专利名称：一种墨旱莲有效组分的制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属中药提取物，具体地说涉及从墨旱莲中提取有效组分的制备方法，以及 该有效组分在制备治疗、预防肿瘤药物中的应用。
背景技术：
肿瘤是一种常见病、多发病，其中恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重的一类疾 病。目前业内对恶性肿瘤的治疗主要还是以手术、放疗、化疗为主，但许多化学抗癌药物在 作用于靶细胞时往往累及正常细胞，造成严重的副反应。植物药的遗传毒性不明显，中草药 在抗癌抗突变方面有独特的优势和广阔的应用前景，而且中药在对肿瘤的辅助治疗中也起 到不容忽视的作用。紫杉醇即是典型的从植物中获得的具有良好抗癌活性的天然化合物， 现已开发为抗肿瘤药物。目前我国危害性最为严重的肿瘤为肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、大 肠癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、白血病及淋巴瘤等。特别是肝癌的发生率近年来有所增加。值 得重视，这些肿瘤的病因学、发病学及其防治，均为我国肿瘤研究的重点。寻找高效低毒的 抗癌药物以及抗癌辅助药物是当前肿瘤研究的重要内容。我国药用生物资源十分丰富，其生理活性物质是研究和发现新药先导化学物，开 发新药的天然宝库。目前，我国从天然产物中提取活性物质，用于开发成治疗肿瘤疾病、 安全性好、毒性低的新药还很少，从天然产物中提取活性物质，开发成具有抗肿瘤疗效的新 药，具有重要应用价值和广阔发展前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种墨旱莲有效组分的制备方法，通过以下步骤实现将墨 旱莲药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇，加热提取得提取液，将提取液浓缩成浸膏，用反相硅 胶柱(0DS)对其进行分离，首先用低浓度乙醇作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换高浓 度乙醇作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分 离得到的样品；制备色谱的分离条件色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，收 集溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分。优选的墨旱莲有效组分制备方法，包括下列步骤将墨旱莲药材粉碎后加入 1 0.8 1.2(体积比)的乙酸乙酯和乙醇，加热回流0.8 1.2小时，提取1 3次， 合并滤液得提取液，将提取液浓缩成浸膏，用反相硅胶柱(0DS)对其进行分离，首先用 20% -40% (体积比)的乙醇溶液作为流动相，得洗脱液I，弃之，再用90%-100% (体 积比)的乙醇溶液作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相 色谱继续分离得到的目的物；制备色谱的分离条件为色谱柱为制备柱(Zorbax SB-C18 ； 21. 2mmX 250mm)，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，流速为9 llml/min，柱温为室温，收集溶 液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分。最佳的墨旱莲有效组分制备方法，包括下列步骤将墨旱莲药材粉碎后加入 1 1(体积比)的乙酸乙酯和乙醇，加热回流1小时，提取2次，合并滤液得提取液，将提取液浓缩成浸膏，用反相硅胶柱(ODS)对其进行分离，首先用30% (体积比)的乙醇溶液 作为流动相，得洗脱液I，弃之，再用95% (体积比)的乙醇溶液作为流动相，得洗脱液II， 将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的目的物；制备色谱的分 离条件为色谱柱为制备柱(Zorbax SB-C18 ；21. 2mmX 250mm)，流动相为水和乙腈，梯度洗 脱，流速为lOml/min，柱温为室温。梯度洗脱程序如下0分钟时，流动相为80%的水溶液 和20%的乙腈溶液；4分钟时，流动相为80%的水溶液和20%的乙腈溶液；19分钟时，流动 相为50%的水溶液和50%的乙腈溶液；54分钟时，流动相为5%的水溶液和95%的乙腈溶 液；64分钟时，流动相为5%的水溶液和95%的乙腈溶液。在时间段40. O 44. Omin收集 溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分。
本发明的再一个目的是提供该墨旱莲有效组分在制备治疗、预防肝脏肿瘤药物中 的应用。本发明的墨旱莲有效组分可以作为活性成分，加入药剂学上接受的药物赋形剂或 载体，按照药剂学上记载的方法制成制剂。所制备的药物的制剂形式为液体制剂、固体制 剂、胶囊剂或胶丸剂，给药方式为口服给药或注射给药。本发明的墨旱莲有效组分还可以作为活性成分之一，加入其他抗肿瘤药物，加入 药剂学上接受的药物赋形剂或载体，按照药剂学上记载的方法制成制剂。本发明的有益之处是通过本方法制得墨旱莲有效组分方法简便，质量稳定。且现 有技术中尚未有墨旱莲抗肝脏肿瘤活性的报道，本发明为研发墨旱莲抗肿瘤新药提供一定 ■石出。
具体实施例方式本发明结合下面实施例进一步详细说明本发明的实质内容，该实施例仅用于说明 本发明而并非对本发明的限制。实施例一墨旱莲有效组分的制备将200g墨旱莲药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1 0.8)(体积比)1500ml，加热 提取1次得提取液，将提取液浓缩成浸膏，用反相硅胶柱(ODS)对其进行分离，首先用20% (体积比)乙醇溶液作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换90% (体积比)乙醇溶液作为 流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样 品，制备色谱的分离条件色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱。梯度洗脱程序如 下0分钟时，流动相为80%的水溶液和20%的乙腈溶液；4分钟时，流动相为80%的水溶 液和20%的乙腈溶液；19分钟时，流动相为50%的水溶液和50%的乙腈溶液；54分钟时， 流动相为5 %的水溶液和95 %的乙腈溶液；64分钟时，流动相为5 %的水溶液和95%的乙 腈溶液。在时间段40. O 44. Omin收集溶液，浓缩干燥后得到有效组分。实施例二墨旱莲有效组分的制备将500g墨旱莲药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1 1.2)(体积比)5000ml，加热 提取3次得提取液，将提取液浓缩成浸膏，用反相硅胶柱(ODS)对其进行分离，首先用40% (体积比)乙醇溶液作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换100% (体积比)乙醇溶液作 为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的 样品，制备色谱的分离条件色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱。梯度洗脱程 序如下0分钟时，流动相为80%的水溶液和20%的乙腈溶液；4分钟时，流动相为80%的水溶液和20%的乙腈溶液；19分钟时，流动相为50%的水溶液和50%的乙腈溶液；54分钟 时，流动相为5 %的水溶液和95 %的乙腈溶液；64分钟时，流动相为5 %的水溶液和95 %的 乙腈溶液。在时间段40. 0 44. Omin收集溶液，浓缩干燥后得到有效组分。实施例三墨旱莲有效组分的制备将250g墨旱莲药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1 1)(体积比)2000ml，加热 提取2次得提取液，将提取液浓缩成浸膏，用反相硅胶柱(ODS)对其进行分离，首先用30% (体积比)乙醇溶液作为 流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换95% (体积比)乙醇溶液作为 流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样 品，制备色谱的分离条件色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱。梯度洗脱程序如 下0分钟时，流动相为80%的水溶液和20%的乙腈溶液；4分钟时，流动相为80%的水溶 液和20%的乙腈溶液；19分钟时，流动相为50%的水溶液和50%的乙腈溶液；54分钟时， 流动相为5%的水溶液和95%的乙腈溶液；64分钟时，流动相为5%的水溶液和95%的乙 腈溶液。在时间段40. 0 44. Omin收集溶液，浓缩干燥后得到有效组分。实施例四墨旱莲有效组分制剂取实施例三的墨旱莲有效组分0. 5g与10. 5g聚乙二醇-6000混合均勻，加热熔 融，化料后移至滴丸滴灌中，药液滴至6 8°C液体石蜡中，除油，制得滴丸400粒。实施例五墨旱莲有效组分制剂取实施例三的墨旱莲有效组分0. 5g、葡萄糖4. 5g、硫代硫酸钠0. 9g和蒸馏水1ml， 上述组分混合均勻后，冷冻干燥，分装500支，即得。 实施例六墨旱莲有效组分制剂取降香油1.5g，加入到13ml饱和的羟丙基β -环糊精中，搅拌溶解，滤过，滤液低 温干燥，得降香油和羟丙基环糊精的包合物粉末。除上述降香油合羟丙基环糊精 的包合物粉末外，再取实施例三的墨旱莲提取物0. 5g、甘露醇5. 5g、依地酸钙钠0. 9g和蒸 馏水2ml，上述组分混勻后，冷冻干燥，分装300支，即得。实施例七墨旱莲有效组分制剂取实施例三的墨旱莲有效组分适量用40°C注射用水溶解，加入适量药用载体等渗 齐U，调节溶液的pH值为7. 0-8.0，加注射用水至全量，用超滤器超滤除热源，测定PH值后，用 膜过滤，分装后，高压灭菌，检验、包装，即得。实施例八墨旱莲有效组分制剂取实施例三的墨旱莲有效组分与花生油按2 18的比例水溶式不锈钢搅拌灌中， 同时加入适量明胶和甘油混合，放出再用胶体磨磨浆，磨出的混合液搅拌，制成药液；将甘 油与蒸馏水在40-50°C温度下搅拌混溶，再将甘油液温至80-90°C，取明胶加入其中混合搅 拌，直至全部溶化成胶液，然后在60°C温度下使胶液静置4小时，用制板机制成胶板供制丸 工序使用；将上述制成的药液和胶板送入压丸机制丸，然后在22-25°C温度下吹风4小时作 滚筒定型，又在25-30°C温度下吹风干燥16-20小时，检选合格胶丸，用95%乙醇清洗，在 25-30°C下吹风干燥4小时，即得。实施例九墨旱莲有效组分制剂取实施例三的墨旱莲有效组分适量与微晶纤维素混合均勻，加3%聚维酮乙醇溶 液制软材，过18目筛制颗粒，60°C干燥1小时，整粒，加入滑石粉适量，混勻，压片，即得。
实施例十墨旱莲有效组分的药理实验阴性对照组正常培养条件的等量细胞
阳性对照组D0X (阿霉素4 ii M)细胞株IfepG-2(人肝癌细胞株)，贴壁细胞；培养液90% DMEM(高糖)+10% CS+1 %非必须氨基酸+100U/ml青霉素及链霉素样品配制取实施例三墨旱莲有效组分用二甲基亚砜(DMS0)配置成50iig/ ml, -20°C保存测试步骤96孔板，药物作用(48h)结束后，吸去上清培养液，MTT储备液和完全 培养液以1 10稀释，每孔加入100 iiL。37°C培养箱里孵育4h。去上清培养液，每孔加入 150 uL DMS0溶解结晶，500rpm振荡lOmin，使结晶充分溶解。550nm测定吸光度，结果参见 表1。表 1 计算方法抑制率(％ ) = 100_(筛选组吸光度-空白对照组吸光度)/(阴性对照组吸光 度-空白对照组吸光度)X100结果表明该墨旱莲有效组分的抑制率为96. 13%。
权利要求
一种墨旱莲有效组分的制备方法，通过以下步骤实现将墨旱莲药材粉碎后加入体积比为1∶0.8～1.2的乙酸乙酯和乙醇，加热回流0.8～1.2小时，提取1～3次，合并滤液得提取液，将提取液浓缩成浸膏，用反相硅胶柱对其进行分离，首先用体积比为20％-40％的乙醇溶液作为流动相，得洗脱液I，弃之，再用体积比为90％-100％的乙醇溶液作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的目的物；制备色谱的分离条件为色谱柱为制备柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，流速为9～11ml/min，柱温为室温，收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分。
2.根据权利要求1所述的一种墨旱莲有效组分的制备方法，其特征在于，色谱分离后， 在时间段40. 0 44. Omin收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分。
3.根据权利要求1方法制备获得的墨旱莲有效组分在制备治疗、预防肝脏肿瘤药物中 的应用。
4.根据权利要求3所述的一种墨旱莲有效组分的应用，其特征在于，所制备的药物还 含有制剂允许的药物赋形剂或载体。
5.根据权利要求3所述的一种墨旱莲有效组分的应用，其特征在于所制备的药物还 含有其他抗肿瘤药物。
6.根据权利要求3所述的一种墨旱莲有效组分的应用，其特征在于所述药物的制剂 形式为液体制剂、固体制剂、胶囊剂或胶丸剂。
7.根据权利要求3所述的一种墨旱莲有效组分的应用，其特征在于所述药物的给药 方式为口服给药或注射给药。
全文摘要
本发明提供一种墨旱莲有效组分的制备方法，将药材通过加热提取，浓缩，硅胶柱分离，洗脱，洗脱液浓缩干燥，再用制备液相色谱继续分离，收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分。本发明的墨旱莲有效组分可以作为活性成分，加入药剂学上接受的药物赋形剂或载体，按照药剂学上记载的方法制成制剂。所制备的药物的制剂形式为液体制剂、固体制剂、胶囊剂或胶丸剂，给药方式为口服给药或注射给药。本发明提供的墨旱莲有效组分可在制备治疗、预防肿瘤药物中应用。本发明的制备方法操作简便，质量稳定，且现有技术中尚未有墨旱莲抗肝脏肿瘤活性的报道，为研发墨旱莲抗肿瘤新药提供研究基础。
文档编号A61P35/00GK101856380SQ201010214799
公开日2010年10月13日 申请日期2010年6月29日 优先权日2010年6月29日
发明者吴斌, 瞿海斌, 程翼宇 申请人:浙江大学