存活蛋白衍生肽及其用途的制作方法

专利名称：存活蛋白衍生肽及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的存活蛋白衍生肽及它们对于诊断和治疗目的的用途，特别是诊断 和治疗癌症的用途。特别地，这些新的肽是MHC I类限制性T细胞表位，其能够引发癌症患 者中包括原位和先体外后体内反应的细胞毒性T细胞反应。特别地，这些新肽衍生自程序 性细胞死亡抑制蛋白质存活蛋白(survivin)，其是公认的肿瘤相关抗原(TAA)。技术背景及现有技术哺乳动物的免疫系统对外来或相异物质的识别和反应的过程是复杂的。该系统重 要的方面是T细胞反应。此反应需要T细胞识别并与被称为人白细胞抗原(HLA)的细胞表 面分子与肽的复合体相作用，该白细胞抗原构成了人主要组织相容性复合体(MHC)。这些肽 衍生自较大的分子，其经细胞加工，该细胞也提呈HLA/MHC分子。T细胞和HLA/肽复合体的 相互作用是受限制的，需要对于HLA分子和肽的特定组合特异的T细胞。如果不存在特异 的T细胞，即使其配偶体复合体存在也不会有T细胞反应。类似地，如果特异复合体缺失但 T细胞存在也没有反应。癌症中T细胞识别细胞异常的机制也已有涉及。例如，在W092/20356中，公开了 加工成肽的基因家族，上述肽而后表达于细胞表面上并能够通过特异的CTLs导致肿瘤细 胞的裂解。将这些基因称之为MAGE家族，且据说编码“肿瘤排斥抗原前体”或“TRAP”分子， 并且从所述分子衍生的肽被称为“肿瘤排斥抗原”或“TRAs”。在W094/05304中，公开了结合到HLA-Al分子的九肽。所述参考文献公开，假如已 知特定肽对于特定HLA分子的特异性，人们应当预期特定肽结合到一种HLA分子，而不是其 它分子。这是重要的，因为不同的个体具有不同的HLA表型。结果，尽管作为特定HLA分子 配偶体的特定肽的鉴定具有诊断和治疗结果(ramification)，这些结果仅仅与具有那种特 定HLA表型的个体有关。几种由MHC分子提呈的肽已表征，并且发现这些肽中的一些可携带可能对HLA-肽 复合体功能性有影响的翻译后修饰。因此，许多研究已将磷酸化模式的改变与恶性转化相 关联。而且，已有表明，磷酸化对于肽与I类MHC的结合可能具有中性、负效应或甚至正效 应，并且可能产生区别肽的磷酸化和非磷酸化形式的磷酸肽特异的CTL，表明此CTL很可能 是I类MHC-限制性CTL所有组成成分的部分。最近，已有表明，在体内磷酸化肽实际上经 天然加工并由MHC I类分子提呈。另外，在从几种不同的EBV转化的B细胞分离的I类分 子提取物中磷酸化肽的存在已得以证实。因此，在MHC分子存在下衍生自肿瘤相关抗原(TAAs)的肽表位能够由细胞毒性T 淋巴细胞(CTLs)识别为抗原已非常确定(1)。然而，尽管通常公认大多数(如果不是全部) 肿瘤是抗原性的，但是在肿瘤发展容易由免疫系统控制的意义上，仅仅少数肿瘤确实是免 疫原性的。
为克服此局限，已开始了几种免疫疗法试验，例如用TAA-衍生肽接种。对于黑素 瘤，已经为此肿瘤表征了最多的CTL-限制的TAAs，通过接种已经诱导了强烈的针对抗原的 CTL反应，并且一些患者经历了其疾病的完全缓解(2，3)。然而，用于这些接种试验的大多 数肽表位是黑色素细胞特异的，且这些肽不能应用于非黑色素细胞来源的肿瘤。此外，这些 TAAs的表达在来自于不同患者的肿瘤间是异质的，甚至在来自于同一名患者的转移瘤之间 也不同。然而，在过去几年中，在许多不同癌症中表达的许多肿瘤特异性肽抗原已得以鉴 定，即，HER-2(4)、Muc-l (5)和端粒酶(6)。也已有显示，通过适当的处理肿瘤中存在的肿瘤抗原能够暴露于免疫系统。研究 表明，免疫反应的CD8+CTL臂单独或与CD4+Th细胞相结合构成了适应性免疫反应的原初抗 肿瘤效应臂(primary anti-tumor effectorarm)。到目前为止焦点主要集中在免疫反应的 CTL臂上。然而，CD4T细胞反应在肿瘤排斥中起根本的作用，尤其是在诱导期或在体内CTL 反应的扩大中，这一点正变得越来越清楚。因此，有效的肿瘤接种方案中II类限制性肿瘤 抗原的并入也许会增加疫苗的有效性。程序性细胞死亡是细胞自杀的遗传程序，已提出程序性细胞死亡的抑制为参与癌 症形成的重要机制，程序性细胞死亡抑制通过延长有利于转化突变积累的细胞的寿命导致 癌形成(7)。存活蛋白是新近鉴定的程序性细胞死亡蛋白抑制因子(IAPs)家族成员。在大 约4百万转录物的全球基因表达分析中，将存活蛋白鉴定为在多种癌症中总是上调而在正 常组织中不上调的首要基因之一(8)。过表达存活蛋白的实体恶性肿瘤包括肺癌、结肠癌、 乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌以及造血恶性肿瘤(9)。另外，已报导黑素瘤和非黑素瘤皮肤癌 系列总是存活蛋白阳性(10，11)。多数人类癌症中存活蛋白的过表达暗示了程序性细胞死 亡抑制在肿瘤发展中的普遍作用，通过对结肠和膀胱癌以及成神经细胞瘤病例中存活蛋白 的表达与不利的预后相关联这一观察，所述概念得以证实。相反，存活蛋白在正常的成人组 织中检测不到。这些特征使存活蛋白成为用于诊断和治疗目的的合适的TAA。因此，在过去的十年中，许多由CTLs识别的主要组织相容性复合体(MHC)限制性 形式的TAAs得到鉴定。由于存活蛋白在大多数人类癌症中过表达且其功能的抑制导致增 强的程序性细胞死亡，因此此蛋白可作为治疗性CTL反应的靶标。存活蛋白蛋白质及其潜 在的诊断和治疗用途公开于此处引用作为参考的(8)和US6. 245. 523中。存活蛋白是包含 单个BIR和高电荷羧基末端卷曲区域而不是环指(RING finger)结构的16. 5kDa胞浆蛋白 质，当该蛋白转入B细胞前体时可抑制由生长因子(IL-3)撤消诱导的程序性细胞死亡。编 码存活蛋白的基因几乎与效应细胞蛋白酶受体-I(EPR-I)的序列相同，但是定向于相反的 方向，从而暗示存在以头对头构型复制的两种独立基因。因此，可将存活蛋白描述为反义 EPR-I产物。功能上，通过上调其天然的反义EPR-I产物而引起的对存活蛋白表达的抑制导 致了大量程序性细胞死亡和降低的细胞生长。US6. 245. 523公开了纯化的存活蛋白的分离并提供编码存活蛋白蛋白质的核酸分 子，及结合存活蛋白的抗体和其它分子。US6. 245. 523还公开了存活蛋白蛋白质和其变体的 抗程序性细胞死亡的活性片段，所述变体中一个氨基酸残基插入到所公开的存活蛋白序列 的N-或C-末端或中间。特别公开，此类肽应当包含程序性细胞死亡所需的关键功能残基， 例如，67位的Trp、73位的Pro和84位的Cys。本发明基于发现了 MHC I类限制性肽可衍生自存活蛋白蛋白质，所述肽能够结合
6到MHC I类HLA分子上，从而在患有多种癌症疾病的患者中引起先体外后体内或原位的CTL 免疫反应。这些发现强烈暗示存活蛋白作为TRAP分子，所述存活蛋白经细胞加工成具有 TRP功能性的肽。显然，这些发现开辟了新的治疗和诊断方法的途径，由于肿瘤细胞广泛表 达存活蛋白的事实，所述新方法通常可应用于癌症疾病的控制中。发明概述因此，本发明第一方面涉及衍生自存活蛋白的MHC I类限制性表位，所述表位具有 至少一种下列特征(i)能够以一定亲和力结合限制该表位的I类HLA分子，其中所述亲和力使用如文 中描述的装配结合测定法测定以能够半数最大回收I类HLA分子的肽量(C5tl值)表示最多 为 50μΜ，(ii)能够以每IO4个PBLs至少1个的频率在癌症患者的PBL群体中引发产生 INF- γ的细胞，所述频率可以通过ELISP0T试验确定，和/或(iii)能够原位检测肿瘤组织中与所述表位肽起反应的CTLs。优选地，本发明的肽具有这三个特征中的至少两种，最优选地具有所有这三种特 征。在更进一步的方面，本发明提供了药物组合物和用于癌症患者的PBLs或肿瘤组 织中存活蛋白反应性T细胞的存在的先体外后体内或原位诊断的组合物，该组合物包含如 上定义的肽。在更进一步的方面本发明涉及用于癌症患者的PBLs或肿瘤组织中存活蛋白反应 性T细胞存在的先体外后体内或原位诊断的诊断试剂盒，该试剂盒包含根据本发明的肽， 和此肽与I类HLA分子或此分子片段的复合体。在另一方面还提供了检测癌症患者中存活蛋白反应性T细胞存在的方法，该方法 包括将肿瘤组织或血液样品与如上所定义的复合体相接触，并检测该复合体与组织或血细 胞的结合。在更进一步的方面本发明涉及能够特异地结合本发明的肽的分子例如抗体或其 片段，并涉及能够阻断此类分子结合的分子。本发明重要的方面涉及本发明的肽用于癌症治疗的药物制备方面的用途。更进一 步的方面涉及如上所述的组合物或分子用于癌症治疗的药物制备方面的用途。更进一步的方面独立地涉及治疗哺乳动物例如人类中癌症的方法，其包括以有效 量的本发明的肽、组合物或分子施用于患该病的患者。发明详述本发明新的MHC I类限制性肽的特征在于具有几个特征中的至少一个，所述特征 之一是能够结合限制所述肽的I类HLA分子，当所述结合的亲和力以如此处所述的装配试 验中I类HLA分子的半数最大回收的肽量(C5tl值)测量时，最多为50 μ M。该装配试验如 前所述来完成(12，13)，且该试验以将肽加入到肽转运蛋白缺陷的细胞系Τ2后HLA分子的 稳定化为基础。随后，利用构象依赖性抗体将正确折叠的稳定HLA重链进行免疫沉淀并定 量肽结合。此试验提供了根据它们以上述亲和力结合到给定HLA等位基因分子的能力筛选 候选肽的简单方法。在优选的实施方案中，本发明的肽在一个实施方案中具有最多为30 μ M的C5tl值，例如最多为20 μ M的C50值，包括最多为10 μ Μ、最多为5 μ M和最多为2 μ M的C5tl 值。如上所述，HLA系统代表人类主要组织相容性(MHC)系统。通常，MHC系统控制着 一系列特征移植抗原、胸腺依赖性免疫反应、某些补体因子和某些疾病的诱因。更特别地， MHC编码三种不同类型的分子，S卩，I类、II类和III类分子，它们决定了 MHC的更加一般的 特征。在这些分子中，I类分子是提呈于大多数有核细胞和血小板表面的所称作的HLA-A、 HLA-B 禾口 HLA-C 分子。本发明肽的特征在于它们结合到(受限于)特定MHC I类HLA分子的能力。因 此，在一个实施方案中，所述肽是受限于MHC I类HLA-A分子的一种肽，所述MHC I类HLA-A 分子包括 HLA-Al、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A9、HLA-AlO, HLA-AlU HLA_Awl9、HLA-A23 (9)、 HLA-A24 (9)、HLA-A25 (10)、HLA-A26 (10)、HLA-A28、HLA-A29 (wl9)、HLA-A30 (wl9)、 HLA-A31 (wl9)、HLA-A32 (wl9)、HLA_Aw33 (wl9)、HLA_Aw34 (10)、HLA_Aw36、HLA_Aw43、 HLA-Aw66(10)、HLA_Aw68 (28)、HLA_A69(28)。更多简单名称也贯穿应用于本文中，其中只用 了主要的数字名称，例如HLA-A19或HLA-A24分别代替了 HLA-Aw 19和HLA-A24 (9)。在特 定的实施方案中，本发明的肽受限于选自HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-All和HLA-A24的 MHC I类HLA种类。本发明的肽衍生自存活蛋白的已知序列，例如，公开于US6. 245. 523的 序列。潜在具有结合特定HLA分子能力的肽的选择可通过结合到给定的具体HLA分子的已 知序列的比对来完成，从而揭示肽的特定位置上少数相关氨基酸的超优势度。此类优势氨 基酸残基此处也称为“锚定残基”或“锚定残基基序”。通过依照此种基于已知序列数据的 相对简单的方法，肽可衍生自可能结合到特定HLA分子的存活蛋白蛋白质分子，所述已知 序列数据可在可进入的数据库中找到。此类对于一系列HLA分子分析的有代表性的实例在 下表中给出 因此，作为例子，潜在具有结合到HLA-Al能力的九肽将具有下述序 ^lJ 之 一 :Xaa~T-D-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa~Y> Xaa-T-E-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y ； Xaa-S-D-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y 或 Xaa-S-E-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y (Xaa 指任意氨基酸残 基)。以类似的方式，可设计潜在具有结合到任何其它HLA分子的能力的序列。将理解本领域中普通技术人员将能够鉴定给定HLA分子的其它的“锚定残基基 序”。因此，在有用的实施方案中，本发明的肽包括这样的肽，对于表中所列的每个特定 HLA等位基因，所述肽的序列包含任何一个如表中所指出的氨基酸残基。
因此，鉴定本发明肽的简单方法包括下列步骤选择特定的HLA分子，例如在给 定的群体中以高比率出现的HLA分子，如上所述实施比对分析来鉴定存活蛋白蛋白质中的 “锚定残基基序”，分离或构建包含一个或更多已鉴定的锚定残基的合适大小的肽，并测试 所得肽(i)利用如此处所述的装配试验测定的结合到特定HLA分子的能力，(ii)在如此处 所述的ELISP0T试验所确定的肽以每IO4个PBLs至少1个的频率引发癌症患者的PBL群 体中产生INF-Y的细胞的能力，和/或(iii)肽原位检测肿瘤组织中与所测表位肽反应的 CTLs的能力。在特定的实施方案中，本发明的肽是具有选自下列序列的hla-a2限制性的存 活蛋白衍生肽=Flkldrera (存活蛋白 101_109) (seq id no ι)、tlppawqpfl (存活蛋白 5_14) (seq id no 2)、eltlgeflkl(存活蛋白 95_104) (seq id no 3)、lllgeflkl(seq id no 4)和 lmlgeflkl(seqid no 5)。(括号中的名称指如us6. 245. 523所公开的存活蛋白蛋白中的 残基位置)。lllgeflkl(seq id no 4)是通过用“l”替代肽2位上“t”的衍生自存活蛋白 96-104的序列，且lmlgeflkl(seq id no 5)是通过用“m”替代2位上“t”而衍生自存活蛋白 96-104的序列。在更有用的实施方案中，本发明的肽是受MHC I类HLA-B分子限制的肽，所述 mhc i 类 hla-b 分子包括下列任何一个hla_b5、hla-b7、hla-b8、hla-b12、hla-b13、 HLA-B14, HLA-B15, HLA-B16, HLA-B17、HLA-B18, HLA-B21、HLA_Bw22、HLA-B27、HLA-B35、 HLA-B37、HLA-B38、HLA-B39、HLA-B40、HLA-Bw41、HLA_Bw42、HLA-B44、HLA-B45、HLA_Bw46 和 HLA-Bw470在特定的实施方案中，本发明的肽能够结合的MHC I类HLA-B种类选自HLA-B7、 HLA-B35、HLA-B44、HLA-B8、HLA-B15、HLA-B27 和 HLA-B51。在特定的实施方案中，本发明的肽是具有选自下列序列的HLA-B35限制性的存活 蛋白衍生肽CPTENEPDL (存活蛋白 46_54) (SEQ ID NO 6)、EPDLAQCFF (存活蛋白 51_59) (SEQ ID NO 7), CPTENEPDY (SEQ ID NO :8)和 EPDLAQCFY (SEQ ID NO :9)。(括号中的名称指如 US6. 245. 523所公开的存活蛋白蛋白质中的残基位置)。CPTENEPDY (SEQ ID NO 8)是通过 用“Y”替代肽C-末端“L”的衍生自存活蛋白46_54的序列，EPDLAQCFY(SEQID NO 9)是通过 用“Y”替代C-末端2位上的“F”残基而衍生自存活蛋白51_59。在更特定的实施方案中，本发明的肽是具有选自下列序列的HLA-Al限制 性肽存活蛋白 38-46 (Sur38Y9)(在 P9 处 C 变为 Y，MAEAGFIHY(SEQID NO 38)、存活 蛋白 47_56(Sur47Y10)(在 PlO 处 Q 变为 Y，PTENEPDLAY(SEQ ID NO :39))、存活蛋白 92_101(Sur92-101) (QFEELTLGEF) (SEQ ID NO :27)、和存活蛋白 93_1(11 (Sur93T2 (在 P2 处 E 变 为t，fteltlgef(seq id n0:36))。本发明的肽也可为hla-a3限制性肽，例如存活蛋白 18_24(Surl8K10)(在 PlO 处 F 变为 K, RISTFKNWPK) (SEQ ID NO 57)禾口 / 或 HLA-All 限制性 肽，例如存活蛋白 53_62 (Sur53-62) (DLAQCFFCFK) (SEQ ID NO 45)和 / 或 HLA-A2 限制性肽， 例如存活蛋白 18_28 (Sur 18-28) (RISTFKNWPFL) (SEQ IDNO 66)。在更加有用的实施方案中，本发明的肽是受MHC I类HLA-C分子限制的肽，所述 MHC I 类 HLA-C 分子包括下列任何一种HLA-Cwl、HLA_Cw2、HLA_Cw3、HLA_Cw4、HLA_Cw5、 HLA-Cw6、HLA-Cw7 禾口 HLA_Cwl60优选地，本发明的肽包含少于50个氨基酸残基，并且更优选地它包含最多20个氨 基酸残基，例如最多10个氨基酸残基。在特定实施方案中，该肽为七肽、八肽、九肽、十肽或
11十一肽。如上所述，本发明的肽衍生自存活蛋白蛋白质或其片段。能够从中衍生肽的存活 蛋白蛋白质来自于任何表达该蛋白质的动物种类。在优选的实施方案中，存活蛋白起始蛋 白质来自于哺乳动物类包括啮齿类、兔和灵长类例如人。基于所选择的存活蛋白蛋白质的 序列，本发明的肽衍生自对存活蛋白起始材料的任何适宜的化学或酶的处理，所述处理导 致如上所述获得的合适大小的肽，或者本发明的肽可通过本领域普通技术人员所熟悉的任 何常规肽合成方法来合成。本发明的肽可具有衍生自存活蛋白蛋白质的天然序列的序列。然而，对任何给定 的HLA分子具有更高亲和力的肽可通过替换、缺失或添加至少一个氨基酸残基来修饰该天 然序列从而衍生自此天然序列，例如，所述修饰以上述方法为基础由此鉴定关于给定HLA 分子的锚定残基基序。因此，为增加存活蛋白衍生肽的免疫原性，可在锚定位置但不是TCR接触残基处 引入氨基酸替换，以增加肽与HLA I类分子的结合。这样已获得更具免疫原性的表位，例如 这已提高了诱导癌症反应性CTL的能力并已证明其更适于诱导临床上有意义的CTL反应。 然而，重要地，目标癌细胞只表达和提呈天然存活蛋白衍生肽于细胞表面上。在这方面，对 修饰的存活蛋白衍生肽特异的治疗诱导的CTL与天然类似物交叉反应，这一点尤其重要。本发明也包括如此处所公开的存活蛋白衍生肽的变体和功能等同物。本上下文所 用的“功能等同物”通过参考所讨论序列的预定片段的相应功能性来确定。功能等同物可 通过例如由ELISP0T试验所阐明的对HLA I类分子相似的结合亲和力或相似潜能来确定。将理解由于插入、缺失和替换包括保守替换的数目和范围增加，如此处所述的存 活蛋白衍生肽的功能等同物或变体显示出逐渐区别于优选的预定序列的氨基酸序列。此区 别被测量为优选的预定序列与衍生自存活蛋白的变体或衍生自存活蛋白的功能等同物之 间同源性的降低。氨基酸序列间的同源性可利用本领域公知的算法来计算。当与包含或由连续的存 活蛋白衍生氨基酸残基组成的片段具有同源性的片段优选地与预定的存活蛋白衍生肽至 少具有约90%同源性，例如至少94%同源性，包括95%、96%、97%、98%或99%同源性时， 认为所述片段在本发明的范围内。而且，实施本发明肽的翻译后修饰是有利的。已有显示，将乳腺癌MCF-7细胞或宫 颈癌HeLa细胞暴露于抗癌试剂(包括阿霉素、紫杉酚或UVB)导致了存活蛋白蛋白质表达 增加4-5倍。抗癌治疗后存活蛋白水平的变化不包括存活蛋白mRNA表达的调整并且独立 于从头基因转录。相反地，通过细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂flavopiridol抑制存活蛋 白Thr34上磷酸化导致了存活蛋白表达的丧失，并且不可磷酸化的存活蛋白Thr34 — Ala与 野生型存活蛋白相比显示出加速的清除。在存活蛋白Thr34处磷酸化的顺序消除增加了乳 腺癌体内异种移植模型中不依赖P53的由抗癌试剂诱导的肿瘤程序性细胞死亡并无毒性 地抑制了肿瘤生长。这些数据表明Thr34磷酸化关键性地调节肿瘤细胞中的存活蛋白水平， 并且P34-2激酶活性的随后除去可除去肿瘤细胞中存活蛋白生存力(viability)限制点及 增强肿瘤细胞中程序性细胞死亡。因此，预期本发明存活蛋白衍生肽包括磷酸化的肽。天然存活蛋白磷酸肽抗原可 通过扫描磷酸化位点Thr34周围MHC肽结合基序的存在来鉴定。因此，可能的衍生自存活蛋白的磷酸肽序列包括TPERMAEAGF 假定的HLA-B35-和/或HLA-B7-和/或HLA-B51-限制性 肽抗原。此处所包括的另外的天然磷酸肽包括HLA-A2 :CACTPERMA和CTPERMAEA ；HLA-A3 FLEGCACTP ；HLA-B7/HLA-B35/HLA-B51 :WPFLEGCACT (磷酸化 Thr 残基用斜体标记)。本发明肽的重要特征是识别或引发产生INF-Y-的效应T细胞的能力，所述细 胞即特异识别癌症患者的PBL群体或肿瘤细胞(靶细胞)中的特定肽的细胞毒性T细胞 (CTLs)。此活性可通过将来自患者的PBLs或肿瘤细胞进行如参考文献(16)和下文实施例 中所述的ELISP0T试验而容易地确定。测定前，刺激要测定的PBL群体或肿瘤细胞是有利 的，可通过使细胞与待测肽相接触实现刺激。优选地，在如此处所用的ELISP0T试验所确定 的，所述肽能够以每IO4个PBLs至少1个的频率引发或识别产生INF-Y的T细胞。更优选 地此频率为每IO4个PBLs至少5个，最优选地每IO4个PBLs至少10个，例如每IO4个PBLs 至少50或100个。ELISP0T试验代表监测存活蛋白肽特异的T细胞反应的强大工具。然而，尽管已有 显示ELISP0T反应性在大多数情况下与CLLs裂解靶细胞的能力相关，对此观念的决定性证 据只能直接给出。此处提供了这种直接证据，因为已证实(见实施例2)通过HLA/肽复合 体分离的存活蛋白反应细胞具备裂解靶细胞的功能。另外，已证实特异识别本发明肽的分 离的CTLs能够裂解不同来源，例如黑素瘤和乳腺癌来源的HLA匹配的肿瘤细胞。此发现有 力地证明了癌症细胞通常加工和提呈相同的内源性存活蛋白肽。因此，此处该发现的主要 含义是本发明的肽经表达并与多种不同组织学来源的肿瘤细胞上HLA分子形成复合体。这 使得这些癌细胞对CTLs的破坏敏感并强调了存活蛋白免疫对控制不同肿瘤生长的潜在有 用性。PBLs和肿瘤细胞中存在针对几种HLA限制性存活蛋白衍生肽表位的自发性CTL-反 应，进一步证实了此肿瘤抗原普遍的免疫治疗潜力，所述肽表位来自患有三种不相关的癌 症类型，即乳腺癌、黑素瘤和CLL的患者。因此，在另一个优选的实施方案中，本发明的肽能够引发患有其中表达存活蛋白 的癌症疾病的患者PBL群体中产生INF-γ的细胞，所述癌症疾病包括包括慢性淋巴细胞性 白血病和慢性髓细胞白血病的造血恶性肿瘤、黑素瘤、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肺癌、结肠 癌、胰腺癌和前列腺癌。特别地，本发明的肽能够以具有针对癌细胞系的存活蛋白表达细胞 的细胞毒性效应的T细胞形式引起免疫反应，所述癌细胞系包括选自乳腺癌细胞系MCF-7 和黑素瘤细胞系FM3的细胞系。除它们引发PBL群体和癌细胞系中免疫反应的能力之外，已证实本发明的肽还能 够在原位，即在实体瘤组织中引发细胞溶解性免疫反应。这已通过提供HLA-肽复合体(例 如进行多聚化和提供可检测的标记)及利用这类复合体进行免疫组织化学染色来检测肿 瘤组织中与本发明的表位肽反应的CTLs得以证实。因此，本发明的肽更重要的特征是它能 够原位检测肿瘤组织中与表位肽反应的CTLs。预期本发明的肽除了它们结合HLA分子导致HLA和肽的复合体提呈于细胞表面之 外，该复合体进而作为细胞溶解性T细胞的表位或靶标，还可引起其它类型的免疫反应，例 如导致产生针对该复合体的抗体的B-细胞反应和/或迟发型超敏(DTH)反应。后一类型 的免疫反应被定义为在本发明肽的注射部位充血并且可触知的硬结。众所周知，不同的HLA分子在主要人类群体中具有不同的优势。因此，需要鉴定受 限于几种HLA I类分子的肽表位来扩大根据本发明的方法可获得治疗的患者群体。用不同的HLA限制元件对多个存活蛋白表位的表征以两种重要方式拓宽了此靶抗原的临床潜力 (i)其增加了适合基于存活蛋白衍生肽的免疫疗法的患者数目。大约有50%的白种人和亚 洲群体体表达HLA-A2抗原，大约有25%的白种人和5%的亚洲人表达HLA-Al和HLA-A3抗 原，而大约有15%的白种人和30%的亚洲人表达HLA-All抗原。尽管这些数字由于共表达 而无法相加，受这些多样性限制的肽的组合肯定能包含大多数癌症患者，(ii)每名患者中 几种限制性元件的集体靶定可能降低由HLA-等位基因缺失而引起的免疫逃逸的危险。单 个HLA等位基因的缺失是关于癌细胞描述的MHC改变的重要部分，而I类表达的完全缺失 是相当罕见的事件。因此，随着受限于不同HLA等位基因的存活蛋白表位的鉴定，目前利用 等位重叠在患者中同时靶定一种以上的HLA分子是可能的。因此，基于本发明的公开，本领域技术人员能够开发高免疫原性的多表位疫苗。优 选地，应当设计此类疫苗，以促进最适存活蛋白衍生肽与如下文所述的其它合适肽和/或 佐剂任选组合的同时递送。而且，如前所述，对引发肿瘤特异性T辅助细胞免疫已有更高的关注，所述免疫即 用II类MHC限制表位接种，尽管事实上肿瘤一般不表达II类MHC。这是基于最近的发现 许多病例中疫苗诱导的抗肿瘤反应的诱导和功效需要肿瘤特异的CD4阳性Th细胞的共同 作用。因此，推动具有更多复杂成分的疫苗开发的重要因素是对靶向多种肿瘤抗原的期望， 例如通过设计包含或编码一组仔细挑选的CTL和Th细胞表位的疫苗实现所述靶向。显然，无需引入(基因编码)有潜在危险的蛋白质例如癌蛋白质，多表位疫苗组成 了产生针对衍生自几种不同抗原的表位的免疫性的有效途径。这类疫苗也允许针对亚优势 和隐蔽T细胞表位的免疫力的选择性诱导，这在肿瘤相关自身抗原情况下可能尤其重要， 因为针对正常组织中显著提呈的表位可能存在耐受性。而且，由于抗原提呈细胞的免疫蛋 白酶体(immunoDroteasome)与大多数肿瘤细胞中的‘组成性’蛋白酶体间的功能差别，抗 原提呈细胞可能无法提呈某些表达于肿瘤细胞上的表位。在以肽为基础的疫苗的情况下， 这类表位能够以“MHC-现成”的形式施用，这使得能够通过独立于抗原摄入的外源装载来提 呈和由宿主抗原提呈细胞加工。显然本发明的发现为存活蛋白衍生肽的治疗及诊断应用提供了基础。因此，在更进一步的方面本发明提供了药物组合物，其单独包含一种或多种本发 明的肽或与其它蛋白质或肽片段的合适的组合。在特定的实施方案中，这类其它蛋白质 或肽片段包括但不限于参与程序性细胞死亡调节的蛋白质或其肽片段。这类蛋白质的合 适的实例可选自Bcl-2蛋白质家族，例如，Bcl-2蛋白质、Bcl-w蛋白质、Mcl-I蛋白质、 8(1-\蛋白质和衍生自任何这些蛋白质的肽片段。其它已知的程序性细胞死亡抑制因子 包括程序性细胞死亡蛋白质抑制因子(IAP)家族的成员例如X-IAP、C-IAPl和C-IAP2，这 些蛋白质都相对普遍地表达而程序性细胞死亡多肽ML-IAP的抑制因子则具有相当选择 性表达，且主要在黑素瘤中检测到。因此，能够引发特异性T细胞反应，即细胞毒性T细 胞反应或辅助性T细胞反应的ML-IAP片段可任选地包括于本发明的组合物中。ML-IAP 的有用的肽片段包括 ML-IAP245 (RLQEERTCKV) (SEQ ID NO 75)、ML-IAP280 (QLCPICRAPV) (SEQ ID NO 76)、ML-IAP90 (RLASFYDWPL) (SEQ ID NO 77)、ML-IAP154 (LLRSKGRDFV) (SEQ ID NO 78)、ML-IAP230 (VLEPPGARDV) (SEQ ID NO 79)、ML-IAP98 (PLTAEVPPEL) (SEQ IDNO 80)、ML-IAP34 (SLGSPVLGL) (SEQ ID NO 81)、ML-IAP54 (QILGQLRPL) (SEQ ID NO 82)、ML-IAP99 (LTAEVPPEL) (SEQ ID NO 83)、ML-IAP83 (GMGSEELRL) (SEQ IDNO 84)禾口 ML-IAP200 (ELPTPRREV) (SEQ ID NO 85)。另外，根据本发明的组合物可用作包含如上文定义的I类限制性表位和/或II类 限制性表位的多表位疫苗。目前优选的多表位疫苗的实例包括“定制的”依赖于特定患者组织类型的存活 蛋白衍生肽表位的组合，例如，具有HLA-A2、HLA-A3和HLA-B35表型的受试者可用包含 surlM2、sur9、surl8K10、sur46Y9、sur51Y9的疫苗接种。另外，本发明的药物组合物可有利 地包含至少一种另外的免疫原性蛋白质或其肽片段，该蛋白质或肽片段选自不属于或衍生 自存活蛋白蛋白质的蛋白质或肽片段。在特定的实施方案中，所述免疫原性蛋白质或其片 段衍生自如上文所述的Bcl-2蛋白质家族。另外的免疫原性的衍生自Bcl-2的肽是HLA-A2 限制性肽，其具有选自下列的序列=Bcl172, Bcl180, Bcl208和Bcl214。由于本发明的肽是相对小的分子，需要在这类组合物中组合所述肽与多种物 质，例如佐剂，以产生疫苗、免疫原性组合物等等。广义定义的佐剂是促进免疫反应的物 质。通常，佐剂的选择是弗氏完全或不完全佐剂、或灭活的百日咳杆菌(B. pertussis)生 物，用于例如与明矾沉淀的抗原组合。Goding, Monoclonal Antibodies principles & Practice (第二版，1986)的61-63页提供了有关佐剂的全面讨论。然而，Goding指出，当 目标抗原为小分子量或是弱免疫原性抗原时，建议连接免疫原性载体。这类载体分子的 实例包括匙孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白和家禽免疫球蛋白。已认为多种皂苷提 取物可用作免疫原性组合物中的佐剂。近来，已有建议用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)( 一种熟知的细胞因子)作为佐剂(W097/28816)。因此，本发明包括进一步包含任何佐剂物质的治疗组合物，所述佐剂包括任何上 述佐剂或其组合。也可预期，抗原，即本发明的肽与佐剂可以以任何适当的序列分别施用。本发明的药物组合物中抗原的选择依赖于本领域技术人员可以确定的参数。如已 提到的，本发明的每种不同肽由特定的HLA分子提呈到细胞表面上。同样，如果将接受治疗 的患者关于HLA表型进行分类，则选择已知结合到该特定HLA分子的一种或多种肽。备选地，目标抗原基于多种HLA表型在给定群体中的优势来选择。例如，HLA-A2 是白种群体体中最优势的表型，因此包含结合到HLA-A2的存活蛋白衍生肽的组合物将在 大部分该群体中有活性。然而，本发明的组合物也可包含两种或更多存活蛋白衍生肽的组 合，每种肽特异地与不同的HLA分子相互作用以便覆盖目标群体的更大比例。因此，作为实 例，药物组合物可包含受限于HLA-A分子的肽与受限于HLA-B分子的肽的组合，例如，包括 那些对应于目标群体中HLA表型优势的HLA-A和HLA-B分子，例如HLA-A2和HLA-B35。另 外，组合物可包含受限于HLA-C分子的肽。可以预期，本发明有用的免疫原性组合物除此处所定义的存活蛋白衍生肽之外， 还可包含免疫学上有效量的如此处所定义的存活蛋白蛋白质或其免疫原性片段。药物组合物中本发明的免疫原性肽的量可依赖于特定应用而不同。然而，免疫原 的单次剂量优选为大约IOyg至大约5000 μ g，更优选地大约50 μ g至大约2500 μ g例如约 IOOy g至约1000μ g。施用的方式包括皮内、皮下和静脉内施用，延时释放制剂形式的植入 物，等等。此处包含本领域公知的任何和所有施用形式。而且包含本领域公知的适于配制 可注射的免疫原性肽组合物的任何和所有常规剂型，例如冻干形式和溶液剂、悬浮剂或乳剂形式，如需要的话，上述形式中包含常规药学上可接受的载体、稀释剂、防腐剂、佐剂、缓 冲剂组分，等等。本发明组合物的免疫保护效果可利用几种方法测定。在下文的实施例中提供了其 实例。W097/28816(如前)中有关于如何测定由免疫原性组合物引起的CTL反应的进一步 的实例。成功的免疫反应也可通过免疫后DTH反应的出现和/或特异识别疫苗组合物的肽 的抗体的检测来测定。在优选的实施方案中，本发明的药物组合物是能够引发针对癌症疾病的免疫反应 的免疫原性组合物或疫苗。如此处所用，表达“免疫原性组合物或疫苗”指引发针对癌细胞 的至少一种类型免疫反应的组合物。因此，这种免疫反应可为上述提及类型的任何一种 CTL反应，该反应中产生能够识别提呈于细胞表面的HLA/肽复合体的CTLs，导致细胞裂解， 即疫苗引发经接种受试者产生对癌细胞具有细胞毒性效应的效应T细胞；产生抗癌抗体的 B细胞反应；和/或DTH类型的免疫反应。在有用的实施方案中，针对癌症疾病的免疫原性反应通过施用本发明的肽引发， 上述施用既可通过将MHC I类分子装载到来自患者的抗原提呈细胞(APCs)上；通过从患者 中分离PBLs并用肽孵育细胞后将细胞注射回患者；或通过从患者中分离前体APCs并利用 细胞因子和抗原使细胞分化成专职APCs后将细胞注射回患者来实现。因此，在本发明的一 个实施方案中，治疗癌症患者的方法是这样的一种方法，此方法通过先体外后体内地将肽 呈递给患者的抗原提呈细胞(APCs)，然后将经过处理的APCs注射回患者中进行肽的施用。 实施此方案至少有两种备选的方法。一种备选方法是从癌症患者中分离APCs并将MHC I类 分子与肽一起孵育(装载)。装载MHC I类分子意味着孵育APCs和肽以便带有对所述肽特 异的MHC I类分子的APCs将结合肽并因此能将该肽提呈给T细胞。然后，将APCs重新注 射进患者体内。另一备选方法依赖于最近在树突细胞生物学领域做出的发现。在这种情况 下，将单核细胞(是树突细胞的前体)从患者中分离出来并在体外利用细胞因子和抗原使 单核细胞分化为专职APC (或树突细胞)。这在实施例3和5中描述，其中贴壁的PBLs (主 要是单核细胞)在体外与61^3 、11^-4和1顺-(1 一起培养。随后，将体外产生的DCs与肽 一起脉冲并注射进患者体内。由于存活蛋白似乎在大多数癌症形式中表达的事实，本发明的疫苗能够用来控制 其中表达存活蛋白的任何癌症疾病类型是非常可能的。因此，作为实例，本发明的疫苗组合 物针对包括慢性淋巴细胞性白血病和慢性髓性白血病的造血恶性肿瘤、黑素瘤、乳腺癌、宫 颈癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌和前列腺癌是免疫活性的。根据上述描述，技术人员将容易理解本发明的肽可以作为癌症诊断工具，当肽是 衍生自在所有癌症类型中均表达的存活蛋白时尤其如此。因此，本发明的肽为开发有关癌 症疾病诊断和预后的通用方法提供了基础。因此，在其它有用的实施方案中本发明的组合 物是用于先体外后体内或原位诊断癌症患者中存在的组合物，例如基于PBLs或肿瘤组织 中存活蛋白反应性T细胞的检测进行诊断。因此，在更进一步的方面，提供了用于先体外后体内或原位诊断PBLs或肿瘤组织 中存活蛋白反应性T细胞的存在的诊断试剂盒，该试剂盒包含一种或多种本发明的肽，和 检测癌症患者中存活蛋白反应性T细胞存在的方法，所述方法包含将肿瘤组织或血液样品 与本发明肽和I类HLA分子或此分子片段的复合体接触，并检测复合体与组织或血细胞的
16结合。另一有用的诊断或预后方法是以在异源动物种类中产生抗体为基础，所述抗体为 例如针对本发明的人存活蛋白衍生肽的鼠抗体，然后所述抗体可用于，例如诊断提呈该肽 的癌细胞的存在。对于这类免疫目的，肽的量可低于体内治疗过程所用量，例如上面提到的 量。通常，优选的剂量可为大约Iyg至大约750yg肽。基于利用本发明的肽的免疫也可 以产生单克隆抗体。因此，本发明还涉及分子，尤其是单克隆或多克隆抗体，包括其片段，该 分子能够特异地结合本发明的肽，还涉及能够阻断此类结合的分子，例如针对针对本发明 肽的单克隆或多克隆抗体而产生的抗体。在一方面，本发明提供了本发明的肽与I类HLA分子或此分子片段的复合体，其可 作为诊断试剂，例如如上所述。此复合体可通过任何常规方法包括下文实施例所述的方法 来制备。这种复合体可为单体的或多体的。本发明提供了减轻或治愈癌症疾病的方法。因此，将如上文所定义的肽用于癌症 治疗药物的制备是本发明更进一步的方面。本发明更进一步的方面涉及如上文所定义的分 子或组合物用于制备癌症治疗药物的用途。优选地，癌症疾病与存活蛋白的表达有关，癌症 疾病包括例如，包括慢性淋巴细胞性白血病和慢性髓性白血病的造血恶性肿瘤、黑素瘤、乳 腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌和前列腺癌。此用途包括对患所述疾病的患者 施用有效量的根据本发明的药物组合物、能够特异结合本发明肽的分子和/或能够阻断此 种分子结合的分子。在一些情况下，联合使用本发明与常规癌症治疗例如放射疗法或化学疗法将是适 当的。现在将以下面的非限制性实施例和附图对本发明进行更详细描述，其中

图1说明了 ELISP0T中所测的患者CLLl对于无肽、Surl肽(LTLGEFLKL，SEQ ID NO 10)和Sur9肽(ELTLGEFLKL，SEQ ID NO 3)的T细胞反应。将PBLs用肽刺激一次后， 以每孔6X IO5个细胞一式两份接种平板。利用CCD扫描装置和计算机系统计算出每种肽 的斑点的平均数，图2说明了 ELISP0T中所测的患者CLLl对于无肽、肽类似物Sur 1L2 (LLLGEFLKL， SEQ ID NO 4)和肽类似物 SurlM2(LMLGEFLKL，SEQ ID NO 5)的 T 细胞反应。将 PBLs 用肽 刺激一次后，以每孔IO4个细胞一式两份接种平板。利用CCD扫描装置和计算机系统计算 出每种肽的斑点的平均数，图3显示了 ELISP0T中所测的患者CLL2和CLL3对于无肽(黑条形)、Surl肽 (LTLGEFLKL, SEQ ID NO 10)(灰条形)、Sur9 肽(ELTLGEFLKL, SEQ ID NO 3)(白条形)、 肽类似物 SurlL2 (LLLGEFLKL，SEQ ID NO :4)(浅灰条形)和肽类似物 SurlM2 (LMLGEFLKL， SEQ ID N0:5)(深灰条形)的反应。每个实验用每孔IO5个细胞一式两份进行，并计算出斑 点的平均数，图4代表用ELISP0T试验所分析的T细胞对于无肽(黑条形)、Surl肽 (LTLGEFLKL, SEQ ID NO 10)(灰条形)、Sur9 肽(ELTLGEFLKL，SEQID NO 3)(白条形)的反 应，其中上述T细胞分离自患者Mell、Mel2和Mel3的肿瘤浸润淋巴结并在体外刺激一次。 每个实验以每孔IO5个细胞一式两份进行。每个实验中还包括两个未加肽的孔。对每名患 者计算出每种肽的斑点的平均数，
图5显示了存活蛋白特异的CTLs的功能活性。CTLs是利用包被存活蛋白的磁珠 分离自黑素瘤浸润的淋巴结。(A)黑素瘤细胞系HLA-A2阳性FM3 (三角形)和HLA-A2阴 性FM45 (正方形)的特异裂解。(B)乳腺癌细胞系HLA-A2阳性MCF-7 (三角形)和HLA-A2 阴性BT-20 (正方形)的特异裂解，图6显示了乳腺癌患者的PBL中存活蛋白反应性CTLs的频率。通过ELISP0T检 测三名乳腺癌患者(分别上、中和下)中的反应性。对于每名患者，在不存在肽、存在surl 肽、存在sur9和存在修饰的SurlM2肽时进行测定。每孔使用1 X IO4个效应细胞。该图描 述了反应性细胞的定量；灰色柱形代表产生IFN-Y的细胞的平均数，图7说明了 HLA-35对存活蛋白衍生肽的结合，以及通过存活蛋白衍生肽对 HLA-B35分子的肽介导的回收的分析。在50、5、0. 5,0. 05和0. 005mM肽存在下，将代谢标 记的T2-B35细胞的裂解物在4°C下孵育。在装配试验中分析HLA-B35的回收并在IEF-凝 胶电泳后利用ImageGaug印hosphorimager软件(FUJI photo film有限公司，日本)定量。 C50值是与HLA-B35的半最大结合所需肽的浓度，图8显示了癌症患者的PBLs中所观察到的自发性T细胞反应。A) ELISPOT试验所 测定的无肽(白条形)、有sur51-59(黑条形)或sur46_54(灰条形)时体外刺激的PBLs 中的IFN γ斑点形成细胞的数目，所述PBLs来自患者CLL5 (IO5个细胞/孔),HEMl2 (IO5个 细胞/孔)和HEM8(5X104个细胞/孔)，B)与肽脉冲的成熟自体树突细胞培养10天的来 自HEM12的1. 7 X IO5个PBL中斑点形成细胞数。柱形代表两次测量的平均值。图9表明了针对黑素瘤患者中的天然和修饰的存活蛋白肽的自发T细胞反应。A) 用ELISP0T试验所测得的来自患者FM25的PBLs (4X IO3个细胞/孔)禾口 TILs (7 X IO4个细 胞/孔)以及来自患者FM45的TILs (IO4个细胞/孔)中针对sur51_59和sur51Y9的斑点 形成细胞的数目。B)在ELISP0T试验中测量的来自FM74的TILs (5 XlO3个细胞/孔)中 针对sur46-54和surf46Y9的斑点形成细胞数。柱形代表了利用扣除非特异IFN γ释放 的两次测定的平均值。图10说明了存活蛋白衍生肽对于HLA-Al的结合亲和力。用Phosphorimager将I 类MHC重链的条带定量。稳定化的HLA-Al重链的量与所加肽的结合亲和力直接相关。由 40,4,0. 4,0. 04 μ M Sur93_101 (线形)、Sur93T2 (正方形)、Sur49_58 (圆形)或流感 Α,ΡΒΙ 591-599 (三角形)诱导HLA-Al的肽介导的回收(任意单位)，图11显示了针对HLA-Al限制性肽的自发性反应。针对存活蛋白衍生肽的自发性 T细胞反应由ELISP0T试验来测定。在来自黑素瘤患者的5 X IO4体外刺激的PBL或TIL中， 对Sur92-101、Sur38Y9、Sur47Y10和Sur93T2反应形成肽特异IFN γ斑点的平均数目。在 对来自黑素瘤(Mel)患者的6个PBL样品和3个TIL样品的分析中观察到了所显示的肽特 异反应。非特异的IFNy斑点已扣除。横条形多次测量的范围，图12显示了针对HLA-All限制性肽的自发性反应。针对存活蛋白衍生肽的自 发性τ细胞反应由ELISP0T试验来测定。在来自癌症患者的5X IO4个体外刺激的PBL或 TIL中，对Sur53-62反应形成肽特异IFNy斑点的平均数目。在对5名黑素瘤(Mel)患者 (5PBL, 1TIL)和2名CLL(CLL)患者(PBL)的分析中观察到了所显示的肽特异反应。非特异 的IFNy斑点已扣除。横条形多次测量的范围，图13说明了针对HLA-A3限制性肽的自发性反应。针对存活蛋白衍生肽的自发性T细胞反应由ELISP0T试验来测定。在来自黑素瘤患者的5X IO4个体外刺激的PBL或TIL 中，对SurlSKlO反应形成肽特异IFNy斑点的平均数目。在对来自黑素瘤(Mel)患者的23 个PBL样品和4个TIL样品的分析中观察到了所显示的肽特异反应。非特异的IFNy斑点 已扣除。横条形多次测量的范围，图14说明了针对HLA-A2限制性肽的自发性反应。针对存活蛋白衍生肽的自发 性τ细胞反应由ELISP0T试验来测定。在来自癌症患者的5X IO4个体外刺激的PBL中，对 11聚体肽Sur 18-28反应形成肽特异IFNy斑点的平均数目。在对2名黑素瘤(Mel)、6名 CLL(CLL)和2名乳腺癌(MC)患者的分析中观察到了所显示的肽特异反应。非特异的IFN γ 斑点已扣除。横条形多次测量的范围，图15说明了通过ELISP0T试验所测定的针对存活蛋白衍生肽的自发性T细 胞反应。在来自5名黑素瘤患者(mel25、mel26、mel3、mel6、mel39)、两名CLL患者 (CLL1、CLL54)和2名乳腺癌患者(breastll、breastl5)的IO5个体外刺激的PBL中，对 sur6-14 (LPPAffQPFL)反应形成肽特异IFN γ斑点的平均数目。非特异的IFNy斑点已扣 除，图16说明了 4名患者(▲ RW、· KN,-WffE, ■ GB)的免疫疗法后对LDH、胆碱酯酶、
肌酸酐、血红蛋白、白细胞和血小板稳定检测的实验值，和图17表明了通过IFNy ELISP0T来评定的存活蛋白肽免疫性的动力学分析。 PBMCs在首次DC接种之前和接种后3个月获得。描述了高于背景的IFNY斑点形成细胞的 数目。在下表中，列出了此处所用的肽的氨基酸序列和它们各自的SEQ IDNOs
实施例1癌症患者中针对程序性细胞死亡抑制因子蛋白质存活蛋白的细胞毒性T淋巴细 胞反应的鉴定MM利用衍生自存活蛋白的CTL表位，通过ELISP0T分析研究了针对来自慢性淋巴细 胞性白血病(CLL)患者外周血中和黑素瘤患者肿瘤浸润淋巴结中此类抗原的特异性T细胞 反应。在6名黑素瘤患者的3名和4名CLL患者的3名中检测到了针对存活蛋白衍生肽表 位的CTL反应。在来自6名健康对照的PBL中未检测到T细胞反应。因此，存活蛋白衍生 肽可作为抗癌免疫疗法策略的重要和可广泛应用的靶标。筛选存在HLA-A女0201 (HLA-A2)结合肽基序的存活蛋白蛋白质并在成功鉴定后， 通过ELISP0T试验将此肽用于白血病和黑素瘤患者中特异性T细胞反应的测试。在两种患 者群体中均检测到了针对两种存活蛋白衍生肽表位的CTL反应，而健康对照中未能检测到 T细胞反应。这些数据表明存活蛋白代表被自体T细胞识别的广泛表达的肿瘤抗原。材料与方法患者和正常对照将来自4名诊断为CLL(命名为CLL1-4)的患者的外周静脉血样品和来自6名正 常个体的血样品收集到肝素化管中。利用Lymphopr印分离来分离PBLs并在含10%二甲 亚砜的胎牛血清(FCS)中冷冻。另外，来自肿瘤浸润淋巴结的T淋巴细胞从6名黑素瘤患 者(命名为mell-6)获得。将刚切除的淋巴结切成小碎片，压碎使细胞释放进培养液并冷 藏。从4名黑素瘤患者得到PBLs。如利用HLA-A2特异抗体BB7. 2通过FACS分析所测定 的，所包括的所有个体都是HLA-A2阳性。此抗体纯化自杂交瘤上清液。患者样品得自丹麦 的State University Hospital, Herlev0在做任何这些测量之前均从患者处获得知情同
辰、ο存活蛋白衍生肽所有肽均来自Research Genetics (Huntsville, AL，美国)且以如 HPLC 和 MS 分 析所核实的大于90%的纯度提供。所用的肽在表1中列出表1.此研究中所撒__t及它们对HLA-A2的结合亲和力 3下标所列的数值范围指肽在如US6. 245. 523所公开的存活蛋白序列中肽的位置。bC50值是如下所述测定的对HLA-A2的半最大结合所需肽的浓度。用于肽与I类MHC分子结合的装配试验用于合成肽与I类MHC分子结合的装配试验如所述(12，13)的来完成，其中所述I 类MHC分子经[35S]-甲硫氨酸代谢标记。装配试验以将肽加入到肽转运蛋白缺陷的T2细 胞系后I类分子的稳定化为基础。随后，利用构象依赖性抗体免疫沉淀正确折叠的稳定MHC 重链。IEF电泳后将凝胶置于phosphorlmager屏曝光，并利用Imagequant PhosphorImager 程序(Molecular Dynamics, Sunnyvale,力口拿大)定量月太结合。PBLs的抗原刺激为增加ELISP0T试验的灵敏度，分析之前将PBLs在体外刺激一次(14，15)。新鲜 的和从前冷冻的PBLs在ELISP0T试验中得出了相似结果。第O天，将PBLs或压碎的淋巴 结解冻，置于AIM V培养基(LifeTechnologies，Roskilde，丹麦)、5%热灭活的人血清和 2mM L-谷氨酰胺中以2X IO6个细胞的浓度2mi每孔接种24孔板(Nunc，丹麦)，上述孔中 存在IOyiUt每个实验中均包括一个不含肽的孔。两天后，向培养物中加入300IU/ml重 组白介素-2(IL-2) (Chiron，Ratingen，德国)。第12天用ELISP0T试验测定培养细胞的反 应性。ELISP0T 试验用于定量肽表位特异的释放干扰素-Y的效应细胞的ELISP0T试验如(16)中完 成。简言之，用抗-IFN-Y-抗体(1-D1K，Mabtech, Nacka，瑞典)包被硝酸纤维素底的96 孔板(Multiscreen MAIP N45, Millipore, Hedehusene，丹麦)。孔经洗涤，用 AIM V 培养 基封闭后，将不同细胞浓度的细胞一式两份加入。然后将肽加入每孔并将板孵育过夜。第 二天，在加入生物素化的二级抗体(7-B6-1-生物素，Mabtech)之前，弃去培养基并洗孔。 将板孵育2小时，洗涤并将抗生物素蛋白-酶缀合物(AP-抗生物素蛋白，Calbiochem， Life Technologies)加入每孔。将板在室温下孵育1小时并向每孔中加入酶底物NBT/ BCIP(Gibco, Life Technologies)，室温下孵育5_10分钟。出现暗紫色斑点时即通过自来 水洗涤终止反应。利用AlphaImager系统(Alpha Innotech，San Leandro，CA，美国)计数 斑点并可从斑点形成细胞的数目计算出肽特异的CTL频率。对每一种肽抗原的测试均一式两份地进行。MM存活蛋白衍生肽对HLA-A2的结合利用主要的HLA-A2特异性锚定残基(17)，筛选存活蛋白蛋白质的氨基酸序列以 寻找最可能的HLA-A2九肽和十肽表位。合成了十种存活蛋白衍生肽并检测了对HLA-A2 的结合。来自HIV-lpol476-484(ILKEPVHGV，SEQ ID NO :11)(表1)的表位用作阳性对 照。对于阳性对照，I类MHC的半最外回收所需的肽浓度(C5tl值)为0.7μΜ。比较起 来，命名为Sur9(ELTLGEFLKL，SEQ ID NO :3)的肽以C5tl = 10 μ M的亲和力结合。命名为 Sur6 (FLKLDRERA, SEQ ID NO 1)和 Sur8 (TLPPAWQPFL, SEQ ID NO 2)的肽分别以 C5tl = 30 μ M 结合 HLA-A2，而 Surl(LTLGEFLKL，SEQ ID NO: 10)禾口 Sur3 (KVRRAIEQL，SEQ ID NO 13)结 合较弱(C5Q > 100 μ Μ)。所检测肽中的5种(Sur2、Sur4、Sur5、Sur7、和SurlO)不结合到 HLA-A2。由于Surl是弱HLA-A2结合剂，所以合成了两种分别命名为SurlL2和SurlM2的 类似肽，在上述类似肽中分别用更好的锚定残基(亮氨酸或甲硫氨酸)代替了 2位上天然 的苏氨酸。所述两种都以与阳性对照几乎一样高的亲和力(C5tl= ΙμΜ)结合到HLA-A2上。CLL患者中对存活蛋白的CTL反应在ELISP0T试验中检测之前，将来自4名HLA-A2阳性CLL患者的PBLs在体外刺 激一次。选择此方法以增加ELISP0T的灵敏度。所有上面10种存活蛋白衍生肽都包括在 实验的第一线(first line)中。检测了针对Surl和Sur9的反应并且只有这些肽的数据 在图中给出。图1显示了如患者CLLl中所测定的针对Surl和Sur9的CTL反应性。每个 斑点代表一个肽反应性产生INF-γ的细胞。利用CCD扫描装置和计算机系统计算出了每 种肽的斑点平均数目。在CLLl患者中每6X IO5个细胞中检测出52个Sur9肽特异性斑点 (在扣除不加入肽的斑点后)(图1)。未检测到针对弱HLA-A2结合肽Surl的反应，然而患 者对强HLA-A2结合肽类似物Sur 1M2反应强烈(每IO4个细胞35个肽特异性斑点)(图2)。 在此患者中未检测到针对另一种强HLA-A2结合肽类似物SurlL2的反应(图2)。患者CLL2 对于Sur9反应强烈(每IO5个细胞128个肽特异性斑点)却对Surl反应微弱(每IO5个 细胞22个肽特异性斑点)(图3)。针对SurlL2类似物的反应相对于天然表位只是稍微增 强，而患者对于Sur 1M2肽的反应与针对十聚体肽Sur9相似地强烈。患者CLL3中观察到针 对Sur9的微弱反应(图3)。该患者中未观察到针对Surl和修饰的Surl肽的反应。在最 后一名患者CLL4中未检测到存活蛋白反应(数据未显示)。为研究是否能在健康个体中检 测出针对存活蛋白的反应，分析了来自6名健康HLA-A2阳性对照的PBLs。在任何对照中均 未检测到针对任何存活蛋白衍生肽的反应。黑素瘤患者中针对存活蛋白的CTL反应对分离自HLA-A2阳性黑素瘤患者的肿瘤浸润淋巴结的T淋巴细胞进行了检测。 将刚切除的淋巴结切成小碎片并压碎从而将细胞释放进培养液。在ELISP0T试验中检测之 前在体外用肽将细胞刺激一次。在6名所分析的患者中的3名中检测到存活蛋白特异性T 细胞反应。在患者Mel2和Mel3中检测到强烈的Sur9反应。在这些患者中也检测到较弱 的针对Surl肽的反应(图4)。在Mell中针对微弱结合肽Surl的反应比针对较强HLA-A2 结合剂Sur9的反应要强(图4)。在来自最后三名黑素瘤患者(Mel4-6)的肿瘤浸润淋巴结 中未检测到反应。检测了来自两名存活蛋白反应患者Me 11和Me 12和来自两名非反应患者
25Mel4和Mel5的PBLs。在来自任何这些患者的PBLs中均未检测到针对Sur9或Surl的反 应(数据未显示)。实施例2癌症患者中原位或先体外后体内的针对衍生自存活蛋白的MHC I类限制性T细胞 表位的自发细胞毒性T细胞反应鍵乳腺癌、白血病和黑素瘤患者中的原位及先体外后体内的针对衍生自存活蛋白的 MHC I类限制性T细胞表位的自发细胞毒性T细胞反应已得到阐明。而且，通过包被MHC/ 肽复合体的磁珠分离的存活蛋白反应性T细胞对于不同组织类型的HLA匹配的肿瘤是细胞 毒性的。作为普遍的肿瘤抗原，存活蛋白可作为抗癌免疫疗法的可广泛应用的靶标。材料与方法用于T细胞染色和T细胞分选的HLA-肽复合体的构建利用生物素蛋白质连接酶(BirA)将酶促生物素化的识别位点与HLAA女0201 胞外结构域(残基1-275)的5’ -末端融合并且融合体在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3) 中表达。该重组蛋白质通过大小排阻层析(S印hadeXG25，Pharmacia)和离子交换 (mono-Q, Pharmacia)层析从溶于8M尿素的包函体中得到纯化。在修饰的存活蛋白肽 Sur 1M2 (LMLGEFLKL, SEQ IDNO 5)或MAA 肽 gpl00154_163 的存在下，在体外通过稀释使 HLA A * 0201折叠，并随后如前所述将其生物素化(35，36)。在用Pharmacia S印hadexG25柱 凝胶过滤除去未结合的生物素后，用链霉亲和素-FITC连接的葡聚糖分子(由丹麦DAKO 的L. Winther友情提供)将所述蛋白质多聚化以产生用于免疫组织化学的多价HLA-葡 聚糖化合物。HLA A * 0201 构建体是 Mark Μ. Davis 博士(D印t. of Microbiology and Immunology, StanfordUniversity, Palo Alto, CA)的友好赠品。细胞分离如前所述(37) 来完成。简言之，将5X IO6个链霉亲和素连接的磁珠(Dynal，Oslo，挪威)在200 μ 1冷的 PBS中洗涤两次，加入0. 5 μ g肽/A * 0201单体并将混合物在室温下孵育15分钟。洗涤两 次后将磁珠与PBLs以1 10的比例混合，且随后孵育1小时后在磁场中沉淀珠子结合的 细胞。重复一次此沉淀步骤。免疫组织化学染色将组织切片干燥过夜且随后在冷丙酮中固定5分钟，用于用FITC-连接的多 聚化肽/MHC复合体染色。所有孵育步骤均在室温和黑暗中完成(i)45分钟一级抗体 (1 100稀释)，(ii)Cy 3-连接的山羊抗小鼠(1 500稀释；编号115-165-100，Jackson ImmunoResearch，从德国汉堡的Dianova处获得)孵育45分钟，和最后(iii)多聚体75分 钟。每步之间将载玻片在PBS/BSA 0. 中洗涤两次10分钟。将载玻片在vectashield中 封片并保存在冰箱中直到在共焦显微镜下观察为止。细胞毒性测试用于CTL介导的细胞毒性的常规[51Cr]_释放测定如(13)中所述的来进行。靶 细胞是自体EBW转化的B细胞系，HLA-A2阳性乳腺癌细胞系MCF-7 (从ATCC获得)、HLA_A2 阳性黑素瘤细胞系FM3 (38)、HLA-A2阴性乳腺癌细胞系BT-20 (从ATCC获得)和HLA-A2阴 性黑素瘤细胞系FM45 (38)。如通过RT-PCR所检测的，所有癌细胞系均表达存活蛋白(数据 未显不)ο
ELISP0T 试验ELISP0T试验用于对肽表位特异性释放IFN- γ的效应细胞进行定量且从前已有 描述(39)。简言之，用抗IFN-γ的抗体(1-D1K MabtechJ^W)包被硝酸纤维素底的96孔 板(Multiscreen MAIP N45, Millipore)并用 AIMV (GibcoBRL，Life Technologies Inc.， GaithersbUry，MD，美国)封闭非特异性结合。将不同细胞浓度的淋巴细胞与特异性肽和T2 细胞一起加入并在37°C下孵育过夜。两次洗涤后加入生物素化的检测抗体(7-B6-1-生物 素，Mabtech)。利用碱性磷酸酶-亲和素和各自的底物(GibcoBRL)显现特异性结合。在暗 紫色斑点出现时即终止此反应，利用AlphaImager系统(Alphalnnotech，San Leandro，CA， 美国)将斑点定量。用于ELISP0T的肽是Surl、Sur9和如实施例1所述的Surl的类似肽 Sur1M2。MMHLA-A2/存活蛋白反应性T细胞的原位染色在实施例1中，鉴定了白血病和黑素瘤中由T细胞识别的两种存活蛋白衍生肽表 位，即Surl。通过用更好的锚定残基(甲硫氨酸；SurlM2)替换2位的苏氨酸，Surl对HLA-A2 的弱结合亲和力得到极大提高。此措施使得可以构建稳定的HLA-A2/肽复合体。这些复合 体利用葡聚糖分子得以多聚化，所述葡聚糖分子与链霉亲和素和FITC连接。多聚化的MHC 复合体用于对丙酮固定的冰冻材料染色。利用共焦激光显微镜，SurlM2/HLA-A女0201反 应性CTLs能够容易地在肿瘤微环境中原位检测到。我们描述了 III期黑素瘤患者的原发 肿瘤和岗哨淋巴结以及原发乳腺癌病灶中的此类细胞。为确保染色的特异性，做了一系列 的阴性对照。无论肽/HLA-葡聚糖多聚体与同一肿瘤上衍生自黑素瘤分化抗原gplOO的肽 的使用，还是在来自于HLA-A2阴性供体的肿瘤样品情况下使用SurlM2/HLA-葡聚糖多聚体 均未得出阳性染色。分离的存活蛋白反应性CTLs裂解不同来源的肿瘤细胞系为表征存活蛋白反应性CTLs的功能性能力，通过包被HLA_A2/SurlM2复合体的磁 珠将这些细胞分离(36)。将刚切除的黑素瘤浸润淋巴结切成碎片并压碎使细胞释放进培养 液。分离前将细胞在体外用肽刺激一次。分离后一天加入IL-2并在第5天通过ELISP0T或 在标准51Cr释放试验中对这些细胞杀死肿瘤细胞的能力进行测试。首先，通过ELISP0T分 析可能证实利用修饰的SurlM2/HLA-A2复合体分离的CTLs也对天然Surl肽起反应(数据 未显示)。第二，测试了存活蛋白反应性CTLs对于HLA-A2阳性黑素瘤细胞系FM3 (图5A) 和HLA-A2阳性乳腺癌细胞系MCF-7(图5B)的细胞毒性。分离的T细胞有效地裂解了两种 HLA-A女0201细胞系。与此相反，未观察到针对HLA-A2阴性黑素瘤细胞系FM45 (图5A)或 HLA-A2阴性乳腺癌细胞系BT-20(图5B)的细胞毒性。通过ELISP0T测量PBL中的存活蛋白反应性通过ELISP0T检查了来自十名HLA-A2阳性乳腺癌患者的PBLs中存活蛋白反应性 T细胞的存在。分析前，为增加测试的灵敏度将PBLs在体外刺激一次。检查了对于下列存 活蛋白肽的反应性Surl、Sur9和Sur 1M2。在十名HLA-A2阳性乳腺癌患者的六名中检测到 了存活蛋白特异性T细胞。图6中给出了代表性实例。来自两名患者的PBLs中检测到针 对Surl和修饰的类似物Sur 1M2但不是针对Sur9 (图6，上部，中部)的反应，三名患者中检 测到针对Sur9而不是针对Surl或SurlM2(图6底部)的反应，一名患者仅应答Sur 1M2。
27与此相反，在来自20名健康HLA-A2阳性供体的PBLs中未检测到存活蛋白反应。相似地， 检查了来自14名HLA-A2阳性黑素瘤患者的PBLs。存活蛋白反应存在于这些患者的7名中 (表2)。两名患者对Sur9肽起反应，三名对Sur 1M2肽起反应，一名对Surl和SurM2都起反 应，一名对所有三种肽都起反应。在实施例1中，测试了 3名慢性淋巴细胞性白血病(CLL) 患者中针对存活蛋白的T细胞反应(表2 ;CLL1、CLL2、CLL3)。利用来自三名另外的CLL患 者的PBLs扩大了这些研究。显著地，所有患者产生了针对至少一种存活蛋白表位的T细胞 应答(表2 ；CLL5、CLL6、CLL7)。另外，检查了来自一名患有慢性髓性白血病(CML)患者的 PBLs。在此患者中，鉴定出了针对所有三种肽的反应(数据未显示)。表2中概述了这些数 据。 表2.诵i寸ELISP0T检测丨的在PBLs中含有存活蛋白flt _特异t牛T淋Piffl朐的患、者 a)每IO4个细胞中反应细胞的频率；检查了 14名患者。b)每IO4个细胞中反应细胞的频率；检查了 10名患者。c)每IO5个细胞中反应细胞的频率；检查了 14名患者。实施例3癌症患者中针对存活蛋白衍生肽的HLA-B35-限制性免疫反应MM在此研究中，鉴定和表征了两种受限于HLA-B35的衍生自存活蛋白的表位。针对 这两种肽表位的特异性T细胞反应性存在于来自患有不同造血恶性肿瘤和黑素瘤的患者的外周血液中。C末端锚定残基的替换提高了被黑素瘤患者的肿瘤浸润淋巴细胞的识别。而 且，证实了原发黑素瘤病灶中原位针对存活蛋白的自发性细胞毒性T细胞反应。这些表位 扩大了将来的疫苗策略适用性，此策略以涉及恶性肿瘤的存活蛋白肽以及有关患者的HLA 图谱为基础。在实施例1和2中，研究了 HLA-A2限制性的衍生自存活蛋白的T细胞表位。由于 HLA-A2只在大约30%的白种人群体中表达(63)，需要鉴定受限于其它HLA I类分子的肽表 位以扩大可以治疗的患者比例。在此研究中，来自受限于HLA-B35的存活蛋白的两个新的 T细胞表位得以鉴定，HLA-B35在9%的白种人群体中表达(63)，并检测了患有不同造血恶 性肿瘤和黑素瘤的患者中这些存活蛋白肽的自发性免疫反应。材料与方法患者收集癌症患者的外周静脉血液样品，利用Lymphopr印分离来分离PBLs，HLA分型 (Department of Clinical Immunology, UniversityHospital,哥本哈根)并冷冻在含有 10% DMSO的FCS中。筛选出10名HLA-B35阳性患者用于进一步的分析。这些患者分别患 有黑素瘤、CLL、滤泡性淋巴瘤(FL)、扩散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和多发性骨髓瘤(MM)。 在收集血液样品之时，患者在前面四个月中未进行过医学上的治疗。另外，从三名黑素瘤患 者中收集分离自淋巴结的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)并冷冻于含10% DMSO的FCS中。肽七种合成的存活蛋白衍生肽用于此研究Sur6-14、Surl 1_19、Sur34_43、 Sur46-54、Sur51_59、Sur46Y9、Sur51Y9 和一种衍生自 EBV 的肽 EBNA3A457-466 (63)。所有 肽均从Research Genetics (Huntsville, AL)获得，并以如通过HPLC和MC分析证实的> 90%的纯度提供。这些肽在下面表3中列出。表3.存活蛋白衍生肽对HLA-B35的结合 用于肽与MHC I类分子结合的装配试验实施例1和实施例2中所描述的装配试验用于测定合成肽对于用[S35]甲硫氨酸 代谢标记的HLA-B35分子的结合亲和力。简言之，此试验以肽介导的空HLA分子的稳定化为 基础，所述HLA分子是在细胞裂解时释放自用HLA-B35稳定转染的TAP缺陷型细胞系T2 (由 J. Haurum博士友情提供，Symphogen ApS, Lyngby，丹麦)。用依赖构象的mAb W6/32免疫 沉淀稳定折叠的HLA分子。通过IEF电泳分离HLA分子，将凝胶暴露于phosphor imager屏 (成像板，FUJI photo film有限公司，日本)，分析并利用ImageGauge phosphorimager软 件(FUJI photo film有限公司，日本)定量正确折叠的HLA分子的量。
PBLs的抗原刺激为增加ELISP0T试验的灵敏度，分析前在体外将淋巴细胞用肽刺激一次(14，15)。 将PBLs或TILs解冻并在96孔板中用50 μ M各自的肽表位在26°C下刺激2小时(每种肽 5 X IO5-IO6个细胞)，合并后再培养10天，所述培养在37°C下in χ-vivo中用5%的人血清 (HS)以2X IO6个细胞每孔在24孔板(Nunc，Roskilde，丹麦)中进行。孵育的第二天，加 入^yg/mllLKApodan A/S，丹麦)。第十天在ELISP0T试验中测试培养细胞的反应性。ELISP0T 试验用于对收集自癌症患者的PBLs或TILs中的肽特异性释放IFN-Y的效应细胞 定量的ELISP0T试验，如实施例1中所述的来完成。简言之，用针对人的IFN-Y的mAb 7. 5μ g/ml(l-DlK ；Mabtech，Nacka，瑞典)包被硝酸纤维素底的 96 孔板。在 x-vivo (x-vivo 15TM BioWhittacker，MolecularApplications Aps，丹麦)中洗涤和封闭孔并以不同浓 度一式两份加入细胞。对于抗原提呈，将含有和不含10 μ M肽的IO4个Τ2-Β35细胞加入 每孔中。将板孵育过夜，弃去细胞并洗涤孔后加入生物素化的二级抗体(7-Β6-1-生物素； Mabtech)。在室温下将板孵育2小时，洗涤并加入亲和素-碱性磷酸酶缀合物(AP-亲和素； Calbiochem, Life Technologies, Inc.)。室温下孵育1小时后，加入酶底物氮蓝四唑/磷 酸5-溴-4-氯-3-吲哚基酯(编号K0598, DakoCytomation Norden A/S)，暗紫色斑点在 3-7分钟内显现。通过用自来水洗涤终止反应。利用Alpha Imager系统(Alpha Innotech, San Leandro，加拿大)计数斑点，并从斑点形成细胞的数目计算出肽特异性T细胞的频率。对于每种肽抗原所有试验均一式两份地进行，并且将培养在同一孔中的淋巴细胞 在含有和不含有肽时以相等的细胞数目测试，以测量培养物中肽特异性细胞的数目。树突细胞(DCs)的成熟培养2小时后从PBLs中分离贴壁细胞。将这些细胞在含有10 % FCS的RPMI 1640中(GibcoTM Invitrogen公司，英国)再培养10天。每隔一天加入800ng/ml 61-05卩(？1~印1~(^6吐，伦敦，英国)和 40ng/mlIL-4 (Pi^proTech)。第 10 天，通过加入 50ng/ ml TNF- α (PreproTech)使DCs成熟。成熟后，将DCs释放并在3 μ g/ml β 2-微球蛋白存 下与20 μ M肽一起在26°C下脉冲2小时。肽特异性T细胞的分离如实施例2中所述的利用sur51Y9/HLA_B35包被的磁珠分离抗原特异性细胞。 通过将2. 5μ g单体与5 X IO6个磁珠在40 μ 1 PBS中室温下孵育20分钟，将生物素化 的HLA-B35单体和sur51Y9(获得自Prolmmune，牛津，英国)与链霉亲和素包被的磁珠 (Dynabeads M-280,Dynal A/S，0slo，挪威)偶联在一起。利用磁性装置(Dynal,A/S,Oslo, 挪威)用PBS将磁性复合体洗涤三次，并随后与含有5% BSA的PBLs以1 10的比率混 合，并非常轻柔地旋转1小时。将与磁性复合体结合的抗原特异性CD8+T细胞轻柔地洗涤 二次或三次。分离的细胞在补加5%人血清的x-vivo中重悬浮几次并孵育2小时后将磁珠 释放并从细胞悬浮液中移走。分离的抗原特异性CD8+T细胞用于ELISP0T试验以分析天然 和修饰肽之间的交叉反应性。通过变性梯度凝胶电泳(DGGE)进行TCR克隆型作图人类TCR BV区域1-24的DGGE克隆型作图已有详细描述(66)。简言之，利用 Purescript Isolation 试剂盒(Gentra Systems Inc. MN)分离 RNA 并利用 TCR beta 链可变区的引物连同共同的恒定区引物通过PCR扩增转录的cDNA。用计算机程序MELT87确保 如果将50bp的富含GC的序列(GC-夹子)连接在恒定区引物的5’末端，那么扩增的DNA 分子适合于DGGE分析。DGGE分析在含有20% -80%的尿素和甲酰胺梯度的6%的聚丙烯 酰胺凝胶中进行。电泳在1 XTAE缓冲液中54°C恒温下以160V进行4. 5小时。免疫组织化学染色利用如实施例2中所述的方法，将多聚化的肽/HLA复合体用于鉴定癌症患者的 肿瘤病灶中原位的抗原特异性T细胞。生物素化的sur51Y9/HLA-B35单体由英国牛津的 Proimmune有限公司提供。将生物素化的sur51Y9/HLA_B35单体用链霉亲和素-FITC-连 接的葡聚糖分子(由丹麦Glostrup，DAKO的LWinther友情提供)多聚化以产生用于免疫 组织化学的多价HLA-葡聚糖化合物。将组织切片干燥过夜并随后在冷丙酮中固定5分钟。 所有的孵育步骤均在黑暗中室温下完成(a) —级抗体(1 100稀释)45分钟；(b)Cy3-连 接的山羊抗小鼠抗体(1 500稀释；编号115-165-100 Jackson ImmunoResearch，获得自 Dianova，汉堡，德国)45分钟；及最后(c)多聚体75分钟。每步之间，在PBS/BSA 0.1%中 洗涤载玻片两次10分钟。将载玻片在vectashield中封片并保存在冰箱中直到在共焦显 微镜(Leica)下观察。HLA-B35结合存活蛋白衍生肽的鉴定根据HLA-B35的肽结合基序(67)筛选存活蛋白的氨基酸序列以寻找带有锚定残 基的九聚体和十聚体肽。筛选出包含脯氨酸作为2位N-末端锚定残基和苯丙氨酸、亮氨 酸、异亮氨酸或酪氨酸作为C-末端锚定残基的5种肽(表3)。装配试验显示出能够有效 稳定 HLA-B35 的两种肽:sur51-59 (EPDLAQCFF, SEQ ID NO 7)和 sur46_54 (CPTENEPDL，SEQ IDNO :6)。另外，两种肽 sur34-43 (TPERMAEAGF，SEQ ID NO 20)和 sur6_14 (LPPAWQPFL，SEQ ID NO 18)显示出弱稳定性，而剩余的肽根本不稳定HLA-B35。HLA-B35的半数最大回收所 需的肽浓度(C5tl)估计为对于sur51-59为13 μ M和对于sur46_54为20 μ Μ。比较起来，来 自 ΕΒΝΑ3Α458-466 (YPLHEQHQM, SEQ ID NO 21)的阳性对照表位 C24 具有估计为 0. 8 μ M 的 C50 值。为提高sur46-54和sur51-59的结合亲和力，将C末端氨基酸用更好的锚定残基 酪氨酸来代替(67)。在装配试验中分析由修饰的肽介导的HLA-B35的回收，并估计出C5tl值 对于 sur51Y9 是 1. 5 μ M 和对于 sur46Y9 是 4 μ M (图 7)。针对天然肽表位的自发性免疫反应最初，分析了五名患者对于四种天然HLA-B35结合肽sur51_59、sur46_54、 sur34-43和sur6_14的自发性免疫反应。这五名患者患有不同的造血恶性肿瘤HEM8和 HEM18 患有 MM，HEMl2 患有 FL，HEM9 患有 DLBCL 和 CLL5 患有 CLL。十天的体外刺激后对PBLs进行INF-γ ELISP0T试验，以检测肽前体CTLs。检测出 针对两种天然HLA-B35结合肽sur51-59和sur46_54的自发性免疫反应。两名患者HEM12 和CLL5对sur51-59和sur46_54均显示出反应，而HEM8只显示出针对sur51-59的反应 (图8A和B)。在剩余两名患者HEM9和HEM18中未检测到反应，且在任何患者中均没检测 到针对弱结合肽sur34-46和sur6_14的反应。将体外刺激的备选方法用于患者HEM12中，即将PBLs与用sur51_59脉冲的成熟 自体树突细胞共培养从而体外刺激CTL反应。此培养的PBLs在ELISP0T中显示出针对
31sur51-59的强烈反应性(图8B)。修饰肽的增强识别如上所述，为提高HLA-B35亲和力的肽修饰导致了 HLA-B35相对于天然肽的5_10 倍高的亲和力。通过ELISP0T试验将一组五名黑素瘤患者用于分析针对天然和修饰肽的自 发性免疫反应。PBL样品在体外刺激后进行分析，而直接分析TIL样品。在来自五名患者中 的三名的PBLs或TILs中观察到自发性免疫反应。FM25在PBL和TIL样品中均显示出针 对sur51-59和sur51Y9的反应性(图9A)。FM45只对修饰肽sur51Y9起反应，在TILs中 可检测到强烈反应。在此患者中未获得PBLs (图9A)。FM74在TIL中显示出针对sur46Y9 的强烈反应，但未检测到针对天然肽的反应(图9B)。在来自FM74的PBLs中也观察到针对 sur46Y9的弱反应(数据未显示)。天然和修饰肽之间的交叉反应性Sur51Y9对HLA-B35的高亲和力使得用sur51Y9产生HLA-B35的稳定单体成为可 能。在来自不同癌症患者的肿瘤浸润淋巴结和PBLs中存活蛋白反应性T淋巴细胞的存在 已经确定，用此类HLA-B35/Sur51Y9复合体包被磁珠并将这些磁珠用于从患者CLL5的PBL 中分离存活蛋白肽反应性T淋巴细胞。此患者显示出针对sur51-59的强烈反应。如通过显 微术所显现的，珠子紧密结合到特异性细胞的细胞表面(数据未显示)，容许通过磁场沉淀 抗原特异性细胞。分离的sur51Y9特异性细胞强烈应答sur51-59 (图9)，而在剩余的PBLs 中未能检测到应答(数据未显示)。此分离通过RT-PCR/DGGE为基础的TCR克隆型作图来 分析。此技术允许对复杂细胞群体中的T细胞克隆性(clonality)的分析，甚至只要获得 少数细胞就可分析。这些分析表明8个不同的克隆得以分离(数据未显示)。抗原特异性T细胞原位存在于黑素瘤病灶中利用与链霉亲和素和FITC连接的葡聚糖分子将sur51Y9/HLA-B35单体多聚化。利 用实施例2中所述的方法将多聚化的MHC复合体用于对丙酮固定的冰冻材料染色。抗原特 异性细胞用共焦激光显微镜观察。分析了来自三名患者的原发黑素瘤切片，并在一名患者 的肿瘤微环境中能够在原位容易地检测到Sur51Y9/HLA-B35反应性CTLs。用针对粒酶B的 mAb的共染色表明这些存活蛋白特异性CTLs释放粒酶B，发挥细胞毒素的活性，将HLA-B35 阴性黑素瘤患者用作对照(数据未显示)。实施例4具有不同HLA-A限制谱的新的衍生自存活蛋白的CTL表位的鉴定MM以癌症患者中的CTL反应为基础表征了新的HLA-A1-、HLA-A2-、HLA-A3-和 HLA-All-限制性存活蛋白表位。这些表位显著增加了适合基于存活蛋白衍生肽的免疫疗法 的患者数。另外，几种限制元件的集体靶定可能降低HLA-等位基因缺失造成的免疫逃逸的危险。材料与方法患者患者样品获得自德国的University of Wurzburg大学和丹麦Herlev的 University Hospital。在做任何这些测量之前均获得了患者的知情同意。组织分型在丹 麦哥本哈根的 Department of Clinical Immunology, University Hospital 进行。利用Lymphopr印分离来分离患有黑素瘤、乳腺癌和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)患者的外周血 淋巴细胞(PBL)并冷冻在含有10%二甲亚砜的胎牛血清(FCS)中。而且，获得了来自黑素 瘤患者的原发病灶和肿瘤浸润淋巴结的T淋巴细胞。将刚切除的肿瘤组织切成小快并压碎 以释放用于冷藏的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。月太所有的肽都购买自Invitrogen (Carlsbad，CA，美国)并以如通过HPLC和MS分析 所证实的> 80%的纯度提供。所有用到的肽在下面表4、实施例5中列出。细胞系人T2细胞系是B-LCL. 174和T-LCL CEM细胞的TAPl和TAP2缺陷杂种，因此只在 细胞表面表达低水平的HLA I类分子(HLA-A * 0201和HLA-B * 5101)。用HLA-A * 0301 转染的T2细胞由牛津的John RadcliffeHospital IMM的A McMicheael博士友情提供。用 HLA-A * 1101转染的T2细胞由瑞典斯德哥尔摩Karolinska Institute MTC的M Masucci 博士友情提供。BM36. 1细胞系也是TAP功能缺陷的并具有与T2相似的表型，在表面低水 平表达 HLA I 类(HLA-A * 0101 和 HLA-B * 3501)。BM36. 1 细胞由德国柏林的 Humboldt University 的 A Ziegler 博士友情提供。用于肽结合MHC I类分子的装配试验如前所述(12)，在装配试验中测定合成肽(Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)对用 [35S]-甲硫氨酸代谢标记的HLA-Al、-A2、-A3或-All分子的结合亲和力。此试验以细胞裂 解时从TAP缺陷细胞系中所释放的空HLA分子的肽介导的稳定化为基础。利用HLA I类特 异的构象依赖性mAb W6/32将稳定折叠的HLA分子免疫沉淀，并通过等电聚焦(IEF)凝胶电 泳将其分离。用 ImageGauge Phosphorimager 禾呈序(FUJI photo film 公司，Carro 11 ton, TX，美国)定量MHC重链条带。条带的强度与试验中所回收的肽结合的I类MHC复合体的 量是成比例的。其次，HLA分子的稳定化程度与所加肽的结合亲和力是直接相关的。用于 分析HLA分子回收的肽浓度对于HLA-Al和HLA-All是40、4、0. 4,0. 04 μ Μ,而对于HLA-A2 和HLA-A3是100、10、1、0. Κ0.01μΜο随后对每种肽计算出C5tl值，其为足以达到半最大稳 定化的肽浓度。PBL的抗原刺激为增加ELISP0T试验灵敏度，分析前在体外刺激一次PBL。第O天，将PBL或压碎 的淋巴结解冻并以2ml/孔中2Χ IO6个细胞接种24孔板(Nunc，Roskilde，丹麦)，所述细 胞存在于10 μ M肽存在下的含有5%热灭活的人血清和2mM L-谷氨酰胺的χ-vivo培养基 (Bioffhi11aker,Wa 1 kersνi 11 e,Mary 1 and)中。两天后，向培养物中加入20IU/ml的重组白 介素-2(IL-2) (Chiron, Ratingen，德国)。第10天在ELISP0T中测试所培养细胞的反应 性。ELISP0T 试验如前面描述的(16)，用ELISP0T试验定量肽表位特异的Y干扰素释放性效应细 胞。简言之，用抗-IFN-Y-抗体(1-D1K，Mabtech, Nacka，瑞典)包被硝酸纤维素底的96 孔板(Multiscreen MAIP N45，Millipore，Hedehusene，丹麦)。将孔洗涤，用 X-vivo 培 养基封闭，并将细胞以不同细胞浓度一式两份加入。然后每孔中加入肽并将板孵育过夜。 第二天，在加入生物素化的二次抗体(7-B6-1-生物素，Mabtech)之前，弃去培养基并洗涤孔。将板孵育2小时，洗涤并将抗生物素蛋白-碱性磷酸酶缀合物(Calbiochem，Life Technologies, Inc, San Diego，CA，美国)加入每孔。将板在室温下孵育1小时，洗涤，并在 每孔中加入酶底物NBT/BCIP (DakoCytomation Norden A/S，Glostrup，丹麦)并在室温下孵 育5-10分钟。暗紫色斑点出现时即通过自来水洗涤来终止反应。利用ImmunoSpot Series 2. O分析仪(CTL分析仪，LLC, Cleveland，美国)计数斑点并可从斑点形成细胞的 数目计算出肽特异的CTL频率。对每种肽抗原的所有测试均一式两份地进行。MMHLA-Al限制件存活蛋白表位的鉴定存活蛋白衍生肽对HLA-Al的结合利用主要的HLA-Al锚定残基3位上的天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)和C末端的 酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)筛选存活蛋白蛋白质的氨基酸序列以寻找最可能的HLA-Al九 聚体或十聚体肽表位。因此，合成了六种存活蛋白衍生肽并检测了与HLA-Al的结合(表 4)。另外，包括两种肽 Sur38-46(MAEAGFIHC) (SEQ ID NO :23)和 Sur47_56 (PTENEPDLAQ) (SEQ IDNO :25),尽管它们R含有主要锚定残基中的一个，因为通过在http //syfpeithi. bmiheidelberR. com/可获得的Rammensee等人的预测算法将这两种肽鉴定为可能的良好 结合物。估计每种肽的C5tl值，其为HLA-Al的半最大稳定化所需的肽浓度(表4)。然而， 这些肽中只有一种Sur92-101(QFEELTLGEF) (SEQ ID NO 27)以与已知阳性对照表位相似高 的亲和力结合，所述阳性对照表位来自如图10中例示的流感A蛋白质碱性聚合酶I(PBl) (VSDGGPNLY)。Sur93_101 (FEELTLGEF) (SEQ ID NO :24)对 HLA-A1 具有低结合亲和力，而所 分析的其它肽中没有肽结合到HLA-Al (表4)。因此，我们合成了许多类似肽，在其中更好的 锚定残基代替了天然氨基酸。我们在C末端引入酪氨酸(Y)分别代替半胱氨酸(C)或谷氨 酰胺(Q)来修饰两种肽 Sur38_46(MAEAGFIHC) (SEQ ID NO 23)和 Surf7-56 (PTENEPDLAQ) (SEQ ID N0:25)。两种修饰肽都强烈地结合到HLA-Al上(表4)。另外，我们用辅助锚定 苏氨酸(T)或丝氨酸(S)替换两种肽Sur92-101和Sur93_101中2位上的氨基酸。这些修 饰对 Sur92-101 与 HLA-Al 的结合不具有正效应。相反，Sur93T2 (FTELTLGEF) (SEQ IDNO 36)对HLA-Al以高亲和力结合(表4)。图10说明了与来自流感的阳性对照表位相比，天 然低亲和力肽Sur93-101、高亲和力修饰肽Sur93T2和非结合肽Sur49_58的结合。最后，我 们在 C 末端用酪氨酸(Y)修饰了 Surl4-22、Sur34_43、Sur49_58、Sur51_59、Sur92_101 和 Sur93-101，然而这没有提高任何这些肽对于HLA-Al的结合亲和力(数据未显示)。癌症患者中针对存活蛋白衍生肽的HLA-Al限制性CTL反应通过ELI SPOT分析了来自六名黑素瘤患者的PBL和来自三名黑素瘤患者的 TIL中，特异针对四种高亲和力的存活蛋白衍生的肽Sur38Y9、Sur47Y10、Sur 92-101和 Sur93T2中任何一种的CTL的存在。在所有来自九名所分析患者的三个PBL样品和一个TIL 样品中观察到针对至少一种存活蛋白衍生肽的T细胞反应性。如图11中所示，来自一名患 者 Mel. A1-3 的 PBL 具有针对所有 4 种肽 Sur38Y9、Sur47Y10、Sur 92-101 和 Sur93T2 的 T 细胞反应。Mel. A1-2显示出针对Sur47Y10、Sur 92-101和Sur93T2的反应，而在Mel. Al-I/ TIL和Mel. A1-4/PBL中分别观察到针对Sur47Y10和Sur93T2的反应(图11)。另外，通过ELISP0T试验了十名黑素瘤患者的针对天然肽Sur93-101、Sur38-46和 Sur47-56的免疫反应性；然而，在任何这些肽中都未检测到肽特异反应(数据未显示)。
HLA-Al限制件存活蛋白表位的鉴定存活蛋白衍生肽对HLA-All的结合筛选存活蛋白蛋白质的氨基酸序列以寻找九聚体或十聚体肽，所述肽含有相应于 HLA-A3超家族包括HLA-A3和HLA-All的结合基序的结合基序。根据Rammensee等人的预 测算法选择了含有主要锚定残基在2位的亮氨酸(L)和C末端的赖氨酸(K)的肽序列，和 在这些位置上具有相关氨基酸的肽序列(表4)。从存活蛋白的蛋白质序列预测了十三种肽并分析了其与HLA-All和HLA-A3的结 合。这些肽中的三种 Sur53_62(DLAQCFFCFK) (SEQ IDNO 47) ,Sur54-62 (LAQCFFCFK) (SEQ ID NO 42)和 Sur 112-120 (KIAKETNNK) (SEQ ID NO 44)以高亲和力结合 HLA-A11，所述亲和力 与来自EBV核抗原4 (AVFDRKSDAK) (SEQ ID NO 63)的病毒的表位结合HLA-All的亲和力相 当。另夕卜，一种肽 Surll2-121(KIAKETNNKK) (SEQ ID NO 51)与 HLA-A11 弱结合(表 4)。癌 症患者中针对存活蛋白衍生肽的HLA-All限制性CTL反应测试了来自五名黑素瘤患者和两名CLL患者的PBL针对四种HLA-All结合肽 Sur53-62、Sur54_62、Surll2_120、和 Surll2_121 的 T 细胞反应性。通过 ELISP0T，我们能 够检测来自两名黑素瘤患者Mel. Al 1-1、Mel. Al 1-2的PBL中针对存活蛋白衍生肽Sur53-62 的反应(图12)。另外，我们能够在来自患者Mel.All-2的肿瘤浸润淋巴结的肿瘤浸润淋 巴细胞(TIL)中检测到Sur53-62特异性T细胞(图12)。在两年时间内从患者Mel. All-I 所采集的五个不同血液样品中观察到针对存活蛋白肽Sur53-62的强免疫反应(数据未显 示)°HLA-A3限制性存活蛋白表位的鉴定存活蛋白衍生肽对HLA-A3的结合另外分析了经预测结合HLA-A3超家族的存活蛋白衍生肽与HLA-A3的结合。只 有两种肽 Sur112-120(KIAKETNNK)(SEQ ID NO 44)和 Surl12-121(KIAKETNNKK)(SEQ ID NO 57)以高亲和力结合HLA-A3，与病毒表位流感A核蛋白265-273 (ILRGSVAHK) (SEQ ID N0:74)相似(表 4)。而且，两种肽 Sur53_62 (DLAQCFFCFK) (SEQ ID NO 47)和 Sur95-103 (ELTLGEFLK) (SEQ ID NO 43)弱结合至Ij HLA—A3。为了增加对HLA-A3的结合亲和力，修饰了检测不到结合的一些肽。因此，我们合 成了两种类似肽Sur54-62和Surll3_122，在其中2位上用更好的锚定残基亮氨酸(L)代 替了天然的丙氨酸(A)。Sur54L2 (LLQCFFCFK) (SEQ ID NO 56)以高亲和力结合HLA-A3，而 Surll3L2(ILKETNNKKK) (SEQ ID NO 59)只是弱结合(表4)。另外，我们合成了四种类似肽 Sur5-13、Surl3-22、Surl8-27、和Sur53_61，在其中用更好的锚定残基赖氨酸(K)代替了 C 末端天然的苯丙氨酸(F)。Sur5K9 (TLPPAWQPK) (SEQ ID NO 54)和 Surl8K10 (RISIFKNWPK) (SEQ IDNO 58)以高亲和力结合到HLA-A3上，而与天然类似物相比，所述替换对于 Surl3K9(FLKDHRISTK)(SEQ ID NO 57)和 Sur53K9 (DLAQCFFCK)(SEQ ID NO 55)对 HLA-A3 的结合无可检测的效果。癌症患者中针对存活蛋白衍生肽的HLA-A3限制性CTL反应分析了来自黑素瘤患者的九个样品(5个PBL和4个TIL)针对两种天然高亲和力 HLA-A3结合肽Surll2-120和Surll2_121以及两种天然弱结合肽Sur53_62和Sur95_103 的免疫反应。然而，通过ELISP0T在任何这些患者中均未检测出针对这些肽的免疫反应。随力的经修饰的存活蛋白衍生肽Sur5K9、SUr18K10、 和Sur54L2的自发性免疫反应性。在来自三名患者Mel. A3-1、Mel. A3-2、Mel. A3-3的TIL 样品中检测到针对Surl8K10的CTL反应性(图13)。未检测到针对另外两种肽Sur5K9和 Sur54L2的反应。为进一步证实这些反应，分析了来自另外18名黑素瘤患者的PBL的针对 Surl8K10的CTL反应性。在这些患者中发现了三名应答患者Mel. A3_4、Mel. A3-5、和Mel. A3-6，导致在所分析的27名患者中共有6名应答患者(表13)。新的HLA-A2限制t牛存活蛋白表拟的鉴定11聚体存活蛋白衍生肽对HLA-A2的结合利用主要的HLA-A2特异性锚定残基，筛选存活蛋白蛋白质的氨基酸序列寻找最 可能的HLA-A211聚体肽表位。合成了六种存活蛋白衍生肽并检测了其对HLA-A2的结 合。没有检测到以与已知的阳性对照表位相似的高亲和力结合的肽，所述阳性对照表位来 自 EB 病毒 BMLF280-288 肽(GLCTLVAML) (SEQ ID NO 72)(表 4)。对于阳性对照，HLA-A2 的半数最大回收所需的肽浓度(C5tl值)是0.9 μ M。比较起来，Surl8-28(RISTFKNWPFL) (SEQ ID NO 67)禾口 Sur86-96 (FLSVKKQFEEL) (SEQID NO 69)弱结合到 HLA-A2 (分另Ij C50 =69μΜ和72μΜ)。然而，两种已知的HLA-A2限制性存活蛋白表位以相似的方式弱结合 到 HLA-A2 ;Sur95-104(ELTLGEFLKL) (SEQ ID NO 43)以中等亲和力(C50= 10 μ M)结合而 Sur96-104(LTLGEFLKL) (SEQ ID NO 10)只是弱结合(C5。> 100 μ Μ)。剩余四种所检测的 11-聚体肽(Sur4-14 (PTLPPAffQPFL) (SEQ ID NO 66)、Sur54-64 (LAQCFFCFKEL) (SEQ IDNO 68)、Sur88-98 (SVKKQFEELTL) (SEQ ID NO 70)、和 Surl03_113 (KLDRERAKNKI) (SEQ ID NO 74))不结合到HLA-A2。癌症患者中针对存活蛋白衍生肽的HLA-A2限制性CTL反应最初分析了来自10名癌症患者(2名黑素瘤(Mel)、6名CLL(CLL)和2名乳腺癌 (MC)患者)的PBL以研究两种弱结合11聚体肽Surl8-28和Sur86_96是否由HLA-A2提呈 并由癌症患者的免疫系统识别。在10名所分析患者中的2名(CLL-l、CLL-2，图14)的PBL 中发现了针对Surl8-28的CTL反应，而未检测到针对Sur86_96的反应(数据未显示)。为 进一步证实这些Surl8-28特异性反应，分析了来自另外12名患者(7名黑素瘤、1名CLL和 4名乳腺癌患者)的PBL针对此肽的CTL反应性。在这些患者中，4名患者(CLL-3、MC-1、 MC-2、Mel. A2-1)具有通过ELISPOT可检测的Sur 18-28特异性免疫活性(图14)。因此， 总共22名所分析患者中的6名的PBL具有针对Surl8-28的CTL反应。HLA-B7限制性存活蛋白表位的鉴定存活蛋白衍生肽对HLA-B7的结合筛选存活蛋白蛋白质的氨基酸序列以寻找九到十个氨基酸组成的肽，所述肽含有 根据HLA-B7的肽结合基序的锚定残基。选出了 5种肽并在装配试验中分析了它们稳定 HLA-B7的能力。估计每种肽的C5tl值，其为HLA-B7的半最大稳定化所需的肽浓度(表4)。 两个存活蛋白衍生肽 sur6-14(LPPAWQPFL) (SEQ ID NO 18)和 surll-19 (QPFLKDHRI) (SEQID NO 19)弱稳定 HLA-B7，所述肽具有超过 100 μ M 的 C5tl 值；而 sur46_54 (CPTENEPDL) (SEQ ID NO 6)、sur51-59(EPDLAQCFF)(SEQ IDNO 7)和 sur34-43(TPERMAEAGF)(SEQ ID NO 20)不 结合到HLA-B7 (表4)。癌症患者中针对存活蛋白衍生肽的HLA-B7限制性CTL反应
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检测了来自5 名黑素瘤患者(mel25、mel26、mel3、mel6、mel39)、2 名 CLL 患者 (CLLUCLL54)和 2 名乳腺癌患者(breastll、breastl5)的 HLA-B7 阳性 PBL 针对弱 HLA-B7 结合肽 sur6-14(LPPAWQPFL) (SEQ IDNO 18)和 surll-19 (QPFLKDHRI) (SEQ ID NO 19)的 T 细胞反应性。我们能够在一名CLL患者和一名乳腺癌患者的PBL中检测到针对存活蛋白衍 生肽sur6-14的强自发性CTL反应(图15)。另外，我们能够在黑素瘤患者mel3中检测到 针对此肽的弱反应(图15)。癌症患、者中针对存活蛋白衍牛At的HLA等位某_限吿Ht牛免,疮 应概沭利用前面实施例所述的肽与MHC I类分子结合的装配试验，测试了一系列包含 9-11个氨基酸残基的存活蛋白衍生肽对于下列HLA等位基因的结合HLA-A1、HLA-A3、 HLA-All和HLA-B7。另外，利用也如上所述的ELISP0T试验测试了几种肽引发CTL免疫反 应的能力。结果，包括前面实施例中所获得的结果的概述在下面表4中给出表4.所诜择的存活蛋白衍牛肽的C=和ELISP0T数据 1通过ELISP0T观察到的一名淋巴瘤患者(HEM34)中针对肽Surl 12-120的反应。 ”通过ELISP0T检测到的3名淋巴瘤患者(HEM9、11、34)中针对肽Sur53_62的反应。iv通 过ELISP0T观察到的黑素瘤患者(FM-TIL95)中的弱反应。vii通过ELISP0T观察到的黑素 瘤患者(PM6)中针对Surll2-121的反应，该反应在转移的淋巴结悬液中最明显，而在来自 原发肿瘤的TIL和PBL中较弱。viii通过ELISP0T在CLL患者(CLL9)中观察到针对肽Sur6_14的反应，并在淋巴 瘤患者(HEM21)中观察到较弱的反应(数据未显示)。实施例5利用存活蛋白衍生肽作为免疫原的治疗试验方法MM用经修饰的HLA-A2限制性存活蛋白表位，即surlM2肽对5名严重预处理的IV 期黑素瘤患者接种，所述表位由自愿使用(in a compassionateuse setting)的自体树 突细胞提呈。如通过ELISP0T试验所测的，4名患者产生针对此表位的强T细胞反应。而 且，原位肽/HLA-A2多聚体染色揭示出存活蛋白反应性细胞浸润到内脏和软组织转移瘤 (metastases)中。显著地，未观察到接种相关的毒性。这些数据证实诱导针对存活蛋白的 T细胞反应，甚至在晚期黑素瘤患者中诱导也是可行的，且这些接种是良好耐受的。材料与方法患者合格标准和治疗方案所有临床方法均根据赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)且在治疗前为所 有患者提供知情同意。当至少两种不同的化学的、免疫的或化学免疫治疗后VI期皮肤或血 管膜黑素瘤患者的病情仍然恶化时，他们适于用来研究。另外，患者必须18岁或以上，表达 HLAA女0201并患有通过头颅、胸部和腹部的计算层析X射线照相术扫描证实的可测量的 疾病。患者的Karnofsky指数必须为60%或更好。接种前的4周内不允许有全身的化学、 和/或免疫疗法。重要的排除标准是CNS转移、主动自身免疫或传染性疾病、妊娠和哺乳、 以及显著的精神异常的证据。肽脉冲的树突细胞如前所述产生(82)。简言之，将来自白细 胞除去法(Ieukapheresis)的 PBMCs 在 Lymphopr印TM(Nycomed Pharma)上分离，以等分试 样冷冻并储存在液氮中。接种前的一周，将PBMCs解冻、洗涤并培养在含有庆大霉素、谷氨 酰胺和热灭活的自体血浆的培养基中。在第1和第5天，加入IL-4和GM-CSF。为分化成熟 的DCs，在第6天加入TNF-Y和前列腺素E2。在第7天，将显示出成熟DCs的表型和形态
40学特征即面纱(veiled)外观和=75%的CD83表达的细胞用经修饰的衍生自存活蛋白的 HLA-A2 限制性存活蛋白 96_1(14 表位 LMLGEFLKL(SEQ ID NO 10) (Clinalfa 瑞士)14 脉冲。只 有当第1和第5天取自培养物的样品的微生物测试证明是无菌的，才能将细胞用于接种。对于前两次接种，对患者以七天间隔进行接种，然后以28天间隔进行进一步的接 种。将总共10-20X 106个成熟的存活蛋白96_1(14脉冲的DCs悬浮在含有人血清白蛋白 的PBS中，并以每个注射部位1. 5X IO6个DCs等分试样在靠近局部淋巴结的大腿的腹内侧 区域进行皮内注射。引流(draining)淋巴结被除去和/或辐射过的四肢除外。在不存在 患者健康状态严重恶化或出现CNS转移的情况下，5次接种后重复白细胞除去法。临床和免疫反应的测量接种前和接种后每三个月或如果有疾病发展的严重临床病征时，进行CT扫描。为 检测存活蛋白96-1(14特异性的IFN- γ释放，每三个月利用PBMCs通过ELISP0T试验监视免 疫反应。为增加ELISP0T试验的灵敏度，在10 μ M肽存在下，在24孔板(Nunc，丹麦)中 以每mil X IO6个细胞的浓度体外刺激PBMCs —次，所述细胞存在于添加了 5%热灭活的人 血清和 2mM L-谷氨酰胺的 X-vivo 培养基(Bio ffhittaker, ffalkersville, Maryland)中。 两天后，加入40IU/ml的重组白介素-2(IL-2) (Chiron, Ratingen，德国)。10天后测试细 胞反应性。为此，用抗IFN-Y抗体(I-DlKMabtechJ^W)包被硝酸纤维素底的96孔板 (Multiscreen MAIP N45, Millipore, Glostrup，丹麦)。以每孔 200μ1 X-vivo 培养基中 IO4-IO5个细胞加入淋巴细胞连同IO4个T2细胞和终浓度为2μ M的相应肽。在37°C下过 夜孵育和两次洗涤后，加入生物素化的检测抗体(7-B6-1-生物素，Mabtechj^W )，利用碱 性磷酸酶-抗生物素蛋白连同各自的底物(GibcoBRL)显现其特异性结合。当暗紫色斑点 出现时终止此反应，所述斑点利用AlphaImager系统(Alpha Innotech，San Leandro, CA, 美国)来定量。还通过多聚化存活蛋白96_1Q4/HLA-A * 0201复合体在接种部位以及内脏、软组织 或皮肤转移瘤原位追踪了存活蛋白96-1M/HLA-A女0201反应性⑶8+T淋巴细胞。在所有患者 中皮内注射24小时后将免疫部位切除，如果容易得到，只将选定患者(患者KN和GB)中的 转移性病灶除去，或在治疗目的(curative intent)中除去(患者WW)。对于多聚体肽/MHC 复合体的染色方法最近已有描述(68)。通过在HLA-A 0201胞外结构域(残基1-275)的 5’端引入酶促生物素化识别位点来产生多聚化的存活蛋白96_1(i4/HLA-A女0201复合体。通 过大小 阻(Sephadex G25，Pharmacia,Erlangen，德国)禾口离子交换(mono—Q，Pharmacia) 层析来纯化重组蛋白质，并在各自肽和β 2-微球蛋白存在下通过稀释使所述重组蛋白质 折叠。在S印hadex G25柱上凝胶过滤后，用连接到葡聚糖分子的链霉亲和素-FITC(由丹麦 哥本哈根DAKO的L. Winther友情提供)将所述蛋白质多聚化以产生多价的HLA-葡聚糖复 合体。将各自样品的冷藏切片干燥过夜并随后在冷丙酮中固定5分钟。所有孵育步骤均在 黑暗中室温下如下进行:(i)抗-CD8抗体(1 100，克隆HIT8a，Pharmingen, San Diego, CA)45分钟，(ii)Cy3-连接的山羊抗小鼠(1 500稀释，编号115-165-100，Dianova，汉堡， 德国)45分钟，最后(iii)多聚体75分钟。每步骤之间在PBS/BSA 0.1%中洗涤载玻片两 次10分钟。最后，将载玻片在vectashield中封片并在Leica共焦显微镜(TCS 4D, Leica, 曼海姆，德国)下观察。结果
患者特征、毒性和临床发病病程5个极晚期的IV期黑素瘤患者得以参加，两名患有血管膜黑素瘤、一名患有软组 织黑素瘤而剩余两名患有皮肤黑素瘤。由于症状性脑转移的表现，一名患者在两次接种后 取消治疗。其它4名患者接受治疗多达15次接种。一名患者在剩余转移瘤的外科切除术 后在无肿瘤状态下死于心博停止。另一名患者(RW)在10次接种后由于内脏转移的出现而 取消治疗。一名患者在15次接种后继续进行研究。在表5中概述了详细的患者特征、先前 的治疗、接种的次数和存活状态。无较大的毒性发生。因此，血红蛋白、白细胞和血小板以及乳酸脱氢酶、肌酸酐和 胆碱酯酶未受接种治疗的影响(图16)。在注射部位未观察到全身或局部毒性的病征。而 且，未检测到受损伤口的治愈、出血病症、心脏功能异常、脉管炎和炎性肠病。在一名患者 (WW)中，预先存在的肝转移在接种治疗下能够得以稳定，但仍出现了新的肾上腺转移。不 幸的是，此患者由于心搏停止而死亡，尽管治疗性手术后无肿瘤。接种开始后仅4周在患者 PB中检测到脑转移。因此，在仅仅两次DC注射后，不得不将此患者排除在进一步的接种之 外。其它3名患者表现出在他们的一般健康状态下无实质损伤的转移性疾病的慢速发展。 显著地，对于患者KN，能够达到13个月的总体生存(从接种开始到死亡)，尽管在接种开始 时有严重的转移性负荷(load)和快速的疾病发展。患者GB在用存活蛋白肽脉冲的DCs接 种开始后的14个月仍保持在方案中。然而，应该注意，两名患者(RW和GB)都接受过用于 肿瘤控制的其他局部治疗皮下肿瘤的放射疗法(RW)或局部化学疗法(GB)。存活蛋白特异性⑶8+T细胞反应为监视细胞毒性T细胞反应的动力学，通过IFN- γ的ELISP0T试验测试接种前和 接种后三个月所获得的PBMCs对于经修饰的存活蛋白96_1(14表位的反应性。分析前，为增加 试验的灵敏度在体外刺激PBMCs —次。在所有4名所测试的患者中，存活蛋白96_1(14反应性 T细胞的诱导是明显的(图17)。针对其它HLA-A女0201限制性存活蛋白肽，即未修饰的 存活蛋白96_1(14和邻近的Sur9表位的反应性分析证实了在两名患者(KN和RW)中针对这些 肽的T细胞反应(数据未显示)。在外周血液中肿瘤特异性T细胞反应测量的预后和临床价值已被反复置疑；因 此，我们还在原位通过肽/MHC多聚体染色，测试了肿瘤浸润淋巴细胞中存活蛋白96_1(14/ HLA-A 0201反应性⑶8+T淋巴细胞的存在。为证实此方法，我们首先分析了来自24小时 内发生在接种部位的迟发型超敏反应的组织样品。此分析证实了早期观察肽脉冲的DC的 皮内注射诱导强烈的肽特异性炎性T细胞浸润。随后，将肽/MHC多聚体染色方法应用于软 组织和内脏转移瘤，显示了在⑶8+浸润中存活蛋白96_1Q4/HLA-A 0201反应性细胞的存在。 此观察表明接种不仅诱导具有预期特异性的T细胞，而且赋予它们必要的归巢(homing)能 力。
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权利要求
衍生自存活蛋白的MHC I类限制性表位肽，所述表位具有至少一种下列特征(i)能够以一定亲和力结合限制该表位的I类HLA分子，其中所述亲和力使用HLA稳定化测定法测定以能够半数最大回收I类HLA分子的肽量(C50值)表示最多为50μM，(ii)能够以每104个PBLs至少1个的频率引发癌症患者的PBL群体中的产生INF γ的细胞，所述频率可以通过ELISPOT试验确定，和/或(iii)能够原位检测肿瘤组织中与所述表位肽起反应的CTLs。
2.根据权利要求1的肽，所述肽具有选自SEQID NO 36,SEQ IDNO :6_8、18_20、22_27、 29-52,54-62 和 66-71 的序列。
3.根据权利要求1或2的肽，所述肽具有选自CPTENEPDL(SEQ IDNO 6)、EPDLAQCFF (SEQ ID NO 7)、CPTENEPDY(SEQ ID NO 8)、EPDLAQCFY(SEQ ID NO 9)、LPPAffQPFL(SEQ ID NO 18)、QPFLKDHRI (SEQ ID NO 19)、QFEELTLGEF (SEQ ID NO 27)、QTEELTLGEF (SEQ ID NO 34)、FTELTLGEF(SEQ ID NO :36)、FSELTLGEF(SEQ ID NO :37)、MAEAGFIHY(SEQ ID NO :38)、 PTENEPDLAY (SEQ ID NO :39)、ELTLGEFLK (SEQ ID NO :43)、KIAKETNNK (SEQ ID NO :44)、 KIAKETNNKK (SEQ ID NO 51), TLPPAffQPK (SEQ ID NO :54)、LLQCFFCFK (SEQ ID NO :56)、 RISTFKNWPK(SEQ ID NO :58)、ILKETNNKKK(SEQ ID NO :59)、TIRRKNLRK(SEQ ID NO :60)、 LAQCFFCFK (SEQ ID NO :42)，DLAQCFFCFK (SEQ ID NO 47)的序列。
4.根据权利要求1-3中任意一项的肽，所述肽具有SEQID N0:36所示的肽。
5.根据权利要求1-4中任意一项的肽，其具有最多为30μΜ的C5tl值。
6.根据权利要求1-5中任意一项的肽，其具有最多为20μΜ的C5tl值。
7.根据前述权利要求任意一项的肽，其含有至多20个氨基酸残基。
8.根据前述权利要求任意一项的肽，其含有至多12个氨基酸残基。
9.根据前述权利要求任意一项的肽，其含有至多10个氨基酸残基。
10.根据前述权利要求任意一项的肽，该肽为九肽或十肽。
11.根据前述权利要求任意一项的肽，该肽为哺乳动物物种的存活蛋白的天然序列。
12.根据权利要求11的肽，其衍生自人存活蛋白。
13.根据前述权利要求任意一项的肽，该肽通过替换、缺失或添加至少一个氨基酸残基 而衍生自存活蛋白的天然序列。
14.根据前述权利要求任意一项的肽，其能够以每IO4个PBLs至少10个的频率在癌症 患者的PBL群体中引发产生INF-γ的细胞。
15.根据前述权利要求任意一项的肽，该肽能够在患有表达存活蛋白的癌症疾病患者 的PBL群体中引发产生INF-γ的细胞。
16.根据权利要求7的肽，其中癌症疾病选自包括慢性淋巴细胞性白血病和慢性髓性 白血病的造血恶性肿瘤、黑素瘤、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌和前列腺 癌。
17.根据前述权利要求任意一项的肽，该肽能够在患有癌症疾病的患者的PBL群体中 引发产生INF-Y的细胞，所述产生INF-Y的细胞具有针对癌细胞系的存活蛋白表达细胞 的细胞毒性效应，所述癌细胞系包括选自乳腺癌细胞系MCF-7和黑素瘤细胞系FM3的细胞 系。
18.药物组合物，其含有根据权利要求1-17任意一项的肽。
19.根据权利要求18的药物组合物，所述药物组合物包含两种或多种衍生自存活蛋白 的MHC I类限制性表位肽，每种表位肽与不同的HLA分子特异相互作用并且具有至少一种 下列特征(i)能够以一定亲和力结合限制该表位的I类HLA分子，其中所述亲和力使用HLA稳定 化测定法测定以能够半数最大回收I类HLA分子的肽量(C5tl值)表示最多为50 μ Μ,(ii)能够以每IO4个PBLs至少1个的频率引发癌症患者的PBL群体中的产生INF-γ 的细胞，所述频率可以通过ELISP0T试验确定，和/或(iii)能够原位检测肿瘤组织中与所述表位肽起反应的CTLs。
20.根据权利要求19的药物组合物，其中每种表位肽与MHCI类HLA-A分子、MHC I类 HLA-B分子或MHC I类HLA-C分子特异相互作用。
21.根据权利要求20的药物组合物，其中所述MHCI类HLA-A分子包括HLA-Al、 HLA-A2、HLA-A3、HLA-A9、HLA-AlO, HLA-AlU HLA-Awl9, HLA-A23 (9)、HLA-A24 (9)、 HLA-A25 (10)、HLA-A26 (10)，、HLA-A28、HLA-A29 (wl9)、HLA-A30 (wl9)、HLA-A31 (wl9)、 HLA-A32 (wl9)、HLA_Aw33 (wl9)、HLA_Aw34 (10)、HLA_Aw36、HLA_Aw43、HLA_Aw66 (10)、 HLA-Aw68(28)、HLA—A69(28)。
22.根据权利要求20或21任一项的药物组合物，其中所述MHCI类HLA-B分子包括 下面的任一种HLA-B5、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B12、HLA-B13、HLA-B14, HLA-Bl5, HLA-B16, HLA-Bl7, HLA-B18, HLA-B21、HLA_Bw22、HLA-B27、HLA-B35、HLA-B37、HLA-B38、HLA-B39、 HLA-B40、HLA-Bw41、HLA-Bw42、HLA-B44、HLA-B45、HLA_Bw46 和 HLA_Bw47。
23.根据权利要求20-22任一项的药物组合物，其中所述MHCI类HLA-C分子包括下面 的任一种HLA-Cw 1、HLA-Cw2、HLA-Cw3、HLA-Cw4、HLA_Cw5、HLA_Cw6、HLA_Cw7 和 HLA_Cwl6。
24.根据权利要求18-23任一项的药物组合物，其中所述两种或多种衍生自存活蛋白 的MHC I 类限制性表位肽具有选自:SEQ ID NO 36、SEQID NOs 1-10、12_20、22-27、29_52、 54-62和66-71的序列。
25.根据权利要求24的药物组合物，其中所述两种或多种衍生自存活蛋白的MHC I 类限制性表位肽具有选自:FLKLDRERA (SEQ ID NO 1)、TLPPAffQPFL (SEQ ID NO :2)、 ELTLGEFLKL(SEQ ID NO :3)、LLLGEFLKL (SEQ ID NO :4)、LMLGEFLKL (SEQ ID NO :5)、 LTLGEFLKL (SEQ ID NO 10), LPPAffQPFL (SEQ ID NO 18)、CPTENEPDL (SEQ ID NO :6)、 EPDLAQCFF(SEQ ID NO :7)、CPTENEPDY (SEQ ID NO :8)、EPDLAQCFY (SEQ ID NO :9)、 QFEELTLGEF (SEQ ID NO :27)、QTEELTLGEF (SEQ ID NO :34)、FTELTLGEF (SEQ ID NO :36)、 FSELTLGEF (SEQ ID NO :37)、MAEAGFIHY (SEQ ID NO :38)、PTENEPDLAY (SEQ ID NO :39)、 ELTLGEFLK(SEQ ID NO :43)、KIAKETNNK (SEQ ID NO :44)、KIAKETNNKK(SEQ ID NO :51)、 TLPPAffQPK (SEQ ID NO :54)、LLQCFFCFK (SEQ ID NO :56)、RISTFKNWPK (SEQ ID NO :58)、 ILKETNNKKK(SEQ ID NO :59)、TIRRKNLRK(SEQ ID NO :60)、LAQCFFCFK(SEQ ID NO :42)、 DLAQCFFCFK(SEQ ID NO 47) ,LPPAffQPFL(SEQ ID NO :18)、QPFLKDHRI (SEQ ID NO 19)的序 列。
26.根据权利要求18-25任一项的药物组合物，其还含有免疫原性蛋白质或者肽片段， 所述蛋白质或肽片段选自不属于或衍生自存活蛋白蛋白质家族的蛋白质或者肽片段。
27.根据权利要求26的药物组合物，其中所述不属于或衍生自存活蛋白蛋白质家族的蛋白质或肽片段是参与调节细胞程序性细胞死亡的蛋白质或其肽片段。
28.根据权利要求26或27的药物组合物，其中所述不属于或衍生自存活蛋白蛋白质家 族的蛋白质或其肽片段是Bcl-2或其肽片段。
29.根据权利要求26或27的药物组合物，其中所述不属于或衍生自存活蛋白蛋白质家 族的蛋白质或其肽片段是IAP蛋白质家族成员或其肽片段。
30.根据权利要求29的药物组合物，其中所述IAP蛋白质家族成员是ML-IAP。
31.根据权利要求26、27、29和30任一项的药物组合物，其中所述不属于或衍生自存 活蛋白蛋白质家族的蛋白质或其肽片段选自SEQ IDNO 75,SEQ ID NO 76、SEQ ID NO :77、 SEQ ID NO78,SEQ ID NO 79,SEQ ID NO80,SEQ ID N0:81、SEQ ID NO 82,SEQ ID NO: 83、SEQ IDNO :84、SEQ ID NO :85。
32.根据权利要求18-31任一项的药物组合物，其包含HLAI类和HLAII类限制性表位。
33.根据权利要求18-32任一项的药物组合物，其包含佐剂。
34.根据权利要求18-32任一项的药物组合物，其是用于先体外后体内或原位诊断 PBLs中或肿瘤组织中存活蛋白反应性T细胞的存在的组合物。
35.多表位疫苗，其包含权利要求1-17任一项的肽。
36.根据权利要求35的多表位疫苗，其包括依赖于给定患者的组织类型的存活蛋白衍 生的肽表位的组合。
37.根据权利要求35或36的多表位疫苗，其中疫苗能够引发针对其中表达存活蛋白的 癌症疾病的免疫反应。
38.根据权利要求37的多表位疫苗，其中癌症疾病选自包括慢性淋巴细胞性白血病和 慢性髓性白血病的造血恶性肿瘤、黑素瘤、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌和 前列腺癌。
39.根据权利要求35-38任一项的多表位疫苗，其中疫苗在接种的受试者中引发产生 具有针对癌细胞的细胞毒性效应的效应T细胞。
40.权利要求1-17中任意一项所定义的肽用于制备药物的用途，所述药物与常规癌症 治疗如放射疗法或化学疗法组合用于治疗癌症。
全文摘要
本发明涉及衍生自肿瘤相关抗原存活蛋白的MHC I类限制性肽，此肽能够以高亲和力结合I类HLA分子，能够在癌症患者的PBL群体中引发产生INF-γ的细胞，并且能够原位检测肿瘤组织中的细胞毒性T细胞，还涉及含有所述肽的治疗和诊断组合物和其用途。
文档编号A61K38/00GK101906148SQ20101011956
公开日2010年12月8日 申请日期2004年1月30日 优先权日2003年1月30日
发明者E·P·T·施特拉腾, M·H·安诺生 申请人:苏瓦克有限公司