专利名称：促肝细胞生长素肠溶胶囊的制作方法
技术领域：
本发明涉及促肝细胞生长素，尤其是促肝细胞生长素的肠溶胶囊，及其制备工艺 和用途。
背景技术：
重型病毒性肝炎病理学认为，重型肝炎指在急剧而广泛的肝细胞变性、坏死及高 度肝功能损害的基础上，出现以肝性脑病为主要表现的肝炎。目前认为病毒蛋白及其变异、 宿主CTL反应、巨噬细胞、多种细胞因子、肝细胞凋亡、凝血系统因素是引起重型肝炎的分 子机制。肝炎病毒在一定条件下引起宿主免疫反应异常，使肝细胞大量坏死和严重变性，从 而导致肝细胞功能的衰竭，由此引起的内毒素血症，进一步加重肝细胞损害，使肝衰竭更为 严重，成为后阶段的重要致病因素。促肝细胞生长素(HGF)治疗理论认为促肝细胞生长素具有特异刺激肝细胞合成 增加，有丝分裂加速，使肝细胞再生能力增强，肝脏功能和临床症状得到恢复和改善，以及 激发机体的免疫状态等作用。其具体机理包括1.刺激肝细胞的合成，促进肝细胞的再生； 2.抑制肿瘤坏死因子的活性，促进各种肝炎，尤其是重症肝炎和慢性活动性肝炎患者的康 复；3.增强枯否氏细胞功能，从而增强人的免疫力；4.对肝细胞膜起保护作用，使肝损伤得 到有效恢复；5.具有抗纤维化作用，抑制肝脏纤维化。临床实验也证明在一般治疗基础上 采用促肝细胞生长素辅助治疗具有明显疗效。目前市场上促肝细胞生长素常用的剂型为注射剂和颗粒剂，但这两种剂型分别存 在各自的缺点注射剂在临床上应用多年，具有良好的治疗效果，但其缺点也是显而易见1.静 脉注射使用注射器卫生要求高时，不良反应时有发生，且需要在医生监护下使用，对医疗条 件落后的地区应用困难；2.每天的静脉注射给患者带来了无尽的痛苦以及生活的不便，在 我国，肝病人数众多，相当一部分在家接受长期治疗，注射剂型使用不便，对于不同类型的 病人已有一定的局限性；3.价格较高(约2268 3427元/疗程，4 6周一疗程计)。颗粒剂使用安全，方便。其缺点在于1.须温水溶化后冲服，过热会影响其中的多 肽活性，影响药效；2.颗粒剂是以溶液形态通过胃部，活性物质易被胃液中胃酸、胃酶酶解 而降低活性，药理作用由此受到影响，大大削弱治疗效果；3.由于以上原因，据文献报道， 颗粒剂口服后生物利用度仅4. 8%，使其用药剂量远远大于注射剂，疗程周期延长，相对价 格大大提高；4.病人服用时难以忍受药物溶解产生的腥味，极易引发恶心、呕吐现象，因此 颗粒剂的使用受到很大的限制，尽管该剂型上市多年却始终未能打开市场。
发明内容
本发明针对以上剂型的不足，提出一种促肝细胞生长素肠溶胶囊，其活性高，副作 用小。同时还提出了该肠溶胶囊的制备工艺，以及其用途。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案一种促肝细胞生长素肠溶胶囊，由促肝细胞生长素和药学上可接受的肠溶胶囊辅料组成。由于促肝细胞生长素在胃内极其不稳定，生物活性会降低至原来的三分之一左 右，而在小肠中生物活性基本保持不变。本发明促肝细胞生长素肠溶胶囊，经口服后，通常 须进入小肠后才得以崩解，其中的药效成分经十二指肠吸收，直接进入门静脉，发挥全身药 效。这就避免了胃酸、胃酶对活性成分的破坏，也减少了应用注射剂带来的诸多不便和安全 急 ^^ ο本发明的另一目的，还提供了上述肠溶胶囊的制备工艺，包括以下步骤a、取促肝细胞生长素溶液，浓度为15 30mg/ml ；b、将步骤a的水溶液通过凝胶色谱层析柱，收集活性刺激指数大于4. 5峰的洗脱 液；C、将步骤b收集的洗脱液浓缩、冷冻干燥；d、将步骤c制得的促肝细胞生长素干粉，与药学上可接受的肠溶胶囊辅料，制成 促肝细胞生长素肠溶胶囊。所述凝胶色谱层析柱层析过程为i、装柱将凝胶在纯水中浸泡24小时以上，水洗滤干后，将溶胀的凝胶与水按体 积比3 1混合，经超声波脱气后湿态装柱；装柱要求无气泡、无裂纹、填料分布均勻；柱的 径高比为1 5 20，用3 5个柱体积纯水平衡层析柱；ii、系统连接将装好的层析柱下端出液口与紫外检测器进口连接；层析柱上端 进液口与泵系统连接；iii、加样取促肝细胞生长素溶液小心加于该层析柱的上表面，上样体积为柱床 体积的2% 25% ；打开柱下端出口，使促肝细胞生长素溶液进入凝胶内；iv、洗脱在层析柱的上表面上加入水，保持液位高度为3 4cm，调节洗脱速度为 30ml/min ；ν、收集在214nm紫外检测器下在线监测，分段收集活性刺激指数大于4. 5峰的洗 脱液。 本发明最后还提供了上述肠溶胶囊在制备治疗肝脏疾病的药物中的用途。
由于促肝细胞生长素溶液含有多种多肽、核苷酸、氨基酸等物质，为确保药品的安 全性，本发明采用凝胶色谱层析法提取纯度较高的促肝细胞生长素。凝胶阻滞层析方法利 用凝胶层析介质的网状结构，根据分子大小进行分离。其基本原理是含有不同尺寸大小的 分子进入层析柱后，较大的分子不能通过孔道扩散进入凝胶珠体内部，而与流动相一起流 出层析柱；较小的分子可通过部分孔道，更小的分子可通过任意孔道扩散进入珠体内部。这 种颗粒内部扩散的结果，使小分子向柱下的移动减慢，从而样品根据分子大小的不同依次 按一定顺序从柱内流出，一般是大分子先流出来，小分子后流出来，从而达到分离的目的。 经过凝胶色谱层析法处理前后的产品，通过紫外检测器进行检测发现，处理后的产品中杂 质减少，如附图中的图1(处理前产品检测)和图2(处理后的产品检测)所示，杂质为图1 中峰1和峰8，图2中明显不存在图1中的杂质峰，因此产品纯度提高；同时对得到的产品 进行活性检测，检测方法为促肝细胞生长素活性测定法(MTT法)(见附件)，测定结果如表 2所示，处理后的产品的活性明显较市售的促肝细胞生长素高，提高了 70%左右。
图1是常规促肝细胞生长素溶液的紫外光谱图；图2是经过凝胶色谱层析柱处理后的促肝细胞生长素溶液的紫外光普图。
具体实施例方式一种促肝细胞生长素肠溶胶囊，由促肝细胞生长素和药学上可接受的肠溶胶囊辅 料组成。本发明促肝细胞生长素肠溶胶囊，经口服后，由于肠溶胶囊一般只会在进入到小 肠后才崩解，其中的药效成分经十二指肠吸收，直接进入门静脉，发挥全身药效。这就避免 了胃酸、胃酶对活性成分的破坏，也减少了应用注射剂带来的诸多不便和安全隐患。本发明促肝细胞生长素肠溶胶囊的药代动力学特征为本品口服后，集中分 布于全身多种组织器官，以肝和胃含量最高，促肝细胞生长素在体内分布容积较小，为 1. 4士0. 33L，其在人体内前40min衰减较快，基本快慢两时相，a -半衰期为19. 7士2. 9min,
半衰期为260士57min，由此提示药物排泄迅速，在体内不易形成积蓄，不会在体内进行 再分布。上述促肝细胞生长素肠溶胶囊的制备工艺，包括以下步骤a、取促肝细胞生长素溶液，浓度为15 30mg/ml ；b、将步骤a的水溶液通过凝胶色谱层析柱，收集活性刺激指数大于4. 5峰的洗脱 液；c、将步骤b收集的洗脱液浓缩、冷冻干燥；d、将步骤c制得的促肝细胞生长素干粉，与药学上可接受的肠溶胶囊辅料，制成 促肝细胞生长素肠溶胶囊。优选的，步骤b中凝胶色谱层析柱装填的为聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖凝胶、琼 脂糖凝胶或聚苯乙烯凝胶。1、聚丙烯酰胺凝胶人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联 成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。交联剂 越多，孔隙越小；2、交联葡聚糖凝胶S印hadex G交联葡聚糖；S印hadex LH-20，是_S印hadex G-25 的羧丙基衍生物；3、琼脂糖凝胶依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密 依靠琼脂糖的浓度；4、聚苯乙烯凝胶具有大网孔结构，可用于分离分子量1600到40，000，000的生物 大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好。上述步骤d具体可为①、将干燥后的促肝细胞生长素制品用粉碎机进行机械粉碎，制成促肝细胞生长 素干粉。②、添加稀释剂根据促肝细胞生长素干粉的多肽含量计算稀释剂(淀粉)用 量，使稀释后的促肝细胞生长素干粉的多肽含量控制在促肝细胞生长素干粉重量的15 25%。将添加稀释剂后的促肝细胞生长素干粉进行均勻混合。
③、灌装将添加稀释剂、混合均勻的促肝细胞生长素干粉灌装至空心胶囊中，最 终完成促肝细胞生长素肠溶胶囊的制备。下面结合具体实施例对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释 性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。上述制备工艺得到的促肝细胞生长素肠溶胶囊，其中存在凝胶色谱层析柱的不 同，对得到的产品按照MTT法检测，结果如下表1 :表 1 采用上述方法得到的促肝细胞生长素肠溶胶囊，高分子量物质被控制在0. 5%以 内。用此工艺制备的促肝细胞生长素肠溶胶囊，其得率为80%以上，活性刺激指数稳定在 7.0左右，高出国家标准4.0约70%。将本发明制成的促肝细胞生长素肠溶胶囊与常规的促肝细胞生长素的其它剂型， 如注射剂和颗粒剂，进行活性比较，如下表2 表2 促肝细胞生长素肠溶胶囊，口服后不会受胃酸、酶的破坏(试验证明经胰酶处理2 小时仍不失活性)，本品在肠道中集中释放，能够在肠道中保持稳定，使之达到局部高浓度， 在小肠中保持稳定的活性成分易被高效吸收，从而直接进入淋巴系统和血液循环，显著提 高了本品生物利用度和药效。 本发明的肠溶胶囊剂生物活性普遍比上市促肝细胞生长素注射剂高40 %，且更加稳定。本发明促肝细胞生长素中高分子量物质非常稳定(低于0. 5% )，国家标准规定不 得过5. 0%，为产品安全性提供了可靠保障。促肝细胞生长素肠溶胶囊性价比高，解决了注射剂价格高昂的问题。按生物利用 度计算，在同等药效的情况下本品的价格只是注射剂型的三分之一。促肝细胞生长素肠溶胶囊的药效试验例1、病例来源上海市公共卫生临床中心门诊；明确诊断的慢性乙型肝炎及乙肝肝硬化病人。2、诊断标准依据《病毒性肝炎防治方案》(2000年)3、纳入标准(1)、ALT < 10倍正常值上限；(2)、TBIL < 3倍正常值上限；(3)、凝血酶原活动度彡60%。4、治疗方案试验组常规保肝治疗+本发明实施例2促肝细胞生长素肠溶胶囊50mg/粒；每天 2粒，连续服用12周；对照组常规保肝治疗50mg/粒；其中，常规保肝治疗为a、护肝宁片(上海玉安药业)，每天4-5片；和b、茴三硫片25mg/片，每天1片；两组治疗期间不再加用其他降酶药物，相关基础治疗和抗病毒治疗不限。表3
7 5、观察指标①、分别于治疗0、4、8、12周时检测肝功能的下述指标丙氨酸氨基转移酶(ALT)天冬氨酸氨基转移酶(AST)总胆红素(TBIL)白蛋白(ALB)②、不良反应观察临床各种不良反应如胃肠道反应，过敏等；监测肾功能、血常规、血糖等指标。6、统计学处理统计方法计量资料的配对t检验7、检测结果分别如下各表7. 1治疗前后肝功能各项指标变化如下表4 表 4 注* 与同组治疗前比较P < 0. 05 ；Δ 治疗后试验组与对照组比较P < 0. 05。从上表可以看出1、两组患者经过治疗12周后，肝功能指标ALT、AST、TBIL及ALB均较治疗前明显 改善(P < 0. 05)。2、血清ALT、AST活性及TBIL 治疗8周时，试验组的已基本恢复正常，而对照组的于治疗后12周时基本恢复正常。3、血清ALT、AST、ALB 试验组血清ALT、AST降低幅度及血清ALB含量升高幅度均 比对照组更为明显(P<0. 05)。因此，两组比较ALT、AST、TBIL的结果a、试验组及对照组患者肝功能指标两组均有改善b、试验组肝功能改善情况优于对照组c、试验组ALT、AST、TBIL指标降低或复常早于对照组提示促肝细胞生长素肠溶胶囊具有降低血清ALT、AST活性及TBIL含量，以及缩短 病程；加用促肝细胞生长素肠溶胶囊组，肝功能复常时间更短。再根据两组比较白蛋白ALB的结果对照组治疗前后ALB无明显改善；试验组治 疗8，12周时ALB较治疗前显著提高，提示促肝细胞生长素肠溶胶囊具有提高患者白蛋白功 效。7. 2两组治疗过程中均未见明显恶心呕吐等消化道症状、过敏等不良反应。7. 3两组治疗前后肾功能、血糖比较(X士S) 注试验组及对照组在治疗前及治疗中各时间点血糖差别无统计学意义(P > 0. 05)。综上所述，本发明的促肝细胞生长素肠溶胶囊，具有促进肝细胞修复和再生，显著 提高白蛋白的功能，其应用优势如下疗效确切——护肝保肝作用明显；药品特点——肠道吸收综合疗效不亚于注射剂；用药安全——临床研究中未见不良反应。附促肝细胞生长素活性测定法(MTT法)试剂的配制0. 01mol/L磷酸盐缓冲液(PH7. 3)取氯化钠8. 0g、氯化钾0. 2g、磷酸 氢二钠(Na2HP04) 1. 15g及磷酸二氢钾0. 2g，加超纯水1000ml溶解后，高压灭菌。RPMI-1640培养液取碳酸氢钠2. 00g及RPMI-164010. 0g加超纯水约800ml溶解后，用lmol/L盐酸溶液调节pH值至6. 9，加超纯水稀释至1000ml，过滤除菌。10 %小牛血清培养液取上述RPMI-1640培养液900ml，加已灭活的小牛血清 100ml。0. 25%胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二钠消化液取0. 25g胰蛋白酶及0. 02g乙二胺四 醋酸二钠，加0. 0lmol/L磷酸盐缓冲液IOOml溶解后，用5. 6%碳酸氢钠调节pH值至7. 2， 过滤除菌，_20°C保存。噻唑蓝(MTT)溶液取MTT50mg，加0. Olmol/L磷酸盐缓冲 液IOml溶解后，过滤除菌 (保存于冷处，使用不超过两周)。操作法供试品溶液的制备取供试品适量，用RPMI-培养液制成每Iml中含多肽100 μ g 的溶液。测定法用10%小牛血清培养液培养SMMC-7721细胞至对数增长期，用0. 25% 胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二钠消化液消化，加10%小牛血清培养液稀释至每Iml中含 (2. 5X IO4) (5X104)个细胞，将上述细胞悬液在96孔细胞培养板上铺板，每孔ΙΟΟμΙ， 其中留3孔加10%小牛血清培养液100μ 1作为空白对照，置37°C，5%二氧化碳饱和水 汽培养箱中培养3 4小时使其贴壁。供试品组，每孔加供试品溶液100 μ 1，每批供试品 均做3孔，细胞对照组和空白对照组每孔分别加RPMI-1640培养液100 μ 1，置37°C，5 % 二氧化碳饱和水汽培养箱中培养48小时，结束培养前4小时取出培养板，吸去培养液，每 孔加入0. Olmol/L磷酸盐缓冲液(pH7. 3)洗一次，然后在每孔中加入上述磷酸盐缓冲液 (pH7. 3) 100 μ 1和MTT溶液20 μ 1，继续培养。培养结束后，吸出培养液，每孔加入100 μ 1 二甲基亚砜，摇勻，在酶标仪上以550nm的波长处分别测定其吸收度A值。
供试品组3孔吸收度平均值(At) 一空白对照组3孔吸收度平均值 7)
活性刺激指数=-
对照组3孔吸收度平均值d)—空白对照组3孔吸收度平均值 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
权利要求
一种促肝细胞生长素肠溶胶囊，由促肝细胞生长素和药学上可接受的肠溶胶囊辅料组成。
2.如权利要求1所述的促肝细胞生长素肠溶胶囊的制备工艺，包括以下步骤a、取促肝细胞生长素溶液，浓度为15 30mg/ml；b、将步骤a的水溶液通过凝胶色谱层析柱，收集活性刺激指数大于4.5峰的洗脱液；c、将步骤b收集的洗脱液浓缩、冷冻干燥；d、将步骤c制得的促肝细胞生长素干粉，与药学上可接受的肠溶胶囊辅料，制成促肝 细胞生长素肠溶胶囊。
3.根据权利要求2所述的制备工艺，其特征在于步骤a中促肝细胞生长素是从乳猪 肝脏、小牛肝脏或胎牛肝脏中分离提取的。
4.根据权利要求2所述的制备工艺，其特征在于步骤b中凝胶色谱层析柱装填的为 聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶或聚苯乙烯凝胶。
5.根据权利要求2所述的制备工艺，其特征在于所述凝胶色谱层析柱层析过程为i、装柱将凝胶在纯水中浸泡24小时以上，水洗滤干后，将溶胀的凝胶与水按体积比 3 1混合，经超声波脱气后湿态装柱；装柱要求无气泡、无裂纹、填料分布均勻；柱的径高 比为1 5 20，用3 5个柱体积纯水平衡层析柱；ii、系统连接将装好的层析柱下端出液口与紫外检测器进口连接；层析柱上端进液 口与泵系统连接；iii、加样取促肝细胞生长素溶液小心加于该层析柱的上表面，上样体积为柱床体积 的2% 25% ；打开柱下端出口，使促肝细胞生长素溶液进入凝胶内；iv、洗脱在层析柱的上表面上加入水，保持液位高度为3 4cm，调节洗脱速度为 30ml/min ；V、收集在214nm紫外检测器下在线监测，分段收集活性刺激指数大于4. 5峰的洗脱液。
6.根据权利要求5所述的制备工艺，其特征在于步骤iv中，在促肝细胞生长素溶液 恰好流至与凝胶上表面平齐时，关闭层析柱的下端出口 ；用水清洗加样区，共洗涤三次；待 上次清洗液应完全进入凝胶柱内后，再进行下一次洗涤。
7.如权利要求1所述肠溶胶囊在制备治疗肝脏疾病的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种促肝细胞生长素肠溶胶囊，由促肝细胞生长素和药学上可接受的肠溶胶囊辅料组成。还公开了该肠溶胶囊的制备工艺和用途。本发明经过凝胶色谱层析法处理的产品，杂质减少，产品纯度提高；活性明显较市售的促肝细胞生长素高，提高了70％左右。
文档编号A61P1/16GK101869701SQ20101021310
公开日2010年10月27日 申请日期2010年6月30日 优先权日2010年6月30日
发明者俞保彬, 周天琼, 周正兵, 高留根 申请人:杭州华津药业股份有限公司