鉴定离子通道调节剂的方法

专利名称：鉴定离子通道调节剂的方法
鉴定离子通道调节剂的方法优先权本申请是2008年7月11日提交的U. S.系列号12/171，475的部分延续，它要求 2007年7月11日提交的U. S.系列号60/949，142的权益。这些申请的全部内容通过参考 并入本文。本申请交叉引用了 2008年12月15日提交的标题为“细胞中变化的检测方法 (Methods of Detection of Changes In Cells)”的 U. S.系列号 12/335，393，其全部内容 通过参考并入本文。
背景技术：
在制药和生物技术工业中，特别是在心、肺和胃肠道健康领域中，离子通道构成最 大的治疗靶标类别之一。涉及调节离子流入和流出细胞的蛋白质的治疗靶标对患者健康具 有引人注目的作用。检测化合物调节离子通道靶标的能力是困难和费时的。膜片箝测定法 是一种对离子通道调节剂的生物作用非常敏感的测定法。然而，膜片箝测定法复杂且对测 试化合物的通量低。其它测定离子通道活性的方法需要在细胞中重组表达离子通道或部分离子通道 和/或使用荧光或放射性标记物。这些方法虽然有用，但它们仅限于(测定)那些只靶向 一小部分通道功能的药物。此外，重组离子通道可能与它们在天然细胞中的功能不同。本发明方法允许亲代(非重组)细胞系的高效高通量、无标记物筛选，而不对细胞 进行操作使其对可能用作药物的测试化合物发生特异性响应。发明概述在一实施方案中，本发明提供一种鉴定离子通道拮抗剂或激动剂的方法。该方法 包括将细胞施加到比色共振反射光学生物传感器表面上的第一位置和第二位置，并将测试 试剂施加到第一位置。将已知的细胞离子通道拮抗剂或激动剂施加到第二位置。测定第一 位置的比色共振反射光学第一峰波长值(PWV)和测定第二位置的第二 PWV。如果第一 PWV 和第二 PWV相同或类似，则测试试剂为离子通道的拮抗剂或激动剂。如果第一 PWV和第二 PffV不同，则测试试剂不是拮抗剂或激动剂。将细胞施加到第一位置之后、将测试试剂施加 到第一位置之后、将细胞施加到第二位置之后、将已知的离子通道拮抗剂或激动剂施加到 第二位置之后、或其组合之后，可将细胞孵育一段时间。可采用带有约2微米-约200微米 下限像素大小的透镜的扫描仪测定PWV。比色共振反射光学生物传感器表面上的第一位置 和第二位置可以是容器的内表面，该容器选自微量滴定孔、微量滴定板、试管、培养皿、微观 流体槽(microfluidic channel)和微阵列。所述细胞、测试试剂和离子通道拮抗剂或激动 剂可不包含检测标记物。该方法可在约25、30或37摄氏度下进行。本发明另一实施方案提供一种鉴定离子通道调节剂的方法。该方法包括将细胞施 加到比色共振反射光学生物传感器表面上的第一位置，并将测试试剂和已知的细胞离子通 道拮抗剂或激动剂施加到所述第一位置。测定第一位置的第一 PWV。将细胞施加到比色共 振反射光学生物传感器表面上的第二位置，并将已知的细胞离子通道拮抗剂或激动剂施加 到所述第二位置。测定第二位置的第二 PWV。如果第一 PWV和第二 PWV不同，则测试试剂 为离子通道的调节剂。如果第一和第二 PWV相同或类似，则测试试剂不是离子通道的调节剂。在将细胞施加到第一位置之后、在将测试试剂施加到第一位置之后、将细胞施加到第二 位置之后、将已知的离子通道拮抗剂或激动剂施加到第二位置之后、或其组合之后，可将细 胞孵育一段时间。可采用带有约2微米-约200微米下限像素大小的透镜的扫描仪测定 PWV。比色共振反射光学生物传感器表面上的第一位置和第二位置可以是容器的内表面，该 容器选自微量滴定孔、微量滴定板、试管、培养皿、微观流体槽和微阵列。所述细胞、测试试 剂和离子通道拮抗剂或激动剂可不包含检测标记物。该方法可在约25、30或37摄氏度下 进行。本发明另一实施方案提供一种鉴定离子通道调节剂的方法。该方法包括将细胞施 加到比色共振反射光学生物传感器表面上的第一位置，并测定第一位置的PWV。将测试试剂 施加到所述第一位置。测定第一位置的第二 PWV。确定第一个值，其中所述第一个值是第 一 PffV和第二 PWV之间的差值。将第一个值与对照测试相比较，其中对照测试包括将细胞 施加到比色共振反射光学生物传感器表面上的第二位置，并测定第二位置的第三PWVt^fe 知的细胞离子通道拮抗剂或激动剂施加到所述第二位置上。确定第二位置的第四PWV。测 定第二个值，其中所述第二个值是第二位置的第三PWV和第四PWV之间的差值。如果第一 个值与第二个值相同或类似，则测试试剂是离子通道的调节剂。如果第一个值和第二个值 不同，则测试试剂不是离子通道的调节剂。本发明另一实施方案提供一种鉴定离子通道调节剂的方法。该方法包括将细胞 施加到比色共振反射光学生物传感器表面上的第一位置，并将测试试剂施加到所述第一位 置。测定第一位置的第一 PWV。将已知的细胞离子通道拮抗剂或激动剂施加到所述第一位 置。测定第一位置的第二 PWV。确定第一个值，其中所述第一个值是第一 PWV和第二 PWV之 间的差值。将细胞施加到比色共振反射光学生物传感器表面上的第二位置，并测定第二位 置的第三PWV。将已知的细胞离子通道拮抗剂或激动剂施加到所述第二位置。确定第二位 置的第四PWV。确定第二个值，其中第二个值是第三PWV和第四PWV之间的差值。如果第一 个值和第二个值不同，则测试试剂是离子通道的调节剂。如果第一个值和第二个值相同或 类似，则测试试剂不是离子通道的调节剂。本发明另一实施方案提供一种确认(confirm)测试试剂为离子通道调节剂的方 法。该方法包括将细胞施加到比色共振反射光学生物传感器表面上的第一位置，并测定第 一位置的第一PWV。将已知的细胞离子通道拮抗剂或激动剂和测试试剂施加到所述第一位 置。确定第一位置的第二PWV。确定第一个值，其中第一个值是第一PWV和第二PWV之间的 差值。将细胞施加到比色共振反射光学生物传感器表面上的第二位置，并测定第二位置的 第三PWV。将已知的细胞离子通道激动剂或拮抗剂施加到所述第二位置，并确定第二位置的 第四PWV。确定第二个值，其中第二个值是第三PWV和第四PWV之间的差值。如果第一个值 和第二个值不同，则确认测试试剂是离子通道的调节剂。如果第一个值和第二个值相同或 类似，则测试试剂不是离子通道的调节剂。本发明另一实施方案提供一种确认测试试剂为离子通道调节剂的方法。该方法包 括将细胞施加到比色共振反射光学生物传感器表面上的第一位置，并将已知的细胞离子通 道激动剂或拮抗剂和测试试剂施加到所述第一位置。确定第一位置的第一 PWV。将细胞施 加到比色共振反射光学生物传感器表面上的第二位置，并将已知的细胞离子通道激动剂或 拮抗剂施加到所述第二位置。确定第二位置的第二 PWV。如果第一 PWV和第二 PWV不同，则确认测试试剂为离子通道的调节剂。本发明的另一实施方案提供了确定测试试剂的离子通道调节性质的方法。该方法 包括将细胞施加到比色共振反射光学生物传感器的表面；基本阻断一种或多种第一类型离 子通道(one or more first types of ion channels)的功能活性，其中未阻断一种或多 种第二类型离子通道的活性；测定细胞的比色共振反射光学第一峰波长值(PWV)；将测试 试剂施加到所述细胞；测定细胞的比色共振反射光学第二 PWV ；和根据所述第一 PWV和第二 PWV的比较，确定所述测试试剂的离子通道调节性质。可以用抗体基本阻断一种或多种类型 的离子通道的功能活性。所述一种或多种第一类型和第二类型的离子通道可以是电压门控 钠通道、电压门控钙通道、钾通道、内向整流钾通道、钙激活钾通道、电压门控钾通道、双孔 结构域钾通道、瞬时受体电位通道、精子阳离子通道、环核苷酸门控通道、超极化激活环核 苷酸门控通道、双孔通道、配体门控通道和光门控通道。在所述方法的每一步之后均可以将 所述细胞孵育一段时间。比色共振反射光学生物传感器的表面可以是容器的内表面，所述 容器选自微量滴定孔、微量滴定板、试管、培养皿、微观流体槽和微阵列。可以使用带有约2 微米-约200微米下限像素大小的透镜的扫描仪测定所述第一 PWV和第二 PWV。所述细胞 和测试试剂可以不包含检测标记物。可以在约2、10、15、25、30或37°C的温度执行该方法。 该方法还可以包括以下步骤清洗细胞；平衡细胞和任选地重复所述试验(assay)的(多 个)步骤。本发明的另一实施方案提供了鉴定离子通道调节剂的方法。该方法包括将无血清 培养基中的细胞施加到比色共振反射光学生物传感器的表面，其中将一种或多种细胞外基 质(ECM)配体固定到所述生物传感器的表面；测定所述细胞的比色共振反射光学第一峰波 长值(PWV)；将一种或多种测试离子通道调节剂施加到所述生物传感器的表面；使所述细 胞的一种或多种离子通道活性发生变化；测定所述细胞的比色共振反射光学第二 PWV ；和 确定所述一种或多种测试离子通道调节剂是否调节所述细胞的一种或多种离子通道。该方 法还可以包括以下步骤清洗细胞；平衡细胞；和任选地重复所述试验的(多个)步骤。本发明的另一实施方案提供了鉴定离子通道调节剂的方法。该方法包括将无血清 培养基中的细胞施加到比色共振反射光学生物传感器的表面，其中将一种或多种细胞外基 质(ECM)配体固定到所述生物传感器的表面；将一种或多种测试离子通道调节剂施加到所 述生物传感器的表面；使所述细胞的一种或多种离子通道发生变化；测定所述细胞的比色 共振反射光学第一 PWV ；使所述细胞的一种或多种离子通道发生变化；测定所述细胞的比 色共振反射光学第二 PWV ；和确定所述一种或多种测试离子通道调节剂是否调节所述细胞 的一种或多种离子通道。该方法还可以包括以下步骤清洗细胞；平衡细胞；和任选地重复 所述(多个)步骤。因此，本发明提供不使用重组细胞系过表达离子通道蛋白或不使用检测标记物鉴 定和确认离子通道调节剂的方法。


图1示出了从用人ether-a-go-go (hERG)钾通道转染的CHO细胞以及从亲本CHO 细胞中除去钾的影响。图2示出了西沙必利(cisapride)和E4031对hERG转染的CHO细胞的影响。
图3示出了西沙必利和E4031对亲本CHO细胞的影响。发明详述如本文所使用的，除非上下文中明确指明，否则单数形式的“一”和“所述”包括复
数对象。现已知几种类型的离子通道，包括例如电压门控钠通道(它感知跨膜电位并且对 去极化或超极化产生响应而打开或关闭)、电压门控钙通道、机械敏感性离子通道、钾通道 (如内向整流型钾通道、钙激活钾通道、电压门控钾通道和双孔结构域钾通道)、瞬时受体 电位通道、精子阳离子通道、环核苷酸门控通道(如超极化激活环核苷酸门控通道)(它对 内部溶质产生响应而打开并且介导对第二信使的细胞响应)、拉伸激活通道(它对机械作 用力产生响应而打开或关闭)、双孔通道、配体门控通道(它对膜外侧面上的特定配体分子 产生响应而打开)、G蛋白门控通道(它对经由其受体的G蛋白激活产生响应而打开)、内 向整流K通道(它允许钾以内向整流的方式流入到细胞中)和光门控通道。一些通道对多 种影响因素响应。配体门控离子通道对与受体蛋白的细胞外结构域结合的特定配体分子产生响应 而打开。配体结合造成通道蛋白结构的构象变化，其导致通道门的打开以及随后跨质膜 的离子流。该类通道的实例包括G蛋白偶联离子通道、阴离子可穿透的Y-氨基丁酸门控 GABAabsc受体、离子移变谷氨酸门控受体、血清素/5-HT3受体、ATP门控P2X受体和阳离子 可穿透的“烟碱”乙酰胆碱受体。当神经递质与G蛋白偶联受体(GCR)结合时，刺激了 G蛋白偶联离子通道(GPC)。 这激活了 G蛋白，它移动至另一离子通道。G蛋白使得通道打开并且离子能够流动通过细胞 膜。由于从受体向离子的移动，延缓了通道打开的速度，但是该通道保持打开更长时间。诸 如GABA (A和C亚型)和NMDA (拮抗剂)的GPC通道是麻醉剂起到阻断感知、暂时剥夺肌肉 激活和行为矫正作用的可能治疗位置。GABA分子(神经递质、Y氨基丁酸)与GABAa和GABAc受体细胞外部分中它们的 结合位置的结合触发了氯离子选择性孔的打开。提高的氯化物导电性驱使膜电位朝着神经 元中C1_离子的逆转电位移动，从而抑制了新动作电位或神经冲动的触发。谷氨酸(glutamate)调节离子通道并且它是哺乳动物神经系统中最丰富的刺激 性神经递质。神经冲动触发谷氨酸从前突触细胞上释放。在相反的后突触细胞中，诸如 NMDA(配体门控离子通道)受体的谷氨酸受体与谷氨酸结合并且被激活。在神经元膜和神经胶膜中发现了谷氨酸转运体。它们快速地将谷氨酸从细胞外间 隙移除。在脑损伤或疾病中，它们可以相反地作用并且可以在细胞外积累过量的谷氨酸。该 过程造成钙离子通过NMDA受体通道进入细胞，从而导致神经元损伤和最终的细胞死亡。神经递质5-羟色胺(血清素)与5-HT3受体的结合打开了配体门控离子通道，其 继而导致了神经元中的兴奋响应。当通过激动剂激活受体以打开离子通道。5-HT3拮抗剂 包括昂丹司琼、格拉司琼和托烷司琼。P2X受体是阳离子可穿透性配体门控离子通道，其对细胞外腺苷5'-三磷酸 (ATP)的结合产生响应而打开。ATP与P2X受体结合并造成离子通道的结构发生构象变化， 从而导致离子可穿透孔的打开。这使得如Na+和Ca2+的阳离子能够进入细胞，从而导致细 胞膜去极化和各种Ca2+敏感性细胞内过程的激活。已发现该通道不同的蛋白质部分负责调节ATP结合、离子穿透、孔扩大和脱敏。当与骨骼肌纤维上的乙酰胆碱受体结合时，乙酰胆碱可以打开配体门控钠通道。在多种细胞类型上发现了内向整流钾(KJ通道。在心肌细胞中，Kh通道在去极 化时关闭，从而减缓了膜的复极化并帮助保持更长时间的动作电位。这种类型的向内整流 通道不同于在动作电位之后帮助神经和肌细胞复极化的延迟整流K+通道；并且不同于为其 它(resting)膜电位提供大部分基础的钾渗漏通道。在内皮细胞中，Kir通道参与一氧化氮 合酶的调控。在肾细胞中，Kir将多余的钾输出到集合小管中以从尿液中除去，或者作为另外 一种选择，可以参与将钾再吸收回到体内。在神经元和心脏细胞中，G蛋白激活的IRK(Kj) 是重要的调节剂。在胰腺β细胞中，Katp通道控制胰岛素的释放。钙电压门控离子通道(VDCC)在肌肉兴奋与收缩以及神经元兴奋与递质释放的联 系中起到重要作用。VDCC的激活使得Ca2+进入到细胞中，根据细胞类型的不同，它导致了 肌肉收缩、神经元兴奋、基因表达上调或者激素或神经递质的释放。电压门控钠通道控制并且设置了跨细胞膜的动作电位。当电压门控钠通道打开 时，细胞膜电位发生变化，并且少量但明显的Na+离子将顺着电化学梯度移动到细胞内，借 此使细胞去极化。细胞内和细胞外阻断剂是这些离子通道药理学控制的已知的调节剂。基 于生物碱的植物和动物(河豚和蓝环章鱼)毒素在细胞外对这些通道作用并导致神经活性 的损失。这些通道的细胞内阻断导致产生了麻醉剂、抗心律不齐和抗惊厥剂。这些通道的 激动剂(如毒箭蛙毒素)直接影响外周神经系统并导致持续激活(打开)通道，并且它们 作为导致心律不齐和呼吸麻痹的毒素存在。一些瞬时受体电位通道(TRP)通道可以是组成型(constitutively)打开的，而其 它通道则通过电压、细胞内Ca2+、pH、氧化还原态、渗透压和机械拉伸进行门控。这些通道根 据它们所通过的离子(的不同)而不同，一些对Ca2+具有选择性而其它的则选择性较差，它 们起到阳离子通道的作用。根据同源性TRPC(标准(canonical))将该家族细分为6个亚 家族TRPV(辣椒素)；TRPA(锚定蛋白)；TRPM(黑素抑制素)；TRPP(多囊素)；TRPML(粘 脂蛋白)；TRPN (NOMPC)。某些化学药物和遗传疾病干扰正常离子通道功能并引起疾病和病症。可 破坏离子通道功能的化学物包括例如利多卡因、奴佛卡因(novocaine)、树眼镜蛇毒 素(dedrotoxin)、芋螺毒素(conotoxin)、蛤蛘毒素(saxitoxin)、伊比禾丨J亚蝎毒素 (iberiotoxin)、异足蛛毒素(heteropodatoxin)、河豚毒素。受体酪氨酸激酶、GPCR、瞬时 受体电位通道、磷脂酶C、信号转导途径(例如，P13激酶)、细胞因子、β -阻抑素途径响应、 细胞骨架重组、核外遗传(印igenetic)信号均可以影响离子通道功能。由离子通道亚单位突变或调节它们的蛋白的突变引起的遗传病包括例如儿童交 替性偏瘫、Bartter综合征、Brugada综合征、先天性高胰岛素症、囊性纤维病、周期性共济 失调、红斑性肢痛病、带有热性癫痫发作的全身性癫痫、血钾过多性周期性麻痹、血钾过少 性周期性麻痹、长期QT综合征、恶性高热、偏头痛、重症肌无力、先天性肌强直(myotonia congenita)、神经性肌强直、家族性偏瘫性偏头痛、脊髓小脑性共济失调13型、非综合征型 耳毫、先天性肌强直(paramyotonia congenita)、钟力口重的肌强直(potassium aggravated myotonias)、周期性麻痹、色素性视网膜炎、粘脂贮积病IV型、罗马诺-沃德(Romano-Ward) 综合征、短期QT综合征和Timothy综合征。
8
本发明一实施方案使用比色共振反射生物传感器且不需要掺入放射性、比色性或 荧光性标记物，当细胞响应于离子通道调节剂而发生变化时实时直接测定这种变化。当用 测试试剂、激动剂和拮抗剂探测细胞时，可检测细胞中的变化。然后可用高速仪器如BIND Scanner (即比色共振反射生物传感器系统)和对应的算法来定量数据从而测定细胞变 化。参见例如美国专利No. 6，951，715和美国专利Publ. 2004/01516沈。通过结合这种方法 学、仪器操作和计算机分析，可以以无标记物方式实时方便地监测细胞变化。生物传感器本发明的生物传感器可以是比色共振反射生物传感器。参见例如Cunningham 等的“作为一种直接生物化学检测技术的比色共振反射法(Colorimetric resonant reflection as a direct biochemical assay technique) "Sensors and Actuators B,81 卷，p. 316-3 ，Jan 52002 ；美国专利Ribl. No. 2004/0091397。比色共振生物传感器不是表 面等离子共振(SPR)生物传感器。sra生物传感器具有薄的金属层，如银、金、铜、铝、钠和 铟。该金属必须具有传导带电子，其能够与适合波长处的光共振。暴露于光的sra生物传 感器表面必须是纯金属。氧化物、硫化物和其它膜干扰SPR。比色共振生物传感器不具有金 属层，而是具有一高折光率材料如T^2的电介质涂层。光栅基波导生物传感器在例如美国专利No. 5，738，825中有述。光栅基波导生物 传感器包括波导膜和衍射光栅，其将入射光区耦入(incouple)波导膜中而产生衍射光区。 检测波导膜内有效折光率的变化。其中必须将光波在仪器内传送很长一段距离的仪器，如 光栅基波导生物传感器，缺乏本发明的空间分辨率。在不使用荧光标签、比色标记物或任何其它类型的检测标签或检测标记物的情况 下，比色共振反射生物传感器允许在传感器表面上测定生物化学相互作用。生物传感器表 面包含光学结构，将其设计成当用校准和/或白光照射时，仅反射窄谱带波长(“共振光栅 效应”)。将该窄波长谱带描述为波长“峰”。当将诸如生物材料等材料放置于所述生物传 感器表面或从其移出时，“峰波长值”(PWV)变化。使用读出仪用校准和/或白光照射生物 传感器表面上的不同位置，并收集反射光。将收集的光聚集到波长分光计内检测PWV。通过将所述结构(生物传感器上侧(side up))结合到无底微量滴定板筒的底部， 可将生物传感器结合到标准的一次性实验室器件(item)如微量滴定板内。生物传感器结 合到常用的实验室格式筒(laboratory format cartridges)内对于与现有的微量滴定板 处理设备例如混合器、培养箱和移液器的相容性是理想的。还可将比色共振反射生物传感 器结合到诸如微流性(microfluidic)、巨流性(macrofluidic)或微阵列设备内(参见例如 美国专禾Ij No. 7，033，819、美国专利No. 7，033，821)。可用本领域熟知的方法使用比色共振 反射生物传感器(参见例如 Methods of Molecular Biology, Jun-Lin Guan 编，Vol. 294， Humana Press,Totowa,New Jersey)以监测暴露于一或多种细胞外试剂后细胞行为的变化 或这些变化的缺乏。比色共振反射生物传感器包含次波长结构性表面(SWS)，并且是非传统类型的衍 射光学镜，其能模拟薄膜涂层的作用(Peng & Morris，“二维光栅中的共振散射(Resonant scattering from two-dimensional gratings) ” J. Opt.Soc. Am. A, Vol. 13, No. 5, p.993, May 1996 ;Magnusson，&Wang，“滤光器的新原理(New principle for optical filters) Appl. Phys. Lett.，61，No. 9，p. 1022，August, 1992 ；Peng & Morris，“二维光栅衍射中共振异常白勺实S^ifeilH (Experimental demonstration of resonant anomalies in diffraction from two-dimensional gratings)，，，Optics Letters, Vol. 21, No. 8, p. 549, April, 1996)。 SffS结构包含一维、二维或三维光栅，其中与入射光波长相比，光栅周期小，使得除反射和透 射零级外，无衍射级(diffractive order)允许传播。不支持侧向引导型模式的传播。而 且，该传导型模式的共振效应出现在任何光子进入该生物传感器结构的点的大约3微米的 高度集中区域内。比色共振反射生物传感器的反射或透射光可通过将分子(诸如特异性结合物质 或结合伴侣或两者)加到生物传感器的上表面上而进行调节。所施加的分子增加入射辐射 通过所述结构的光路长度，由此改变将发生最大反射或透射之处的波长。在一实施方案中，当用白光和/或校准光照射时，将比色共振反射生物传感器设 计为反射单一波长或窄谱带波长(“共振光栅效应”)。光可从顶部或底部照射生物传感器。 当将物质放置在生物传感器的表面上时，反射波长由于显示在生物传感器上的光的光路径 变化而位移。检测系统由例如光源和分光计组成，光源通过例如光纤探头以正入射照射生物传 感器的小点，分光计通过例如也在正入射处的第二个光纤探头收集反射光。由于在激发/ 检测系统和生物传感器表面之间未出现物理性接触，因此不需要特殊的偶联棱镜，并且可 很容易地调节生物传感器以适于任何常规使用的试验平台，包括例如微量滴定板。单一的 分光计读数可在数毫秒内进行，因此可能快速测量平行发生在生物传感器表面上的大量的 分子相互作用，并实时监测反应动力学。比色共振反射生物传感器包含例如由高折光率材料组成的光栅、支持光栅的基层 和任选固定在与基层相背的光栅表面上的一或多种特异性结合物质或接头。高折光率材料 比基底层具有更高的折光率。参见例如美国专利No. 7，094，595 ；美国专利No. 7，070, 987。 任选地，覆盖层覆盖光栅表面。在一实施方案中，光栅的折光率可小于任选的覆盖层的折 光率。将光栅用高折光率的电介质膜涂覆，该电介质膜可由包括例如硫化锌、二氧化钛、氧 化钽、氮化硅和二氧化硅的物质组成。具有光学特征的光栅的横断层面(cross-sectional profile)可包含任何周期性重复功能，例如“方波”。光栅还可包含重复的形状图案，其选 自线形(一维)、方形、圆形、椭圆形、三角形、梯形、正旋波、卵形、矩形和六边形。本发明的 比色共振反射生物传感器还可包含由例如塑料或环氧树脂组成的光栅，其涂覆有高折光率 的材料。选择层厚度(即覆盖层、生物学材料或光栅)以实现对顶面上附加分子的共振波 长敏感性。选择光栅周期以实现在所要求波长下的共振。线形光栅(即一维光栅)具有共振特性，其中将照射光偏振定向垂直于光栅周期。 比色共振反射生物传感器还可包含例如二维光栅，如六角形排列的孔(hole)或正方形。也 可使用其它形状。线形光栅与六角形排列的光栅具有相同的间距(Pitch)(即高和低折光 率区域之间的距离)、周期、层厚和材料特性。然而，为共振偶合入光学结构，光必须被偏振 垂直于光栅线。因此，必须将用其垂直于线形光栅的偏振轴定向的偏振滤镜插入到照射光 源和生物传感器表面之间。由于仅一小部分照射光源被正确偏振，因此与六角形光栅相比， 其需要较长的积分时间(integration time)来收集等量的共振反射光。光栅还可包含例如一种“踏级”形式，其中在较低折光率覆盖层中埋入具有单个 的、固定的高度的高折光率区域。高和低折光率的交替区域提供平行于生物传感器顶面的光波导。本发明的比色共振反射生物传感器还可包含在与基底层相背的(opposite of a substrate layer)光栅表面上的覆盖层。当存在覆盖层时，可将一或多种特异性结合物质 固定在与光栅相背的覆盖层表面上。覆盖层优选包含比构成光栅的材料折光率更低的材 料。覆盖层可由诸如玻璃(包括旋制玻璃(SOG))、环氧树脂或塑料构成。例如，满足生物传感器折光率要求的各种聚合物可用作覆盖层。可使用S0G，原因 是其良好的折光率、易于处理和采用丰富的玻璃表面活化技术可用特异性结合物质方便地 激活。当生物传感器表面的平坦度不是一具体系统方案的问题时，可直接将SiN/玻璃的光 栅结构用作传感表面，可采用与玻璃表面上相同的方式进行活化。在光栅上没有平面化覆盖层时，也可获得共振反射。例如，生物传感器可仅含有基 底层，其涂覆有高折光率材料的结构性薄膜层。在不使用平面化覆盖层的情况下，外周介质 (如空气或水)填充光栅。因此，特异性结合物质在光栅暴露于特异性结合物质的所有表面 上而非仅仅上表面上固定于生物传感器。本发明的比色共振反射生物传感器的照射一般使用包含各偏振角度光的白光和/ 或校准光。对于生物传感器光栅中重复特征的偏振角的定向将确定共振波长。例如，由一 套重复的线和空间组成的“线形光栅”(即一维光栅)生物传感器具有两个可产生单独共振 反射的光学偏振。垂直于所述线偏振的光被称为“S-偏振”，而平行于所述线偏振的光被称 为“P-偏振”。入射光的S和P组成同时存在于未滤过的照射光束中，并且各自产生一单独 的共振信号。一般可将生物传感器设计为最优化仅一种偏振(S-偏振)的(多个)特性， 并且未最优化的偏振很容易通过偏振滤镜除去。为除去这种偏振依存性，以使各偏振角均产生相同的反射光谱，可使用由一套同 心环组成的另一种生物传感器结构。在该结构中，各同心环的内径和外径之间的差等于大 约光栅周期的一半。各连续的环具有比前一个环的内径大于约一个光栅周期的内径。同心 环结构延伸覆盖一单个传感器的位置-如阵列点(an array spot)或微量滴定板孔。各个 单独的微阵列点或微量滴定板孔具有中心位于其内的单独的同心环结构。该结构所有偏振 方向都具有相同的横断层面。必须准确照射同心环结构的中心以保持偏振的独立性。同心 环结构的光栅周期比共振反射光的波长小。该光栅周期约为0.01-1微米。光栅深度约为 0.01-1 微米。在另一实施方案中，将孔或柱(posts)的阵列安排在非常接近于上述的同心环 处，而不需要照射光束集中于栅格的任何特定的位置。这种阵列方式通过以等角度从三个 方向入射在表面上的三个激光束的光学干涉自动产生。在这种方式中，孔(或柱)居中于紧 密填充的六角形的阵列的角落上(the holes (or posts) are centered upon the corners of an array of closely packed hexagons)。所述孑L或位置还可存在于各六角形的中心。 这种孔或位置的六角形栅格具有三个偏振方向，其“看”相同的横断层面。因此，使用任何 偏振角度的光，该六角形栅格(结构)提供等同的共振反射光谱。由此不需要偏振滤镜以 移除不需要的反射信号组分。孔或位置的周期可为大约0.01-1微米，且其深度或高度可约 为0. 01-1微米。检测系统可包括将光指向比色共振反射生物传感器的比色共振反射生物传感器 光源，以及检测生物传感器的反射光的检测器。在一实施方案中，可能通过使用滤镜使得仅有超过确定阈值的阳性结果触发检测，从而使读出仪器简化。通过测定本发明比色共振反射生物传感器的各不同位置的共振波长的位移，可能 确定哪些不同的位置在其上放置有例如生物材料。可使用位移程度确定例如测试样本中结 合伴侣的量以及一或多种特异性结合物质和测试样本的结合伴侣之间的化学亲和力。可将比色共振反射生物传感器照射2或多次。第一次测量可确定例如在生物传感 器上无生物材料或在表面上带有细胞的生物传感器的一或多个不同位置的反射光谱。第 二、三、四次或另外的测量可确定将例如一或多种细胞、测试试剂、离子通道激动剂或离子 通道拮抗剂施加到生物传感器之后或者孵育期或清洗步骤之后的反射光谱。可使用这些两 或多次测量之间峰波长的差别以例如测定生物传感器上细胞的存在或量，或者细胞上测试 试剂、离子通道激动剂或离子通道拮抗剂的活性。另外，该照射方法可控制生物传感器表面 上的小的缺陷，其可导致峰共振波长轻微变化的区域。该方法还可控制生物传感器上细胞 物质的浓度或密度的变化。生物传感器表面可通过例如物理吸附或通过化学结合，将一或多种细胞固定在生物传感器上。细 胞可以是非粘附细胞或粘附细胞。细胞可天然表达一或多种离子通道或一或多种离子通道 组分。另外，细胞可重组性表达一或多种离子通道或一或多种离子通道组分。细胞可以是 哺乳动物细胞，如人体细胞。细胞可通过诸如下列特异性结合物质而特异性结合到生物传感器表面核酸、肽、 蛋白溶液、肽溶液、包含来自组合化学库的化合物的溶液、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、 单链抗体(ScFV)、F(ab)片段、F(ab' )2片段、Fv片段、小有机分子、病毒、聚合物或生物样 本，其中将特异性结合物质固定在生物传感器表面，而结合伴侣在细胞的表面。或者，不论 细胞类型是常规粘附性的或非粘附性的，细胞可在生物传感器表面上生长并任选地粘附在 该表面上，而不必直接固定在生物传感器的表面。可将细胞以一或多个不同位置的阵列方式安排在生物传感器表面上，该表面位于 多孔板的一或多个孔内，并包含多孔板或微阵列的一或多个表面。所述细胞阵列包含在微 孔板内生物传感器表面上的一或多种细胞，使得表面包含一或多个不同的各自带有不同细 胞或带有不同量细胞的位置。例如阵列可包含1、10、100、1，000、10，000或100，000个或更 多的不同位置。因此，多孔板或微阵列的各孔可在其内具有与多孔板的其它孔分开的一或 多个不同位置的阵列，其允许在一个多孔板上处理多个不同的样本。与同一微量滴定板的 任何其它微量滴定孔中发现的一个或多个阵列相比，任何一孔内的一个或多个阵列可以相 同或不同。将细胞固定于生物传感器表面还可通过结合诸如下列功能接头而受到影响镍 基、胺基、醛基、酸基、链烷基、链烯基、链炔基、芳香基、醇基、醚基、酮基、酯基、酰胺基、氨基 酸基、硝基、氰基、碳水化合物基(carbohydrate group)、巯基、有机磷酸酯基、脂基、磷脂基 或甾基。另外，可通过物理吸附、化学结合、电化学结合、静电结合、被动或主动粘附分子、疏 水性结合或亲水性结合以及免疫捕获方法将细胞固定在生物传感器表面。涂覆表面以使其 适于细胞粘附和/或生长的方法对细胞培养领域的技术人员来讲是熟知的，并可包括用包 括但不限于下列的物质或其衍生物涂覆生物传感器聚-D-赖氨酸、纤连蛋白、肌动蛋白、 整联蛋白、粘合蛋白(adherins)、钙粘素、胶原、人血清、胎牛血清、小牛血清、层粘连蛋白或其它物质。在本发明的一实施方案中，可将生物传感器用诸如下列接头涂覆，如镍基、胺基、 醛基、酸基、链烷基、链烯基、链炔基、芳香基、醇基、醚基、酮基、酯基、酰胺基、氨基酸基、硝 基、氰基、碳水化合物基、巯基、有机磷酸酯基、脂基、磷脂基或留基。例如，可使用胺表面连 接几种类型的接头分子，而醛表面可用于直接结合蛋白质，而不需要另外的接头。可使用镍 表面结合那些掺入了组氨酸(“his”)标签的分子。对与镍-活化表面结合的“his-标签 的”分子的检测是本领域熟知的(Whitesides，Anal. Chem. 68，490，(1996))。可将接头和特异性结合物质固定在生物传感器的表面，使得各孔在其中都固定有 相同的接头和/或特异性结合物质。或者，各孔可包含接头和/或特异性结合物质的不同 组合。细胞可特异性地或非特异性地结合固定在生物传感器表面上的接头或特异性结 合物质。或者，生物传感器表面可不带有接头或特异性结合物质，且细胞可非特异性结合到 生物传感器表面。将一或多种特异性结合物质或接头固定在生物传感器上，使得特异性结合物质或 接头不能通过漂洗过程清洗掉，并且使得特异性结合物质或接头与测试样本中的细胞的结 合不受生物传感器表面的阻碍。为将特异性结合物质共价连接在诸如玻璃或聚合物上以用 于各种类型的微阵列和生物传感器，已实施了几种不同类型的表面化学策略。制备生物传 感器表面使其包含用于结合一或多种特异性结合物质的适当官能团，是生物传感器制造过 程的一个整体部分。可通过物理吸附(即不使用化学接头)或化学结合(即使用化学接头)以及电 化学结合、静电结合、疏水性结合和亲水性结合，将一或多种特定细胞连接在生物传感器表 面。化学结合可使特异性结合物质在生物传感器表面产生较强的附着，并提供所述表面结 合分子明确的定位和构象(conformation)。可基本上按固定于玻璃上所述的操作，将特异性结合物质固定于塑料、环氧树脂 或高折光率材料。然而，当酸清洗处理可能破坏固定特异性结合物质的材料时，可除去酸清 洗步骤。生物传感器的使用方法本发明一实施方案提供一种鉴定离子通道调节剂的方法。离子通道调节剂对离子 通道的功能活性具有影响。对功能活性的影响包括阻断或抑制离子通道的活性。调节剂可 以阻断、抑制、增强或提高离子通道的功能活性。该阻断、抑制、增强或提高可在阻断离子通 道的分子存在或对该分子响应时发生。调节剂可以(例如)作用于离子通道以改变门控/ 配体离子选择性、改变通道功能的化学信号(PH、渗透压)、改变门控活性的电位功能(改 变的可极化性或电压依赖性)、造成物理阻断、造成物理扩宽(改变通道控制蛋白的折叠功 能)、改变不应期、改变通道功能所需的机械力功能(机械拉伸)或温度。本发明方法可使用通过重组改变以表达或过表达某些离子通道的细胞或重组细 胞，但是本发明方法不需要通过重组表达或过表达离子通道蛋白或亚单位的细胞。可将细 胞施加在比色共振反射光学生物传感器表面上的第一位置。可将细胞固定于生物传感器上 或者仅使细胞在生物传感器表面生长。任选地，可在本发明方法的任何步骤，将细胞在生物 传感器表面上孵育约1、5、10、30或更多分钟或者约1、2、5、M、48、36或更多小时。所述测定法可以在约2、5、10、25、30或37°C (或者在约2-约37°C之间的任何温度范围)的温度进行。有利地，一旦完成本发明的测定，则可以清洗、平衡并再次使用细胞以完成相同测 定或不同测定。这对于细胞十分昂贵或难以处理的情况是特别有利的。在本发明一实施方案中，提供一种鉴定离子通道拮抗剂或激动剂的方法。该方法 包括将细胞施加到比色共振反射光学生物传感器表面上的第一位置和第二位置。可在将第 一组细胞施加到所述第一位置的同时或较早或较晚时间，将细胞施加到第二位置。这些细 胞与施加到第一位置的那组细胞可以是相同类型的细胞或不同的细胞。在将细胞施加到第 一位置之前、在将细胞施加到第一位置的同时或者将细胞施加到第一位置之后，将测试试 剂施加到第一位置。向第二位置施加已知的细胞离子通道拮抗剂或激动剂。在将细胞施加 到第二位置之前、在将细胞施加到第二位置的同时或者将细胞施加到第二位置之后，将已 知的细胞离子通道拮抗剂或激动剂施加到第二位置。已知的激动剂或拮抗剂的使用可以确 定离子通道的特异性。包括(例如)特定毒素和具有已知功能或已知靶标的其它小分子在 内的拮抗剂和激动剂可以用于确定测试试剂/刺激物/调节剂对离子通道响应的特异性。 此外，在离子通道上游或下游位置处作用的化合物的使用也可以用于确定对特定通道响应 的特异性。测定第一位置的比色共振反射光学第一峰波长值(PWV)和测定第二位置的比色 共振反射光学第二 PWV，其中如果第一 PWV和第二 PWV相同或类似，则测试试剂为离子通道 的拮抗剂或激动剂。如果第一个值和第二个值彼此在约Inm或更小之内，则第一个值和第 二个值相同或类似。如果第一 PWV和第二 PWV基本上不同(即第一 PWV和第二 PWV差别大 于约lnm、2nm、3nm、4nm或更大)，则测试试剂不是拮抗剂或激动剂。另外，在该方法任何步 骤之前或之后或该方法中加入任何试剂之前或之后，可测定多个其它PWV的其中之一并与 任何其它PWV相比较。在本发明另一实施方案中，提供一种鉴定离子通道拮抗剂或激动剂的方法。该方 法包括将细胞施加到第一位置。可确定第一位置的PWV。将测试试剂施加到第一位置。如 果需要，可将细胞和测试试剂孵育一段时间。可对第一位置确定第二PWV。计算第一个值， 其中第一个值是第一 PWV和第二 PWV之间的差值。将第一个值与对照测试相比较。对照测 试可包括将细胞施加到比色共振反射光学生物传感器表面的第二位置。如果需要，可将细 胞孵育一段时间。可在将第一组细胞施加到所述第一位置的同时或较早或较晚时间，将这 些细胞施加到第二位置。这些细胞与施加到第一位置的那组细胞可以是相同类型的细胞或 不同细胞。可确定第二位置的第三PWV。将已知的细胞离子通道拮抗剂或激动剂施加到所 述第二位置。如果需要，可将细胞孵育一段时间。可测定第二位置的第四PWV。可测定第二 个值，其中第二个值可以是第二位置的第三PWV和第四PWV之间的差值。如果第一个值和 第二个值相同或类似，则测试试剂是离子通道的调节剂。如果第一个值和第二个值彼此在 约Inm或更小之内，则第一个值和第二个值相同或类似。如果第一 PWV和第二 PWV基本上 不同(即第一 PWV和第二 PWV差别大于约lnm、2nm、3nm、4nm、5nm或更大)，则测试试剂不是 拮抗剂或激动剂。由于检测细胞的无标记生物传感器方法对细胞无破坏性，因此可将细胞 处理多于一次以寻找数分钟、数小时或数天内的差别。本领域目前有很多已知的离子通道拮抗剂或激动剂。一小部分实例包括钙通道 阻滞剂(如尼索地平、硝苯地平、尼卡地平、苄普地尔、依拉地平、尼莫地平、费乐地平、氨氯地平、地尔硫卓和维拉帕米)、钾离子通道调节剂(参见例如US 20050267089)、Na+离 子通道调节化合物(参见例如US 6，576，791)，还可参见US 7, 101,877 ；US 7，057，053、 US 20070004718 ；US 20060199848、US20060135536、US 20050192208、US 20050026993、US 20040029937、US 20030008906。比色共振反射光学生物传感器表面上的第一位置和第二位置可以是容器的内表 面，该容器选自微量滴定孔、微量滴定板、试管、培养皿、微观流体槽和微阵列。本发明测定 法中的所述细胞、测试试剂和离子通道拮抗剂或激动剂不必包含检测标记物。本发明另一实施方案提供一种鉴定离子通道调节剂的方法。可将细胞施加到比色 共振反射光学生物传感器表面上的第一位置。将测试试剂和已知的细胞离子通道拮抗剂或 激动剂施加到第一位置。可以以任何次序或者同时，将所述细胞、测试试剂和已知的细胞离 子通道拮抗剂或激动剂施加到传感器表面。可测定第一位置的第一 PWV。可将细胞施加到 比色共振反射光学生物传感器表面上的第二位置。可在将第一组细胞施加到所述第一位置 的同时或较早或较晚时间，将细胞施加到第二位置上。这些细胞与施加到第一位置的那组 细胞可以是相同类型的细胞或不同的细胞。向第二位置上施加已知的细胞离子通道拮抗剂 或激动剂。可以以任何次序或者同时，将所述细胞和已知的细胞离子通道拮抗剂或激动剂 施加到传感器表面上。可测定第二位置的第二 PWV。如果第一 PWV和第二 PWV不同，则测试 试剂是离子通道的调节剂。如果第一个值和第二个值差别大于约111!11、211111、311111、411111、或511111 或更大，则第一个值和第二个值不同。如果第一 PWV和第二 PWV相同或类似，则测试试剂不 是离子通道的调节剂。如果第一个值和第二个值彼此在约Inm或更小之内，则第一个值和 第二个值相同或类似。在本发明另一实施方案中，提供一种鉴定离子通道调节剂的方法。该方法包括将 细胞施加到比色共振反射光学生物传感器表面上的第一位置，将测试试剂施加到第一位 置，并测定第一位置的第一 PWV。可以以任何次序或者同时，将所述细胞和测试试剂施加到 第一位置。然后向第一位置施加已知的细胞离子通道拮抗剂或激动剂，并测定第一位置的 第二 PWV。确定第一个值，其中第一个值是第一 PWV和第二 PWV之间的差值。所述方法还包括将细胞施加到比色共振反射光学生物传感器表面上的第一位置， 将已知的细胞离子通道拮抗剂或激动剂施加到第一位置，并测定第一位置的第一 PWV。可 以以任何次序或者同时，将所述细胞和已知的细胞离子通道拮抗剂或激动剂施加到第一位 置。然后向第一位置施加测试试剂，并测定第一位置的第二PWV。确定第一个值，其中第一 个值是第一 PWV和第二 PWV之间的差值。将细胞施加到比色共振反射光学生物传感器表面上的第二位置。可在将第一组细 胞施加到所述第一位置的同时或较早或较晚的时间，将细胞施加到第二位置。这些细胞与 施加到第一位置的那组细胞可以是相同类型的细胞或不同的细胞。可测定第二位置的第三 PWV。向第二位置施加已知的细胞离子通道拮抗剂或激动剂。可测定第二位置的第四PWV。 确定第二个值，其中第二个值是第三PWV和第四PWV之间的差值。如果第一个值和第二个 值不同，则测试试剂为离子通道的调节剂。如果第一个值和第二个值差别大于约lnm、2nm、 3nm、4nm、或5nm或更大，则第一个值和第二个值不同。如果第一 PWV和第二 PWV相同或类 似，则测试试剂不是离子通道的调节剂。如果第一个值和第二个值彼此在约Inm或更小之 内，则第一个值和第二个值相同或类似。
在将细胞施加第一位置之后、在将测试试剂施加到第一位置之后、在将已知的离 子通道拮抗剂或激动剂施加到第一位置之后、在将细胞施加到第二位置之后、在将已知的 离子通道拮抗剂或激动剂施加到第二位置之后、或者在测试期间的任何其它点上、或其组 合，可将细胞孵育一段时间。任选地，在将细胞施加到比色共振反射光学生物传感器表面之后；在施加测试试 剂之后；在施加已知的离子通道拮抗剂或激动剂之后；或者在测试期间的任何其它点上、 或其组合，可将细胞孵育一段时间。由于检测所述细胞的无标记生物传感器方法对细胞无 破坏性，因此可将细胞处理多于一次以寻找数分钟、数小时或数天内的差别。本发明另一实施方案提供一种确认测试试剂是离子通道调节剂的方法，该方法包 括将细胞施加到比色共振反射光学生物传感器表面上的第一位置，并任选测定第一位置的 第一 PWV。将已知的细胞离子通道激动剂或拮抗剂施加到第一位置；并将测试试剂施加到 第一位置。可以同时将所述已知的离子通道激动剂或拮抗剂和测试试剂施加到第一位置， 或者将一种在另一种之前施加到第一位置。可测定第一位置的第二PWV。可确定第一个值， 其中第一个值是第一 PWV和第二 PWV之间的差值。将细胞施加到比色共振反射光学生物传 感器表面上的第二位置。可在将第一组细胞施加到所述第一位置的同时或较早或较晚时 间，将这些细胞施加到第二位置。这些细胞与施加到第一位置的那组细胞可以是相同类型 的细胞或不同的细胞。可测定第二位置的第三PWV。向第二位置施加已知的细胞离子通道 激动剂或拮抗剂，并可测定第二位置的第四PWV。所述已知的细胞离子通道激动剂或拮抗剂 可与第一位置使用的那些相同，或者是不同的已知的离子通道激动剂或拮抗剂。确定第二 个值，其中第二个值是第三PWV和第四PWV之间的差值。如果第一个值和第二个值不同，则 确认该测试试剂为离子通道的调节剂。如果第一个值和第二个值差别大于约lnm、2nm、3nm、 4nm、或5nm或更大，则第一个值和第二个值不同。在将细胞施加到生物传感器之后、在施加测试试剂之后、在施加已知的离子通道 激动剂或拮抗剂之后、或在测定中的任何其它时间点，或其组合，可将细胞孵育一段时间。筛选化合物以确保它们不以任何方式调节离子通道也是有用的。药物对离子通 道具有很多非预期的、不良的作用。由于这些作用，已从市场上除去了几种药物(例如 Rezulin、Loronex、Propulsid、Redux、Pondimin、Hismanal、Posicor 禾口 Seldane)。因此，本 发明方法可用于鉴定离子通道的非调节剂以及离子通道调节剂。激动剂、拮抗剂和调节剂可以影响不止一个离子通道。因此，可以有利的是抑制一 种或多种第一类型离子通道的功能以确定施加的测试试剂对一种或多种第二类型离子通 道的功能。第一和第二类型的离子通道可以是相同或不同的。在本发明的一个实施方案中， 使用一种或多种抗体、蛋白质、小分子、siRNA、反义RNA或其它试剂来抑制一种或多种类型 离子通道的一些或所有功能。例如，抗体可以对离子通道的一个或多个孔亚基蛋白是特异 的从而当该抗体特异地与孔蛋白结合时，所述离子通道部分或基本上停止起作用。一旦该 离子通道受抑制，则可以将如激动剂、拮抗剂、离子通道调节剂或任何其它化合物的测试试 剂施加到细胞以确定该测试试剂对未被阻断的类型的离子通道的作用。本发明的一个实施方案提供了筛选用于离子通道活性调节的测试试剂的方法。该 方法可以包括将表达一种或多种离子通道的细胞与可以部分或基本阻断一种或多种类型 的离子通道的试剂接触。细胞与测试试剂接触。在所述细胞与所述测试试剂接触之前和/或之后和/或在所述细胞与所述阻断剂接触之前和/或之后，可以确定一种或多种类型的 离子通道的离子通道活性。通过PWV的改变所确定的离子通道活性的变化表明测试试剂能 够调节一种或多种类型的离子通道的活性。测试试剂可以是潜在地调节离子通道活性或改变细胞内离子通道蛋白表达的任 何分子。分子可以是(例如)多肽、多核苷酸、抗体、有机小分子、多糖、脂肪酸、类固醇、嘌 呤、嘧啶或多价阳离子等。有机小分子可以具有大于100并且小于约2500道尔顿(D)的分 子量。优选的小分子为小于2000或小于1500或小于1000或小于500D。在本发明的一个实施方案中，将一种或多种ECM配体涂覆在生物传感器的一个或 多个表面上。将无血清培养基中多种类型细胞中的一种施加到所述生物传感器的表面上。 无血清培养基含有约5、4、3、2、1、0. 5%或更少的血清。无血清培养基可以包含约0%的血 清或约0%至约的血清。在将所述细胞施加到所述生物传感器后，可以确定PWV。可以 将一种或多种可能或已知的离子通道调节剂施加到生物传感器表面上。在所述一种或多种 调节剂施加后，可以确定PWV。所述细胞的一种或多种离子通道活性可以发生变化。例如， 所述细胞可以被去极化。通过细胞去极化可以使一种或多种离子通道活性发生变化。去极化是细胞膜电 位绝对值的减小。因此，膜电位的正电位或负电位降低的变化均为去极化。可以通过阳离 子流引起去极化，例如，Na+通过Na+通道或Ca2+通过Ca2+通道。可以通过K+通过K+通道 的外向流量抑制去极化。因此，可以通过盐浓度、压力和电流的调控来引起去极化。参见， 例如，由 Boulton 等人编辑的“神经元微环境(Neuronal Microenvironment)，，， Springer, NY (1988) ；Arbib，“脑理论和神经网络手册(The Handbook of brain theory and neural networks) ”，第 2 版，MIT 出版社，Cambridge Mass. (2003)。可以除去、稀释细胞培养基或用离子(如钾)浓度较低的培养基替代细胞培养基 以“打开”离子通道。作为另外一种选择，可以将细胞暴露于离子通道打开剂，例如蝎毒毒 在实现了一种或多种离子通道活性的变化后(例如，离子通道打开剂的施加)，可 以确定PWV。任选地，在预定的时间，可以实现细胞的一种或多种离子通道的活性的另一种 变化。例如，可以提高离子浓度或可以应用电压以实现离子通道去极化。然后，确定PWV。 可以将更多种PWV之一与对照细胞进行比较，对照细胞如在细胞的一种或多种离子通道中 未发生活性变化的细胞(例如，未施加离子通道打开剂)、完全缺少离子通道的细胞、接受 通道打开剂但未接受调节剂的细胞。可以在生物传感器的不同位置测量这些响应，例如，在 微滴板的不同的孔中。可以比较PWV以确定测试离子通道调节剂是否调节细胞的一种或多种离子通道。 例如，当将离子通道的测试调节剂施加到生物传感器表面上的细胞时，测量第一 PWV，将离 子通道打开剂施加到细胞，测量第二 PWV，可以比较所述第一 PWV和第二 PWV。在PWV显著 不同的情况下，测试调节剂确实调节了离子通道。一般说来，可以检测小至5pm的PWV差异 分辨；然而，还可以检测大于约20pm、100pm、200pm或更大的差异。作为另外一种选择，可以 将PWV与对照进行比较以确定测试调节剂是否调节了离子通道。在重组细胞系过表达一种类型的离子通道的情况下，可以确定调节剂对那一种类 型离子通道的作用。
在本发明的测定中，在每个步骤之前和/或之后可以有一段时间的孵育、清洗步 骤、PWV确定或它们的组合。任选地，在整个过程中或在测定的一部分中，可以不断地采取 PWV读数。使用本发明的各实施方案，可在对离子通道的调节出现时检测这种调节或检测 这种调节的缺失，因此避开了在评估时掺入放射法、比色法、荧光法的标记物或显微镜检 查法的必要。可以以非标记的方式，方便地实时监测由于离子通道调节作用而出现的 细胞变化。为检测细胞的实时变化，设计了 BIND Biosensor , BIND Reader 和BIND farmer (如比色共振反射生物传感器系统)，并创立了对应算法以定量数据。参见如美国 专利 No. 6，951，715、美国专利申请 Publ. 2004/01516 。本发明方法具有优越性，原因是它们不需要标记细胞或者试剂以用于显微或比色 /荧光评估，它们允许对相同的细胞群进行实时的、连续的、多重独立的读数，所述方法快 速、所需要的试剂用量极少(体积和类型两方面)、不需要重组细胞系、不需要机械操作细 胞，并且不需要使细胞流过计数器。该无标记生物传感器方法对细胞无破坏性，使得可以在用或不用已知化合物或测 试化合物处理下，在一段长时间内连续或不连续地监测一种细胞或一组细胞。本发明方法 允许在很多天内对相同的细胞群进行实时的连续监测或多重独立的读数。可在正常培养环 境(适当介质中静止)下，在较长时间内方便并客观地定量细胞变化。还可将本发明的方 法与荧光标记协同使用，以从各细胞或细胞群中得到附加的、细胞内数据。通过在数个时间段测定一个位置的PWV，可监测细胞变化。另外，可在数个时间段 对承载细胞的受器(receptacle)(如微量滴定板孔)进行扫描。在本发明一实施方案中， 通过将测试试剂的PWV模式(pattern)与已知的离子通道调节剂比较，可鉴定测试试剂为 潜在的离子通道调节剂。当将某些离子通道调控剂施加到某些细胞群中时，PWV随时间呈 现出特定的模式。例如，将离子通道调节剂施加到细胞后，PWV可能在一特定时间内增加， 然后降低。可将随时间呈现出相同PWV值的模式的测试试剂鉴定为潜在的离子通道调控剂 或调节剂。可将一或多种细胞施加到比色共振反射光学生物传感器表面上的位置，如微量滴 定板孔。受器指一种容器，并不是多个容器的总称，如微量滴定板。检测该位置的比色共振 反射光学峰波长值(PWV)。可将一或多种细胞孵育一段时间(如1秒、30秒，1、2、5、10、20、 30、45分钟，1、2、5、10小时或更多小时)。在孵育前或孵育后，或孵育前和孵育后，可将一或 多种测试试剂、离子通道激动剂和/或离子通道拮抗剂施加到所述一或多种细胞。可对该 位置的比色共振反射光学PWV进行第二次测定。如果细胞中出现变化，则与未出现变化的 情形相比较，光的反射波长发生变化。可将第一 PWV与第二 PWV相比较。PWV变化可表明细 胞中的变化。可测定若干时间段内的PWV并进行比较。生物传感器位置上细胞的变化可通过生物传感器表面的PWV测定，或者更多采用 下列利用透镜型光学或电子电荷耦合器件(electronics-based charge coupled device, (XD)技术的仪器监测，如显微镜、数码相机、常规照相机或其它显像设备(放大或非放大)。PffV变化可采用BIND读数器 、扫描仪或Cartridge读数器测定。在使用BIND读 数器⑧和Cartridge读数器时，可在约0. 0005-8小时内完成测试。测定PWV的扫描仪的透镜分辨率优选具有约2-200、约2_50或约2_15微米像素大小。本发明的测试可在小于约0. 25,0. 5,0. 75、1、2、3、4、5、6、7或8小时内完成。即可以以 一种时间有效的方式测定对所施加试剂响应的细胞变化。本文任何之处参考的所有专利、专利申请和其它的科学或技术著作均通过参考全 文结合到本文中。在不存在本文中未具体公开的任何(一个或多个)要素或(一个或多个) 限制的情况下，可合适地实施本文示范性描述的本发明。因此，例如在本文的各种情况下， 术语“包含(或包括)”、“基本由…组成”和“由…组成”虽然保留其通常的含义，但其可由 其它两个术语的任何一个代替。已使用的术语和表达用作说明的术语且不构成限制，并且 并不意味着所述术语和表达的使用排除了所示和所述特征或其部分的任何等同，但应认可 在本发明所要求的范围内可能有各种变化。因此，应理解虽然通过各实施方案具体公开了 本发明，但本领域技术人员可诉诸于本文公开的概念的任选的特征、变化和变更，并且这些 变化和变更都认为落在本申请说明书和所附权利要求书定义的本发明范围内。另外，当以 Markush基团或可替代的其它基团描述本发明的特征和方面时，本领域技术人员将认可，在 所述Markush基团或其它基团的任何单个成员或亚族成员方面也描述了本发明。实施例hERG钾离子通道抑制剂的筛选本方案使用了不含钾的饥饿缓冲液以使细胞去极化并借此打开离子通道从而使 得有可能进行离子通道调节剂的筛选。用水合基线的IXPBS清洗比色共振反射生物传感 器板3-5分钟。对每个孔确定PWV。该PWV可以用于确定生物传感器是稳定的(无漂移 (drifting))并且穿过孔的信号是均勻的。用25. 0 μ 1/孔的纤连蛋白在室温下涂覆所述板 2小时。通过将25. 0 μ 1卵清蛋白或BSA的PBS溶液加入到之前用纤连蛋白涂覆的孔中，将 所述板在室温下阻断1小时或在4°C阻断过夜。制备了含有和不含钾的饥饿缓冲液。对于500. Oml不含钾的饥饿缓冲液，使用了 下列试剂:25mL 的 3M NaCl，最终浓度为 150mM NaCl ；10. Oml, 20mMHEPES ；1. 0ml, 2mM 氯化 钙；0. 5ml，2mM氯化镁；1. 0ml, 5mM D_(+)_葡萄糖；加入HPLC水至500. Oml。除加入2mM的 KCl外，与上述相同，制备了钾饥饿缓冲液。用不含钾的缓冲液将测试化合物的IOmM母液稀释至10 μ M作为第一浓度，以8个 点的稀释系列连续稀释1/3以制备试剂板一水合西沙必利-IOmM = 10mg/2. 06ml DMSO, 细胞内最终的DMSO百分比为0. 1至0. 5 ；以30 μ M的高浓度起始Ε4031滴定。将细胞(用人ether-a-go-go (hERG)钾通道转染的CHO细胞或CHO亲本细胞)用 3. OmL凡尔生(versene)/瓶收获5_10分钟。用每瓶8. OmL的含FBS的完全培养基使凡尔 生失活。将生物传感器板平衡至室温并除去先前加入的PBS。以IK rpm使细胞轻轻旋转离 心5分钟。吸出培养基并将含钾饥饿缓冲液加入至细胞团。然后，将细胞从它们的初始浓 度稀释至IO6个细胞/毫升的浓度(每20. 0 μ 1中有20，000个细胞)。将生物传感器板的 每个孔的基线PWV作为质量控制步骤以检查在使细胞沉降并粘附足够时间后的细胞粘附 均勻性。将20. 0 μ 1的含钾饥饿缓冲液加入到每个孔中。对每个孔测量PWV。确定平均细 胞数/孔。对于接种来说，每孔在20. 0 μ 1中有20Κ个细胞，以IO6个细胞/毫升制备了细 胞。将20. 0 μ 1的细胞加入到已含有20. 0 μ 1培养基/缓冲液的孔中。使接种的生物传感器试验板在室温下静置约15分钟，然后放置到37°C的培养箱 中以进行120分钟的沉降、粘附和细胞健康回收。对于转染的细胞来说，将所述板放置在30°C的培养箱中以辅助蛋白重折叠。任选地，在此期间可以获得新鲜接种的生物传感器板 的PWV以监控细胞粘附。为了观察阻止hERG离子通道打开的hERG通道抑制剂的作用，首先将细胞与抑制 剂在含钾培养基中预孵育。然后，在离子通道打开的(如通过除去细胞外的钾或通过加入 对打开K+通道特异的化合物，如菲律宾野桐毒素(mallotoxin))条件下观察细胞。在不含 钾的条件(它通常造成静电电位，从而导致孔打开)下或在较低量的菲律宾野桐毒素的情 况下，已在存在钾的情况下与抑制剂预孵育的那些细胞不应打开。明显的比较是，未暴露于 抑制剂的那些细胞应打开并且PWV的变化应导致对正常通道功能的指示。对生物传感器板进行3-5分钟的PWV测量或直至达到小于l_2pm变化/分钟的稳 定读数为止。将适量的配体或测试试剂从试剂板加入到生物传感器板。将细胞孵育约15-30 分钟。尽量将孔中的全部含有抑制剂的含钾饥饿缓冲液用相同体积的含有相同最终所需浓 度的配体或测试试剂的不含钾饥饿缓冲液替换。对每个孔测量PWV。图1示出了用hERG转 染的CHO细胞比亲本CHO细胞膨胀得更快并且更多，这是因为它们具有更多的离子通道，并 且与亲本CHO细胞相比，钠和水能够更快速地移动到细胞中。图2A-C示出了两种钾通道抑 制剂(一水合西沙必利和E4031)对细胞的作用。抑制剂浓度越高，则细胞对钾缺乏产生响 应从而膨胀的越少。由于缺少hERG离子通道，因此亲本CHO系在存在抑制剂的情况下表现 出几乎没有甚至没有作用。参见图3。
权利要求
1.确定测试试剂的离子通道调节性质的方法，包括(a)将细胞施加到比色共振反射光学生物传感器的表面；(b)基本阻断一种或多种第一类型离子通道的功能活性，其中未阻断一种或多种第二 类型离子通道的活性；(c)检测所述细胞的比色共振反射光学第一峰波长值(PWV)；(d)将测试试剂施加到所述细胞；(e)检测所述细胞的比色共振反射光学第二PWV;和(f)根据所述第一PWV与第二 PWV的比较，确定所述测试试剂的离子通道调节性质。
2.权利要求1所述的方法，其中通过抗体、蛋白质或有机小分子基本阻断一种或多种 类型的离子通道的功能活性。
3.权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种第一类型的离子通道为电压门控钠通 道、电压门控钙通道、机械敏感性通道、钾通道、内向整流钾通道、钙激活钾通道、电压门控 钾通道、双孔结构域钾通道、瞬时受体电位通道、精子阳离子通道、环核苷酸门控通道、超极 化激活环核苷酸门控通道、双孔通道、配体门控通道和光门控通道。
4.权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种第二类型的离子通道为电压门控钠通 道、电压门控钙通道、机械敏感性通道、钾通道、内向整流钾通道、钙激活钾通道、电压门控 钾通道、双孔结构域钾通道、瞬时受体电位通道、精子阳离子通道、环核苷酸门控通道、超极 化激活环核苷酸门控通道、双孔通道、配体门控通道和光门控通道。
5.权利要求1所述的方法，其中所述细胞在以下操作后孵育一段时间(a)将它们施加 到所述表面上；(b)阻断一种或多种第一类型的离子通道的功能活性；(c)在检测所述细胞 的第一 PWV后；(d)在将所述测试试剂施加至所述细胞后；(e)在检测所述细胞的第一 PWV 后，或⑴它们的组合。
6.权利要求1所述的方法，其中所述比色共振反射光学生物传感器的表面为容器的内 表面，所述容器选自微量滴定孔、微量滴定板、试管、培养皿、微观流体槽和微阵列。
7.权利要求1所述的方法，其中使用带有约2微米-约200微米下限像素大小的透镜 的扫描仪检测所述第一 PWV和第二 PWV。
8.权利要求1所述的方法，其中所述细胞和测试试剂不包含检测标记物。
9.权利要求1所述的方法，其中所述方法在约2、10、15、25、30或37°C的温度进行。
10.权利要求1所述的方法，还包括以下步骤(g)清洗所述细胞；(h)平衡所述细胞；(i)任选地重复步骤(a)-(f)。
11.鉴定离子通道调节剂的方法，包括(a)将无血清培养基中的细胞施加到比色共振反射光学生物传感器的表面，其中将一 种或多种细胞外基质(ECM)配体固定到所述生物传感器的表面上；(b)检测所述细胞的比色共振反射光学第一峰波长值(PWV)；(c)将一种或多种测试离子通道调节剂施加到所述生物传感器的表面；(d)使所述细胞的一种或多种离子通道的活性发生变化；(e)检测所述细胞的比色共振反射光学第二PWV;和(f)确定所述一种或多种测试离子通道调节剂是否调节了所述细胞的一种或多种离子 通道。
12.权利要求11所述的方法，还包括以下步骤(g)清洗所述细胞；(h)平衡所述细胞；(i)任选地重复步骤(a)-(f)。
13.鉴定离子通道调节剂的方法，包括(a)将无血清培养基中的细胞施加到比色共振反射光学生物传感器的表面，其中将一 种或多种细胞外基质(ECM)配体固定到所述生物传感器的表面；(b)将一种或多种测试离子通道调节剂施加到所述生物传感器的表面；(c)使所述细胞的一种或多种离子通道发生变化；(d)检测所述细胞的比色共振反射光学第一PWV;(e)使所述细胞的一种或多种离子通道发生变化；(f)检测所述细胞的比色共振反射光学第二PWV;和(g)确定所述一种或多种测试离子通道调节剂是否调节了所述细胞的一种或多种离子 通道。 权利要求13所述的方法，还包括以下步骤(h)清洗所述细胞； (j)平衡所述细胞；(k)任选地重复步骤(a)-(g)。
全文摘要
本发明提供不使用重组细胞系过表达离子通道蛋白或不使用检测标记物而鉴定离子通道调节剂的方法。
文档编号A61B6/00GK102149327SQ200980135919
公开日2011年8月10日 申请日期2009年1月8日 优先权日2008年7月11日
发明者A·于扎科夫, L·G·莱恩, R·沃纳, R·费尔南德斯 申请人:Sru生物系统公司