异戊酰螺旋霉素i的分离制备及其应用的制作方法

专利名称：：异戊酰螺旋霉素i的分离制备及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及抗生素的分离及其在抗感染性疾病中的应用，特别涉及异戊酰螺旋霉素单组分化合物。
背景技术：
：可利霉素是利用基因工程技术研制的新型螺旋霉素衍生物，原命名为必特霉素，曾用名为生技霉素[专利号ZL97104440.6]。根据〃中国药品通用名称命名原则〃，经国家药典委员会技术审核及研究确定，必特霉素的中文通用名称更改为可利霉素，英文名称为Calimycin。可利霉素为基因工程菌发酵产物，其化学结构是以4〃-异戊酰螺旋霉素为主成分，包括4〃_异戊酰螺旋霉素1、11、111，其次还含有约6种4〃-位羟基酰基化的螺旋霉素，故其化学名统称为4〃酰化螺旋霉素。可利霉素主成分的化学结构如式(1)所示(1)其中R=H，COCH3、COCH2CH3;R'=COCH2CH(CH3)2、COCH2CH(CH3)2、COCH2CH(CH3)2可利霉素为16元环大环内酯类抗生素，其作用机制是通过与细菌核糖体结合而抑制其蛋白质合成。体外试验结果表明，可利霉素对革兰阳性菌、尤其对某些耐药菌(如耐13-内酰胺金葡菌、耐红霉素金葡菌等)有效，与同类药无明显的交叉耐药性。同时它对支原体、衣原体有很好的抗菌活性，对部分革兰阴性菌也有抗菌活性，且对弓形体、军团菌等有良好抗菌活性和组织渗透性，还有潜在的免疫调节作用。其体内抗菌活性明显优于体外[ZL200310122420.9]。临床研究表明，每日服用可利霉素片剂0.2-0.4g5-7天，可适用于治疗化脓性链球菌引起的急性细菌性咽炎、急性化脓性扁桃体炎；敏感细菌引起的细菌性鼻窦炎、急性支气管炎；肺炎链球菌、流感嗜血杆菌以及肺炎支原体所致的轻症肺炎；支原体、衣原体引起的非淋球菌性尿道炎；敏感细菌引起的皮肤软组织感染、牙周炎、中耳炎等感染性疾病。其总有效率为87.76%，可利霉素的不良反应率低。临床研究证明，可利霉素是一个口服安全有效的抗生素。然而，由于可利霉素本身是多组分药物，经过发酵得到的产品，在发酵过程产生的多种杂质，给组分定量测定带来一定困难。目前建立的高效液相色谱峰高计算法，能将可利霉素样品中几对难分离的物质如异戊酰螺旋霉素II与(异)丁酰螺旋霉素III、(异)丁酰螺旋霉素II与丙酰螺旋霉素ni、丙酰螺旋霉素in与其前面的小组分、丙酰螺旋霉素ii与乙酰螺旋霉素in的分离，度达到中国药典规定的1.5以上；而乙酰螺旋霉素III与其前面的小组分的分离度为1.2。目前建立的可利霉素片剂质控标准，系采用高效液相分析峰高计算法，测定可利霉素9个酰化螺旋霉素组分，其中异戊酰螺旋霉素(I+II+III)总含量应不低于65%;酰化螺旋霉素总含量应不低于80%。尽管按照目前的片剂生产工艺，可以得到产品组分比例可控、质量稳定的可利霉素，然而，为了改进提取纯化工艺、简化质量检测过程、提高临床治疗效果，有必要研制异戊酰螺旋霉素主要单一组分的注射制剂。尤其对于临床危重病人或不宜口服用药的病人，注射给药见效迅速，更易接受。对于发酵产生的多组分抗生素，按照化学药品质控方法很难控制其质量，而且任何细小的变化，均有可能导致物质基础的变化，增加终产品质控标准的难度，引发不可预测的用药不良反应。所以通过发酵产生的多组分抗生素注射剂迄今尚不多见。药代动力学研究结果表明，可利霉素中具活性的有效组分主要为异戊酰螺旋霉素I、II、III。可利霉素进入体内后很快代谢为螺旋霉素，以母体药物异戊酰螺旋霉素I、II、III和活性代谢物螺旋霉素I、II、III的AUC。—t总和计算，其口服绝对生物利用度平均为91.6%。文献报道，螺旋霉素人体口服绝对生物利用度为30-40%[FrydmanAMetalJAntimicrobChemother.1988，22(supplB):93-103]。说明异戊酰螺旋霉素的结构明显改善了活性成分螺旋霉素的生物利用度。单次服药可利霉素消除较慢，T力e在23-27小时之间。本发明人惊讶的发现，可利霉素的主要组分异戊酰螺旋霉素I具有更加优良的抗感染活性，为此，本发明提供异戊酰螺旋霉素I在制备抗感染药物中的应用。
发明内容本发明的目的是，提供一种异戊酰螺旋霉素I化合物及其药物组合物，以及其在抗感染治疗中的应用。本发明将异戊酰螺旋霉素I化合物制备成一种生产工艺简化、质量标准易控，药物效果优良的单组分抗生素。本发明的异戊酰螺旋霉素I化合物，具有以下结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中R=H;R'=C0CH2CH(CH3)2本发明提供了异戊酰螺旋霉素I的结构确定；本发明还提供了异戊酰螺旋霉素I的制备方法，主要包括以下步骤按照专利[ZL97104440.6]制备可利霉素，然后进行样品粗分离，高效纯化，样品后处理等步骤。本发明提还提供了异戊酰螺旋霉素I抗细菌、抗支原体及衣原体活性测定。本发明还提供以本发明的异戊酰螺旋霉素I作为药物活性物质制备的药物组合物，异戊酰螺旋霉素I在药物组合物中所占重量百分比可以是0.01-99.99%，其余为药物可接受的载体。本发明的药物组合物，以单位剂量形式存在，所述单位剂量形式是指制剂的单位，如片剂的每片，胶囊的每粒胶囊，口服液的每瓶，注射剂的每支等。本发明的药物组合物可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴齐U、贴剂。本发明的制剂，优选的是注射剂型，如水针，粉针，输液等剂型。本发明的药物组合物，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉齐U、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。本发明的药物组合物，在制备成药剂时可选择性地加入适合的药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体选自甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、e-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。本发明的药物组合物在使用时根据病人的情况确定剂型和用法用量。本发明的优点和积极效果是，为制药企业提供了生产工艺简化、质量标准易控的异戊酰螺旋霉素I单一组分制品；为临床危重人或不宜口服给药的病人提供了见效迅速，易于接受的用药剂型的可能性。图1异戊酰螺旋霉素I的HPLC图谱图2异戊酰螺旋霉素I的高分辨质谱图图3异戊酰螺旋霉素I的核磁共振氢谱图图4异戊酰螺旋霉素I的核磁共振13C谱图图5化合物及对照药对7株红霉素耐药肺炎链球菌的累积抑菌百分率其中_#_系列1可禾lj毒素系列2异戊酰螺旋霉素I"系列3红霉素>^系列4阿奇霉素_^_系歹1」5克拉毒素图6化合物及对照药对6株红霉素耐药化脓性链球菌的累积抑菌百分率其中_^_系列1可利霉素系列2异戊酰螺旋霉素I_*_系列3红霉素_^_系列4阿奇霉素_^_系列5克拉毒素实施方案以下所列实施例只是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。〈实施例1〉、异戊酰螺旋霉素I的分离制备可利霉素原料按照"一种利用基因工程技术制造生技霉素的方法"专利(专利号ZL97104440.6)制备得到。采用制备型高效液相色谱对可利霉素样品进行分离，获得异戊酰螺旋霉素I化合物纯品。具体包括样品粗分离，高效纯化，样品后处理等步骤。1)、粗分离首先从可利霉素样品中对异戊酰螺旋霉素I组分进行粗分离，采用硅胶柱层析方法，以乙酸乙酯和甲醇作为洗脱剂，分别采用三倍柱体积乙酸乙酯甲醇(3:i)和三至五倍柱体积乙酸乙酯甲醇(i:i)进行洗脱，收集乙酸乙酯甲醇(i:i)部分，将收集液浓縮至干，获得异戊酰螺旋霉素i、n、iii组分，用于进一步纯化分离。2)、高效纯化采用制备型高效液相色谱对粗分离样品进行纯化，以0DS作为色谱填料，用乙腈和醋酸氨缓冲液进行梯度洗脱，通过紫外检测，记录分离的紫外谱图，并对异戊酰螺旋霉素I目标峰进行收集。具体色谱条件如下仪器工业级制备色谱。主要部件包括二元梯度泵，紫外检测器和色谱工作站；色谱柱:0DS制备色谱柱(70i.d.X380mm，10y);流动相乙腈(A)25%，lOOmMNH4Ac水溶液75%(B)。流速:260mL/min;进样量:10mL;进样浓度0.5g/mL;检测波长231nm;收集方式紫外触发收集；按照异戊酰螺旋霉素I的保留时间(RT44.759)，收集样品。异戊酰螺旋霉素I高压液相色谱图见(图1)。3)、样品后处理收集的异戊酰螺旋霉素I样品，采用旋转蒸发除去乙腈，然后用1倍量乙酸乙酯萃取，用旋转蒸发除去萃取液中乙酸乙酯，得膏状样品。用石油醚重溶所得样品，再用旋转蒸发除去石油醚，获得异戊酰螺旋霉素I白色粉末状固体。〈实施例2>异戊酰螺旋霉素I的鉴定通过高分辨质谱(BrukerAPEXII，HR-SI-MS)确证所分离化合物的分子量为926。异戊酰螺旋霉素I高分辨质谱图见(图2)，经核磁共振^和13C谱[BrukerAM500，溶剂CDC13，内标TMS(四甲基硅烷)]等分析确证，所分离的化合物的结构为异戊酰螺旋霉素I。异戊酰螺旋霉素I核磁共振^和"C谱见(图3，4)，核磁共振^和"C谱数据见(表1，2)。表1异戊酰螺旋霉素I的核磁共振^谱数据(500MHz，CDC13)ProtonS卯m(M，JHz)力」HCOSY2ax2.67(dd，J=11.0，14.7)2eq，32eq2.25(m)2ax，333.79(brd，J=11.0)2eq，2ax，443.06(brd，J=8.8)5，354.10(brd，J=8.8)462.14(m)7eq，17b7ax1.49(m)7eq，87eq0.96(m)7ax，681.93(m)7ax，1994.04(dd，J=9.7，4.0)10105.67(dd，J=9.5，15.1)9，11116.23(dd，J=15.1，10.5)10，12126.OO(dd，J=11.0，15.0)11，137<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>〈实施例3>异戊酰螺旋霉素I的抗菌活性测定A抗细菌活性1)化合物样品化合物1可利霉素批号0812512，效价92.8%，沈阳同联集团有限公司提供；化合物2异戊酰螺旋霉素I:批号0811214，效价93.7%，沈阳同联集团有限公司提供；红霉素批号0706392，效价91.6%，中国药品生物制品检定所；阿奇霉素批号0421-9603，效价99.3%，中国药品生物制品检定所；克拉霉素批号0482-9901，效价90.4%，中国药品生物制品检定所。2)试验菌株标准菌株肺炎链球菌ATCC49619;临床分离革兰阳性菌；红霉素耐药肺炎链球菌Str印tococcuspneumoniae(7株)；红霉素耐药化脓性链球菌Str印tococcuspyogenes(6株)。每株细菌在试验前均经过平板转活分纯，以新鲜菌体用于试验。每次实验均用标准菌株作为敏感实验质控菌；用不含抗菌药物的平皿做为试验菌株生长对照。3)培养基与孵育条件M-H(Mueller-Hinton)培养基(g/L):酸水解酪素17.5、牛肉浸骨粉2、淀粉1.5、琼脂12。肺炎链球菌在血培养基(M-H培养基中加入5X脱纤维羊血制成)上，35t:5%。02环境((A培养箱)中孵育20-24h。化脓性链球菌在血培养基(M-H培养基中加入5X脱纤维羊血制成)上，35t:孵育20-24h。4)最低抑菌浓度(MIC)测定采用标准平皿二倍稀释法。被试菌悬液用多点接种仪接种，每点接种量为104CFU。测定各抗菌药物对各种致病菌的最低抑菌浓度。结果在所测定的红霉素耐药链球菌中，本发明的单组分异戊酰螺旋霉素I对链球菌的抗菌作用比可利霉素更加优越，MIC5。和MIC9。分别为0.5和2mg/L，同时，明显强于对照药红霉素、阿奇霉素、克拉霉素(表3)。对于7株红霉素高耐药肺炎链球菌(红霉素MIC64->256mg/L)，阿奇霉素与克拉霉素也同样表现为高度耐药，而本发明化合物异戊酰螺旋霉素I的MIC值在0.25-32mg/L，低于可利霉素2-4倍，低于对照药8-1024倍(表4，图5)。对于6株红霉素低耐药化脓性链球菌(红霉素MIC=l-8mg/L)，本发明化合物的MIC5。值在0.5mg/L，低于可利霉素，优于对照药红霉素、阿奇霉素、克拉霉素2-32倍。(表3，5，图6)。表3.化合物及对照药MIC结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表4.化合物及对照药对7株红霉素耐药肺炎链球菌MIC(mg/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表5.化合物及对照药对6株红霉素耐药化脓性链球菌MIC(mg/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>B抗肺炎支原体和肺炎衣原体活性1.化合物化合物1可利霉素批号0812512，效价92.8%，沈阳同联集团有限公司提供化合物2异戊酰螺旋霉素I:批号0811214，效价93.7%，沈阳同联集团有限公司提供红霉素批号0706392，效价91.6%，中国药品生物制品检定所阿奇霉素批号0421-9603，效价99.3%，中国药品生物制品检定所2.肺炎支原体菌种肺炎支原体菌种(ATCC-FH)。3.肺炎支原体培养基1.支原体琼脂培养基支原体琼脂基础培养基(0xoid公司，CM0401)2.84g，加入超纯水80ml，12rC高压15min灭菌，放置在50°C的水浴中，加入肺炎支原体添加剂(Oxoid，SR0059C)1瓶(20ml)，制备琼脂培养皿。2.支原体PPLO肉汤培养基支原体PPLO肉汤基础培养基(BD公司)2.lg，去离子纯净水70ml，12rC、15min高压灭菌。冷却至室温后加入冻干肺炎支原体培养添加物(Oxoid添加物)1瓶(20ml无菌去离子水溶解)、无菌50%葡萄糖溶液2.Oml和0.4%的酚红0.5ml。4.肺炎支原体培养肺炎支原体FH株接种于含20mlPPLO肉汤培养基，72h收获用玻璃珠刮下，12000rpm，10min离心沉淀，弃上清液，沉淀用8ml新鲜PPLO肉汤培养基再悬，分装8管冻存-8(TC冰箱。肺炎支原体FH接种物滴定上述制备肺炎支原体FH接种物培养使用PPLO肉汤培养基进行1:10、1:100和1:1000稀释后涂布于肺炎支原体琼脂平皿，37t:5%C02培养7天，在X40倍显微镜下计数。计算肺炎支原体滴度。5.肺炎支原体MIC的测定化合物以16mg/ml溶解于无水乙醇，用支原体PPL0肉汤培养基以IO倍比稀释。肺炎支原体接种物加入上述系列稀释的药物管内，肺炎支原体FH最终接种浓度为8.25X105CFU/ml，接种后的培养管(包括对照管)于37。C培养并每天观察颜色的变化。试验设立(1)阳性对照稀释后的肺炎支原体FH接种物(1.65X106CFU/ml)0.5ml+PPL0肉汤培养基0.5ml;(2)阴性对照PPLO肉汤培养基1ml;(3)无水乙醇杀灭干扰对照稀释后的肺炎支原体FH接种物(1.65X106CFU/ml)O.5ml，PPLO肉汤培养基O.5ml，最终浓度0.05%无水乙醇。当阳性对照管发生明显的颜色改变(由红色变黄色)时，而此时没有发生颜色改变管的抗生素浓度为最低抑菌浓即MIC浓度。7.肺炎衣原体菌种肺炎衣原体菌种CWL-029(ATCCVR1310)。8.肺炎衣原体培养(1)细胞培养液10%胎牛血清(HyClone公司)Dulbecco'sMEM(Sigma公司)培养液。(2)肺炎衣原体培养液10X胎牛血清Dulbecco'sMEM培养液，含2yg/ml的放线菌酮(Sigma公司)。(3)BGMK(绿猴肾细胞，DiagnosticHYBRIDS公司)种植在96孔细胞培养板内，37°C，5%C02培养48小时成为单层细胞。9.肺炎衣原体MIC的测定化合物以16mg/ml溶解于无水乙醇，首先用衣原体培养液以IO倍比稀释，将浓度为3.3Xl(fcfu(包涵体形成单位)/lml肺炎衣原体接种物1:200稀释，最终浓度为1.65X105cfu/lml，吸去96孔培养板内的细胞培养液，然后按0.lml/孔进行接种。菌种接种完毕离心96孔细胞培养板，使用Beckman-Coulter公司的J-6MC离心机，离心力X1500g，离心温度35°C，离心时间60min。[cms]设立对照(1)阳性对照BGMK细胞，稀释的肺炎衣原体CWL-029菌种。(2)阴性对照BGMK细胞，肺炎衣原体培养液。(3)药物对照BGMK细胞，最高稀释浓度(8yg/ml)的化合物，最终浓度0.05%无水乙醇。离心完毕后，吸去肺炎衣原体接种物，分别加入系列稀释的化合物0.lml/孑L。37°C，5%C02培养72min。培养完毕，吸取抗生素药物溶液，PBS(0.OIM，pH7.4)洗涤2次，100%无水乙醇固定15min。间接免疫荧光染色鉴定肺炎衣原体单克隆抗体，50iil/孔，37t:湿盒内温育30min，然后洗板机洗板4次，再加入兔抗鼠荧光抗体(Sigma公司)，50y1/孔，同样方法及条件温育及洗板。加入封片甘油，100ii1/孔，在01ympusX71倒置荧光显微镜下观察MIC的定义96孔试验板中肺炎衣原体包涵体生长完全被抑制孔(全孔未发现荧光染色的包涵体)的最小抗生素稀释浓度。10.结果在所测定的抗肺炎支原体活性中的异戊酰螺旋霉素I活性明显强于可利霉素，并明显优于对照药。对肺炎衣原体的活性，异戊酰螺旋霉素I与可利霉素相当，优于红霉素。表6化合物对肺炎支原体/衣原体活性Pg/ml)菌号化合物l化合物2红霉素阿奇霉素肺炎支原体0.1250.032>50.25肺炎衣原体0.0640.0640.50.064〈实施例四>异戊酰螺旋霉素I药物制剂的制备本发明可以将异戊酰螺旋霉素I单组分作为活性成分，与药学上可接收的载体制备成临床可用的各种剂型。如注射剂分别将异戊酰螺旋霉素I(简称原料)100-500mg与溶剂己二酸18-90mg或枸橼酸26-130mg或马来酸14_70mg等摩尔混合均匀后溶解于l_5ml水中，可得到淡黄色澄明溶液，pH在4.6-5.6之间。再加入甘露醇30-150mg作为冻干支撑剂，低温快速冷冻9h后，冷冻干燥，获得淡黄色疏松块状物，使用前用2-10ml无菌水溶解。权利要求含有异戊酰螺旋霉素I化合物的药物组合物，所述异戊酰螺旋霉素I化合物具有以下结构其中R＝H，R′＝COCH2CH(CH3)2。FSA00000027650000011.tif2.权利要求1所述药物组合物的制备方法，包括将异戊酰螺旋霉素I化合物和药学上可接受的载体混合的步骤。3.权利要求2所述的制备方法，其中异戊酰螺旋霉素I化合物的分离包括样品粗分离，高效纯化，样品后处理等步骤。4.权利要求2所述的制备方法，其中分离采用高效液相色谱对可利霉素样品进行分离，获得异戊酰螺旋霉素I化合物纯品的步骤。5.权利要求1所述药物组合物及其药物活性物质异戊酰螺旋霉素I化合物在制备抗感染药物中的应用。全文摘要本发明涉及抗生素的分离及其在抗感染性疾病中的应用，特别涉及异戊酰螺旋霉素I单组分化合物；经样品粗分离、高效纯化、样品后处理等，采用高效液相色谱对可利霉素样品进行分离，获得异戊酰螺旋霉素I化合物纯品；生物学试验结果表明，所说组分I化合物的抗菌活性优于可利霉素，明显优于对照组，其为研制临床有效的异戊酰螺旋霉素I单组分抗生素奠定了基础。文档编号A61P31/04GK101785778SQ20101011974公开日2010年7月28日申请日期2010年3月9日优先权日2010年3月9日发明者姜洋,张海平,徐霈名,梁鑫淼,郝玉有,金郁申请人:沈阳同联集团有限公司