αB-晶状体蛋白的用途
【专利摘要】本发明公开了αB-晶状体蛋白在制备抑制视网膜神经节细胞中钾离子通道药物中的用途。本发明给予急性高眼压大鼠模型注射αB-晶状体蛋白，与未注射组相比，注射组大鼠视网膜上kv1.1和kv1.3的表达量降低，表明αB-晶状体蛋白具有抑制视网膜神经节细胞中钾离子通道的功能。本发明为临床上通过抑制视网膜神经节细胞中钾离子通道的功能治疗相关疾病提供了新的候选药物。
【专利说明】ctB-晶状体蛋白的用途
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药【技术领域】，涉及aB-晶状体蛋白的新用途，具体涉及aB-晶 状体蛋白在制备抑制视网膜神经节细胞中钾离子通道药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 视网膜神经节细胞（RGCs)是视网膜内信息传递的最后一站，其轴突先组成视网 膜的神经纤维层，然后汇聚成视神经，在视觉通路中起着重要的传导作用。视神经损伤能够 弓丨起视神经病变，从而引起视觉缺失，这种情况在许多眼科病重都能见到，如视神经炎、视 路占位性病变、青光眼、缺血性视神经病变和糖尿病视网膜病变等。近年来，关于视神经保 护的研究受到国内外众多学者的关注。研究显示，外伤性视神经病变视神经损害的主要病 理学基础是RGCs的过度凋亡及神经节细胞的再生障碍。视神经损伤后对RGCs的保护主要 是停止或防止其发生凋亡。阻断或降低RGCs的凋亡途径和增加RGCs的存活能力，已成为 防止视神经病变、保存患者视功能的研究方向。
[0003] 研究表明在RGCs上许多种钾离子通道存在，这些钾离子通道在RGCs的发育、神经 轴再生、轴突导向、动作电位和反复放电调解中起到了很重要的作用。Kvl通道家族属于电 压门控钾离子通道。研究证明大鼠的RGCs表达kvl.l、kvl. 2、kvl. 3,但是不表达kvl. 5,并 且通过在大鼠玻璃体腔内注射钾离子通道阻滞剂，发现阻断kvl. 1、kvl. 3、可减少RGCs的 凋亡，只阻断kvl. 2只起很小的作用，阻断kvl. 5不起作用。Kvl. 1和kvl. 3通过凋亡机制 中的不同通路促进RGCs细胞的自发性凋亡，kvl. 1的衰竭增加了抗凋亡因子Bcl-xL等的表 达，而kvl. 3的衰竭减少了caspase-3、caspase-9和Bad等的表达。最终，kvl. 1和kvl. 3 的衰竭均可增加视神经横断伤后RGCs的存活率。
[0004] aB-晶状体蛋白是晶状体主要的蛋白成分之一，随着研究的深入，发现其在角 膜、虹膜、视网膜、睫状体、视神经都有一定的存在且与眼部疾病的发病机制有着重要联系。 aB-晶状体蛋白是一类普通存在的小分子热休克蛋白，有强大的分子伴侣作用。发明人 所在的课题组已经证明aB-晶状体蛋白对大鼠视网膜无毒性作用，可促进急性高眼压后 RGCs的存活，并且通过增加RGCs中GAP-43表达促进RGCs的轴突再生。
[0005] 虽然许多研究证明aB-晶状体蛋白对RGCs具有保护作用，但是其作用机制尚不 明确。
【发明内容】
[0006] 本发明是基于以下实验发现提出的：给予大鼠急性高眼压模型以aB-晶状体蛋 白注射，与未注射相比，注射aB-晶状体蛋白后，RGCs细胞中kvl.l、kvl. 3表达降低，同时 Bcl-xL升高、caspase-3降低，表明aB-晶状体蛋白是通过控制钾离子通道kvl. 1和kvl. 3 来调控RGCs细胞的凋亡。
[0007] 本发明提供了aB-晶状体蛋白在制备抑制视网膜神经节细胞中钾离子通道药物 中的用途。所述钾离子通道可以是kvl. 1、可以是kvl. 3、或是kvl. 1和kvl. 3的组合。kvl. 1 和kvl. 3通过不同的通路控制细胞的凋亡过程，单独抑制上述两种钾离子通道中的一种就 可以达到控制细胞凋亡的目的。在本发明的具体实施方案中，给予大鼠急性高眼压模型以 aB-晶状体蛋白注射，与未注射相比，注射aB-晶状体蛋白后，RGCs细胞中的kvl. 1和 kvl. 3两种通道蛋白的表达均受到抑制。
[0008] 本发明还提供了aB-晶状体蛋白在制备促进视网膜神经节细胞中Bcl-xL蛋白 表达升高的药物中的用途。在本发明的具体的实施方案中，给予大鼠急性高眼压模型以 aB-晶状体蛋白注射，与未注射相比，注射aB-晶状体蛋白后，RGCs细胞中Bcl-xL表达升 商。
[0009] 本发明还提供乐aB-晶状体蛋白在制备抑制视网膜神经节细胞中caspase-3 蛋白表达的药物中的用途。在本发明的具体的实施方案中，给予大鼠急性高眼压模型以 aB-晶状体蛋白注射，与未注射相比，注射aB-晶状体蛋白后，RGCs细胞中caspase-3表 达降低。
[0010] 本发明还提供了aB-晶状体蛋白在制备抑制视网膜神经节细胞凋亡的药物中的 用途。在本发明的具体的实施方案中，给予大鼠急性高眼压模型以aB-晶状体蛋白注射， 与未注射相比，注射aB-晶状体蛋白后，RGCs细胞中Bcl-xL表达升高，同时caspase-3表 达降低，表明RGCs细胞凋亡的进程受到抑制。
[0011] 本发明还提供了aB-晶状体蛋白在制备治疗视神经损伤的药物中的用途。视神 经损伤的主要病理学基础是RGCs的过度凋亡及神经节细胞的再生障碍。视神经损伤后对RGCs的保护主要是停止或防止其发生凋亡。
[0012] 通过建立视神经损伤的动物模型并进行实验研究，以寻求有效的治疗方法，对于 研究视神经损伤机制及治疗具有重要意义。现在国内外视神经损伤模型分为机械性视神经 损伤的动物模型、缺血性视神经损伤的动物模型、高眼压性视神经损伤的动物模型。高眼压 性视神经损伤的动物模型包括急性暂时性高眼压和慢性持续性高眼压。急性暂时性高眼压 可以通过下列方法实现：（1)前房灌注法；（2)玻璃体腔灌注法；(3)药物诱导法。上述所提 到的构建视神经损伤模型的方法均可用于本发明。
[0013] 在本发明的具体的实施方案中，选用的是前房灌注生理盐水法制备的急性高眼压 视神经损伤模型，具体的构建过程如下：用10%水合氯醛（0.4ml/100g)行大鼠左下腹腔注 射麻醉。全身麻醉成功后用左氧氟沙星滴眼液冲洗右眼结膜囊，再滴复方托吡卡胺滴眼液 和盐酸奥布卡因滴眼液各一滴，两种滴眼液使用时间间隔5min。在解剖显微镜下将连有生 理盐水输液器的33G针头于角膜缘做隧道切口刺入前房，注意勿伤虹膜和晶状体，打开输 液调节器至最大。保持液体液平面与鼠眼垂直距离156cm(产生15. 22kPa，相当于120mmHg 的眼内压）。当莫非氏管中无液体滴注并且球结膜、虹膜、视网膜苍白时说明急性高眼压模 型成功。间断滴诺氟沙星滴眼液以预防感染并防止角膜干燥。持续灌注60min，拔出针头， 可见球结膜及虹膜恢复正常颜色，涂抹红霉素眼膏。前房穿刺过程中伤及晶状体、虹膜以及 穿刺后发生眼部感染的大鼠予以剔除。
[0014] 本发明的优点和有益效果：首次发现了aB-晶状体蛋白与kvl. 1和kvl. 3两种 通道蛋白的相关性，S卩aB-晶状体蛋白可以抑制kvl. 1和kvl. 3两种钾离子通道蛋白的表 达，从而阻断钾离子通道的功能。根据上述发现，可以开发aB-晶状体蛋白作为治疗跟钾 离子通道功能相关的疾病的候选药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1显示术后7dQRT-PCR检测结果；
[0016] 图2显示术后14dQRT-PCR检测结果；
[0017] 图3显示术后7d和14d蛋白表达量的Westernblot结果；
[0018] 图4显不术后7d蛋白表达量的统计结果；
[0019] 图5显示术后14d蛋白表达量的统计结果。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明， 并不意味着限制本发明的保护范围。
[0021] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0022] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0023] 实验动物与分组：
[0024] 3月龄雄性清洁级SD大鼠60只，体重220g左右，由中国人民解放军军事医学科学 院实验动物中心提供，许可证号SCXK-(军）2012-0004,饲养于武警总医院总医院中心实验 室，经裂隙灯及眼底镜检查无眼部病变。随机分成以下三组 ：
[0025] (1)急性高眼压组（A组）：急性高眼压模型成功构建后，不做其他处理。
[0026] (2)急性高眼压+玻璃体腔注射生理盐水组（B组）：急性高眼压模型成功建立后， 行玻璃体注射生理盐水5ii1。
[0027] (3)急性高眼压+玻璃体腔注射aB-晶状体蛋白组（C组）：急性高眼压模型建立 后，行玻璃体腔注射aB-晶状体蛋白（浓度l*l(T5g/L)5ia。
[0028] 每组20只，右眼为实验眼。分别于术后7d和14d，每组取5只大鼠视网膜，使用 QRT-PCR法检测kvl. 1、kvl. 3、Bcl-xL、和caspase_3mRNA的表达水平；分别于术后7d和 14d时，每组取5只大鼠视网膜，使用westernblot检测视网膜kvl. 1、kvl. 3、Bcl-xL、和 caspase-3的蛋白表达水平。
[0029] 实施例1大鼠急性高眼压模型的建立
[0030] 方法：用10%水合氯醛（0. 4ml/100g)行大鼠左下腹腔注射麻醉。全身麻醉成功 后用左氧氟沙星滴眼液冲洗右眼结膜囊，再滴复方托吡卡胺滴眼液和盐酸奥布卡因滴眼液 各一滴，两种滴眼液使用时间间隔5min。在解剖显微镜下将连有生理盐水输液器的33G针 头于角膜缘做隧道切口刺入前房，注意勿伤虹膜和晶状体，打开输液调节器至最大。保持液 体液平面与鼠眼垂直距离156cm(产生15. 22kPa，相当于120mmHg的眼内压）。当莫非氏管 中无液体滴注并且球结膜、虹膜、视网膜苍白时说明急性高眼压模型成功。间断滴诺氟沙星 滴眼液以预防感染并防止角膜干燥。持续灌注60min，拔出针头，可见球结膜及虹膜恢复正 常颜色，涂抹红霉素眼膏。前房穿刺过程中伤及晶状体、虹膜以及穿刺后发生眼部感染的大 鼠予以剔除。
[0031] 实施例2大鼠急性高眼压模型玻璃体腔药物注射
[0032] aB-晶状体蛋白溶液的配制：将商品aB-晶状体蛋白干粉（购自sigma)溶于生 理盐水中，使其终浓度为l*l(T5g/L。
[0033] 方法：大鼠急性高眼压模型建立后，使用微量进样器，在显微镜下于大鼠右眼角膜 缘后刺入玻璃体腔，从角膜中央可见放大的针头，缓慢注射，拔出针头，结膜囊内涂红霉素 眼膏。其中B组大鼠玻璃体腔内注入等渗盐水5iU，C组大鼠玻璃体腔内注入l*l(T5g/L的 aB-晶状体蛋白溶液5iU。用盖玻片轻压角膜，观察玻璃体腔注射部位有无出血及渗漏， 眼底视网膜反光是否正常，眼底血管走行及充盈是否正常。显微镜下观察确认玻璃体腔无 出血、无晶状体及虹膜损伤者纳入实验。诺氟沙星滴眼液点术眼一滴，然后用红霉素眼膏涂 抹术眼。
[0034] 实施例 3QRT-PCR法检测kvl. 1、kvl. 3、Bcl-xL和caspase-3 的mRNA水平
[0035] 步骤：
[0036] 1.视网膜总RNA提取
[0037] 分别于术后7d和14d时，每组取5只大鼠，10%水合氯醛腹腔麻醉。取出术眼置 冰浴生理盐水中漂洗3min*2次。显微镜下，去除眼前节，取出视网膜组织。按超纯RNA提 取试剂盒（购自北京康为世纪生物科技有限公司）的说明提取视网膜组织中的总RNA。
[0038] 2.RNA定量
[0039] 吸取2ylRNA，以空气作空白对照，用ABI核酸定量分析仪检测RNA纯度，纯RNA 的0D260/280比值接近2. 0，DNA的0D260/280的比值接近1. 8。用ABI核算定量分析仪测 定0D260值进行准确定量。
[0040] 3.反转录
[0041] 用HiFi-MMLVcDNA第一链合成试剂盒（购自北京康为世纪生物科技有限公司） 进行反转录，实验操作按产品说明书进行，步骤如下：
[0042] (1)将RNA模板、引物、5*RTmix和无RNase的水溶解并置于冰上备用。按下表向 反应管中加入20ii1反应体系的第一部分，混匀。（见表1)
[0043] 表1反应体系的第一部分
【权利要求】
1. a B-晶状体蛋白在制备抑制视网膜神经节细胞中钾离子通道药物中的用途。
2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抑制视网膜神经节细胞中钾离子通 道是抑制视网膜神经节细胞中钾离子通道蛋白的表达。
3. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述钾离子通道蛋白是kvl. 1。
4. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述钾离子通道蛋白是kvl. 3。
5. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述钾离子通道蛋白是kvl. 1和kvl. 3。 6. a B-晶状体蛋白在制备促进视网膜神经节细胞中Bcl-xL蛋白表达升高的药物中的 用途。 7. a B-晶状体蛋白在制备抑制视网膜神经节细胞中caspase-3蛋白表达的药物中的 用途。
8. 根据权利要求1-7中任一项所述的用途，其特征在于，所述视网膜神经节细胞来自 于大鼠。
【文档编号】A61K38/17GK104383521SQ201410584604
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月27日 优先权日:2014年10月27日
【发明者】吴志鸿, 侯世科, 樊毫军, 马艳 申请人:中国人民武装警察部队总医院