电荷分布有助于防止这一点。可 以预期，为了实现与用HSA、Tf和Fc实现的相同数量级的半寿期延长，至少这一分子量范围 的蛋白质可能是必需或需要的，即超过550个氨基酸和超过65kDa。然而，与HSA、Tf和Fc 相比，氨基酸数目少(例如约300-400的范围)且30-40kDa左右的ELP的半寿期却可具有 与HSA、Tf和Fc相当或超过HSA、Tf和Fc的半寿期。在一些实施方案中，未转变状态下的ELP成分可具有伸展的相对非结构化和非球 状的形式，因此，与HSA、Tf和Fc相比，这类分子可具有大的膨胀结构，使得可逃避肾滤过。 在这类实施方案中，本发明的治疗剂的分子量小于普遍公认的通过肾滤过截止值，例如小 于约60kD，或者在一些实施方案中小于约55、50、45、40、30或25kDa，并且在机体内的持续 时间比未偶联的(例如未融合的或未缀合的)治疗剂对应物的长至少2倍、3倍、4倍、5倍、 10倍、20倍或100倍。在某些实施方案中，ELP成分进行可逆的逆相变。也就是说，ELP成分在结构上是 无序的，且在转变温度(Tt)以下极溶于水，但当温度升至Tt以上时具有急剧的范 围)无序-有序相变，导致ELP成分去溶剂化和聚集。例如，ELP当达到充分大小时形成不 溶性聚合物，这可容易地通过离心从溶液中除去和分离。这类相变是可逆的，当温度再次回 到ELP的Tt以下时，分离的不溶性ELP可完全再溶于缓冲溶液中。因此，在一些实施方案 中，可以采用逆转变循环方法，例如利用治疗剂依赖温度的溶解度，或将盐加入培养基中， 从其它污染蛋白质中分离出高纯度的本发明的治疗剂。可采用连续的逆相变循环来实现高 纯度。除温度和离子强度以外，用于调节治疗剂逆转变的其它环境变量包括PH、加入无机和 有机溶质和溶剂、侧链离子化或化学修饰和压力。在某些实施方案中，ELP成分不进行可逆的逆相变，或者不在生物学上相关的Tt 时进行这类转变，因此，分子的生物性质和/或生理性质的改进(如本文其它部分所述)可 以完全独立于或基本上独立于任何相变性质。而且，这类相变性质可提供例如与这类分子 的回收和纯化有关的其它实用优势。在某些实施方案中，ELP成分由包括但不限于以下的结构单元构成(a)四肽 Val-Pro-Gly-Gly，即 VPGG(SEQ ID NO 1)；(b)四肽 Ile-Pro-Gly-Gly，即 IPGG(SEQ ID NO 2)；(c)五肽 Val-Pro-Gly-X-Gly (SEQ ID NO 3),即 VPGXG，其中 X 为任何天然或非天 然的氨基酸残基，且其中X任选在聚合或寡聚重复序列中不同；(d)五肽 Ala-Val-Gly-Val-Pro，即 AVGVP (SEQ ID NO 4)；(e)五肽 Ile-Pro-Gly-X-Gly,即 IPGXG (SEQ ID NO :5)，其中 X 为任何天然或非天然的氨基酸残基，且其中X任选在聚合或寡聚重复序列中不同；(e)五肽 Ile-Pro-Gly-Val-Gly, BP IPGVG (SEQ ID NO 6)；(f)五肽 Leu-Pro-Gly-X-Gly，即 LPGXG (SEQ ID NO :7)，其中 X 为任何天然或非天 然的氨基酸残基，且其中X任选在聚合或寡聚重复序列中不同；(g)五肽 Leu-Pro-Gly-Val-Gly，即 LPGVG (SEQ ID NO 8)；(h)六肽 Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly，即 VAPGVG(SEQ ID NO 9)；(I)八肽 Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Val-Gly，即 GVGVPGVG(SEQ IDNO :10)；(J)九肽 Val-Pro-Gly-Phe-Gly-Val-Gly-Ala-Gly,即 VPGFGVGAG(SEQID NO :11)； 和(K)九肽 Val-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Gly,即 VPGVGVPGG (SEQID NO 12)。由SEQ ID NO 1_12定义的这类结构单元可形成结构重复单元，或者可组合使用形 成本发明的ELP成分。在一些实施方案中，ELP成分完全(或几乎完全)由选自SEQ ID N0 1-12的一个结构单元或其组合(例如2、3或4个)构成。在其它实施方案中，至少75%， 或至少80%，或至少90%的ELP成分由选自SEQ ID NO :1_12的一个结构单元或其组合结 构单元构成，其可以重复单元出现。在某些实施方案中，ELP成分含有重复单元，包括五肽Val-Pr0-Gly-X-Gly(SEQ ID NO 3)的串联重复单元，其中X如上定义，且就整个ELP成分(其可包含VPGXG (SEQ ID N0: 3)以外的结构单元)而言，其中Val-Pro-Gly-X-Gly (SEQ ID NO 3)五肽单元占整个ELP成 分的百分比大于约75%，或大于约85%，或大于约95%。ELP成分可含有具有SEQ IDNO 3 五肽的5-15个单元重复(例如约10个单元重复)的基序，其客体残基(guest residue) X 可在至少2个或至少3个单元中不同。客体残基可独立选自例如氨基酸V、I、L、A、G和W， 并且可以对客体残基进行选择以保持所需要的逆相变性质。重复基序本身可以重复例如约 5次-约12次，例如约8-10次，以产生示例性的ELP成分。当然，本段落所描述的ELP成分 由SEQ ID NO :1-12定义的结构单元中的任意一种或其组合构建。在一些实施方案中，ELP成分可包括β转角结构。适于产生β转角结构的示例性 肽序列披露于国际专利申请PCT/US96/05186，其通过引用其整体结合到本文中。例如，可以 改变弹性蛋白五肽序列VPGXG(SEQ ID NO 3)的第四个残基(X)而不破坏β转角的形成。 或者，ELP成分可以没有β转角，或者具有不同的构象和/或折叠性质。在某些实施方案中，ELP成分包括五肽VPGXG (SEQ ID NO 3)的聚合或寡聚重复序 列，其中客体残基χ为任何氨基酸。χ可以为天然或非天然的氨基酸。在一些实施方案中， X选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、 异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。 在一些实施方案中，X是脯氨酸或半胱氨酸以外的天然氨基酸。客体残基X (例如就SEQ ID NO :3而言，或其它ELP结构单元)可以是非典型(非 遗传编码)氨基酸。非典型氨基酸的实例包括常见氨基酸的D-异构体、2，4_ 二氨基丁酸、 α -氨基异丁酸、A-氨基丁酸、Abu、2_氨基丁酸、Y -Abu、ε -Ahx、6_氨基己酸、Aib、2_氨基 异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半 胱磺酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯甘氨酸、环己基丙氨酸、β -丙氨酸、氟-氨基酸、 设计的(designer)氨基酸例如β -甲基氨基酸、C α -甲基氨基酸、N α -甲基氨基酸和常用的氨基酸类似物。X的选择在各ELP结构单元(例如本文定义的具有客体残基X的各结构单元)中 是独立的。例如，对于各结构单元，X可独立选取带正电荷侧链的氨基酸、具有带负电荷侧 链的氨基酸或具有中性侧链的氨基酸，包括在一些实施方案中为疏水侧链的氨基酸。在另一些实施方案中，ELP成分可包括五肽VPGXG(SEQ ID NO :3)、IPGXG(SEQ ID NO 5)或LPGXG(SEQ ID NO 7)或其组合的聚合或寡聚重复序列，其中X如上定义。在各个实施方案中，ELP序列的结构单元，或在某些情况下为聚合或寡聚重复序 列，可被不会破坏分子整体作用的一个或多个氨基酸残基分隔开来，其为所述治疗成分提 供某些改进。在某些实施方案中，这样的一个或多个氨基酸也不会破坏或明显影响ELP成 分的相变性质(与缺乏这类一个或多个氨基酸相比)。在各个重复序列中，X是独立选择的。所得ELP成分的结构可用符号ELPk [XiYj-Ii] 表示，其中k是指特定的ELP重复单元，括号内的大写字母是单字母氨基酸代码，其相应的 下标是指结构单元中各个客体残基X(适用的话)的相对比，η是指多个结构重复中ELP的 总长度。例如，ELPl [V5A2Q-IO]是指含有五肽VPGXG(SEQ ID NO 3)的10个重复单元的ELP 成分，其中X为缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸，相对比为5 2 3 ；ELPl [K1V2F1^]是指含有五 肽VPGXG (SEQ ID NO 3)的4个重复单元的ELP成分，其中X为赖氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸， 相对比为1 2 1 ;ELP1 [K1V7F1-Q]是指含有五肽VPGXG(SEQ ID NO 3)的9个重复单元 的多肽，其中X为赖氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，相对比为1 7 1 ;ELPl[V-5]是指含有五 肽VPGXG(SEQID NO 3)的5个重复单元的多肽，其中X全为缬氨酸；ELPl [V-20]是指含有 五肽VPGXG(SEQ ID NO 3)的20个重复单元的多肽，其中X全为缬氨酸；ELP2[5]是指含有 五肽AVGVP(SEQ ID NO 4)的5个重复单元的多肽；ELP3[V-5]是指含有五肽IPGXG(SEQ ID NO 5)的5个重复单元的多肽，其中X全为缬氨酸；ELP4[V-5]是指含有五肽LPGXG (SEQ ID NO 7)的5个重复单元的多肽，其中X全为缬氨酸。本段落描述的这类ELP成分可与本发 明联用以增强治疗成分的治疗性质。此外，Tt随客体残基的疏水性而变化。因此，通过改变客体残基本身(identity) 及其克分子数，可以合成在0-100°C范围内能够逆转变的ELP。因此，可通过在ELP序列中 掺入较大量的疏水客体残基来降低给定ELP长度的Tt。合适的疏水客体残基的实例包括缬 氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。还可以使用中等疏水性的酪氨酸。 相反，可通过掺入例如选自以下的残基来提高Tt 谷氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙 氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、精氨酸和谷氨酰胺；优选选自丙氨酸、丝氨酸、苏 氨酸和谷氨酸。在一些实施方案中，选择或设计ELP成分以提供Tt范围约10°C-约80°C，例如约 35°C -约60°C，或约38°C -约45°C。在一些实施方案中，Tt大于约40°C或大于约42°C，或 大于约45°C，或大于约50°C。在一些实施方案中，转变温度超过受治疗者或患者的体温(例 如> 37°C )，从而在体内保持可溶性，或者在其它实施方案中，Tt低于体温(例如< 37°C ) 以提供替代性优势，例如体内药物库形成用于治疗剂的缓释。可通过改变ELP链长来改变ELP成分的Tt，因为Tt 一般随丽降低而提高。对于 分子量> 100，000的多肽，由Urry等人开发的疏水标度(PCT/US96/05186，通过引用其整 体结合到本文中)优选用于预测特定ELP序列的Tt近似值。然而，在一些实施方案中，可通过在ELP序列中掺入较大量的疏水客体残基(例如具有疏水侧链的氨基酸残基)来保持 相对较短的ELP成分长度，而同时保持目标Tt。对于分子量< 100，000的多肽，可通过下 列二次方程式预测或确定Tt =Tt = MJM1XiM2X2,其中X为融合蛋白的MW, M0 = 116. 21 =-1. 7499 ；M2 = 0. 010349。ELP成分的Tt以及由此与治疗成分偶联的ELP成分的Tt在受客体残基X的本身 (identity)和疏水性影响的同时，分子的其它性质也可能会受到影响。这类性质包括但不 限于分子的溶解度、生物利用度、持久性和半寿期。如PCT/US2007/077767 (以WO 2008/030968公布)所述(其通过引用其整体结合 到本文中)，ELP偶联的治疗成分可保持治疗成分的生物活性。此外，ELP本身可具有长的 半寿期。因此，本发明的ELP成分大大延长(例如在具体实施方案中大于lO^JO^JO^、 so^uoo^doo^joo^或以上)与之缀合的治疗成分的半寿期。与治疗成分的游离(未 缀合或未融合)形式的半寿期相比较来确定这类半寿期(或者在一些实施方案中为持久性 或清除率)。此外，当体内给予时，ELP可靶向高血容量器官，因此，ELP可在机体内分配，从 而在身体的不同器官或部位中提供预定的所需要的体内分布，或提供所需要的治疗剂的选 择性或靶向性。总之，本发明设计了体内给予或产生延长半寿期(例如循环半寿期)的治 疗剂的活性组合物，包括本文所述的其它潜在益处。因此，本发明提供用于治疗(体内)用途的各种药物，其中治疗成分具有生物活 性。这类治疗成分包括表1所列的治疗成分(例如全长或功能部分或其功能类似物)，以 及GLP-I受体激动剂(例如GLP-I或毒蜥外泌肽-4)、胰岛素或因子Vll/VIIa及其功能类 似物。下面将详细描述这类治疗成分的结构和活性。在治疗剂的一些形式中，治疗成分与 ELP成分的偶联通过直接共价结合或间接(通过合适的间隔基)结合来实现(如本文其它 部分所述)。此外，治疗成分和ELP成分可以任何合适的方式(包括所述彼此直接或间接共 价结合)结构性排列。胰高血糖素样肽(GLP)-I受体激动剂在本发明的某些实施方案中，治疗剂包含与GLP-I受体激动剂(例如GLP-1、毒蜥 外泌肽-4或其功能类似物)融合或缀合的ELP成分。人GLP-I是37个氨基酸残基的肽，来源于在回肠远端的L细胞、胰腺和脑中 合成的前胰高血糖素原(Pr印roglucagon)。主要在L细胞中加工前胰高血糖素原得到 GLP-I (7-36)酰胺、GLP-I (7-37)和GLP-2。采用一个简单体系描述该肽的片段和类似物。 例如，Gly8-GLP-I (7-37)是指通过缺失第1_6号氨基酸残基并用Gly取代8位的天然氨基 酸残基(Ala)而从GLP-I得到GLP-I片段。同样，Lys34(Νε-十四烷酰基)-GLP-I (7_37)是 指其中34位Lys残基的ε-氨基被十四烷酰基化的GLP-I (7-37)。当在本文中提及C端延 伸的GLP-I类似物时，38位的氨基酸残基为Arg，除非另有说明，39位的任选氨基酸残基同 样为Arg，除非另有说明，且40位的任选氨基酸残基为Asp，除非另有说明。同样，如果C端 延伸的类似物在41、42、43、44或45位上延伸，则这种延伸的氨基酸序列与人前胰高血糖素 原中的相应序列一样，除非另有说明。GLP-I的母体肽胰高血糖素原(PG)具有产生取决于组织来源的、不同肽产物的若 干切割位点，包括胰腺中的胰高血糖素(PG[32-62])和GLP-I [7-36]NH2(PG[72-107])和肠 L 细胞中的 GLP-I [7-37] (PG[78-108])和 GLP-I [7-36]NH2 (PG[78-107])，其中 GLP-I [7-36]NH2(78-107PG)是主要产物。本发明的GLP-I成分可以是胰高血糖素原(proglocagon) 的任何生物活性产物或衍生物或其功能类似物，包括GLP-1 (1-35)、GLP-I (1-36)、 GLP-I (1-36)酰胺、GLP-I (1-37)、GLP-I (1-38)、GLP-I (1-39)、GLP-I (1-40)、GLP-I (1-41)、 GLP-I (7-35)、GLP-I (7-36)、GLP-I (7-36)酰胺、GLP—1 (7-37)、GLP-I (7-38)、GLP-I (7-39)、 GLP-I (7-40)和GLP-I (7-41)或上述的类似物。在一些实施方案中，GLP-I成分一般可表示 为GLP-I (A-B)，其中A是1-7的整数，而B是38-45的整数，任选具有如下定义的一个或多 个氨基酸取代。综上所述，在肠L细胞中加工后，GLP-I释放到循环中，进餐后最为显著。GLP-I的 血浆浓度从约15pmol/L的空腹水平升至40pmol/L的餐后峰值水平。对于特定血浆葡萄糖 浓度的上升，口服给予葡萄糖的血浆胰岛素水平与静脉内给予相比升高约3倍(Kreymarm 等，1987, Lancet 2(8571) :1300-4)。这种胰岛素释放的饮食性提高，称为肠降血糖素效应， 主要是体液性的，而且目前认为GLP-I是人最有效的生理肠降血糖素。GLP-I通过与已知在 胰β细胞表达的GLP-I受体结合而介导胰岛素产生。除促胰岛素作用以外，GLP-I还抑制 胰高血糖素分泌，延缓胃排空(Wettergen等，1993，Dig Dis Sci 38 :665-73)，并可促进外 周葡萄糖清除(D' Alessio 等，1994，J. ClinInvest 93 :2293-6)。综合作用赋予GLP-I优于当前用于治疗非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)的其它药 剂的独特的治疗优势。首先，单次皮下剂量的GLP-I可使NIDDM患者的餐后葡萄糖水平完 全正常化(Gutniak等，1994，DiabetesCare 17:1039-44)。可通过增加胰岛素释放和通过 降低胰高血糖素分泌两者介导这种作用。其次，GLP-I的静脉内输注可延缓NIDDM患者的 餐后胃排空(Williams 等，1996，J.Clin Endo Metab 81:327-32)。第三，与磺酰脲不同， GLP-I的促胰岛素作用依赖于血浆葡萄糖浓度(Holz等，1993，Nature 361 :362-5)。因此， 在低血浆葡萄糖浓度时GLP-I介导的胰岛素释放的丧失防止严重低血糖。当给予健康受试者时，GLP-I有效地影响血糖水平以及胰岛素和胰高血糖素浓 度(Orskov，1992，Diabetologia 35 :701-11)，这是葡萄糖依赖性的作用(Weir 等，1989， Diabetes 38:338-342)。此外，在糖尿病患者中也是有效的(Gutniak，M.，1992，N. Engl J Med 226 :1316-22)，能使2型糖尿病患者的血液葡萄糖水平正常化，并改善1型患者的血糖 控制(Nauck 等，1993，Diabetologia 36 :741-4 ；Creutzfeldt 等，1996，Diabetes Care 19 580-6)。然而，GLP-I是代谢不稳定的，体内血浆半寿期(t1/2)仅1-2分钟。此外，外部给予 的GLP-I也快速降解(Deacon等，1995，Diabetes 44 :1126-31)。这种代谢不稳定性限制了 天然GLP-I的治疗潜力。GLP-I [7-36] NH2 具有下列氨基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR (SEQ ID NO :13)，其可用作本发明的GLP-I成分。或者，GLP-I成分可在第2位含有甘氨酸(G)， 例如序列 HGEGTFTSDVS SYLEGQAAKEFIAffLVKGR(SEQ ID N0:17)。GLP-1 成分可以是例如公 开于US 2007/0041951的GLP-I的生物活性片段，其通过引用其整体结合到本文中。GLP-I 的其它片段和修饰序列是本领域已知的(美国专利号5，614，492、美国专利号5，545, 618、 欧洲专利申请公布号EP 0658568 Al、WO 93/25579，其均通过引用其整体结合到本文中)。 这类片段和修饰序列可与本发明的成分和下面描述的成分联用。GLP-I的某些结构及功能类似物是从大毒蜥(钝尾毒蜥(Helodermasuspectum)和蛛毒蜥(Heloderma horridum))毒液中分离的，并已显示出临床效用。这类分子可用于本发 明。具体地讲，毒蜥外泌肽-4是从钝尾毒蜥毒液分离的39个氨基酸残基肽，与人GLP-I有 约52%同源性。毒蜥外泌肽-4是刺激胰岛素释放从而降低血液葡萄糖水平的有效的GLP-I 受体激动剂。毒蜥外泌肽-4具有下列氨基酸序列HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFEWLKNGGPSSG APPPS (SEQ ID N0:14)。称为艾塞那肽(商品名Byetta )的一种毒蜥外泌肽-4的合成形 式已获准用于治疗2型糖尿病。虽然艾塞那肽在结构上类似于天然GLP-I，但在注射后具有 较长的半寿期。虽然艾塞那肽本身具有降低血液葡萄糖水平的能力，但是它也可与例如二甲双 胍、噻唑烷二酮(thiozolidinedione)、磺酰脲等其它药物和/或胰岛素组合以改善葡萄糖 控制。使用预灌装注射笔式装置，一天两次通过皮下注射给予艾塞那肽。人对艾塞那肽的 反应通常包括改进最初的内源胰岛素快速释放，增加β细胞生长和复制，抑制胰腺胰高血 糖素释放，延缓胃排空和降低食欲一均起到降低血液葡萄糖的作用。与磺酰脲和美格列奈 (meglitinides)不同，艾塞那肽仅在葡萄糖存在时增加胰岛素合成和分泌，从而降低低血 糖的风险。尽管艾塞那肽有治疗效用，但它具有某些不良特征，包括一天注射两次、胃肠外 副作用和类似于天然GLP-I的相对较短的半寿期(即2小时左右)。GLP-I和毒蜥外泌肽-4的各种功能类似物是已知的，且可用于本发明。这 些功能类似物包括利拉鲁肽(Iiraglutide) (Novo Nordisk, W098/008871)、R1583/ taspoglutide (Roche, W000/034331)、CJC-1131 (ConjuChem, W000/069911)、ZP-IO/ AVEOOlO (Zealand Pharma, Sanofi-Aventis, W001/004156)禾口 LY548806(Eli Lilly, W003/018516)。利拉鲁肽，亦称NN2211，是设计为一天注射一次的GLP-I受体激动剂类似物 (Harder等，2004，Diabetes Care 27:1915-21)。在许多研究中，在2型糖尿病患者中测试 了利拉鲁肽，已证实具有不同有效持续时间。在一项研究中，在用利拉鲁肽治疗2型糖尿 病患者1周后，治疗改善了血糖控制，改进了 β细胞功能，并降低了内源葡萄糖释放(Degn 等，2004，Diabetes53 :1187-94)。在类似研究中，8周0. 6mg利拉鲁肽治疗2型糖尿病患者 与使用安慰剂的患者相比显著改善了血糖控制又没有增加体重(Harder等，2004，Diabetes Care 27 :1915-21)。因此，在某些实施方案中，本发明的GLP-I受体激动剂与W098/008871(其通过引 用其整体结合到本文中)中披露的一样。除相对于天然GLP-I有1、2或更多个氨基酸取 代以外，GLP-I受体激动剂还可具有至少一个亲脂取代基。例如，亲脂取代基可以是选自 CH3(CH2)nCO-的酰基，其中η为4-38的整数，例如4- 的整数。亲脂取代基可以是直链或 支链烷基或脂肪酸的酰基(例如参见W098/008871，其通过引用结合到本文中)。在某些实施方案中，GLP-I成分为 Arg26-GLP-I (7-37)、Arg34-GLP-I (7-37)、 Lys36-GLP-I (7-37)、Arg26l34Lys36-GLP-I (7-37)、Arg26l34Lys38-GLP-I (7-38)、 Arg28l34Lys39-GLP-I (7-39)、Arg26l34Lys40-GLP-I (7-40)、Arg26Lys36-GLP-I (7-37)、 Arg34Lys36-GLP-I (7-37)、Arg26Lys39-GLP-I (7-39)、Arg34Lys40-GLP-I (7-40)、Arg26' 34Lys36l39-GLP-I (7-39)、Arg26,34Lys36,40-GLP_l (7-40)、Gly8Arg26-GLP-I (7-37)、 Gly8Arg34-GLP-I (7-37)、Gly8Lys38-GLP-I (7-37)、Gly8Arg26l34Lys36-GLP-I (7-37)、Gly8Arg26' 34Lys39-GLP-I (7-39)、Gly8Arg26,34Lys40-GLP-I (7-40)、Gly8Arg26Lys36-GLP-I (7-37)、Gly8Arg34Lys36-GLP-I (7-37)、Gly8Arg26Lys39-GLP-I (7-39)、Gly8Arg34Lys40-GLP-I (7-40)、 Gly8Arg28'34Lys36'39-GLP-l (7-39)和 Gly8Arg26’34Lys35’4°-GLP-l (7-40)，各自任选具有亲脂取 代基。例如GLP-I受体激动剂可具有以下序列/结构Arg34Lys26-(Ν-ε-(γ -Glu (N- α -十六 酰基)))-GLP-l(7-37)。 Taspoglutide，亦称为R1583或BIM 51077，是在用二甲双胍治疗的2型糖尿病患 者中已经证实改善血糖控制和降低体重的GLP-I受体激动剂(摘要编号A-1604，2008年6 月 7 日，68th American Diabetes AssociationMeeting(第 68 届美国糖尿病协会会议)， San Francisco, CA)。因此，在某些实施方案中，GLP-I受体激动剂与W000/034331(其通过引用其整体 结合到本文中)中披露的一样。在某些示例性实施方案中，GLP-I受体激动剂具有序列 [Aib8'35]hGLP-l (7-36) NH2 (例如 taspoglutide)，其中 Aib 是 α -氨基异丁酸。CJC-1131是GLP-I类似物，由GLP-I与反应性化学接头基团连接的DPP-IV抗性 形式组成，该接头基团可供GLP-I在皮下注射后与血清白蛋白形成不可逆的共价健(Kim 等，2003，Diabetes 52 :751_9)。在12周的随机双盲安慰剂对照多中心研究中，CJC-1131 和二甲双胍治疗在降低2型糖尿病患者的空腹血液葡萄糖水平中是有效的(Ratner等， 摘要编号10-0R，2005年6月10-14日，第65届美国糖尿病协会会议(65th American DiabetesAssociation Meeting), San Francisco, CA)。因此，在某些实施方案中，GLP-I受体激动剂与W000/069911(其通过引用其整体 结合到本文中)中披露的一样。在一些实施方案中，GLP-I受体激动剂用反应基团修饰，所 述反应基团与血液成分中的氨基、羟基或巯基反应形成稳定的共价键。在某些实施方案中， GLP-I受体激动剂用选自琥珀酰亚胺基和马来酰亚胺基的反应基团修饰。在某些示例性实 施方案中，GLP-I受体激动剂具有下列序列/结构=D-Ala8Lys37- (2- (2- (2-马来酰亚胺基丙 酰胺基(乙氧基)乙氧基)乙酰胺))_GLP-1 (7-37)(例如CJC-1131)。AVE0010，亦称ZP-10，是可与本发明联用的GLP-I受体激动剂。在最近的双盲研究 中，用一天一次剂量的AVE0010治疗的患者显示HbAlc水平显著降低(Ratner等，摘要编号 433-P，第68届美国糖尿病协会会议(68thAmerican Diabetes Association Meeting) ,San Francisco,CA)。在研究结束时，对于一天一次给药，与安慰剂的32%相比，HbAlc < 7%的 患者的百分比范围为47-69%。此外，AVE0010治疗的患者显示体重和餐后血浆葡萄糖呈剂 量依赖性降低。因此，在某些实施方案中，GLP-I受体激动剂与W001/004156(其通过引用其整体 结合到本文中)中披露的一样。例如，GLP-I受体激动剂可具有以下序列HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEffLKNGGPS SGAPPSKKKKKK-NH2 (SEQ ID NO 18)(例如 AVEOO10)。LY548806是设计成对二肽酶-肽基IV(DPP-IV)的蛋白酶解有抗性的GLP-I衍生 物(Jackson等，摘要编号562，2005年6月10-14日，第65届美国糖尿病协会会议(65th American Diabetes Association Meeting), SanFrancisco, CA)。石if究表明，在高血糖症 动物模型中，LY548806在高血糖期引起血液葡萄糖水平显著降低(Saha等，2006，J. Pharm. Exp. Ther. 316 =1159-64) 此外，LY548806显示引起胰岛素水平显著增加，这与已知的作用 机制一致，即在高血糖症存在时刺激胰岛素释放。
因此，在某些实施方案中，GLP-I受体激动剂与W003/018516(其通过引用其整体 结合到本文中)中的披露的一样。在一些实施方案中，本发明的治疗剂包含GLP-I类似物， 其中这类类似物或片段的主链在8位含有丙氨酸以外的氨基酸(8位类似物)。主链还可 包括L-组氨酸、D-组氨酸或组氨酸的修饰形式，例如脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、 β-羟基-组氨酸、高组氨酸、α-氟甲基-组氨酸或在7位的α-甲基-组氨酸。在一些 实施方案中，与天然GLP-I相应的氨基酸相比，这些8位类似物可在12、16、18、19、20、22、 25、27、30、33和37位上含有一个或多个其它的变化。在其它实施方案中，与天然GLP-I相 应的氨基酸相比，这些8位类似物可在16、18、22、25和33位含有一个或多个其它变化。在 某些示例性实施方案中，GLP-I受体激动剂具有以下序列HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLI KGRG-OH (SEQ ID NO :19)(例如 LY548806)。因此，本发明提供包含弹性蛋白样肽(ELP)和GLP-I受体激动剂的治疗剂。例如， 在某些实施方案中，GLP-I受体激动剂是GLP-I (SEQ ID N0:13、17或59)或其功能类似物。 在其它实施方案中，GLP-I受体激动剂是毒蜥外泌肽-4 (SEQ ID NO 14)或其功能类似物。 GLP-I或毒蜥外泌肽-4的这类功能类似物包括在C端截短1-10个氨基酸(包括1、2、3或 多达约5个氨基酸)的功能片段(对应于SEQ ID N0:13、14、17或59)。这类功能类似物 相对于天然序列(例如SEQ ID NOS 13、14和59)可含有1_10个氨基酸插入、缺失和/或 取代(总体上)，并且在每种情况下都保持肽的活性。例如，GLP-I或毒蜥外泌肽-4的功能 类似物相对于SEQ ID NO 13,59和14可具有1至约3、4或5个插入、缺失和/或取代(总 体上)，并且在每种情况下都保持肽的活性。可采用任何可获得的测定法(包括本文所述方 法)证实或测定这类活性。在这些或其它实施方案中，GLP-I受体激动剂成分与天然序列 (SEQ ID N0:13、59 和 14)有至少约 50%、75%、80%、85%、90%或 95% 同一性。两个序列 之间(例如天然序列和功能类似物之间)序列同一性的测定可采用任何比对工具完成，包 Tatusova等，Blast 2 sequences—a new toolfor comparing protein and nucleotide sequences (Blast 2序列-一种比较蛋白质和核苷酸序列的新型工具)，FEMS Microbiol Lett. 174 :247-250(1999)。这类功能类似物还可包含其它化学修饰，例如本节描述的修饰 和/或本领域已知的其它修饰。在某些实施方案中，GLPl-ELP融合物具有本文列举的序列SEQ IDNO力4和56。当 加工时，这类融合蛋白的成熟形式将以GLP的His7开始。另一方面，本发明提供用于治疗或预防以下疾病的方法2型糖尿病、葡萄糖耐量 减低、1型糖尿病、高血糖症、肥胖症、暴食症、贪食症、高血压、X综合征、血脂异常、认知障 碍、动脉粥样硬化、非脂肪肝疾病、心肌梗死、冠心病和其它心血管疾病。所述方法包括给予 需要这类治疗的患者包含弹性蛋白样肽(ELP)和GLP-I受体激动剂的治疗剂(如上所述)。 在这些或其它实施方案中，本发明提供用于减少食物摄取、降低β细胞凋亡、增加β细胞 功能和β细胞量和/或用于恢复β细胞的葡萄糖敏感性的方法。患者一般可为人或非人 类动物患者(例如狗、猫、牛或马)。优选患者为人。用本发明的ELP/GLP-1受体激动剂化合物的治疗还可与一种或多种药理活性物 质组合，例如选自抗糖尿病药、抗肥胖症药、食欲调节药、抗高血压药、用于治疗和/或预防 由糖尿病引起或与糖尿病有关的并发症的药物以及用于治疗和/或预防由肥胖症引起或 与肥胖症有关的并发症和障碍的药物。在本文中，表述“抗糖尿病药”包括用于治疗和/或预防胰岛素抵抗和其中胰岛素抵抗是病理生理机制的疾病的化合物。GLP-I或毒蜥外泌肽-4类似物，或GLP-I受体激动剂/ELP化合物结合GLP-I受体的能力可通过标准方法测定，例如，通过受体结合活性筛选方法，该方法包括提供在其表 面表达GLP-I受体的合适细胞，例如胰岛瘤细胞系，例如RINmSF细胞或INS-I细胞。除了 使用放射免疫测定方法测定示踪剂与膜的特异性结合以外，还可测定cAMP活性或葡萄糖 依赖性的胰岛素产生。在一种方法中，使用编码GLP-I受体的多核苷酸转染细胞，从而表达 GLP-I受体蛋白。因此，这些方法还可用于测试或确定疑似GLP-I受体激动剂是否有活性。 本文更详细地描述了示例性的测定法。此外，可采用已知方法测定或预测体内生物活性的GLP-I受体激动剂或GLP-I受 体激动剂/ELP的水平(参见例如Siegel等，1999，Regul P印t79 (2-3) :93_102)。具体 地讲，可以使用各种已知的测定GLP-I活性的方法来评价GLP-I受体激动剂或GLP-I受体 激动剂/ELP化合物体内诱导胰岛素产生的能力。例如，可将ELP/GLP-1受体激动剂化合 物导入细胞，例如无限增殖化β细胞，并可使所得细胞与葡萄糖接触。如果细胞在响应 葡萄糖时产生胰岛素，则一般把修饰的GLP-I视为在体内有生物活性(Fehmarm等，1992， Endocrinology 130:159-166)。本文更详细地描述了示例性的测定法。还可采用已知测定法测定GLP-I受体激动剂/ELP化合物促进β细胞增殖、抑 制β细胞凋亡和调节胰岛生长的能力。胰β细胞增殖可通过3H-胸苷或BrdU掺入测 定法评价(参见例如Buteau等，2003，Diabetes 52 124-32)，其中使胰β细胞(例如 INS (832/13)细胞与ELP/GLP-1受体激动剂化合物接触，并分析3H-胸苷或BrdU掺入的增 力口。可在培养的胰岛素分泌细胞中和/或在由于β细胞凋亡速率过快而发生糖尿病的动物 模型中测定ELP/GLP-1受体激动剂化合物的抗凋亡活性(参见例如Bulotta等，2004，Cell BiochemBiophys 40 (增刊 3) :65_78)。除GLP-I以外，该家族的其它肽(例如由胰高血糖素原基因加工得到的肽，例如 GLP-2、GIP和泌酸调节肽(oxyntomodulin))也可与ELP成分(如本文所述)缀合或融合 以提高其治疗潜力。胰岛素在其它实施方案中，本发明提供包含ELP成分与胰岛素偶联(例如通过融合或缀 合)的治疗剂。可以使用胰岛素注射剂(例如人胰岛素注射剂)治疗糖尿病。机体的产胰 岛素细胞称为β细胞，而且它们存在于胰腺中。这些细胞聚集在一起形成“胰岛”，以描述 胰岛的德国医科学生命名。胰岛素的合成始于胰岛素基因的翻译，该基因位于11号染色体上。在翻译期间， 两个内含子从mRNA产物中切割出来，其编码长度为110个氨基酸的蛋白质。这种主要的翻 译产物称为前胰岛素原，并且是无活性的。它含有长度为24个氨基酸的信号肽，这是蛋白 质跨过细胞膜所必需的。一旦前胰岛素原到达内质网，蛋白酶便切下信号肽以产生胰岛素原。胰岛素 原由3个结构域组成氨基端B链、羧基端A链和中间称为C肽的连接肽。胰岛素由称 为 A 链(21 个氨基酸-GIVEQCCASVCSLYQLENYCN) (SEQ ID NO 15)和 B 链(30 个氨基酸 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKA) (SEQ ID NO 16)的两条氨基酸链组成，两条氨基酸链 两个二硫键连接在一起。A链内有第3个二硫键，将A链第6个和第11个残基连接在一起。在大多数物种中，A链和B链的长度和氨基酸组成类似，3个二硫键的位置是极其保守的。 由于这个原因，猪胰岛素可代替糖尿病患者的人胰岛素水平不足。如今，猪胰岛素在很大程 度上已经被通过细菌大规模生产的人胰岛素原(重组胰岛素)代替。胰岛素分子具有在溶液中形成二聚体的趋向，而且在锌离子存在时胰岛素二聚体 缔合成六聚体。而胰岛素单体容易通过血液扩散并且快速起效，六聚体扩散缓慢且起效延 迟。在设计重组胰岛素时，可以降低胰岛素分子形成二聚体和六聚体的趋势但不会中断与 胰岛素受体结合的方式对胰岛素的结构进行修饰。这样，制成从短效到长效的各种制剂。在内质网中，胰岛素原暴露于脱去C肽的若干特异性肽酶，从而产生成熟和活性 形式的胰岛素。在高尔基体中，胰岛素和游离的C肽被包装到在β细胞的胞质中蓄积的分 泌性颗粒中。分泌颗粒的胞吐作用由葡萄糖进入β细胞触发。胰岛素的分泌对代谢具有 广泛的影响。在响应葡萄糖升高时，胰岛素的释放分两个阶段。第一是胰岛素的立即释放。这 可归于贮存在分泌颗粒中的预先形成的胰岛素的释放。在短暂延迟后，便有新合成胰岛素 的第二次更持久的释放。一旦释放，胰岛素只是短暂具有活性，然后被酶降解。胰岛素酶存在于肝和肾中， 其分解在血浆中的循环胰岛素，因此，胰岛素的半寿期仅约为6分钟。这种短期作用导致循 环中的胰岛素水平快速变化。已开发出具有改进的治疗性质的胰岛素类似物(Owens等，2001，Lancet358 739-46 ；Vajo等，2001 ,Endocr Rev 22 :706-17)，且这类类似物可与本发明联用。采用各种 策略，包括延长胰岛素B链的COOH端和改造对白蛋白具有相当亲和力的脂肪酸酰化的胰岛 素，来产生更长效的胰岛素类似物。然而，用可获得的更长效的胰岛素化合物进行体内治疗 仍导致高频率的低血糖和高血糖波动以及HbA1。的一般降低。因此，开发真正长效而稳定的 人胰岛素类似物仍是一项重要任务。可用于本发明的胰岛素的功能类似物包括快速起效的类似物，例如赖脯胰岛素、 门冬胰岛素和格鲁辛胰岛素(glulisine)，它们在皮下注射后快速吸收(< 30分钟)，1小 时达峰值，而且作用时间相对较短(3-4小时)。此外，已开发出可与本发明联用的两种长效 胰岛素类似物甘精胰岛素和地特胰岛素。长效胰岛素类似物大约2小时开始起效，4-6小 时生物作用达到平稳期，并可持续长达M小时。因此，在一个实施方案中，胰岛素成分可含有赖脯胰岛素(亦称Humalog，Eli Lilly)的A链和/或B链。赖脯胰岛素因观位上的脯氨酸被赖氨酸取代，且胰岛素8链四 位上的赖氨酸被脯氨酸取代而不同于人胰岛素。虽然这些修饰不改变受体结合，但它们有 助于阻断胰岛素二聚体和六聚体的形成，使得餐后注射可获得较大量活性的单体胰岛素。在另一个实施方案中，胰岛素可含有门冬胰岛素(亦称NovologjovoNordisk)的 A链和/或B链。门冬胰岛素被设计成在人胰岛素B链观位上的氨基酸脯氨酸被天冬氨酸 单一置换。这种修饰有助于阻断胰岛素六聚体的形成，产生更快速起效的胰岛素。在又一个实施方案中，胰岛素可含有格鲁辛胰岛素(亦称Apidra， Sanofi-Aventis)的A链和/或B链。格鲁辛胰岛素是短效类似物，由人胰岛素B链3位上 的天冬酰胺被赖氨酸取代，且四位的赖氨酸被谷氨酰胺取代而产生。与正常的人胰岛素相 比，格鲁辛胰岛素起效更快，作用时间更短。
在另一个实施方案中，胰岛素可含有甘精胰岛素(亦称Lantus，Sanof i-Aventis) 的A链和/或B链。甘精胰岛素不同于人胰岛素，因为A链21位的氨基酸天冬酰胺被甘氨 酸置换，且将2个精氨酸加至B链C端。与睡前中性低精蛋白锌(NPH)胰岛素(一种中效 胰岛素)相比，甘精胰岛素与2型糖尿病患者较少的夜间低血糖有关。在又一个实施方案中，胰岛素可含有地特胰岛素(亦称Levemir,NovoNordisk)的 A链和/或B链。地特胰岛素是可溶性的(中性pH)长效胰岛素类似物，其中去除B30位的 氨基酸苏氨酸，且将14-碳肉豆蔻酰脂肪酸乙酰化为LysB^W ε-氨基。在皮下注射后， 地特胰岛素解离，从而暴露出能够与白蛋白分子可逆结合的游离脂肪酸。因此在稳定状态 下，未结合的游离胰岛素的浓度大大降低，导致稳定的血浆葡萄糖水平。在一些实施方案中，胰岛素可以是单链胰岛素类似物(SIA)(例如参见6，630，438 和W008/019368，其通过引用其整体结合到本文中)。单链胰岛素类似物包括一组结构上相 关的蛋白质，其中A链和B链与多肽接头共价连接。多肽接头将B链的C端连接至A链的 N端。接头可以是任何长度，只要接头提供对于SIA具有葡萄糖摄取和胰岛素受体结合作 用所必需的结构构象。在一些实施方案中，接头长度约为5-18个氨基酸。在其它实施方案 中，接头长度约为9-15个氨基酸。在某些实施方案中，接头长约12个氨基酸。在某些示例 性实施方案中，接头具有序列 KDDNPNLraLVR(SEQ ID NO :20)或 GAGSSSRRAPQT (SEQ ID NO: 21)。然而，应当了解的是，这个序列可能有许多变化(例如氨基酸的长度(添加和缺失两 者)和取代)但基本上不损害所产生的SIA在葡萄糖摄取和胰岛素受体结合活性方面的功 效。例如，可在任一端添加或脱去若干不同的氨基酸残基但基本上不降低所产生的SIA的 活性。目前处于临床研发中的示例性单链胰岛素类似物是albulin(Duttaroy等，2005， Diabetes 54 :251-8) 0 albulin可在酵母或哺乳动物细胞中产生。它由经十二肽接头连接 在一起并与天然人血清白蛋白的NH2端融合的人胰岛素的B链和A链(与天然人胰岛素有 100%同一性)组成。为了表达和纯化albulin，Duttaroy等人使用4个重叠引物和PCR扩 增，构建了编码含有经十二肽接头连接在一起的成熟人胰岛素的B链和A链的单链胰岛素 的合成基因构建体。将所得PCR产物在人血清白蛋白(HSA)的信号肽和成熟HSA的NH2端 之间符合读框地连接，装入PSAC35载体中用于在酵母内表达。按照本发明，abulin的HSA 成分可用本文所述的ELP成分置换。因此，一方面，本发明提供包含弹性蛋白样肽(ELP)和胰岛素或其功能类似物的 治疗剂。例如，在某些实施方案中，胰岛素是哺乳动物胰岛素，例如人胰岛素或猪胰岛素。按 照本发明，ELP成分可与胰岛素A链、或B链、或两条链偶联(例如通过重组融合或化学缀 合)。胰岛素可包含A链、B链和C链中的每条链(SEQ ID NO :51和52)，或者可包含仅含有A 链和B链的加工形式。在一些实施方案中，A链和B链通过短的连接肽连接产生单链胰岛素。 胰岛素可以是人胰岛素的功能类似物，包括在N端和/或C端(A链和B链的任一条或两条) 截短1-10个氨基酸(包括1、2、3个或约5个氨基酸)的功能片段。相对于天然序列(例如 SEQ ID NO 15和16)，功能类似物可含有1_10个氨基酸插入、缺失和/或取代(总体上)， 并且在每种情况下都保持肽的活性。例如，相对于天然序列(其可含有A链和B链，或A链、 B链和C链)，功能类似物可具有1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失和/或取代(总体上)。 可采用任何可获得的测定法(包括本文所述方法)证实或测定这类活性。在这些或其它实施方案中，胰岛素成分与A链和B链的每个天然序列(SEQ ID N0:15和16)有至少约75%、 80%、85%、90%、95%或98%同一性。两个序列之间(例如天然序列和功能类似物之间) 序列同一性的测定可采用任何比对工具完成，包括Tatusova等，Blast 2 seguences-anew tool for comparinR protein and nucleotide sequences (Blast 2 序歹Ij _——禾中比较蛋白 质和核苷酸序列的新型工具)，FEMS Microbiol Lett. 174 :247_250 (1999)。胰岛素成分可 含有本领域已知的其它化学修饰。
另一方面，本发明提供用于治疗或预防以下疾病的方法糖尿病，包括I型和II型 糖尿病。所述方法包括给予有其需要的患者有效量的包含弹性蛋白样肽(ELP)成分和胰岛 素(或其功能类似物)成分的治疗剂。患者一般可以是人或非人类动物(例如狗、猫、牛或 马)患者。优选患者是人。为了表征胰岛素类似物或含有ELP的胰岛素类似物的体外结合性质，可以在表 达胰岛素受体的各种细胞系中进行竞争结合测定法(Jehle等，1996，Diabetologia 39: 421-432)。例如，可以采用使用CHO细胞过量表达人胰岛素受体的竞争结合测定法。胰岛 素还可以比胰岛素受体低的亲和力与IGF-I受体结合。为了测定含有ELP的胰岛素类似物 的结合亲和力，可以在L6细胞中使用125I标记的IGF-I进行竞争结合测定法。胰岛素的活性包括刺激外周葡萄糖清除和抑制肝葡萄糖产生。可采用已知方法体 外测定含有ELP的胰岛素类似物介导这些生物活性的能力。例如，可以在3T3-L1脂肪细 胞中测定含有ELP的类似物对葡萄糖摄取的作用，并与胰岛素的作用进行比较。细胞用生 物活性类似物预处理一般可在2-脱氧葡萄糖摄取时产生剂量依赖性的增加。可以在许多 细胞类型中测定含有ELP的胰岛素类似物调节葡萄糖产生的能力，例如，H411e肝细胞瘤细 胞。在该测定法中，用生物活性类似物预处理一般将导致剂量依赖性地抑制葡萄糖释放量。因子 VII(VIIa)在某些实施方案中，本发明提供包含ELP成分与因子Vll/VIIa偶联(例如通过融 合或缀合)的治疗剂。凝血是血液凝块形成的生物过程，涉及许多不同的丝氨酸蛋白酶及 其必需的辅因子和抑制剂。它始于因子VII (FVII)和因子Vlla(FVIIa)暴露于其膜结合 的辅因子即组织因子(TF)，导致因子Xa(FXa)和更多FVIIa的产生。该过程之后产生因子 IXa(FIXa)和进一步的FXa，其与相应的辅因子FVIIIa和FVa结合时形成血小板结合复合 物，最终导致形成凝血酶和血纤蛋白凝块。凝血酶还通过激活辅因子(例如FV和FVII)和 酶原(例如因子XI)进一步增强凝血。此外，凝血酶激活血小板导致血小板聚集，这是止血 栓子形成所需要的。因子VII在血液中以酶原形式循环，并通过因子IXa、因子Xa、因子Xlla、或凝血酶 通过轻微蛋白酶解转化成其活性形式因子Vila。因子Vila为两条链的50千道尔顿(kDa) 血浆丝氨酸蛋白酶。酶的活性形式包含重链(254个氨基酸残基)和轻链(152个残基)， 重链含有催化结构域，轻链含有2个表皮生长因子(EGF)样结构域。在血浆中循环的成熟 因子Vll/VIIa由406个氨基酸残基组成(SEQ ID NO 33)。轻链和重链由二硫键连接在一 起。如上所述，因子VIIa由蛋白酶解其单链酶原因子VII的一个肽键而产生，因子 VII以约0.5 μ g/ml存在于血浆中。通过切割内部肽键使酶原因子VII转化成其活化的两 条链分子。在人因子VII中，切割位点位于Argl52-Ilel53 (Hagen等，1986，PNAS USA 83 2412-6)。本申请使用的“因子Vll/VIIa”是指由未活化形式(因子VII)或活化形式(因子 Vila)或其混合物组成的产物。上述定义中的“因子Vll/VIIa”包括具有天然人因子VII / VIIa的氨基酸序列的蛋白质。它还包括具有稍加修饰的氨基酸序列的蛋白质，例如，修饰的 N末端包括N端氨基酸缺失或添加，只要这些蛋白质基本上保持因子VIIa的活性。上述定 义中的“因子VII ”还包括可存在和发生在一个个体到另一个个体间的天然等位基因变异。 同样，糖基化程度和位置或其它翻译后修饰可以随所选择的宿主细胞和宿主细胞环境的性 质而改变。在钙离子存在时，因子VIIa以高亲和力与TF结合。TF是263个氨基酸残基糖蛋 白，由219个残基胞外域、一个跨膜结构域和一个短胞质域组成(Morrissey等，1987，Cell 50 129-35)。TF胞外域由两个各约105个氨基酸的纤连蛋白III型结构域组成。FVIIa的 结合完全是由TF胞外域介导的(Muller等，1994, Biochem. 33 10864-70)。氨基酸16-26和 129-147区域的残基有助于FVIIa的结合以及分子的促凝功能。残基Lys20、Trp45、Asp58、 Tyr94和Phel40对FVIIa结合的自由能(AG)的贡献较大(lkcal/mol)。TF在血浆分隔开的细胞和血管内皮上组成型表达。通过暴露于炎性细胞因子或细 菌脂多糖诱导其在内皮细胞和单核细胞上表达(Drake等，1989，J. Cell Biol. 109 389)。 在组织受损时，TF暴露的胞外域与FVII形成高亲和力的钙依赖性复合物。一旦与TF结合， 可通过肽键切割产生丝氨酸蛋白酶FVIIa而激活FVII。尚未阐明体内催化这个步骤的酶， 但是体外FXa、凝血酶、TF FVIIa和FIXa可以催化这种切割。FVIIa对其生理底物FX和FIX 只有弱的活性，而TF:FVIIa复合物快速激活FX和FIX。TF:FVIIa复合物构成血液凝固外源途径的初级引发物。复合物通过激活FX成为 因子Xa (FXa)、激活FIX成为因子IXa (FIXa)及激活其它FVII成为FVIIa而启动外源途径。 TF:FVIIa的作用最终导致凝血酶原转化成可进行许多生物功能的凝血酶。凝血酶最重要的 活性是将血纤蛋白原转化为血纤蛋白，而血纤蛋白聚合形成凝块。TF:FVIIa复合物还作为 次级因子参与延伸接触激活系统的生理效应。凝血的初始调节和后续调节是复杂的，因为止血的维持对于生存是决定性的。在 止血(正常凝块形成和溶解)和血栓形成(病理凝块形成)之间存在微妙的平稳。涉及凝 血异常的严重临床病症包括深静脉血栓形成、心肌梗死、肺栓塞、中风和弥散性血管内凝血 (脓毒症中)。还有许多流血性凝血病，其中凝块形成不足。这些包括血友病A(FVIII缺乏 症)或血友病B(FIX缺乏症)，其中需要促凝血疗法。这个治疗领域的挑战是在太多凝血和 太少凝血之间的窄窗位下操作。研究表明，用作治疗剂的外源FVIIa在血友病A和血友病B患者中诱导止 血(Hedner，2001， Seminars Hematol. 38 ( ±曾干Ij 12) 43-7 ；Hedner, 2004, Seminars Hemat01.41(增刊1) :35_9)。它还被用来治疗肝病患者的出血、抗凝血诱发性出血、夕卜 科手术、血小板减少、血小板机能不全、Bemard-Soulier综合征、冯威勒布兰特氏病(von Willebrand disease)和其它出血病症(参见例如Roberts 等，2004，Blood 104 :3858_64)。人重组FVIIa的市售制剂以NovoSeven 销售。NovoSeven 标明用于治疗血友病 A或B患者的出血，而且是现行唯一有效用于出血的重组FVIIa。在“Summary Basis for Approval for NovoSeven ”FDA参考号96-0597中报道了半寿期为2. 3小时的循环重组，重组FVIIa的半寿期在儿科患者中较短(约1.3小时)，这就表明在这个人群 中可能需要较高剂量的重组FVIIa (Roberts等，2004，Blood 104:3858-64)。因此，需要相 对较高剂量和频率的给药以达到和维持所需要的治疗或预防效果。因此，难以获得适当的 剂量调节，并且频繁的静脉内给药的需要给患者的生活方式带来限制。具有较长循环半寿期的分子可减少需要的给药次数。考虑到现行可用的FVIIa疗 法的频繁注射问题以及为了获得FVIIa的更佳治疗水平以及伴随的治疗效果提高的潜力， 显然需要体内半寿期较长的改进的FVII或FVIIa样分子。已经证实，重组人凝血因子 VIIa(rFVIIa，NovoSeven ；Novo NordiskA/S, Copenhagen, Denmark)与抑制剂一起有效治疗血友病患者的出血。少部分患者可能对 rFVIIa治疗无效，可能获益于具有功效提高的遗传修饰的FVIIa分子。为此，已经对 固有活性提高的FVIIa类似物进行了研究，其表现出上好的体外止血特性(参见例如 W002/077218或W005/074975，其通过引用其整体结合到本文中，以及Tranholm等，2003， Blood 102(10) :3615-20，同样通过引用结合)。这些类似物还可以在其中已观察到rFVIIa 功效的其它适应症(包括血小板减少和创伤)中用作更有效的止血药。因此，在一些实施方案中，可用于本发明的因子VIIa类似物与W002/077218或 W005/074975所描述的一样。例如，FVIIa类似物可具有在298位取代甲硫氨酸的谷氨酰 胺(即iC98Q-FVIIa)。在某些示例性实施方案中，FVIIa类似物含有两个其它突变，158位 的缬氨酸被天冬氨酸置换，296位的谷氨酸被缬氨酸置换(即V158D/E^6V/iC98Q-FVIIa)。 或者，因子VIIa类似物可具有在337位取代赖氨酸的丙氨酸残基(即V158D/E^6V/iC98Q/ K337A-FVIIa)。在另一些实施方案中，因子Vila类似物具有选自Q250C、P406C和407C的 取代或插入，其中半胱氨酸也被引入C端序列(参见例如US 7，235，638，其通过引用其整体 结合到本文中)。因子VIIa类似物还可包含在M7J60、393、396和/或405位的一个或多 个位置上的取代或插入。在这些或其它实施方案中，因子VIIa类似物包含相对于天然因子VIIa序列的选 自以下的取代(a)Lysl57被选自Gly、Val、Ser、Thr、ASp和Glu的氨基酸取代；(b) Lys337 被选自 Ala、Gly、Val、Ser、Thr、Gin、Asp 和 Glu 的氨基酸取代；(c) Asp334 被 Ala 或 Asn 以外的任何氨基酸取代；和(d) Ser336被Ala或Cys以外的任何氨基酸取代(参见例如US 7，176，观8，其通过引用其整体结合到本文中)。或者，因子VIIa类似物包含因子VII 305位 上的Leu被选自以下的氨基酸残基取代Val、lie、Met、Phe、Trp、Pro, Gly、Ser, Thr、Cys、 Tyr、Asn、Glu、Lys, Arg、His、Asp和Gln (参见例如US 6，905，683，其通过引用其整体结合 到本文中)。因此，一方面，本发明提供包含弹性蛋白样肽(ELP)和因子Vll/VIIa或其功能类 似物的治疗剂。例如，在某些实施方案中，因子Vll/VIIa是人因子Vll/VIIa(例如SEQ ID NO 33)。因子Vll/VIIa可以是人因子Vll/VIIa的功能类似物，包括在N端和/或C端截 短达1-10个氨基酸(包括1、2、3或约5个氨基酸)的功能片段。相对于天然序列(例如 SEQ ID NO 33)，功能类似物可含有1_10个氨基酸插入、缺失和/或取代(总体上)，并且 在每种情况下都保持肽的活性。例如，相对于天然全长序列，或相对于重链和轻链之一或两 者，这类类似物可具有1个至约5个氨基酸插入、缺失和/或取代(总体上)。可采用任何 可获得的测定法(包括本文所述方法)证实或测定这类活性。在这些或其它实施方案中，因子VII/VIIa成分与天然序列(SEQ ID NO :33)有至少约75%、80%、85%、90%、95%或 98%同一性。两个序列之间(例如天然序列和功能类似物之间)序列同一性的测定可采 用7[壬 可比对工具完成，包f舌 Tatusova 等，Blast 2 seauences~a new tool for comparinR protein andnucleotide sequences (Blast 2序列一一禾中比较蛋白质禾口核昔酸序列的新型 工具),FEMS Microbiol Lett. 174 :247-250(1999)。在示例性的实施方案中，因子VII-ELP融合物具有SEQ ID NO 58的氨基酸序列。 SEQ ID NO 58在因子VII和ELP序列之间还包含TEV蛋白酶切割位点，这可能对需要时在 表达后脱去ELP序列是有益的。然而，按照本发明，可完全脱去tev序列，或用如本文公开 的其它连接序列置换。另一方面，本发明提供用于治疗或预防出血相关疾病的方法。所述方法包括给予 有需要的患者有效量的包含弹性蛋白样肽(ELP)和因子VII/VIIa或其功能类似物的治疗 剂。在某些实施方案中，出血相关疾病是一种或多种血友病(A或B)、手术后出血、抗凝血 诱发性出血、血小板减少、因子VII缺乏症、因子XI缺乏症、肝病患者的出血、血小板机能不 全、Bemard-Soulier综合征、冯威勒布兰特氏病和颅内出血。患者一般是人或非人类动物 (例如狗、猫、牛或马)患者。优选患者是人。为了表征疑似因子VII/VIIa类似物或含有ELP的因子VIIa类似物的体外结合 性质，如前所述进行TF结合测定(参见例如Chaing等，1994，Blood83 (12) =3524-35)。简 单地讲，可将重组人TF在碳酸盐抗原缓冲液中于4°C过夜包被于Immulon II板上。同样 将BSA包被于板上用作对照。将含有ELP的因子VIIa类似物以不同浓度加入TBS-T缓冲 液中。几次洗涤后，加入单特异性多克隆兔抗人FVIIa血清，并于室温温育约1小时。接下 来，依次加入与碱性磷酸酶缀合的山羊抗兔IgG和用于检测的碱性磷酸酶底物PNPP。减去 背景信号后，读取约405nm下的吸光度，其与因子VIIa结合固定化TF的程度成正比。然后 将这些值与含有因子VIIa的对照血浆进行比较。可以在人FVII缺乏症血浆中测定因子VII/VIIa类似物或含有ELP的因子VIIa类 似物的凝血能力。在该测定法中，将稀释成不同浓度的含有ELP的因子VIIa类似物直接加 入FVII缺乏症血浆中。在血凝仪中，可将一份血浆士FVIIa类似物与2份hn0VinTM(Dade， Miami,Fla)凝血酶原时间试剂(具有磷脂和CaCl2的重组人组织因子)混合。目测凝块形 成，测量凝固时间。将凝固时间(秒)与仅FVII缺乏症血浆的平均凝固时间进行比较，按 凝固时间相对于FVIIa类似物浓度作图。治疗性蛋白质本发明还提供包含选自表1的ELP成分和至少一种治疗性蛋白质的治疗剂。ELP 成分和治疗性蛋白质可通过本文所述的重组融合或化学缀合偶联。这类治疗性蛋白质以蛋 白质名称和Geru^eq Accession号列于表1中。本领域已知的各治疗性蛋白质的氨基酸序 列，通过引用表1所列各治疗性蛋白质结合到本文中。同样列于表1的美国专利或PCT公 开文本中进一步描述了这类治疗性蛋白质，且这类美国专利和PCT公开文本，尤其有关这 类治疗性蛋白质的结构和所描述的功能类似物通过引用结合到本文中。表1还记载了所列各种治疗性蛋白质的生物活性，以及测定本发明的功能类似物 或药剂(例如与ELP成分的融合物)的活性的示例性测定法。通常，表1所列治疗性蛋白 质的功能类似物可包括在N端和/或C端截短1-10个氨基酸(包括1、2、3、4或约5个氨基酸)的功能片段。相对于基础序列(例如表1所列基础序列)，功能类似物可含有1-10 个氨基酸插入、缺失和/或取代(总体上)，并在每种情况下保持治疗性蛋白质的全部或部 分生物活性(如表1所列活性)。例如，与基础序列相比，功能类似物可具有1、2、3、4或5 个氨基酸插入、缺失和/或取代(总体上)。可采用任何可获得的测定法(包括表中所述测 定法)证实或测定这类活性。在这些或其它实施方案中，治疗性蛋白质与相应的基础序列 有至少约75%、80%、85%、90%、95%或98%同一性。所述分子还可包含本领域已知的其 它化学修饰。在一些实施方案中，治疗性蛋白质(例如选自表1的治疗性蛋白质)的大小小于 约25kDa，或小于约IOkDa,或小于约5kDa，本发明相应的治疗剂(例如包含ELP成分)的分 子量小于约 60kDa、55kDa、50kDa 或 40kDa。表1还列出各治疗性蛋白质优选的适应症，其相应的治疗剂可用于例如有关这类 适应症的治疗或预防方法中。
权利要求
1.一种治疗剂，其包含弹性蛋白样肽(ELP)成分和治疗成分，当与单独的所述治疗成 分相比时，所述治疗成分具有延长的循环半寿期和/或较低的治疗有效量。
2.权利要求1的治疗剂，其中所述治疗成分是表1所列的治疗性蛋白质或其功能部分 或功能类似物。
3.权利要求2的治疗剂，其中ELP成分在其N端和/或C端共价结合所述治疗性蛋白质。
4.权利要求1-3中任一项的治疗剂，其中一个治疗成分在所述ELP成分的N端与ELP 成分共价结合，而第二治疗成分在所述ELP成分的C端与ELP成分共价结合。
5.权利要求1-4中任一项的治疗剂，其中治疗成分在其N端和/或C端共价结合所述 ELP成分。
6.权利要求1-5中任一项的治疗剂，其中第一ELP成分在所述治疗成分的N端与治疗 成分共价结合，而第二 ELP成分在所述治疗成分的C端与治疗成分共价结合。
7.权利要求1-6中任一项的治疗剂，其还包含在所述ELP成分和治疗成分之间的间隔 基部分。
8.权利要求7的治疗剂，其中所述间隔基部分包含一个或多个蛋白酶抗性部分、非肽 化学部分和蛋白酶切割位点。
9.权利要求8的治疗剂，其中所述蛋白酶切割位点是凝血酶切割位点、因子切割位 点、金属蛋白酶切割位点、肠激酶切割位点、Tev切割位点和组织蛋白酶切割位点。
10.权利要求9的治疗剂，其中所述间隔基部分包含具有式[(Gly)n-kr]m(SEQID NO 22)的不可切割部分，其中η为1-4;且m为1-4。
11.权利要求1-10中任一项的治疗剂，其中所述ELP包含至少一个选自SEQID NO: 1-12的重复单元。
12.权利要求11的治疗剂，其中所述重复单元是VPGXG(SEQID NO :3)。
13.权利要求12的治疗剂，其中X为任何天然或非天然的氨基酸残基，且其中X在至少 两个单元中不同。
14.权利要求13的治疗剂，其中每个X独立选自以下氨基酸残基丙氨酸、精氨酸、天 冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨 酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
15.权利要求1-14中任一项的治疗剂，其中所述治疗剂的分子量小于约50kDa。
16.权利要求1-15中任一项的治疗剂，其中所述ELP成分的Tt大于37°C。
17.权利要求1-16中任一项的治疗剂，其中所述治疗剂是遗传编码的融合蛋白。
18.一种多核苷酸，其包含编码权利要求17的治疗剂的核苷酸序列。
19.权利要求18的多核苷酸，其还包含与所述核苷酸序列有效连接的表达调控元件。
20.权利要求19的多核苷酸，其中所述表达调控元件包含启动子。
21.一种载体，其包含权利要求18-20中任一项的多核苷酸。
22.—种分离的宿主细胞，其含有权利要求21的载体或权利要求18-20中任一项的多核苷酸。
23.一种药物组合物，其包含权利要求1-18中任一项的治疗剂和药学上可接受的载体 和/或赋形剂。
24.一种治疗或预防患者的疾病、障碍或病症的方法，所述方法包括将有效量的权利要 求1-17中任一项的治疗剂或权利要求23的药物组合物给予需要它的患者。
25.权利要求M的方法，其中所述患者患有表1所列的适应症。
26.一种治疗剂，其包含弹性蛋白样肽(ELP)成分和胰高血糖素样肽(GLP)-I受体激动剂。
27.权利要求沈的治疗剂，其中所述GLP-I受体激动剂是GLP-I或其功能类似物。
28.权利要求沈的治疗剂，其中所述GLP-I受体激动剂是毒蜥外泌肽-4或其功能类似物。
29.权利要求沈-观中任一项的治疗剂，其中所述ELP成分在其N端和/或C端共价结 合所述GLP-I受体激动剂。
30.权利要求沈-29中任一项的治疗剂，其中第一GLP-I受体激动剂在所述ELP成分 的N端与ELP成分共价结合，而第二 GLP-I受体激动剂在所述ELP成分的C端与ELP成分 共价结合。
31.权利要求沈-30中任一项的治疗剂，其中所述GLP-I受体激动剂在其N端和/或C 端共价结合所述ELP成分。
32.权利要求沈-31中任一项的治疗剂，其中第一ELP成分在所述GLP-I受体激动剂 的N端与GLP-I受体激动剂共价结合，而第二 ELP成分在所述GLP-I受体激动剂的C端与 GLP-I受体激动剂共价结合。
33.权利要求沈-32中任一项的治疗剂，其还包含在所述ELP成分和GLP-受体激动剂 之间的间隔基部分。
34.权利要求33的治疗剂，其中所述间隔基部分包含一个或多个蛋白酶抗性部分、非 肽化学部分和蛋白酶切割位点。
35.权利要求34的治疗剂，其中所述蛋白酶切割位点是凝血酶切割位点、因子fe切割 位点、金属蛋白酶切割位点、肠激酶切割位点、Tev切割位点和组织蛋白酶切割位点。
36.权利要求34的治疗剂，其中所述间隔基部分包含具有式[(Gly)n-kr]m(SEQID NO 22)的不可切割部分，其中η为1-4 ；且m为1_4。
37.权利要求沈-36中任一项的治疗剂，其中所述ELP包含至少一个选自SEQID NO: 1-12的重复单元。
38.权利要求37的治疗剂，其中所述重复单元是VPGXG(SEQID NO :3)。
39.权利要求38的治疗剂，其中X为任何天然或非天然的氨基酸残基，且其中X在至少 两个单元中不同。
40.权利要求38的治疗剂，其中每个X独立选自以下氨基酸残基丙氨酸、精氨酸、天 冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨 酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
41.权利要求沈-40中任一项的治疗剂，其中所述治疗剂的分子量小于约50kDa。
42.权利要求沈-40中任一项的治疗剂，其中所述ELP成分的Tt大于37°C。
43.权利要求沈-42中任一项的治疗剂，其中所述治疗剂是遗传编码的融合蛋白。
44.一种多核苷酸，其包含编码权利要求43的治疗剂的核苷酸序列。
45.权利要求44的多核苷酸，其还包含与所述核苷酸序列有效连接的表达调控元件。
46.权利要求45的多核苷酸，其中所述表达调控元件包含启动子。
47.一种载体，其包含权利要求44-46中任一项的多核苷酸。
48.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求47的载体或权利要求44-46中任一项的多 核苷酸。
49.一种药物组合物，其包含权利要求沈-43中任一项的治疗剂和药学上可接受的载 体和/或赋形剂。
50.一种治疗或预防患者的生物学病症、障碍或疾病的方法，所述方法包括将有效量的 权利要求26-43中任一项的治疗剂或权利要求49的药物组合物给予需要它的患者。
51.权利要求50的方法，其中所述患者患有糖尿病。
52.一种治疗剂，其包含弹性蛋白样肽(ELP)成分和胰岛素或其功能类似物。
53.权利要求52的治疗剂，其中所述ELP成分在其N端和/或C端共价结合所述胰岛 素或功能类似物。
54.权利要求52或53的治疗剂，其中第一胰岛素或功能类似物在所述ELP成分的N端 与ELP成分共价结合，而第二胰岛素或功能类似物在所述ELP成分的C端与ELP成分共价结合。
55.权利要求52的治疗剂，其中所述胰岛素或功能类似物在其N端和/或C端共价结 合所述ELP成分。
56.权利要求52或53的治疗剂，其中第一ELP成分在其N端共价结合所述胰岛素或功 能类似物，而第二 ELP成分在其C端共价结合所述胰岛素或功能类似物。
57.权利要求52-56中任一项的治疗剂，其还包含在所述ELP成分和所述胰岛素或功能 类似物之间的间隔基部分。
58.权利要求57的治疗剂，其中所述间隔基部分包含一个或多个蛋白酶抗性部分、非 肽化学部分和蛋白酶切割位点。
59.权利要求58的治疗剂，其中所述蛋白酶切割位点是凝血酶切割位点、因子fe切割 位点、金属蛋白酶切割位点、肠激酶切割位点、Tev切割位点或组织蛋白酶切割位点。
60.权利要求58的治疗剂，其中所述间隔基部分包含具有式[(Gly)n-kr]m(SEQID NO 22)的不可切割部分，其中η为1-4 ；且m为1_4。
61.权利要求52-60中任一项的治疗剂，其中所述ELP成分包含至少一个选自SEQID NO 1-12的重复单元。
62.权利要求61的治疗剂，其中所述重复单元是VGPXG(SEQID NO :3)。
63.权利要求61的治疗剂，其中所述重复单元是Ile-Pro-Gly-X-Gly(SEQ ID NO :5)或 Leu-Pro-Gly-X-Gly (SEQ ID NO :7)，其中X为任何天然或非天然的氨基酸残基，且其中X在 至少两个单元中不同。
64.权利要求62或63的治疗剂，其中每个X独立选自以下氨基酸残基丙氨酸、精氨 酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲 硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
65.权利要求52-64中任一项的治疗剂，其中所述治疗剂的分子量小于约50kDa。
66.权利要求52-65中任一项的治疗剂，其中所述ELP成分的Tt大于37°C。
67.权利要求52-66中任一项的治疗剂，其中所述治疗剂是遗传编码的融合蛋白。
68.一种多核苷酸，其包含编码权利要求67的治疗剂的核苷酸序列。
69.权利要求68的多核苷酸，其还包含与所述核苷酸序列有效连接的表达调控元件。
70.权利要求69的多核苷酸，其中所述表达调控元件包含启动子。
71.一种载体，其包含权利要求68-70中任一项的多核苷酸。
72.—种分离的宿主细胞，其包含权利要求71的载体或权利要求68-70中任一项的多核苷酸。
73.一种药物组合物，其包含权利要求52-67中任一项的治疗剂和药学上可接受的载 体和/或赋形剂。
74.一种预防或治疗患者的生物学病症、障碍或疾病的方法，所述方法包括将有效量的 权利要求52-67中任一项的治疗剂或权利要求73的药物组合物给予需要它的患者。
75.权利要求74的方法，其中所述患者患有糖尿病。
76.一种治疗剂，其包含弹性蛋白样肽(ELP)成分和因子Vll/VIIa或其功能类似物。
77.权利要求76的治疗剂，其中所述ELP成分与所述因子Vll/VIIa或功能类似物在因 子Vll/VIIa的N端和/或C端共价结合。
78.权利要求76或77的治疗剂，其中第一因子Vll/VIIa或功能类似物在所述ELP成 分的N端与ELP共价结合，而第二因子Vll/VIIa或功能类似物在所述ELP成分的C端与 ELP成分共价结合。
79.权利要求76的治疗剂，其中所述因子Vll/VIIa或功能类似物与所述ELP成分在 ELP成分的N端和/或C端共价结合。
80.权利要求76或77的治疗剂，其中第一ELP成分在其N端共价结合所述因子VII/ VIIa或功能类似物，而第二 ELP成分在其C端共价结合所述因子Vll/VIIa或功能类似物。
81.权利要求76-80中任一项的治疗剂，其还包含在所述ELP成分和因子Vll/VIIa或 功能类似物之间的间隔基部分。
82.权利要求81的治疗剂，其中所述间隔基部分包含一个或多个蛋白酶抗性部分、非 肽化学部分和蛋白酶切割位点。
83.权利要求82的治疗剂，其中所述蛋白酶切割位点是凝血酶切割位点、因子fe切割 位点、金属蛋白酶切割位点、肠激酶切割位点、Tev切割位点和组织蛋白酶切割位点。
84.权利要求82的治疗剂，其中所述间隔基部分包含具有式[(Gly)n-kr]m(SEQID NO 22)的不可切割部分，其中η为1-4 ；且m为1_4。
85.权利要求76-84中任一项的治疗剂，其中所述ELP成分包含至少一个选自SEQID NO 1-12的重复单元。
86.权利要求85的治疗剂，其中所述重复单元是VPGXG(SEQID NO 3)。
87.权利要求86的治疗剂，其中X为任何天然或非天然的氨基酸残基，且其中X在至少 两个单元中不同。
88.权利要求86的治疗剂，其中每个X独立选自以下氨基酸残基丙氨酸、精氨酸、天 冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨 酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
89.权利要求76-88中任一项的治疗剂，其中所述治疗剂的分子量小于约70kDa。
90.权利要求76-89中任一项的治疗剂，其中所述ELP成分的Tt大于37°C。
91.权利要求76-90中任一项的治疗剂，其中所述治疗剂是遗传编码的融合蛋白。
92.一种多核苷酸，其包含编码权利要求91的治疗剂的核苷酸序列。
93.权利要求92的多核苷酸，其还包含与所述核苷酸序列有效连接的表达调控元件。
94.权利要求93的多核苷酸，其中所述表达调控元件包含启动子。
95.一种载体，其包含权利要求92-94中任一项的多核苷酸。
96.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求95的载体或权利要求92-95中任一项的多核苷酸。
97.一种药物组合物，其包含权利要求76-91中任一项的治疗剂和药学上可接受的载 体和/或赋形剂。
98.一种预防或治疗患者的生物学病症、障碍或疾病的方法，所述方法包括将有效量的 权利要求76-91中任一项的治疗剂或权利要求97的药物组合物给予需要它的患者。
99.权利要求98的方法，其中所述患者患有出血症。
100.权利要求98或99的方法，其中所述患者患有血友病。
全文摘要
本发明提供包含弹性蛋白样肽(ELP)和治疗性蛋白质的治疗剂和组合物。在一些实施方案中，治疗性蛋白质是GLP-1受体激动剂、胰岛素或因子VII/VIIa，包括功能类似物。本发明还提供编码多核苷酸，以及制备和使用所述治疗剂的方法。就其用作治疗剂的用途而言，本发明治疗剂具有改进性质，特别包括体内半寿期、清除率和/或持久性、溶解度和生物利用度中的一种或多种改进性质。
文档编号A61K38/00GK102131516SQ200980134124
公开日2011年7月20日 申请日期2009年6月29日 优先权日2008年6月27日
发明者A·基尔科蒂 申请人:杜克大学