包含结合于EBV(Epstein-Barr病毒)蛋白BARF1的抗体的药物组合物的制作方法

专利名称：包含结合于EBV(Epstein-Barr病毒)蛋白BARF1的抗体的药物组合物的制作方法
包含结合于EBV(Epstein-Barr病毒)蛋白BARF1的抗体的
药物组合物本发明涉及用于免疫疗法和免疫接种的组合物，其包含结合于BARFl或从BARFl 衍生的肽的抗体。Epstein-Barr病毒(EBV)与几种人类癌症相关鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma)、胃癌(Gastric carcinoma)、伯基特淋巴瘤(Burkitt，s lymphoma)、何杰金淋巴瘤(Hodgkin，s lymphoma)、在 AIDS 患者中诱导的淋巴瘤(lymphoma induced in AIDS patients)禾口禾口月干内EBiW- (Esophage and Intrahepatic cholangiocarcinoma)。最近数据显示EBV还涉及鼻NK/T-细胞淋巴瘤(nasal NK/T-cell lymphoma)以及肝内胆管癌(intra-h印atic cholangiocarcinoma)。常见于 AIDS 患者的口腔毛状白斑(Oral hairy leucoplasia，0HL)也与EBV紧密相关。因此，EBV既是亲淋巴的(Iymphotropic)，又是趋上皮的(印itheliotropic) ο已使用了几种针对EBV相关癌症的治疗方法，包括放射和化学疗法。然而放射和化学疗法产生周知的问题(毒性，剂量等等)。也开发了几种细胞和病毒基因疗法，其一般基于病毒和/或细胞蛋白作为靶。然而，这些疗法的效果并不足够良好。在免疫疗法中，也考虑了抗EGFR抗体(表皮生长因子受体)，特别是用于治疗癌瘤 (NPC、胸腺、肺、子宫颈癌瘤、结肠、乳房和头颈)，因为与EBV相关或不相关的上皮肿瘤细胞表达EGFR。因此该治疗并不是排他针对EBV相关癌瘤的。对于子宫颈癌和胸腺瘤，正在评价治疗(单克隆抗体Cetumximab)的效力。然而，用抗EGFR与放射疗法组合治疗的患者有变得对放射疗法具有抗性的风险。鼻咽癌(NPC)为来源于鼻后腔(retro-nasal cavity)上皮的人恶性肿瘤。其为总是与病毒相关的人类恶性肿瘤最著名的实例。Epstein-Ban 病毒(EBV)的全长基因组包含于所有恶性NPC细胞中，且其编码可能促成恶性肿瘤表型的病毒蛋白(Decaussin G， Sbih-Lammali F, De Turenne-Tessier M, Bougermouh AM, Ooka Τ. 2000. Cancer Res 60 5584-5588 ；Ooka T :2005.于Epstein-Barr Virus. Horizon Press,Annette Griffin :Erle S. Robertson编.第观章pp 613-630)。尽管EBV感染在人中广泛存在，NPC的发病率取决于地理区域的不同而变化极大。NPC的活检总是表达几种raV基因，包括编码EBERs、EBNAU LMPU LMP2A、BARFO 和BARFl的基因。其中，仅LMPl和BARF-I能够在啮齿类成纤维细胞中诱导恶性转化(Wei 和 Ooka,1989, EMBO J. 8 :2897-903 ；Wang D, Liebowitz D 和 Kieff E.1985. Cell 43 831-840)。大部分(> 98% )的 NPC 活检表达 BARF 1 (Decaussin G，Sbih-Lammali F, De Turenne-Tessier M, Bougermouth AM, Ooka Τ.2000Cancer Res. 60 :5584-8 ；Hayes DP, Brink AA, Vervoort MB, Middeldorp JM, Meijer CJ, van den Brule A. 1999J. Mol. Pathol. 52 :97-103)。而且，全世界5_10%的胃癌与EBV感染相关，且几乎所有的EBV相关癌瘤的活检表达BARFl。在病毒溶解蛋白(viral lytic protein)中，仅BARFl在NPC和EBV 相关GC癌瘤以及体外EBV无限增殖化的上皮细胞中始终如一地并以高水平表达(Ooka， 2005，28章，于Epstein-Barr Virus. Horizon Press，Annette Griffin :Erle S. Robertson
3编.613-630页)。另一方面，BARFl能够在体外使原代猴肾上皮细胞无限增殖化(Wei MX, de Turenne-Tessier Μ,Decaussin G,Benet G 禾口 Ooka Τ. 19970ncogene 14:3073-3082)。作为由EBV编码的癌基因，BARFl是由Wei和Ooka于1989年发现的(Wei和 Ooka, 1989，EMBO J. 8 :2897-903)。当在啮齿类成纤维细胞(Wei 和 Ooka, 1989，EMBO J. 8 2897-903)、人 B MM (Wei MX, Moulin, JC, Decaussin G, Berger F, Ooka Τ. 1994, Cancer Res. 54 :1843-8)、人上皮细胞系和原代灵长类上皮细胞(Wei MX, de Turenne-Tessier Μ, Decaussin G, Benet G，Ooka Τ. 1997，Oncogene，14 :3073-3082)中表达时,BARFl 癌基因既有转化活性又有无限增殖化活性。BARFl还在注射EBV颗粒后，在小绢猴(Tamarin)(新大陆猴)中诱导的淋巴瘤中表达(Zhang CX,Decaussin G,Finerty S,Morgan A,Ooka Τ. 1992， Virus Res26 :153-166)。BARFl 激活 Bcl2、c_myc、CD23、CD21、运铁蛋白受体和几种转录因子(Ooka, 2005,第 28 章，于 Epstein-Barr Virus. Horizon Press, Annette Griffin :Erle S. Robertson编.第613-630页)。BARFl在转染细胞和EBV相关的胃癌细胞中激活细胞周期蛋白 Dl (ffiech, T. , Nikolopoulos, E. , Lassmann, S. , Heidt, Τ. , Sarbia, Μ. , Werner, Μ., Shimizu, Y. ，Sakka, Μ. ，Ooka, T 禾口 Zur Hausen. Α. 2008，Virchows Archiv 452 :621-628)。 当转染入上皮细胞时，BARFl激活细胞周期，且该序列见于“双微”染色体中，所述染色体常常见于含有扩增的细胞基因如c-myc和mdm2的癌细胞中(Karran L.，Teo C. G.，King D.， Hitt Μ. M.，Gao Y.，Wedderburn N.和 Griffin B. Ε.，1990. Int. J. Cancer 45，763-772)。 BARFl 蛋白由潜在性感染的 B 细胞分泌(Fiorini 和 Ooka，2008，Virology Journal，5 :70)。 这表明BARFl基因属于潜在性家族的基因。转化域位于BARFl蛋白的N端区，包含1_56 位氨基酸，其还涉及抗凋亡 Bcl2 的激活(Sheng W，Decaussin G，Sumner S，Ooka T. 2001， Oncogene 20 :1176-1185)。BARFl似在上皮肿瘤生成中起重要作用。BARFl蛋白显示通过晶体学研究确定的六聚物寡聚结构(Tarbouriech N, Ruggiero F, de Turenne-Tessier M, Ooka T, Burmeister WP. 2006, J Mol Biol. 359 :667-678)并作为强力的促有丝分裂原起作用(Sail A, Caserta S, Jolicoeur P, Franqueville L, de Turenne-Tessier M 禾口 Ooka Τ.2004. Oncogene. 23 4938-4944)。BARFl蛋白可在体外与CSFl (集落刺激因子_1)复合，导致巨噬细胞激活的抑制(Strockbine LD, Cohen JI, Farrah T, Lyman SD, Wagener F, DuBose RF, Armitage RJ 和 Spriggs MK LD. 1998，J Virol. 72 :4015-4021)，并可在 EBV 感染的 B 细胞中抑制 INF-α 的分泌(Cohen J.和 Lekstrom K. 1999 J. Virol. 73 :7627-7632)。另一方面，在 ADCC 测试中 NK 细胞识别 BARFl (Tanner J, Wei M，Ahamad A, Alfieri C, Tailor P, Ooka Τ, Menezes J. 1997 J. Infect Disease. 175 :38-46)。因此，BARFl不仅涉及致癌机理，还涉及免疫调节。 当表达于胃上皮细胞中时，BARFl具有抗凋亡活性(Wang Q.，Tsao Sff.，Ooka T.，Nicholls JM.，Cheung HW,Fu S. ,Wong YC,Wang X. 2006Cancer Letter 238 :90-103)。BARFl 通过其激活几种涉及抗凋亡的细胞蛋白的自分泌机理来激活细胞周期。其促有丝分裂活性在EBV 相关的肿瘤的形成中其关键作用(Sail A, Caserta S, Jolicoeur P, Franqueville L, de Turenne-Tessier Μ,Ooka Τ. 2004，0ncogene23 :4938-44)。正如BARFl 和 LMPl-外来体分泌于培养基(Houali K, X. Wang, Y. Shimizu, D. Djennaoui, J. NicholIs, S. Fiorini, A. Bougermouh 禾口 Τ·Ooka.2007, Clin.Cancer Res. 13 :4993-5000),这些癌蛋白还在来自NPC患者的血清以及唾液中分泌。这些在血清中分泌的蛋白可对细胞激活、免疫调节和/或免疫抑制起关键作用。阐明了 BARFl蛋白在 NPC 患者血清和唾液中的分泌(Houali K, X. Wang, Y. Shimizu, D. Djennaoui, J. Nicholls, S. Fiorini, A. Bo μ guermouh 禾口 Τ· Ooka. 2007， Clin. Cancer Res. 13 :4993-5000)且 BARFl 蛋白在体外显示强力的促有丝分裂活性。该促有丝分裂活性可涉及肿瘤形成。已描述了 BARFl作为B细胞无限增殖化所需的癌基因的作用。然而也描述了其它无限增殖化所需的癌基因。EP-A-1229043描述了来源于LMP1、LMP2和BARFl的不同肽以及与其反应的抗体试剂。然而，未描述使用这些抗体的免疫治疗测定。此外，描述于EP-A-1229043的肽包含 34至42个氨基酸。Decaussin 等(Cancer Res. ,60 :5584-8,2000)描述了来源于 BARFl 的肽和针对这些肽产生的抗体。这些抗体用于在鼻咽癌中检测BARFl的表达。然而，在现有技术中，从未成功地以特异性结合于BARFl的抗体应用免疫疗法。本发明令人惊讶地显示BARFl的抗体结合特异性区域能够在体内中和癌基因，使得在小鼠模型中预防和抑制肿瘤成为可能。产生了结合于三个来源于BARFl的肽的多克隆抗体。在注射NPC来源的上皮肿瘤细胞之前连续注射抗BARFl抗体导致癌症出现(apparition)的预防。在肿瘤大小成为直径约0. 8cm之后，当连续注射抗BARFl抗体时，肿瘤退行并完全消失。这代表了关于用抗LMPl 抗体抑制并避免(protect from) EBV阳性肿瘤的免疫疗法第一个报道。将抗BARFl抗体添加入培养基也能够抑制EBV阳性B细胞生长，表明基于抗BARFl 的免疫疗法对于抑制和避免EBV相关的淋巴瘤的形成也是有效的。基于用抗BARFl进行的免疫疗法的治疗和预防不仅对于NPC类型的癌瘤是有效的，对于GC类型的癌瘤也是有效的。在体内和在体外观察到了抑制作用。基于抗BARFl抗体处理的免疫疗法显得更加有望，因为NPC患者的血清中几乎无法检测到抗BARFl抗体。序列表SEQ ID No. 1 对应于人疱疹病毒4类型1的BARFl蛋白的附72至D180位的来源于 BARFl 的月太(Genebank =Gene ID 3783772，mRNA 和蛋白 YP_401719. 1)SEQ ID No. 2 对应于人疱疹病毒4类型1的BARFl蛋白的G203至Ε209位的来源于 BARFl 的月太(Genebank =Gene ID 3783772，mRNA 和蛋白 YP_401719. 1)SEQ ID No. 3 对应于人疱疹病毒4类型1的BARFl蛋白的W48至Ε55位的来源于 BARFl 的月太(Genebank =Gene ID 3783772，mRNA 和蛋白 ΥΡ_401719· 1)

发明内容
本发明的第一个目的是用作药物的组合物，其包含特异性结合于选自SEQ ID NO 1-3的肽的抗体或抗体片段。在一个优选实施方案中，用作药物的组合物包含特异性结合于SEQ IDNO :1的肽的抗体或抗体片段。在另一个优选实施方案中，用作药物的组合物包含是单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体的抗体或抗体片段。
本发明的第二个目的是用作药物或用作疫苗的组合物，其包含选自SEQID NO :1_3 的肽。优选地，用作药物或用作疫苗的组合物包含SEQ ID NO=I的肽。本发明的另一个目的是用作药物或用作疫苗的组合物，其包含编码选自SEQ ID NO 1-3的肽的多核苷酸。本发明还涉及用作药物或用作疫苗的组合物，其包含表达选自SEQ IDNO :1_3的肽的转化宿主细胞。优选地，组合物是用于预防或治疗Epstein-Barr病毒阳性肿瘤。更优选地，本发明的组合物用于预防或治疗鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma)、胃癌(Gastric carcinoma)、伯基特淋巴瘤(Burkitt，s lymphoma)、何杰金淋巴瘤(Hodgkin' s lymphoma)、在 AIDS 患者中诱导的淋巴瘤(lymphoma induced in AIDS patients)、^": 禾口月干内 EB iW- (Esophage and Intrahepatic cholangiocarcinoma)、 鼻 NK/T-细胞淋巴瘤(nasal NK/T-cell lymphoma)以及口腔毛状白斑(Oral hairy leucoplasia, 0HL)。甚至更优选地，本发明的组合物用于预防或治疗鼻咽癌或胃癌。本发明涉及用作药物的组合物，其包含特异性结合于来自EBV蛋白BARFl的选定肽的抗体或抗体片段。本发明还涉及用作药物或用作疫苗的组合物，其包含来源于EBV蛋白BARFl的选定肽。本发明的另一个目的是用作药物或用作疫苗的组合物，其包含编码 BARFl的选定肽的多核苷酸。本发明的另一个目的是用作药物或用作疫苗的组合物，其包含表达来源于BARFl的选定肽的转化宿主细胞。已描述了来源于BARFl的肽和与其反应的抗体试剂，但其从未成功地用于免疫疗法。现在令人惊讶地发现特异性结合于SEQ ID NO :1-3的肽的抗体能够在体内小鼠模型中预防和减少肿瘤形成。本发明提供了药物组合物，其包含a)如本文中所述的有效量的抗体或抗体片段，如本文中所述的有效量的肽、如本文中所述的有效量的多核苷酸或如本文中所述的有效量的转化宿主细胞，和b)药学上可接受的载体，其可为惰性的或生理学活性的。本发明还提供疫苗组合物，其包含a)如本文中所述的有效量的多肽、如本文中所述的有效量的多核苷酸或如本文中所述的有效量的转化宿主细胞，和b)佐剂。如本文中使用的“药学上可接受的载体”包括任何和所有生理上相容的溶剂、分散介质、涂层(coating)、抗细菌和抗真菌剂等。合适的载体、稀释剂和/或赋形剂的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等的一种或多种以及其组合。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂如糖、多元醇或氯化钠。具体而言，合适的载体的相关实例包括(1)杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco，s phosphate buffered saline), pH 7. 4，含有或不含有约lmg/ml至25mg/ml人血清白蛋白，(2)0. 9%盐水(0. 9% w/v氯化钠 (NaCD)JP (3)5% (w/v)右旋糖；且可含有抗氧化剂如色胺和稳定剂如Tween 20。本发明涵盖的药物组合物还可含有用于治疗与EBV相关的癌症的其它治疗剂。
本发明的组合物可为多种形式。其包括例如液体、半固体和固体剂型，但优选的型式取决于意欲的施用模式和治疗应用。通常优选组合物为可注射或可输注(infusible) 溶液的形式。优选的施用模式是肠胃外(例如静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下)。在一个优选实施方案中，本发明的组合物作为快速注射(bolus)或在一段时间内连续输注来静脉内施用。在另一个优选的实施方案中，其通过肌肉内、皮下、关节内、滑膜内、瘤内、瘤周围 (peritumoral)、损伤内(interlesional)或损伤周围(perilesional)途径注射，以发挥局部以及全身的治疗效果。用于肠胃外施用的灭菌的组合物可通过将如本发明中所述的抗体、抗体片段、多肽或多核苷酸以所需量并入合适的溶剂，然后通过微滤灭菌来制备。作为溶剂或运载体，可使用水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，以及其组合。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂如糖、多元醇或氯化钠。这些组合物还可含有佐剂，特别是湿润剂、等渗剂、乳化剂、分散剂和稳定剂。用于肠胃外施用的灭菌的组合物还可以以灭菌的固体组合物的形式制备，其可在使用时溶解于灭菌水或任何其它可注射的灭菌介质。如本文中所述的抗体、抗体片段、多肽、多核苷酸或转化宿主细胞还可经口施用。 作为用于经口施用的固体组合物，可使用片剂、丸剂、粉剂(明胶胶囊、小药囊(sachet))或颗粒剂。在这些组合物中，将本发明的活性成分与一种或多种惰性稀释剂如淀粉、纤维素、 蔗糖、乳糖或二氧化硅在氩气流下混合。这些组合物还可包含除了稀释剂之外的物质，例如一种或多种润滑剂如硬脂酸镁或滑石，着色剂，包被剂(糖衣片剂)或薄膜(glaze)。作为用于经口施用的液体组合物，可使用药学上可接受的溶液、悬液、乳液、糖浆和酏剂，其含有惰性稀释剂如水、乙醇、甘油、植物油或石蜡油。这些组合物可包含除了稀释剂之外的物质，例如湿润剂、增甜剂、增稠剂、芳香基或稳定剂产物。剂量取决于所需的效果、治疗的持续时间和使用的施用途径。本发明还涉及使用如本文中所述的抗体、抗体片段、多肽、多核苷酸或转化宿主细胞以供制备用于预防或治疗EBV阳性肿瘤或EBV相关肿瘤如鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma)、胃癌(Gastric carcinoma)、伯基特淋巴瘤(Burkitt，s lymphoma)、何杰金淋巴瘤(Hodgkin' s lymphoma)、在 AIDS 患者中诱导的淋巴瘤(lymphoma induced in AIDS patients)、^" : 禾口月干内 EB iW - (Esophage and Intrahepatic cholangiocarcinoma)、 鼻 NK/T-细胞淋巴瘤(nasal NK/T-cell lymphoma)以及口腔毛状白斑(Oral hairy leucoplasia, 0HL)的药物或疫苗。在一个优选实施方案中，如本文中所述的抗体、抗体片段、多肽、多核苷酸或转化宿主细胞用于预防或治疗EBV阳性肿瘤。在一个更优选的实施方案中，使用上述公开的含有如本文中所述的抗体、抗体片段、多肽、多核苷酸或转化宿主细胞的药物组合物或疫苗组合物之一用于预防或治疗EBV阳性肿瘤。更优选地，将其用于预防或治疗鼻咽癌 (Nasopharyngeal carcinoma)、胃癌(Gastric carcinoma)、伯基特淋巴瘤(Burkitt，s lymphoma)、何杰金淋巴瘤(Hodgkin’ s lymphoma)、在AIDS患者中诱导的淋巴瘤 (lymphoma induced in AIDS patients)、食道禾口月干内胆管癌(Esophage and Intrahepatic cholangiocarcinoma)、鼻 NK/T-细胞淋巴瘤(nasal NK/T-cell lymphoma)以及口腔毛状白斑(Oral hairy leucoplasia,0HL) 0在一个优选实施方案中，将其用于预防或治疗鼻咽癌或胃癌。
本发明还提供了用于预防或治疗EBV阳性肿瘤的方法，包括将有效量的如本文中所述的抗体、抗体片段、多肽、多核苷酸或转化宿主细胞施用于有此需要的人或患者。在一个优选实施方案中，本发明涉及用于预防或治疗鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma)、胃癌(Gastric carcinoma)、伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、何杰金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、在 AIDS 患者中诱导的淋巴瘤(lymphoma induced in AIDS patients)、食道和月干内胆管癌(Esophage and Intrahepatic cholangiocarcinoma)、鼻 NK/T—细胞淋巴瘤 (nasal NK/T-cell lymphoma)以及口腔毛状白斑(Oral hairy leucoplasia，OHL)的方法。 甚至更优选地，本发明涉及预防或治疗鼻咽癌或胃癌的方法。在第一个实施方案中，本发明的组合物包含特异性结合于来自BARFl的选定肽的抗体或抗体片段。如本文中使用的术语“结合”指抗体和抗体片段是与SEQ ID NO :1_3的肽之一的表位反应的，或者是针对SEQ ID NO :1-3的肽之一产生的。优选地，所述抗体特异性结合于SEQ ID NO 1_3的肽之一的表位，且不与其它抗原交叉反应。因此，所述抗体与一个特异性抗原反应。在本发明中，特异性结合于SEQ ID NO :1_3的肽的多克隆抗体是在兔中产生的。 特异性结合于SEQ ID NO :1-3的肽的多克隆或单克隆抗体可通过标准技术产生。优选的抗体是结合于SEQ ID NO 1的肽的抗体。本文中使用的术语“抗体”为其最广泛的含意，并具体地涵盖任何同种型的单克隆抗体如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，多克隆抗体，嵌合抗体，人源化抗体和抗体片段。与特异性抗原反应的抗体可通过重组方法生成，如选择噬菌体或类似载体中重组抗体的文库，或通过用抗原或编码抗原的核酸对动物进行免疫接种。典型的IgG抗体由通过二硫键连接的两个相同的重链和两个相同的轻链组成。每个重链和轻链含有恒定区和可变区。每个可变区含有三个称为“互补决定区(CDR) ”或“高变区”的区段，其主要负责结合抗原的表位。其通常称作⑶R1、⑶R2和⑶R3，从N端顺序编号。可变区的较为高度保守的部分称为“框架区”。如本文中使用的“VH”或“VH”指抗体的免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFv、 dsFV、Fab、Fab，或F(ab，)2片段的重链。提及“VL”或“VL”是指抗体的免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab，或F(ab，)2片段的轻链。“多克隆抗体”是在一种或多种其它的非相同抗体存在下产生的抗体。一般而言， 多克隆抗体是由B淋巴细胞在几种其它产生非相同抗体的B淋巴细胞存在下产生的。通常， 多克隆抗体是直接从经免疫接种的动物获得的。如本文中使用的“单克隆抗体”为从基本上同源的抗体群获得的抗体，即形成该群的抗体除了可以以较小量存在的可能天然存在的突变之外是基本上相同的。这些抗体针对单一的表位，并因此是高度特异性的。“表位”是抗原上抗体结合的位点。如本文中使用的“嵌合抗体”指其中恒定区或其部分经改变、替代或交换从而使得可变区连接于不同物种的恒定区或属于另一种抗体类型或亚类型的可变区的抗体。“嵌合抗体”还指其中可变区或其片段经改变、替代或交换从而使得恒定区连接于不同物种的可变区或属于另一种抗体型或亚型的可变区的抗体。用于产生嵌合抗体的方法
8在本领域是已知的。如本文中使用的术语“人源化抗体”指含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。人源化的目标是减少异种抗体如鼠类抗体的免疫原性，以供将其引入人类，而保留抗体的全抗原结合亲和性和特异性。人源化抗体或经适应以不被其它哺乳动物排斥的抗体，可使用几种技术如表面重建(resurfacing)和⑶R移植来产生。人源化嵌合抗体优选具有除了下述互补决定区(CDR)之外的恒定区和可变区，所述互补决定区实质上和排他地来源于相应的人抗体区和CDR，所述人抗体区和CDR实质上和排他地来源于除了人之外的哺乳动物。本发明的抗体包含上述讨论的全长抗体以及其表位结合片段。如本文中使用的 “抗体片段”包括抗体任何保留结合于由全长抗体识别的表位的能力的部分，通常称为“表位结合片段”。抗体片段的实例包括但不仅限于Fab、Fab，和F(ab，)2、Fd、单链Fvs (scFv)、 单链抗体、二硫连接的Fvs (dsFv)和包含VL或VH区的片段。表位结合片段，包括单链抗体， 可仅包含可变区或与下述的整体或一部分组合铰链区、CHI、CH2和CH3域。在第二个实施方案中，本发明的组合物包含选自SEQ ID NO :1_3的肽的肽。在第三个实施方案中，本发明的组合物包含编码选自SEQ ID NO :1_3的肽的肽的多核苷酸。根据本发明术语“多核苷酸”指可为DNA或RNA类型的单链核苷酸链或其互补链， 或可为cDNA(互补)或基因组DNA类型的双链核苷酸链。优选地，本发明的多核苷酸是DNA 类型，即双链DNA。术语“多核苷酸”还指修饰的多核苷酸。将本发明的多核苷酸从其天然环境分离或纯化。优选地，本发明的多核苷酸可使用常规的分子生物学技术如Sambrook等所述的(Molecular Cloning =ALaboratory Manual, 1989)那些或通过化学合成来制备。所述多核苷酸可为载体，例如病毒载体。本发明的另一个目的是包含转化宿主细胞的组合物，所述转化宿主细胞表达选自 SEQ ID NO 1-3的肽的肽。本领域技术人员知悉用于将多核苷酸并入宿主细胞的标准方法，例如转染、脂转染、电穿孔、微注射、病毒感染、热休克、膜的化学渗透后的转化或细胞融合。附图简述Sl 抗BARFl抗体在EBV阳性或EBV阴性细胞系中的作用对于IO5个细胞，将5 μ g P印III抗体添加入人^ν阳性AKATA和EBV阴性 LouckesB细胞系以及人上皮C666-1细胞系的培养物中，然后在120小时期间进行培养。通过考马斯蓝染色确定存活％。Ml 抗BARFlP印III抗体对EBV-AGS细胞生长的作用将EBV阴性AGS (1)和EBV阳性AGS (2)在5 μ g P印III抗体的存在下进行培养。 对照细胞不接受抗体。细胞生存力通过考马斯蓝染色在5日期间测量。Ml 针对鼻咽癌来源肿瘤的免疫治疗测定将50 μ g抗BARFl PepIII抗体在注射c666_l细胞之前(j)、同时(k)或之后(1) 进行腹膜内注射。将IO7个细胞(C666-1)皮下注射。图中表示的值对应于以mm计的平均肿瘤直径大小。方案1 对于C666-1为(j)及S12 方案2 对于c666_l为(k)及S12。方案3 对于C666-1为(1)及S12。不用任何抗体，在注射c666_l细胞之后肿瘤形成(i)。Mi 针对胃癌来源肿瘤的免疫治疗测定将抗BARFl PepIII在注射EBV-AGS细胞之前(η)、同时(ο)或之后(ρ)注射。将 50yg抗体进行腹膜内注射。将IO7个细胞(EBV-AGS)皮下注射。图中表示的值对应于以mm 计的平均肿瘤直径大小。方案1 对于EBV-AGS为(η)及P印III 方案2 :Ρ印III对EBV-AGS 细胞生长的作用，对于EBV-AGS为(ο)及P印III。方案3 对于EBV-AGS为(ρ)及P印III。 不用任何抗体，在注射AGS-EBV细胞之后肿瘤形成(m)。M5 抗EBV DNA酶在肿瘤形成中的作用用兔多克隆抗EBV DNA酶(50 μ g)在20日期间每5日进行处理，然后注射IO6个 C666-1细胞。监视肿瘤形成。抗体对肿瘤形成无抑制作用。M6 抗兔Ig对肿瘤形成的作用用抗兔Ig或抗小鼠Ig(50yg)在20日期间每5日进行处理，然后注射IO6个 C666-1细胞。监视肿瘤形成。抗体对肿瘤形成无抑制作用。Ml 通过免疫印迹在小鼠血清和肿瘤细胞中检测BARFlA^pIII复合物分离了 BARFlA^pin复合物并在12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行分析。用增强的化学发光系统(ECL ；Amersham)检测抗原抗体复合物。在来自形成c666_l或EBV-AGS肿瘤的小鼠的血清中分析BARFl的存在(1)。对照阳性为纯化的BARFl p29。从血清分离的 BARFl/PepIII 复合物(2)S-c666_l。从肿瘤分离的8六1^1/卩印111 复合物(3) :MT-c666_l。 通过二级兔抗Ig发现P印III。商业的兔Ig用作阳性对照Ig(l，2，3)。
实施例为了阐明抗BARFl抗体可用于预防和抑制EBV相关的癌瘤(NPC和GC)，我们使用动物模型裸鼠。结合于SEQ ID NO :1_3的肽的多克隆抗体产生于兔中。结合于SEQ ID NO 1的肽的多克隆抗体(下文称为PEPIII)，如前所述产生于兔中(Decaussin 等，Cancer Res.，60 :5584-8, 2000)。对于在体外分析抗BARFl抗体的作用，在EBV阳性NPC来源的c666_l上皮细胞系和EBV阳性或EBV阴性的人B细胞系中检查多克隆抗BARFl。当将NPC来源的c666_l上皮细胞(Cheung ST, Huang DP, Hui AB, Lo Kff, Ko Cff, Tsang YS, Wong N, Whitney BM, Lee JC. 1999, Int J Cancer 83 :121-6)或 GC 来源的 EBV 阳性 AGS 上皮细胞(Kassis J, Maeda A, Teramoto N, Takada, K, Wu C, Wells A. 2002, Int. J. Cancer 99:644-51)注射入裸鼠时， 可诱导NPC来源或GC来源的肿瘤。我们在这些小鼠中分析抗BARFl的作用。体外实验抗BARFl (PEPIII抗体)对细胞培养的作用对ffiV阳性c666-l上皮细胞系、EBV阳性人AKATA和fcijiB细胞系、EBV阴性人 LouckesB细胞系、人胃AGS细胞系和EBV阳性人胃AGS细胞系在体外培养中分析抗BARFl 抗体的作用(

图1)。c666-l 细胞将 BARFl 蛋白分泌入培养基(Houali K, X. Wang, Y. Shimizu, D.Djennaoui, J. Nicholls, S.Fiorini, A.Bouguermouh 禾口 Τ·Ooka. 2007, Clin. CancerRes. 13 :4993-5000)。当在体外用抗BARFl抗体中和该分泌的癌蛋白时(对于添加于培养基的IO5个细胞为5 μ g抗体)，C666-1细胞死亡，如图1中存活曲线所示。在添加抗体之后，存活的细胞在M小时减少为75%，在48小时为40%，在96小时为20%，且几乎所有的c666_l细胞在 120分钟(5日)之后死亡(图1-3)。这表明BARFl的促有丝分裂活性直接涉及主要的细胞激活途径。相似的现象见于EBV阳性人AKATAB细胞，但作用较弱。在120分钟，约30%的细胞死亡，如图1-4表示。该现象可能涉及这些细胞中BARFl的低水平表达(Fiorini和Ooka， 2008 Virology J. 5 :70)。如预想，未观察到对EBV阴性LouckesB细胞(图1-2)和EBV阳性Raji细胞(图 1-1)的抑制作用，其中在EBV阳性Raji细胞中，Raji EBV基因组对于BARFl序列是阴性的。对于胃癌的AGS或EBV-AGS细胞检查了抗BARFl的抑制作用(图2)。在培养基中添加抗BARFl并不显示任何对AGS细胞生长的抑制(图2_1)，而抗BARFl在120小时给出EBV-AGS细胞生长的显著抑制。此时，几乎所有EBV-AGS细胞死亡(图2_2)。该抑制来自在EBV-AGS培养物中分泌的BARFl蛋白。总而言之，识别BARFl蛋白的表位172-180位氨基酸的抗BARFl抗体可抑制EBV阳性c666_l和AGS上皮细胞系以及表达BARFl蛋白的 EBV阳性B细胞系的细胞生长。体内实验我们研究了抗BARFl抗体在皮下注射IO7个培养的EBV相关的肿瘤细胞系来源于NPC的C666-1细胞或来源于GC的EBV阳性AGS(EBV-AGS)的裸鼠中的活性。本文中使用的裸鼠来自Harlan(法国)，产自意大利。株系=Hsd =Athymic Nude-Foxlnu0我们还测试 T HsdCpb =NMRI-Foxlnu0其年龄为4周。其性别为雄性。其于4周时的体重为约19_21g。对于C666-1细胞，在未经处理的小鼠中在第二或第三日可检测出肿瘤，肿瘤在第 4日达到约2mm，第8日达到8mm，而在第14日达到16mm，并在20日达到20mm的直径(图 3-i)。对于EBV阳性AGS细胞，在未经处理的小鼠中在第二或第三日可检测出肿瘤，肿瘤在第4日达到约3mm，第8日达到15mm，而在第14日达到25mm，并在20日达到30mm的直径 (图 4-m)。用C666-1细胞诱导的肿瘤比用EBV-AGS细胞诱导的肿瘤略小(以mm计的肿瘤直径大小)(图3-i和图4-m)。为了分析抗BARFl的作用，对每只小鼠以三种方案腹膜内注射25 μ g的抗BARFl 方案#1，在预防方案中，将BARFl (P印-III)作为每次25 μ g的5次腹膜内注射以 5日间隔施用，结束后三日(finishing 3days)，进行肿瘤攻击(对于c666-l为图3-j，而对于 EBV-AGS 为图 4-n)。方案#2，与肿瘤攻击同时开始连续5日每日进行注射(对于C666-1为图3-k，而对于EBV-AGS为图4-0)。方案#3，当肿瘤大小成为直径约0. 8cm时进行5次注射(每日一次注射)(对于 C6666-1 为图 3-4，而对于 EBV-AGS 为图 4-4)。
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方案#1和#2用于预防而方案#3用于肿瘤治疗。用抗BARFl进行的预防(方案#1-图3_j和图4_n)或同时(方案#2-图3_k和图4-0)处理对于两个细胞系均在所有经处理的小鼠中至少3个月内完全消除了肿瘤的出现。即使当肿瘤已经达到相当的大小时，注射抗BARFl抗体仍为高度有效的。在每日注射抗BARFl抗体5日之后，约8mm(c666-l)和约15mm(EBV-AGS)的瘤迅速稳定，然后持续退行(对于C666-1为图3-1，而对于EBV-AGS为图4_p)。肿瘤物质在治疗开始11日之后完全消失，且小鼠在至少3个月内保持无肿瘤。为了确证抗BARFl对抑制肿瘤生长的特异性，我们将EBV编码的DNA酶抗体或小鼠多克隆抗Ig抗体分别以方案#1(预防)注射。在预防方案中，将抗EBV-DNA酶或抗小鼠 Ig抗体作为5次25 μ g的腹膜内注射以5日间隔施用，结束后3日进行肿瘤攻击。当在方案#1 (预防)中未经或经抗DNA酶处理的动物用C666-1 (图5)或用抗兔 Ig (图6)替代抗BARFl用作对照实验时，显示快速的肿瘤生长(图5或图6)。这表明对肿瘤形成的特异性抑制可能是由于抗BARFl中和BARFl蛋白所致。使用的抗兔Ig购自Sigma(France)，产品号18772。本文使用的兔多克隆抗DNA酶是在我们的实验室中从通过杆状病毒系统获得的 EBV-DNA 酶产生的(Sbih-Lammali F, Berger F, Busson P 和 Ooka T, 1996, Virology, 222 64-74)(Zeng Y, Middeldorp J, Madjar JJ 禾口 Ooka T, 1997, Virology 239:285-295)。我们然后检查抗BARFl和BARFl蛋白的复合物是否存在于血清以及肿瘤细胞中。BARFl 存在于携带 c666_l (图 7-l，c666_l)和 EBV-AGS (图 7_1，EBV_AGS)的小鼠的血清中。用于该实验的阳性对照(称为P29)来自从经BARFl重组腺病毒感染的293细胞纯化的 BARFl (Sail A, Caserta S, Jolicoeur P, Franqueville L, De Turenne-Tessier M 和 Ooka Τ. (2004)Oncogene. 23 :4938-4944)。我们在形成肿瘤之后用抗体处理(方案#3)的小鼠中研究了这些血清组分。从处理第三日的血清通过刀豆球蛋白A亲和色谱回收了 BARFl (Houali K，X. Wang，Y. Shimizu, D. Djennaoui, J. Nicholls, S.Fiorini, A. Bougermouh 禾口 Τ· Ooka. Clin. Cancer Res. 13 4993-5000 ；De Turenne 和 Ooka, 2007 J. Gen. Virol. 88 :2656-2661).通过Wfestern印迹分析经c666_l处理的小鼠血清中的复合物显示与兔免疫球蛋白(图7-2 :S-c666-l-Ig)相关的BARFl的存在(图7-2 :S-c666_l)。添加商业的兔Ig作为阳性对照(图7-2:Ig)。类似的复合物也存在于与兔免疫球蛋白(图7-3 :MT-c666-l-Ig)相关的肿瘤活检中(图7-3，MT-C666-1)。添加商业的小鼠Ig作为阳性对照(图7-3 :Ig)令人惊讶地，我们在从来自经适当处理的小鼠的肿瘤活检分离的细胞之内发现了 BARF1/P印III抗体复合物。将从肿瘤提取的细胞铺于载玻片上并用丙酮固定。通过针对 PepIII的抗兔Ig发现了该复合物。发现BARFlA^pIII复合物为细胞质内和细胞核内的斑点(patch)。显然，通过与其特异性抗体结合而致使这些通常促有丝分裂的组分失去效力。之前，我们显示从NPC患者血清纯化的BARFl在EBV阴性Louckes细胞中是促有丝分裂的(Houali K, X. Wang, Y. Shimizu, D. Djennaoui, J. Nicholls, S. Fiorini, A. Bougermouh 禾口 Τ· Ooka. Clin. Cancer Res. 13 :4993-5000)。
一般而言，几乎所有raV阳性GC活检表达BARFl(zur Hausen A, Brink A A, Craanen ME. , Middeldorp JM, Meijer C J, van Den Brule AJ. 2000, Cancer Res.60 2745-2748)。对离体和培养中的c666_l和EBV-AGS细胞通过半定量和定量RT-PCR比较了其BRAFl的转录。我们发现在培养的C666-1细胞中，BARFl出于某种原因表达较弱，但其表达在肿瘤活检中变得更加重要。对于EBV-AGS，在培养的EBV-AGS细胞中，BARFl转录非常弱，但肿瘤活检表达多得多的BARF1。由于两者之间用作标准对照的肌动蛋白表达是类似的，这表明 BARFl表达在离体时被激活。在对裸鼠注射EBV-AKATA细胞之后分析肿瘤活检时，我们研究组已经观察到了 EBV基因表达的离体激活(Sheng W，Decaussin, G.，Ligout A.，Takada, K 和 Ooka, T. 2003. J. Virol. 77 :3859-3865)。我们通过定量RT-PCR确证了这些结果。与从培养细胞(EBV-AGS和c666_l)获得的值相比，在EBV-AGS肿瘤中(EBV-AGS/EBV-AGS-T)，转录水平增加为两倍，且在c666_l肿瘤(c666-l/c666-l-T)中，增加为几乎3倍。在肿瘤中BARF转录的显著激活表明其在细胞周期激活导致肿瘤形成中起重要作用。
1权利要求
1.用作药物的组合物，其包含特异性结合于选自SEQID NO :1-3的肽的抗体或抗体片段。
2.权利要求1的用作药物的组合物，其包含特异性结合于SEQID NO 1的肽的抗体或抗体片段。
3.权利要求1-2任一项所述的用作药物的组合物，其中所述抗体或抗体片段是单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
4.用作药物或用作疫苗的组合物，其包含选自SEQID NO :1-3的肽。
5.权利要求4的用作药物或用作疫苗的组合物，其包含SEQID N0:1的肽。
6.用作药物或用作疫苗的组合物，其包含编码选自SEQID NO :1-3的肽的多核苷酸。
7.用作药物或用作疫苗的组合物，其包含表达选自SEQID NO :1-3的肽的转化的宿主细胞。
8.权利要求1-7任一项所述的组合物，用于预防或治疗Epstein-Ban·病毒阳性肿瘤。
9.权利要求1-7任一项所述的组合物，用于预防或治疗鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma)、胃癌(Gastric carcinoma)、伯基特淋巴瘤(Burkitt，s lymphoma)、何杰金淋巴瘤(Hodgkin' s lymphoma)、在 AIDS 患者中诱导的淋巴瘤(lymphoma induced in AIDS patients)、^": 禾口月干内 EB iW- (Esophage and Intrahepatic cholangiocarcinoma)、 鼻 NK/T-细胞淋巴瘤(nasal NK/T-celllymphoma)以及口腔毛状白斑(Oral hairy leucoplasia, 0HL)。
10.权利要求9的组合物，用于预防或治疗鼻咽癌。
11.权利要求9的组合物，用于预防或治疗胃癌。
全文摘要
本发明涉及药物和疫苗组合物，其包含特异性结合于EBV蛋白BARF的选定肽的抗体的。
文档编号A61K39/12GK102176922SQ200980139841
公开日2011年9月7日 申请日期2009年8月7日 优先权日2008年8月8日
发明者大冈忠正 申请人:克劳德伯纳德里昂第一大学, 国家科学研究中心