骨髓纤维化处理剂的制作方法

专利名称：骨髓纤维化处理剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及以骨髓中的细胞外基质产生细胞为靶的物质递送用载体、和使用了对 骨髓中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制的药物的骨髓纤维化处理剂和骨髓 纤维化的处理方法。
背景技术：
骨髓纤维化是导致骨髓中发生大范围的弥漫性纤维化的疾病的总称，其中包括原 因不明的原发性骨髓纤维化和存在基础疾病的继发性骨髓纤维化。原发性骨髓纤维化的特征在于伴随着全身的骨髓的纤维化和肝、脾中的髓外造 血，可见末梢血中出现幼粒细胞和幼红细胞的幼白红细胞增多症，其属于慢性骨髓增殖性 疾病。原发性骨髓纤维化的真实状态为包括以造血干细胞水平产生的Jak2的基因突变 在内的基因异常所导致的单克隆的造血细胞的增殖。由增殖的造血系细胞(主要是巨核细 胞)产生的各种细胞因子作用于骨髓间质细胞，引起骨髓的纤维化、骨硬化、新生血管等、 反应性的多克隆的骨髓间质细胞的增殖。其结果表现出无效造血、末梢血中出现泪滴状红 细胞、幼白红细胞增多症、髓外造血所导致的巨脾等特征性的临床症状。在约40%的原发性骨髓纤维化中，细胞因子的信号传递所必需的酪氨酸激酶即 Jak2发生基因突变，其结果，Jak2即使在没有细胞因子刺激的状态下也被恒定地活化。除 Jak2以外，也存在少数c-mpl (血小板生成素的受体)发生基因突变的症例。目前原发性骨髓纤维化难以通过药物疗法治愈，同种造血干细胞移植成为唯一的 治愈性治疗方法。但是，移植相关的死亡率高达25 48%，与此相伴，总存活率仅50%左 右。最近，治疗相关毒性更少的骨髓非破坏性干细胞移植(minimized implantation)的有 用性受到关注，但仅少数例子得到研究，长期预后也不清楚。作为药物疗法，仅限于对症疗法，达那唑、美替诺龙等蛋白同化激素、沙利度胺、来 那度胺等新生血管抑制剂、羟基脲、阿那格雷、伊马替尼、2-氯脱氧腺苷、美法仑、白消安、依 托泊甙等抗肿瘤药、促红细胞生成素等药剂显示出对贫血、血小板减少症、脾肿大具有有效 性(参照非专利文献1和2)。另一方面，继发性骨髓纤维化是继发于急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、 慢性髓细胞白血病、真性红细胞增加症、原发性血小板增多症、骨髓增生异常综合症、多发 性骨髓瘤、恶性淋巴瘤、癌、全身性红斑狼疮、全身性进行性硬化症等疾病或放射线照射等 的疾病，其表现出与原发性骨髓纤维化同样的骨髓像。继发性骨髓纤维化的治疗主要关注 基础疾病的改善，但大多情况下基础疾病也很难根治，因此强烈要求减轻骨髓纤维化自身 的不良影响。鉴于此种情况，大多的研究努力都关注于骨髓纤维化治疗剂的开发。其结果，报告 了例如酪氨酸激酶JAK2V617F的抑制剂、TGF-β可溶性受体等的TGF-β抑制剂、硼替佐米 等NF κ B抑制剂、地西他滨等DNA甲基转移酶抑制剂、曲古抑菌素A等组蛋白去乙酰化酶抑 制剂、ΡΤΚ787/Ι222584、贝伐单抗等VEGF抑制剂(参照非专利文献1)、某种抗人淋巴细胞抗体(参照专利文献1)等药剂在骨髓纤维化动物模型或临床试验中收到了某种程度的成 果。但是，这些药剂还均不能令人满意，需要开发进一步的骨髓纤维化治疗剂。专利文献1 日本特公平8-2799号公报专利文献2 国际公开第2006/068232号小册子非专利文献 1 =Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2007 ；2007 :346-54非专利文献2 日本内科学会雑誌、第96卷、第7号、2007年7月10日、1398 1404 頁

发明内容
发明所要解决的课题本发明的目的在于提供新型的骨髓纤维化处理剂和骨髓纤维化的处理方法。用于解决课题的手段本发明人等在探求新的骨髓纤维化治疗剂的过程中发现，通过给予在含有类视黄 醇的载体上载持有细胞外基质产生抑制剂的组合物，能够有效地治疗骨髓纤维化，从而完 成了本发明。含有维生素A的载体已知向贮藏维生素A的星状细胞递送药物(参照专利文献 2)，但是到目前为止对于其与骨髓纤维化的关系还完全不清楚，另外，由于尚未见关于利用 以细胞外基质产生抑制剂为有效成分的组合物治疗骨髓纤维化的报告，因此本次的发现是 令人惊讶的。即，本发明涉及以下技术方案。(1) 一种针对骨髓中的细胞外基质产生细胞的物质递送用载体，其含有类视黄醇 作为靶向剂。(2)根据(1)所述的载体，其中，类视黄醇包含视黄醇。(3)根据⑴或⑵所述的载体，其中，类视黄醇的含量为载体总体的0.2 20重量％。(4)根据⑴ (3)中任一项所述的载体，其中，所述载体具有脂质体的形态，且类 视黄醇与脂质体所含的脂质的摩尔比为8 1 1 4。(5) 一种骨髓纤维化处理用组合物，其含有对骨髓中的细胞外基质产生细胞的活 性或增殖进行控制的药物。(6)根据(5)所述的组合物，其进一步含有(1) ⑷中任一项所述的载体。(7)根据( 或(6)所述的组合物，其中，对骨髓中的细胞外基质产生细胞的活 性或增殖进行控制的药物选自下述中的至少1个选自明胶酶A、明胶酶B和血管紧张素 原中的生理活性物质的活性或产生抑制剂、细胞活性抑制剂、增殖抑制剂、细胞凋亡诱导 剂、和以与细胞外基质构成分子或该细胞外基质构成分子的产生或分泌相关的分子为靶的 siRNA、核酶、反义核酸、DNA/RNA嵌合多核苷酸和表达它们的载体(vector)。(8)根据(7)所述的组合物，其中，与细胞外基质构成分子的产生或分泌相关的分 子为HSP47。(9)根据( (8)中任一项所述的组合物，其是在医疗的现场或其附近混合药物 和载体而成的。
(10) (6) (9)中任一项所述的组合物的制备试剂盒，其中，包括1个或1个以上 的容器，所述容器单独或组合地包含对骨髓中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控 制的药物、类视黄醇、以及根据需要使用的除类视黄醇以外的载体构成物质。(11) 一种siRNA，其以选自序列号13表示的核酸序列的1130 1145位、1485 1500位、1501 1516位、1654 1678位和1951 1978位中的部分为靴。(12)根据(11)所述的siRNA，其由以下A E的正义链与反义链的组合中的任一 种构成 A 5，-UGGAUGGGAAAGAUGCAGAAGAAGGAG-3，(正义链、序列号 UUUCUACGUCUUCUUCC-5，(反义链、序列号1)与 3' -UAACCUACCC2)的组合、B 5，-U⑶CUGAGUGGGUAUUUUUAGACAGAG-3，(正义链、序列号 ACCCAUAAAAAUCUGUC-5’(反义链、序列号 3)与 3，-UAACAGACUC4)的组合、C 5，-GAUGCGAGAUGA⑶UGUAGAGUCCAAG-3，(正义链、序列号 UACUCAACAUCUCAGGU-5，(反义链、序列号5)与 3，-UACUACGCUC6)的组合、D 5，-CAGAACUGCCCAUCCUUAAAAUGAUAG-3，(正义链、序列号 GGGUAGGAAUUUUACUA-5，(反义链、序列号7)与 3'-UAGUCUUGAC8)的组合、E 5，-GAGACAAGAUGCGAGAUGA⑶UGUAAG-3，(正义链、序列号 UACG⑶CUA⑶CAACAU-5，(反义链、序列号9)与 3，-UACUCU⑶UC10)的组合。发明的效果本发明的骨髓纤维化处理用组合物的正确的作用机制尚未完全弄清楚，但认为是 类视黄醇作为针对骨髓成纤维细胞等骨髓中的细胞外基质产生细胞的靶向剂发挥功能，通 过将有效成分例如对骨髓中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制的药物等递送 到该细胞，从而起到抗骨髓纤维化的效果。利用本发明的载体，由于能够将有效成分高效地递送到作用部位、甚至靶细胞，因 此使骨髓纤维化特别是到目前为止难以治疗的原发性骨髓纤维化等的治愈、进展的抑制或 发病的预防成为可能，对人的医疗和兽的医疗具有极大的贡献。此外，本发明的组合物由于包含到目前为止尚未知其对骨髓纤维化的有效性的对 细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制的药物作为有效成分，因此使通过与以往不同 的作用机制对骨髓纤维化进行处理成为可能，因此可期待改善使用以往作用机制的药剂时 没有效果的病理状态，并提高与这些以往的药剂并用时的治疗效果。另外，本发明的载体由于能够与任意的药剂(例如已有的骨髓纤维化治疗药)组 合并提高其作用效率，因此具有在制剂方面的应用范围广，能够简便地制造有效的处理剂 的优点。


图1为显示特发性骨髓纤维化患者的骨髓像的照片图。在患者1、患者2中均分 别在HE染色(左列)下可见骨梁的肥厚、在Gitter染色(中央)下可见网状纤维增生、在 Azan染色(右列)下可见胶原的沉积。图2为显示骨髓纤维化小鼠模型的病理状态的发病原理的图。图3为显示出生后4个月和7个月的TPO转基因小鼠的骨髓像的照片图。左列为HE染色像、中央为Gitter染色像、右列为Azan染色像。图4为显示出生后9个月和12个月的TPO转基因小鼠的骨髓像的照片图。左列 为HE染色像、中央为Gitter染色像、右列为Azan染色像。图5为显示TPO转基因小鼠的骨梁肥厚的推移的照片图。左上为出生后4个月 (4M)、右上为出生后7个月(7M)、左下为出生后9个月(9M)、右下为出生后12个月(12M) 时的骨髓的HE染色像。图6为显示用倒立显微镜观察TPO小鼠来源的原代培养骨髓成纤维细胞的细胞形 态的照片图(倍率X 400)。图7为显示用流式细胞仪分析在TPO小鼠来源的原代培养骨髓成纤维细胞中的波 形蛋白和α SMA的表达的结果的图。纵轴表示细胞数(Cellnumber)。图8为显示各种siRNA HSP47对ΝΙΗ3Τ3 (A)和TPO小鼠来源的原代培养骨髓成纤 维细胞(Primary f ibroblasts、B和C)的HSP47表达的效果的蛋白质印迹(western blot)像。图9为显示脂质体包埋HSP47siRNA (Lip-siRNA)的向TPO小鼠来源的原代培养骨 髓成纤维细胞导入维生素A(VA)的效果的图。A表示利用流式细胞仪法的分析结果、B表示 荧光显微镜像。图10为显示siRNA HSP47对TPO小鼠来源的原代培养骨髓成纤维细胞的胶原分 泌的效果的图。图11为显示siRNA HSP47对TPO小鼠的骨髓纤维化的体内效果的Gitter染色标 本的镜检像。图12为利用图像分析将siRNA HSP47所带来的TPO小鼠的网状纤维增生的改善 度数值化后得到的图。纵轴表示各视野中网状纤维的点占全部点的比例。图13为显示siRNA HSP47对TPO小鼠的骨髓纤维化的体内效果的Azan染色标本 的镜检像。图14为显示siRNA HSP47对TPO小鼠的骨髓纤维化的体内效果的HE染色标本的
镜检像。
具体实施例方式本发明涉及一种针对骨髓中的细胞外基质产生细胞的物质递送用载体，其含有类 视黄醇作为靶向剂。本发明中，骨髓中的细胞外基质产生细胞只要是存在于骨髓的具有细胞外基质产 生能力的细胞，则没有特别限定，典型地包括骨髓成纤维细胞。骨髓成纤维细胞的特征在于 表达a-SMA(a平滑肌肌动蛋白)。本发明中的骨髓成纤维细胞为可通过使用了可检测地 被标记的抗α-SMA抗体的免疫染色等进行鉴定的细胞。本发明中的类视黄醇只要是促进针对骨髓中的细胞外基质产生细胞的物质递送 的物质，则没有特别限定，例如可以使用视黄醇(维生素Α)、依曲替酯、维甲酸、异维甲酸、 阿达帕林、阿维a、他扎罗汀、棕榈酸视黄酯等类视黄醇衍生物、和芬维A胺G-HPR)、蓓萨罗 丁等维生素A类似物。本发明中的类视黄醇是促进针对骨髓中的细胞外基质产生细胞的特异性的物质递送的物质。类视黄醇促进物质递送的机理尚未完全弄清楚，但认为例如与RBP (视黄醇结 合蛋白，retinol binding protein)特异性地结合的类视黄醇通过位于骨髓中的细胞外基 质产生细胞的细胞表面上的某种受体而被该细胞摄入。类视黄醇是具有4个类异戊二烯单元头对尾式地连接而成的骨架的化合物的组 中的 1 员(参照 G. P. Moss, "Biochemical Nomenclature and Related Documents,，，2nd Ed. Portland Press, pp. 247-251 (1992)),维生素A是定性地表示视黄醇的生物学活性的 类视黄醇的一般性描述因子。作为本发明中可以使用的类视黄醇，没有特别限定，可列举出 例如视黄醇、视黄醛、视黄酸、视黄醇与脂肪酸的酯、脂肪族醇与视黄酸的酯、依曲替酯、维 甲酸、异维甲酸、阿达帕林、阿维a、他扎罗汀、棕榈酸视黄酯等类视黄醇衍生物、和芬维A胺 (4-HPR)、蓓萨罗丁等维生素A类似物。其中，从针对骨髓中的细胞外基质产生细胞的特异性的物质递送的效率的角度出 发，优选视黄醇、视黄醛、视黄酸、视黄醇与脂肪酸的酯(例如乙酸视黄酯、棕榈酸视黄酯、 硬脂酸视黄酯和月桂酸视黄酯等)和脂肪族醇与视黄酸的酯(例如视黄酸乙酯等)。包括类视黄醇的顺-反式在内的所有异构体都包括在本发明的范围内。类视黄醇 也可以被1个或2个以上的取代基取代。本发明中的类视黄醇当然包括分离状态的类视黄 醇，也包括与能够溶解或保持类视黄醇的介质溶解或混合的状态的类视黄醇。本发明的载体可以由这些类视黄醇本身构成，也可以通过使类视黄醇结合或包含 于与之不同的载体构成成分来构成。因此，本发明的载体可以含有除类视黄醇以外的载体 构成成分。作为该成分，没有特别限定，可以使用医药和药学领域中已知的任意成分，优选 可包含类视黄醇或可与类视黄醇结合的成分。作为这种成分，可列举出脂质、例如甘油磷脂等磷脂、鞘磷脂等鞘脂、胆固醇等甾 醇、大豆油、罂粟油等植物油、矿物油、蛋黄卵磷脂等卵磷脂类等，但并不限定于这些。其 中，优选可构成脂质体的物质，例如卵磷脂等天然磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二 棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)等半合成磷脂、二油酰磷脂酰胆碱 (DOPE)、二亚油酰磷脂酰胆碱(DLPC)、胆固醇等。作为特别优选的成分，可列举出可避免被网状内皮系统捕获的成分、例如 Ν-(α-三甲基胺基乙酰基)-二(十二烷基)-D-谷氨酰氯(TMAG)、N，N，，N”，N”，-四甲 基-N，N’，N”，N”’_四棕榈基精胺(TMTPS)、2，3-二油烯氧基-N-[2(精胺甲酰胺)乙基]-N， N-二甲基-1-丙烯胺三氟乙酸酯(DOSPA)、N-[1-(2，3-二油烯氧基)丙基]-N，N, N-三甲 基氯化铵(D0TMA)、二(十八烷基)二甲基氯化铵(DODAC)、二(十二烷基)溴化铵(DDAB)、 1，2_ 二油烯氧基-3-三甲基胺基丙烷(DOTAP)、3 β-[N-(N，，N，- 二甲基胺基乙烷)胺基 甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、1，2-二肉豆蔻酰氧基丙基-3-二甲基羟基乙基铵(DMRIE)、0， 0’ - 二(十四烷基)-Ν_(α-三甲基胺基乙酰基)二乙醇胺氯化物(DC-6-14)等阳离子性 脂质。本发明的类视黄醇与载体的结合或包含也可以通过下述方法实现利用化学和/ 或物理方法将类视黄醇结合或包含在载体的除类视黄醇以外的构成成分上。或者，本发明 的类视黄醇与载体的结合或包含也可以通过下述方法实现在该载体的制作时，将类视黄 醇与除类视黄醇以外的载体构成成分混合。本发明结合或包含在载体上的类视黄醇的量 可以为以重量比计在载体构成成分中为0. 01% 100%、优选为0. 2% 20%、更优选为1 5%。类视黄醇与载体的结合或包含也可以在使药物等载持于该载体之前进行，也可以 通过将载体、类视黄醇和药物等同时混合等来进行，或者通过将处于已载持有药物等的状 态的载体与类视黄醇混合等来进行。因此，本发明还涉及一种骨髓中的细胞外基质产生细 胞特异性的制剂的制造方法，其包括将类视黄醇与已知的任意的药物结合载体或药物封入 载体，例如DaunoXome (注册商标)、Doxi 1、Caelyx (注册商标)、Myocet (注册商标)等脂 质体制剂结合的工序。本发明的载体的形态只要能够将所希望的物质或物体搬运到作为靶的骨髓中的 细胞外基质产生细胞，则任何形态均可以，例如，并非是进行限定，可以采用高分子胶束、脂 质体、乳胶、微球、毫微球等中的任一形态。在本发明中，从递送效率高低、能够递送的物质 的选择范围宽窄和制剂的容易性等观点出发，这些载体中优选脂质体形态，其中特别优选 含有阳离子性脂质的阳离子性脂质体。当载体为脂质体形态时，类视黄醇与除类视黄醇以 外的脂质体构成脂质的摩尔比为当考虑类视黄醇与载体的结合或包含的效率性时，优选 为8 1 1 4、更优选为4 1 1 2、进一步优选为3 1 1 1、特别优选为 2 I0本发明的载体只要其所含的类视黄醇以作为靶向剂发挥功能的状态存在，则可以 在内部含有搬运物，也可以附着存在于搬运物的外部，还可以与搬运物混合。这里，作为靶 向剂发挥功能是指含有类视黄醇的载体比不含类视黄醇的载体更迅速、和/或大量地到达 和/或被摄入到靶细胞即骨髓中的细胞外基质产生细胞，这可以通过例如将带有标记或含 有标记的载体添加到靶细胞的培养物中，然后在规定时间后分析标记的存在部位来容易地 确认。从结构上来说，例如，通过使类视黄醇最迟在到达靶细胞之前，至少部分地露出到含 有载体的制剂的外部，则就能够满足上述条件。类视黄醇是否露出到制剂的外部可以通过 使制剂与和类视黄醇特异性地结合的物质、例如视黄醇结合蛋白(RBP)等接触，并研究其 对制剂的结合来进行评价。本载体递送的物质或物体并无特殊限制，优选为能够从给药部位向着靶细胞存在 的病变部位在生物体内物理移动的大小。因此，本发明的载体除了可以搬运原子、分子、化 合物、蛋白质、核酸等物质外，还可以搬运载体、病毒颗粒、细胞、由1个以上要素构成的药 物释放系统、微型设备(micromachine)等物体。上述物质或物体优选具有对靶细胞产生 某些影响的性质，包括例如对靶细胞进行标记的物质或物体，或控制靶细胞的活性或增殖 (例如增强或抑制其活性或增殖)的物质或物体。因此，在本发明的一个实施方式中，载体递送的物质是“对骨髓中的细胞外基质产 生细胞的活性或增殖进行控制的药物”。这里，骨髓中的细胞外基质产生细胞的活性是指骨 髓中的细胞外基质产生细胞所表现出的分泌、摄入、游走等各种活性，在本发明中，典型地， 其中特别是指与骨髓纤维化的发病、发展和/或复发等相关的活性。作为所述活性，例如， 并不是进行限定，可列举出例如明胶酶A和B (分别为MMP2和9)、血管紧张素原等生理活性 物质、胶原、蛋白聚糖、肌腱蛋白、纤连蛋白、血小板反应蛋白、骨桥蛋白、骨粘连蛋白、弹性 蛋白等细胞外基质成分等的产生、分泌等的产生、分泌。因此，对骨髓中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制的药物可以是直接 或间接地抑制与骨髓纤维化的发病、发展和/或复发相关的所述细胞的物理、化学和/或生 理作用等的任何药物，并不是进行限定，包括抑制上述生理活性物质的活性或产生的药物、巴马司他等MMP抑制剂、和中和所述生理活性物质的抗体和抗体片段、抑制所述生理活性 物质的表达的siRNA、核酶、反义核酸(包括RNA、DNA、PNA或它们的复合物)等物质、或显 性失活突变体等具有显性失活效果的物质、或表达它们的载体、抑制上述细胞外基质成分 等的产生、分泌的药物，例如抑制细胞外基质成分的表达的、siRNA、核酶、反义核酸(包括 RNA、DNA、PNA或它们的复合物)等物质、或显性失活突变体等具有显性失活效果的物质、 或表达它们的载体、钠通道抑制剂等细胞活性抑制剂、烷化剂(例如异环磷酰胺、盐酸尼莫 司汀、环磷酰胺、达卡巴嗪、美法仑、雷莫司汀等)、抗肿瘤性抗生素(例如依达比星、表柔比 星、柔红霉素、阿霉素、吡柔比星、博来霉素、培洛霉素、米托蒽醌、丝裂霉素C等)、抗代谢剂 (例如吉西他滨、依诺他滨、阿糖胞苷、替加氟·尿嘧啶、替加氟·吉莫斯特·氧嗪酸钾配合 剂、去氧氟尿苷、羟基脲、氟尿嘧啶、氨甲喋呤、巯基嘌呤等)、依托泊甙、盐酸伊立替康、酒 石酸长春瑞滨、多西他赛水合物、紫杉醇、硫酸长春新碱、硫酸长春地辛、硫酸长春碱等生物 碱，和钼尔定、顺钼、奈达钼等钼络合物等细胞增殖抑制剂、以及compound 861、胶霉毒素、 洛伐他汀、贝拉康坦等细胞凋亡诱导剂。另外，本发明中的“对骨髓中的细胞外基质产生细 胞的活性或增殖进行控制的药物”可以是直接或间接地促进直接或间接地与骨髓纤维化的 发病、发展和/或复发的抑制相关的骨髓中的细胞外基质产生细胞的物理、化学和/或生理 作用等的任何药物。本发明中的“对骨髓中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制的药物” 中优选的是抑制胶原、蛋白聚糖、肌腱蛋白、纤连蛋白、血小板反应蛋白、骨桥蛋白、骨粘 连蛋白、弹性蛋白等细胞外基质成分的产生、分泌的药物，特别优选HSP47 (Heat Shock ftx)tein(热休克蛋白质)47)的抑制剂、尤其是针对HSP47的siRNA。作为本发明的载体的递送物，并不是进行限定，可列举出抑制骨髓纤维化的发病、 发展和/或复发和/或症状的除上述药物以外的药物，例如并不是进行限定，可列举出达那 唑、美替诺龙等蛋白同化激素、沙利度胺、来那度胺等新生血管抑制剂、羟基脲、阿那格雷、 伊马替尼、2-氯脱氧腺苷、美法仑、白消安、依托泊甙等抗肿瘤药、促红细胞生成素、酪氨酸 激酶JAK2V617F的抑制剂、TGF- β可溶性受体等的TGF- β抑制剂、硼替佐米等NF κ B抑制 剂、地西他滨等DNA甲基转移酶抑制剂、曲古抑菌素A等组蛋白去乙酰化酶抑制剂、ΡΤΚ787/ ΖΚ222584、贝伐单抗等VEGF抑制剂、专利文献1中记载的抗人淋巴细胞抗体等。本发明的载体递送的物质或物体可以被标记也可以未被标记。通过进行标记，能 够监测搬运是否成功、靶细胞的增减等，在试验、研究水平特别有用。标记可以选择本领域 技术人员公知的任意标记，例如任意的放射性同位素、磁性体、与标记化物质结合的物质 (例如抗体)、荧光物质、荧光团、化学发光物质和酶等。本发明中，“骨髓中的细胞外基质产生细胞用”或”骨髓中的细胞外基质产生细胞 递送用”是指适于将骨髓中的细胞外基质产生细胞作为靶细胞使用，其包括例如能够向所 述细胞比向其他细胞例如正常细胞更迅速、高效和/或大量地递送物质。例如，与向其他的 细胞相比，本发明的载体能够以1. 1倍以上、1.2倍以上、1.3倍以上、1.5倍以上、2倍以上、 进而3倍以上的速度和/或效率向骨髓中的细胞外基质产生细胞递送物质。本发明还涉及含有所述对骨髓中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制 的药物并用于对骨髓中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制、或用于对骨髓纤维 化进行处理的组合物，以及所述对骨髓中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制的药物在这些的组合物的制造中的用途。上述药物可以单独地含有在组合物中，也可以与药 学上可容许的载体一起含有。本发明的组合物为了向作为靶的骨髓中的细胞外基质产生细 胞进行有效的递送，也可以被该细胞靶向化。靶向化只要是促进本发明的组合物向骨髓中 的细胞外基质产生细胞、例如骨髓成纤维细胞进行递送的方法，则没有特别限定，包括例如 类视黄醇的付加。因此，本发明的组合物的优选的实施方式可以含有类视黄醇作为靶向剂， 进一步优选包含含有上述类视黄醇作为靶向剂的载体。本发明中，骨髓纤维化不仅包括原发性骨髓纤维化，还包括继发性骨髓纤维化。继 发性骨髓纤维化，并不是进行限定，包括继发于急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、 慢性髓细胞白血病、真性红细胞增加症、原发性血小板增多症、骨髓增生异常综合症、多发 性骨髓瘤、恶性淋巴瘤、癌、全身性红斑狼疮、全身性进行性硬化症等疾病或放射线照射等 的骨髓纤维化。本发明中的骨髓纤维化可以利用本技术领域中已知的任意方法进行诊断。骨髓纤 维化最特征性的病理状态是骨髓的纤维化，这可以通过骨髓穿刺中无法采取骨髓液的情况 (dry tap)进行某种程度的判断。确定诊断通过利用骨髓活检确认骨髓的纤维化和/或骨 梁的增加来进行(参照图1)。对于原发性骨髓纤维化，除此之外，还可见贫血、肝脾肿大、末 梢血中的幼白红细胞增多症、泪滴红细胞等异形红细胞、母细胞(blast)、巨大血小板、巨核 细胞的出现、血清LDH的上升、利用骨髓闪烁扫描法可见的向肝脾中的摄入增加、有时有出 血倾向、腹胀、发热、全身倦怠感、体重减少等。另外，关于继发性骨髓纤维化，常常之前会出 现基础疾病的症状。基础疾病的具体症状对于本领域技术人员来说是熟知的。在本发明的组合物中，只要载体中所含的类视黄醇以作为靶向剂发挥功能的状态 存在，则载体可以在其内部含有递送物，也可以附着存在于递送物的外部，或者也可以与递 送物混合。因此，根据给药途径和药物释放模式等，可以将上述组合物用适当的材料例如肠 溶性包衣剂或定时崩解性材料包覆，也可以组合到适当的药物释放系统中。本发明的组合物可以通过包括经口和非经口这二者的各种途径，例如，并不是进 行限定，可以通过经口、静脉内、肌肉内、皮下、局部、肺内、气道内、气管内、支气管内、经鼻、 直肠内、动脉内、门静脉内、心室内、骨髓内、淋巴结内、淋巴管内、脑内、脑脊液腔、脑室内、 经粘膜、经皮、鼻内、腹腔内和子宫内等途径给药，也可以制成适于各给药途径的剂型。所述 剂型和制剂方法可以适当采用任意公知的剂型和制剂方法(例如参照標準薬剤学、渡辺喜 照6編、南江堂、2003年等)。例如，作为适于经口给药的剂型，并非是进行限定，可列举出散剂、颗粒剂、片剂、 胶囊剂、液体制剂、悬浮剂、乳剂、凝胶剂、糖浆剂等，另外，作为适于非经口给药的剂型，可 列举出溶液性注射剂、悬浮性注射剂、乳液性注射剂、用时制备型注射剂等注射剂。非经口 给药用制剂可以为水性或非水性的等渗性无菌溶液或悬浮液的形态。 本发明的组合物可以含有能够使骨髓纤维化治愈的、或能够减轻其发病、发展和/ 或复发和/或症状的1种或2种以上的任意的其他药剂，另外也可以与上述药剂并用。作 为上述药剂，并不是进行限定，包括例如达那唑、美替诺龙等蛋白同化激素、沙利度胺、来那 度胺等新生血管抑制剂、羟基脲、阿那格雷、伊马替尼、2-氯脱氧腺苷、美法仑、白消安、依托 泊甙等抗肿瘤药、促红细胞生成素、酪氨酸激酶JAK2V617F的抑制剂、TGF-β可溶性受体等 的TGF- β抑制剂、硼替佐米等NF κ B抑制剂、地西他滨等DNA甲基转移酶抑制剂、曲古抑菌素A等组蛋白去乙酰化酶抑制剂、PTK787/ZK222584、贝伐单抗等VEGF抑制剂、专利文献1 中记载的抗人淋巴细胞抗体等。当并用时，可以将本发明的组合物与上述其他药剂同时、或 者在其之前或在其之后给予。给予途径可以相同也可以不同。例如，可以将本发明的组合 物非经口给予，而将其他药剂经口给予等。本发明的载体或组合物可以以任何形态供给，但从保存稳定性的观点出发，优选 为能够用时制备的形态，例如以在医疗现场或其附近能够由医生和/或药剂师、护士或者 其他辅助医务人员等制备的形态提供。在此情况下，本发明的载体或组合物以包括这些所 必需的构成要素中的至少1个的1个或2个以上的容器的形式提供，在使用前，例如使用前 M小时以内、优选为使用前3小时以内，更优选在即将使用前制备。制备时，在进行制备的 场所，可以适当使用通常能够获得的试剂、溶剂、调剂器具等。因此，本发明还涉及载体或者组合物的制备试剂盒，其包括1个或2个以上的容 器，所述容器单独或组合地含有类视黄醇、和/或递送物、和/或除类视黄醇以外的载体构 成物质；以及涉及以这种试剂盒的形式提供的载体或组合物的必要构成要素。本发明的试 剂盒，除上述以外，还可以包括有关本发明的载体和组合物的制备方法和给药方法等的说 明书或CD、DVD等电子记录介质等。另外，本发明的试剂盒可以包括用于完成本发明的载体 或组合物的全部构成要素，也可以不一定包括全部的构成要素。因此，本发明的试剂盒可以 不包括在医疗现场、实验设施等通常能够获得的试剂或溶剂，例如无菌水、生理盐水或葡萄 糖溶液等。本发明进一步涉及用于对骨髓中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制 或用于对骨髓纤维化进行处理的方法，其包括将有效量的上述组合物对需要该组合物的对 象进行给药。这里，有效量，例如对于后者，是指抑制骨髓纤维化的发病和复发、减轻症状或 者延迟或停止发展的量，优选是能够预防骨髓纤维化的发病或复发、或使骨髓纤维化治愈 的量。另外，优选为不会产生超过给药所带来的好处的不良影响的量。所述量可以通过使 用了培养细胞等的体外试验或通过小鼠、大鼠、狗或猪等动物模型中的试验来适当确定，这 样的试验方法对于本领域技术人员来说是已知的。另外，载体中所含的类视黄醇、和本发明 的方法中使用的药物的用量对于本领域技术人员是公知的，或者可以通过上述试验等来适 当确定。在本发明的方法中，进行给药的组合物的具体用量可以考虑与需要处理的对象相 关的各种条件，例如症状的严重程度、对象的一般健康状态、年龄、体重、对象的性别、饮食、 给药的时期和频率、并用药物、对治疗的反应性以及对治疗的依从性等来确定。作为给药途径，包括经口和非经口这二者的各种途径，例如经口、静脉内、肌肉内、 皮下、局部、肺内、气道内、气管内、支气管内、经鼻、直肠内、动脉内、门静脉内、心室内、骨髓 内、淋巴结内、淋巴管内、脑内、脑脊液腔、脑室内、经粘膜、经皮、鼻内、腹腔内和子宫内等途 径。给药频率根据所用组合物的性状和上述那些对象的条件的不同而不同，例如可以 1日多次(即1日2、3、4次或5次以上)、1日1次、每几日(即每2、3、4、5、6、7日等)、1周 几次(例如1周2、3、4次等)、每周、每几周(即每2、3、4周等)。在本发明的方法中，词语“对象”是指任意的生物个体，优选为动物、更优选为哺乳 动物、进一步优选为人的个体。在本发明中，对象可以是健康的，也可以患有某种疾病，但在希望对骨髓纤维化进行处理的情况下，典型地是指患有骨髓纤维化或具有患骨髓纤维化的 危险的对象。例如当希望预防原发性骨髓纤维化时，并不是进行限定，典型的例子是Jak2 和/或c-mpl具有基因突变的对象，另外，当希望预防继发性骨髓纤维化时，并不是进行限 定，典型的例子是患有急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、真性 红细胞增加症、原发性血小板增多症、骨髓增生异常综合症、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤、 癌、全身性红斑狼疮、全身性进行性硬化症等疾病的对象或接受了放射线照射等的对象。另外，词语“处理”定义为包括以疾病的治愈、暂时缓解或预防等为目的的医学上 可容许的所有种类的预防性和/或治疗性干预。例如，词语“处理”的含义包括骨髓纤维化 的发展的延缓或停止、病变的萎缩或消失、骨髓纤维化发病的预防或复发的防止等各种目 的的医学上可容许的干预。本发明还涉及利用了上述载体的、针对骨髓中的细胞外基质产生细胞的药物递送 方法。该方法包括，并非是进行限定，例如使递送物载持于上述载体的工序、和将载持了递 送物的载体给予或添加到含有骨髓中的细胞外基质产生细胞的生物或介质、例如培养培养 基等的工序。这些工序可以按照公知的任意方法或本说明书中记载的方法等来适当完成。 上述递送方法还可以与其他的递送方法、例如以骨髓为靶的其他递送方法等组合。另外， 上述方法还包括在体外进行的方式、以及以体内的骨髓中的细胞外基质产生细胞为靶的方 式。本发明还涉及针对小鼠HSP47的新型的SiRNA、优选以选自序列号13的1130 1145位、1485 1500位、1501 1516位、1654 1678位和1951 1978位中的部分为靴 的siRNA。为了抑制基因表达，设计和制作针对所述基因的特定区域的siRNA的方法是本技 术领域中已知的，但是通常无法预测应当以基因的哪一部分为靶，只能通过实验来确认。本 发明中，从该HSP47表达抑制效果的强度出发，优选以序列号13的1501 1516位为靶的 siRNA和以1951 1978位为靶的siRNA。本发明的新型siRNA的几个优选的例子由以下 的正义链和反义链的组合构成。序列A 5，-UGGAUGGGAAAGAUGCAGAAGAAGGAG-3 ‘ CCCUUUCUACGUCUUCUUCC-5’(反义、序列号2)的组合。序列B 5，-U⑶CUGAGUGGGUAUUUUUAGACAGAG-3 ‘ CUCACCCAUAAAAAUCUGUC-5‘(反义、序列号4)的组合。序列C 5，-GAUGCGAGAUGA⑶UGUAGAGUCCAAG-3 ‘ CUCUACUCAACAUCUCAGGU-5，(反义、序列号6)的组合。序列D 5，-CAGAACUGCCCAUCCUUAAAAUGAUAG-3 ‘ GACGGGUAGGAAUUUUACUA-5，(反义、序列号8)的组合。序列E 5，-GAGACAAGAUGCGAGAUGA⑶UGUAAG-3 ‘
(正义、序列号1)与3’ -UAACCUA (正义、序列号3)与3’ -UAACAGA (正义、序列号5)与3’ -UACUACG (正义、序列号7)与3’ -UAGUCUU (正义、序列号9)与3’ -UACUCUG
UUCUACGCUCUACUCAACAU-5，(反义、序列号10)的组合。其中，从其HSP47表达抑制效果的强度出发，特别优选序列C和D。本发明的siRNA可以具有天然型的RNA结构，但为了提高生物体内稳定性、或改善 与靶序列的结合性等，也可以具有各种的修饰。作为所述的修饰，并不是进行限定，包括利 用末端的氨基、硫醇基、胆固醇、长链烷基、糖链、多肽等进行的修饰、脱碱基位点的形成、锁 核酸(LNA)、多肽核酸(PNA)、糖的2’位被修饰而得到的核苷酸、例如2’ -0-烷基、2’ -0-烷基-0-烷基或2’ -氟修饰核苷酸等修饰核酸的导入等。本发明的siRNA在抑制小鼠的HSP47的表达和抑制与之相伴的胶原的生成方面极 为有用，特别是可优选用于使用了小鼠的研究、实验、试验等。
实施例实施例1 骨髓纤维化小鼠模型的病理状态的确认作为骨髓纤维化的小鼠模型，使用下田和哉博士和原田实根博士开发的血小板生 成素(TPO)转基因小鼠(以下也记为TPO小鼠(参照Leukemia Research 29 :761-769, 2005))。该小鼠由于TPO基因导入细胞过量地产生ΤΡ0，因此骨髓中的巨核细胞增多，增多 的巨核细胞过量地产生转化生长因子β (transforming growth factor-beta,TGF-beta), 该因子刺激骨髓成纤维细胞，促进成纤维细胞的胶原分泌，引起骨髓纤维化(参照图2)。用通常的喂养条件喂养TPO小鼠(由九州大学实验设施部供给)，在出生后4、7、 9或12个月时使小鼠安乐死，采取骨髓并制作组织标本，分别用苏木素伊红(HE)染色、银 (Gitter)染色或偶氮卡红(Azan)染色进行染色，用光学显微镜观察骨髓像。结果示于图 3 5。出生后4个月(4M)时，完全未见骨髓的纤维化，出生后7个月(7M)时，虽然骨梁 的肥厚并不清楚(HE)，但可见网状纤维的增生(Gitter)和胶原的沉积(Azan)(参照图3)。出生后9个月(9M)和出生后12个月(12M)时，骨梁的肥厚均显著(HE)，并可见网 状纤维的增生(Gitter)和胶原的沉积(Azan)。另外，12M与9M相比，骨髓纤维化和骨梁肥 厚进一步发展(恶化)(参照图4)在TPO小鼠的骨髓HE标本中，从出生后9个月(9M)起骨梁开始肥厚，出生后12 个月(12M)时，骨梁肥厚进一步恶化(参照图5)。如上所述，在TPO小鼠中，确认表现出骨髓纤维化的症状。实施例2 siRNA的制作作为抑制骨髓中的细胞外基质产生细胞的活性的药物，制作以小鼠HSP47为靶的 siRNA (HSP47 siRNA)。具体地，制作具有以下序列的 5 种 HSP47 siRNA (HSP47 si RNA-A E)和随机si RNA (Random siRNA)，用于以后的实验中。其中，HSP47 siRNA购自株式会社 iGENE(东京)(HSP47 siRNA的靶序列根据2006年11月登记的数据库Refseq(GenBank Accession No. NM_009825)设计)。随机siRNA也购自株式会社iGENE(商品名dsRNA scramble)。HSP47 siRNA-A 5，-UGGAUGGGAAAGAUGCAGAAGAAGGAG-3，(正义、序列号1)3，-UAACCUACCCUUUCUAC⑶CUUCUUCC-5，(反义、序列号2)HSP47 siRNA-B :5，-U⑶CUGAGUGGGUAUUUUUAGACAGAG-3，(正义、序列号3)3，-UAACAGACUCACCCAUAAAAAUCUGUC-5，(反义、序列号4)HSP47 siRNA-C :5，-GAUGCGAGAUGA⑶UGUAGAGUCCAAG-3，(正义、序列号5)3，-UACUACGCUCUACUCAACAUCUCAG⑶-5，(反义、序列号6)HSP47 siRNA-D :5，-CAGAACUGCCCAUCCUUAAAAUGAUAG-3，(正义、序列号7)3，-UAGUCUUGACGGGUAGGAAUUUUACUA-5，(反义、序列号8)HSP47 siRNA-E 5' -GAGACAAGAUGCGAGAUGA⑶UGUAAG-3，(正义、序列号9)
3，-UACUCU⑶UCUACGCUCUACUCAACAU-5，(反义、序列号10)随机 siRNA :5，-CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG-3，(正义、序列号11)3，-UAGCUAAGCGAUCUGGCCGAAGUAACG-5，(反义、序列号12)另外，制作在5’侧标记了荧光色素6’ -羧基荧光素(6-FAM)的siRNA。实施例3 =TPO小鼠的原代培养骨髓成纤维细胞的性质将4 6周龄的TPO小鼠的骨髓细胞在添加了 15%的胎牛血清(fetal calf serum、FCS)的 MEM (Minimum Essential Medium Eagle、Sigma 公司)中培养 4 周，得到原 代培养的骨髓成纤维细胞。图6显示在倒立显微镜下观察的细胞形态，细胞为成纤维细 胞的典型的纺锤形。图7显示使用了各自的抗体(anti-Vimentin antibody (Santa Cruz Biotechnology 公司)、anti_ α SMA antibody (Santa Cruz Biotechnology ^li]))白勺式 细胞仪分析间质细胞的标记物波形蛋白(Vimentin)和α SMA的表达的结果，可见二者的表 达。该结果显示上述培养得到的细胞是典型的骨髓成纤维细胞。其中，分析所用的流式细胞 仪为 FACS calibur (Becton Dickinson 公司)，测定数据使用 CellQuest software (Becton Dickinson公司)进行分析。实施例4 :HSP47siRNA对NIH3T3细胞(小鼠成纤维细胞株)的效果使1 X IO5个NIH3T3细胞游离到添加了 10 %胎牛血清(Calf serum、CS)的 Dulbecco' s modified Eagle' s medium(DMEM、Life Technologies 公司)中，然后播种到 6孔培养板上。M小时后，使用Lipotrust (北海道Systemscience株式会社)将HSP47siRNA 转染到达到50 60%汇合的NIH3T3细胞中。具体地，对用漩涡法混合20nM的Lipotrust 和50nM的随机siRNA或HSP47siRNA而得到的物质进行转染。经转染的NIH3T3细胞在无 血清的OPTI-MEM(GIBC0公司)中培养4小时。用DMEM洗涤该NIH3T3细胞，然后在添加了 10%的CS的DMEM中培养M小时，提取蛋白质。然后，用蛋白质印迹法分析HSP47的表达。 即，将从NIH3T3提取的蛋白质用4/20SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分级后，转移 到硝酸纤维素膜。首先，用抗HSP47的1次抗体(Stressgen公司)或抗β-肌动蛋白的1 次抗体(Cell Signaling Technology公司)进行探查，然后用结合了过氧化物酶的2次抗 体(Oncogene Research Product 公司)进行探查，最后用 ECL (Amersham Life Science 公 司)使之显色。其结果可知，在NIH3T3中导入HSP47siRNA后M小时的时点上，HSP47siRNA_C和 D与A、B和E相比效果更强(参照图8的A)。因此，在以下的实验中，使用HSP47siRNA-C 或 D 作为 HSP47siRNA。实施例5 :HSP47siRNA对TPO小鼠来源的原代培养骨髓成纤维细胞的效果使5X IO5个TPO小鼠来源的原代培养骨髓成纤维细胞游离到添加了 15%的FCS 的MEM中，然后播种到6孔培养板上。M小时后使用Lipotrust将HSP47siRNA转染到达到 50 60%汇合的骨髓成纤维细胞中。即，转染用漩涡法混合20nM的Lipotrust和50nM的随 机siRNA或5 50nM的HSP47siRNA_C或D而得到的物质、或将它们进一步用漩涡法与40nM 的维生素A (视黄醇、Sigma公司)混合而得到的物质。将转染了维生素A结合或维生素A非 结合脂质体HSP47 siRNA的骨髓成纤维细胞在无血清的OPTI-MEM中培养4小时。然后，用 MEM洗涤该骨髓成纤维细胞，用添加了 15%的FCS的MEM进一步培养48小时，提取蛋白质。 另外，在另外的实验中，将转染了 50nM的维生素A结合脂质体HSP47siRNA-D (VA_Lip-HSP47siRNA-D,以下也分别将“维生素A结合”简记为“VA”、将“脂质体”简记为“Lip”)的骨髓成 纤维细胞在无血清的OPTI-MEM中培养4小时，然后用MEM洗涤，用添加了 15%的FCS的MEM 进一步培养M 96小时，提取蛋白质。然后，用蛋白质印迹法对提取的蛋白质进行分析， 以分析HSP47的表达情况。即，将从骨髓成纤维细胞提取的蛋白质用4/20SDS-聚丙烯酰胺 凝胶电泳(SDS-PAGE)分级后，转移到硝酸纤维素膜。然后，与实施例4同样地，用抗HSP47 或β -肌动蛋白的1次抗体进行探查，进而用结合了过氧化物酶的2次抗体进行探查，最后 用ECL进行可视化。结果示于图8的B和C。当使用原代培养骨髓成纤维细胞时，HSP47 siRNA_C(图8的a)和 HSP47 siRNA-D(图8的b)单独均未见效果，但通过结合维生素A(VA)，在HSP47 siRNA-C(VA-Lip-HSP47 siRNA-C)中以 50nM 以上的浓度、在 VA_Lip_HSP47 siRNA-D 中 以25nM以上的浓度确认出现了效果。即可知，为了高效地将HSP47 siRNA导入原代培养 骨髓成纤维细胞，需要使用VA-Lip-HSP47 siRNA ；以及可知，与VA_Lip-HSP47 siRNA-C 相比，VA-Lip-HSP47 siRNA-D对HSP47的抑制效果更强。因此，在以后的实验中，使用 VA-Lip-HSP47 siRNA-D。另外可知，VA-Lip-HSP47 siRNA-D(50nM)的效果持续时间为72小室。(参照图8 的C)。实施例6 维生素A(VA)的将脂质体包埋HSP47siRNA(Lip-HSP47siRNA)向TPO小 鼠来源的原代培养骨髓成纤维细胞导入的效果将TPO小鼠来源的原代培养骨髓成纤维细胞在添加了 10%的CS的OPTI-MEM的 培养液中培养，在10mg/ml的抗视黄醇结合蛋白质抗体(anti-RBP-Ab、BD Pharmingen公 司)的存在下或非存在下，导入结合了 50nM的羧基荧光素(FAM)的Lip_HSP47 siRNA或 VA-Lip-HSP47 siRNA (Lip_HSP47 siRNA-FAM 或 VA_Lip_HSP47 siRNA-FAM)，30 分钟后用 流式细胞仪法进行分析。用FACS calibur测定进行了导入的细胞的平均荧光强度(mean fluorescence intensity、MFI)，用 CellQuest software (Becton Dickinson 公司)进行 分析。将5X IO5个TPO小鼠来源的原代培养骨髓成纤维细胞播种到6孔培养板上。对小 时后，添加 50ηΜ 的 VA-Lip-HSP47siRNA-FAM 或 Lip_HSP47 siRNA-FAM。将这些细胞在添 加了 10%的FCS的OPTI-MEM中培养30分钟。然后，将这些细胞用PBS洗涤，用4%的多 聚甲醛固定(25°C、15分钟)。固定后，将这些细胞用DAPI进行1分钟的核染色。细胞内 的FAM的局部分布用荧光显微镜进行评价。代表性的流式细胞仪的图案示于图9的A、FAM 标记的siRNA的细胞内局部分布的代表性的结果示于图9的B。其中，MFI如图9的A所 示。与Lip-HSP47siRNA相比，可知VA_Lip-HSP47 siRNA在向TPO小鼠来源的原代培养骨 髓成纤维细胞的导入效率方面更加优异(A和B)。另外，由于VA-Lip-HSP47siRNA的导入被 anti-RBP-Ab部分地抑制(A)，因此启示VA_Lip-HSP47siRNA的一部分可通过骨髓成纤维细 胞的RBP (视黄醇结合蛋白质、Retinol Binding Protein)受体被摄入。实施例7 siRNA HSP47对TPO小鼠来源的原代培养骨髓成纤维细胞的胶原分泌的 效果使5X IO5个原代培养骨髓成纤维细胞游离到添加了 15%的FCS的MEM中， 然后播种到6孔培养板上。M小时后，导入50nM的Lip-siRNA Random (siRNA ran)、 Lip-HSP47 siRNA-D(siRNA D)、VA-Lip-siRNA Random(VA-siRNA ran)或 VA_Lip_HSP47siRNA-D(VA-siRNA D)。4小时后，将培养液替换为添加了 15%的FCS的MEM，然后培养48 小时。然后，除去培养液，使用无血清的OPTI-MEM进一步培养4小时。然后，首先，使用 Sircol(TM)Collagen Assay kit (Biocolor公司)测定培养上清液中的胶原量。即，将培 养上清液与dye solution混合30分钟。然后，将该溶液在10，000X g下离心10分钟。在 除去未结合的dye solution后，在结合的dye中添加Iml的碱性试剂，用漩涡法混合10分 钟，基于利用吸光度计(540nm)测定的吸光度进行定量。接着，基于利用吸光度计(540nm) 测定的吸光度对沉积于粘附在培养板上的成纤维细胞的胶原量进行定量。结果示于图10。其中，图中“培养上清液”表示成纤维细胞的培养上清液中的胶原 量、“Plate (除去培养上清液后)”表示沉积于除去培养上清液后的成纤维细胞的胶原量、 “总计”表示“培养上清液”与“Plate (除去培养上清液后)，，的总和。数据用3个培养物的 平均值士标准差(*P < 0. 05)表示。其结果可见，导入了 VA-Lip_HSP47 siRNA_D的原代培养成纤维细胞分泌到培养 上清液中的胶原量与其他细胞相比显著地少，在导入了 VA-Lip-HSP47 siRNA-D的细胞 中，沉积于培养板的胶原量与其他细胞相比较少，但未见显著性差异；另外可知，导入了 VA-Lip-HSP47 siRNA-D的成纤维细胞分泌到培养上清液中的胶原量与在除去培养上清液 后沉积于成纤维细胞的胶原量的总和与其他细胞相比显著地少。实施例8 siRNA HSP47对TPO小鼠的骨髓纤维化的体内效果使用出生后7个月的TPO小鼠，研究体内的VA-Lip_HSP47 siRNA-D的骨髓纤维化 改善效果。将HSP47 siRNA-D 12. 5mg/小鼠隔日给予，总计4次，使用^ O夕V >注射器 从眼窝静脉丛进行静注。即，向siRNA 12. 5mg/小鼠(8 μ L)和Lipotrust 12. 5ηΜ(12· 5μ L) 中添加或不添加维生素A 25ηΜ(2. 5 μ L)，然后添加RNAase free PBS使总计达到100 μ L， 将该100 μ L作为1次量给予小鼠。在HSP47siRNA-D给予开始后的第8天使小鼠安乐死，采 取骨髓制作组织标本，分别进行苏木素伊红(HE)染色、银(Gitter)染色或偶氮卡红(Azan) 染色，用光学显微镜观察骨髓像。结果示于图11 14。从处理后的Gitter染色标本(图11)可知，给予了 VA_Lip-siRNA HSP47的2只 小鼠(VA-Lip-siRNA HSP47(1)和(2))与未处理小鼠(未处理)、给予了 Lip-siRNA HSP47 的小鼠(Lip-siRNA HSP47)和给予了 VA-Lip-siRNA Random 的小鼠(VA-Lip-siRNA ran)相 比，骨髓的网状纤维增生显著地得到改善。此外，测定并用KS-400软件(Carl Zeiss公司) 将该siRNA HSP47所带来的网状纤维增生的改善度数值化。也就是说，从处理后的Gitter 染色标本选择10个视野，以网状纤维增生为指标测定各视野中的网状纤维的点占全部点 的比 列(网硬蛋白纤维化区域的百分比(percentage of reticulin fibrosis area)),结 果确认给予了 VA-Lip-siRNAHSP47-D的小鼠(VA-siRNA D)与未处理小鼠(未处理)、给予 了 Lip-siRNAHSP47 的小鼠(siRNA D)和给予了 VA-Lip-siRNA Random 的小鼠(VA-siRNA ran)相比，骨髓的网状纤维增生显著改善(参照图12)。另外，从图13所示的处理后的^Vzan染色标本可知，给予了 VA-Lip-siRNA HSP47 的2只小鼠(VA-Lip-siRNA HSP47(1)和0))与未处理小鼠(未处理)、给予了 Lip-siRNA HSP47 的小鼠(Lip-siRNAHSP47)和给予了 VA-Lip-siRNA Random 的小鼠(VA-Lip-siRNA ran)相比，骨髓的胶原增生显著改善。此外，从图14所示的处理后的HE染色标本可知，给予了 VA-Lip-siRNAHSP47的2只小鼠(VA-Lip-siRNA HSP47(1)禾Π (2))与未处理小鼠(未处理)、给予了 Lip-siRNA HSP47 的小鼠(Lip-siRNA HSP47)和给予了 VA-Lip-siRNA Random 的小鼠(VA-Lip-siRNA ran)相比，骨梁的肥厚显著改善。 以上的结果启示，使用以HSP47为靶的siRNA的对骨髓纤维化的处理可能是有用 的。另外，当使siRNA基本上在细胞质内发挥作用时，上述结果显示，类视黄醇作为针对骨 髓中的细胞外基质产生细胞的靶向剂发挥功能，通过高效地将药物递送给所述细胞，从而 显著地改善了骨髓纤维化的病理状态。
权利要求
1.一种针对骨髓中的细胞外基质产生细胞的物质递送用载体，其含有类视黄醇作为靶 向剂。
2.根据权利要求1所述的载体，其中，类视黄醇包含视黄醇。
3.根据权利要求1或2所述的载体，其中，类视黄醇的含量为载体总体的0.2 20重量％。
4.根据权利要求1 3中任一项所述的载体，其中，所述载体具有脂质体的形态，且类 视黄醇与脂质体所含的脂质的摩尔比为8 1 1 4。
5.一种骨髓纤维化处理用组合物，其含有对骨髓中的细胞外基质产生细胞的活性或增 殖进行控制的药物。
6.根据权利要求5所述的组合物，其进一步含有权利要求1 4中任一项所述的载体。
7.根据权利要求5或6所述的组合物，其中，对骨髓中的细胞外基质产生细胞的活性或 增殖进行控制的药物选自下述中的至少1个选自明胶酶A、明胶酶B和血管紧张素原中的 生理活性物质的活性或产生抑制剂、细胞活性抑制剂、增殖抑制剂、细胞凋亡诱导剂、和以 与细胞外基质构成分子或该细胞外基质构成分子的产生或分泌相关的分子为靶的siRNA、 核酶、反义核酸、DNA/RNA嵌合多核苷酸和表达它们的载体。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中，与细胞外基质构成分子的产生或分泌相关的 分子为HSP47。
9.根据权利要求5 8中任一项所述的组合物，其是在医疗的现场或其附近混合药物 和载体而成的。
10.权利要求6 9中任一项所述的组合物的制备试剂盒，其中，包括1个或1个以上 的容器，所述容器单独或组合地包含对骨髓中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控 制的药物、类视黄醇、以及根据需要使用的除类视黄醇以外的载体构成物质。
11.一种siRNA，其以选自序列号13表示的核酸序列的1130 1145位、1485 1500 位、1501 1516位、1654 1678位和1951 1978位中的部分为靴。
12.根据权利要求11所述的siRNA，其由以下A E的正义链与反义链的组合中的任 一种构成A 正义链 5，-UGGAUGGGAAAGAUGCAGAAGAAGGAG-3，(序列号1)与反义链 3，-UAACCUAC CCUUUCUACGUCUUCUUCC-5，(序列号2)的组合、B 正义链 5，-U⑶CUGAGUGGGUAUUUUUAGACAGAG-3，(序列号3)与反义链 3，-UAACAGAC UCACCCAUAAAAAUCUGUC-5，(序列号4)的组合、C 正义链 5，-GAUGCGAGAUGA⑶UGUAGAGUCCAAG-3，(序列号5)与反义链 3，-UACUACGC UCUACUCAACAUCUCAGGU-5，(序列号6)的组合、D 正义链 5，-CAGAACUGCCCAUCCUUAAAAUGAUAG-3，(序列号7)与反义链 3，-UA⑶CUUG ACGGGUAGGAAUUUUACUA-5，(序列号8)的组合、E 正义链 5，-GAGACAAGAUGCGAGAUGA⑶UGUAAG-3，(序列号9)与反义链 3，-UACUCU⑶ UCUACGCUCUACUCAACAU-5，(序列号10)的组合。
全文摘要
本发明涉及含有类视黄醇的骨髓中的细胞外基质产生细胞用的物质递送载体和使用了对骨髓中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制的药物的骨髓纤维化处理剂。
文档编号A61K45/00GK102143761SQ200980134538
公开日2011年8月3日 申请日期2009年9月4日 优先权日2008年9月5日
发明者新津洋司郎, 松永卓也 申请人:日东电工株式会社