专利名称：一种治疗肠道病毒感染引起的疾病的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗肠道病毒感染引起的疾病的药物组合物，具体涉及包括在细胞内阻断病毒mRNA翻译、抑制病毒核酸合成的第一作用剂和通过调节机体免疫应答以获得细胞免疫的第二作用剂组成的药用组合物，属于生物制药领域。
背景技术：
手足口病(Hand-food-mouth disease，HFMD)是全球性传染病，全世界大部分地区均有该病流行的文献报道。1957年，新西兰首次报道该病，从该病中分离出柯萨奇 (coxsackie，Cox)病毒。发现的HFMD病原体主要为Cox A 16型，1972年美国确认HFMD病原体为肠道病毒(enteric virus, EV) 71。此后，EV71感染与CoxA16感染交替出现，成为 HFMD的主要病原体。对HFMD的流行病学研究显示，球流行间隔期为2_3年，20世纪90年代后期，EV71开始在东亚地区流行，其中，1997年在马来西亚和1998年在台湾爆发的HFMD， 合并中枢神经系统症状发生率较高。HFMD传染性强、传播途径复杂、流行强度大、传播快，短时间内可大面积流行，HFMD传染源为病毒，大量病毒存在于患者和健康者咽部、粪便和疱液中，通过飞沫、唾液、粪便、污染的水和食物，经呼吸道和消化道传染。HFMD急性期，病毒在咽部可持续存活1-2周，粪便中持续存活3-5周，最长可达11周，通常以发病后1周内传染性最强。各年龄组虽均可感染HFMD，但常在婴幼儿中造成爆发性流行，多发生于5岁以下小儿，且3岁以下婴儿发病率最高。EV71感染的HFMD临床症状，往往终于CoxA16感染，但EV71感染的临床表现变化大，轻者可无明显全身症状(约71%)，严重者可致死亡(约0.05% )，其中，HFMD合并肺水肿时，死亡率最高，临床预后与EV71病毒毒力、病毒载量及计提免疫功能相关，目前认为，HFMD与病毒的基因型无关。EV71感染造成计提损害，是细胞免疫反应而非体液免疫反应，研究显示，合并肺水肿的HFMD患儿中，反映细胞免疫反应的细胞因子辅助T淋巴细胞 (helper T lymph0Cyte，TH) ( γ-干扰素、白细胞介素1、白细胞介素6和肿瘤坏死因子)等， 明显低于无肺水肿的 HFMD 患儿(Chang LY,Hsiung CA,Lu CY，et al. Status of cellular rather than humoral immunity is correlated with clinical outcome of enterovirus 71. Pediat r Res, 2006,60 (4) :466-471)。细胞免疫功能低下，可延迟病毒清除，导致病毒扩散，造成持续验证反应，最后导致肺水肿，机体免疫功能也发挥重要作用，在细胞免疫发育尚不成熟的HFMD患儿中，若自身细胞免疫弱于体液免疫，感染EV71后有进展为重症HFMD 的倾向。T淋巴细胞亚群是构成机体免疫防疫系统的重要细胞，T淋巴细胞中包括辅助性T 淋巴细胞CD4+和抑制性T细胞⑶8+2个主要亚群，这2类细胞相互变化、调节，可以维持机体内的免疫平衡。CD4+具有调节免疫反应活性、辅助B细胞产生抗体、分泌细胞因子的作用； 而CD8+有免疫抑制和细胞毒性的作用。CD4+、CD8+分别成为MHCII类分子和I类分子的受体，CD4+、CD8+分别出现在具有不同功能亚群的T细胞表面。在同一个T细胞表面只表达其中过一种，⑶4+与⑶8+合适的比例是维持机体将抗的重要因素，而且⑶4+与⑶8+比值是一重要的评估机体免疫状态的依据。⑶4VtD8+比值减少是imianyi缺陷的重要指标。HFMD对绝大多数轻症患儿为自限性疾病，目前，HFMD的治疗主要以对症支持为主，病毒DNA聚合酶抑制剂更昔洛韦、阿昔洛韦、利巴韦林也常用于HFMD患者的治疗，也取得了一定的疗效，但容易产生耐药性，使其临床受到限制。根据患儿血压、循环变化，也可选用米力农增强心肌收缩力，降低后负荷，从而降低HFMD死亡率。此外，静脉注射丙种球蛋白(IG)能有效地一直炎症的发生，对EV71引起的中枢神经系统感染有一定的疗效。近期国外报道一种新药Pleconaril (普来可那利)，其口服吸收好，对校RNA病毒科的病毒，特别是肠道病毒引起的脑膜炎等有较好的疗效，可缓解症状， 缩短病禾呈持续时间(Romero JR. Pleconaril :a novel antipicornaviral drug [J]. Exper opin Investing Drugs, 2001,10 (2) :369-379)，Pleconaril 作用机制可能通过阻止病毒与宿主细胞受体结合而抑制病毒复制。干扰素作为一种有效的抗病毒制剂，已广泛应用于临床，足量应用IFN能提高机体的细胞免疫力，达到抑制病毒、促进机体康复目的。干扰素局部皮肤外用能直接作用域被病毒侵袭的靶细胞，迅速控制皮疹的发展，对疱疹病毒感染具有明显的治疗效果，目前临床常用的是rIFNa -Ib软膏制剂，最新研究表明，rIFNα -Ib壳聚糖涂膜剂对豚鼠皮肤疱疹病毒感染具有较好的治疗效果(陈勇，陈妍.重组干扰素α-Ib壳聚糖涂膜剂对豚鼠皮肤疱疹病毒感染的治疗作用.中国药师，2006,9(10) =901-902) Arya (Arya SC. Antiviral therapy for neurological manifestations of enterovirus 71infection[J]. Clin Infect Dis，2000，30 :988-992)尝试用IFN-α治疗EV71引起的中枢神经系统感染，结果表明，早期应用可逆转病毒对神经系统的损伤。由于手足口病常造成机体细胞免疫反应损害，足量的干扰素使用能提高机体的细胞免疫力，已知干扰素影响各种细胞功能，包括在正常和异常细胞中的DNA复制以及RNA和蛋白质合成，因而，干扰素的细胞毒性效应并不限于病毒感染细胞也呈现在正常健康的细胞中，因此，在干扰素治疗期间，尤其需要高剂量时，会产生不期望的副作用。使用干扰素可导致骨髓抑制，以致降低红细胞、白细胞、以及血小板水平，更高剂量的干扰素通常引起流感样症状、胃肠紊乱、头晕以及咳嗽。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗手足口病的药物组合物，本发明所述治疗手足口病的药物组合物，包括一类具有抗病毒作用的第一作用剂，和一类具有调节机体免疫作用的第二作用剂。本发明中一类具有抗病毒作用的第一作用剂，可以是病毒DNA聚合酶抑制剂，比如核苷类抗病毒药阿昔洛韦、更昔洛韦或利巴韦林，也可以是其它类的病毒DNA聚合酶抑制剂。或者，本发明中的具有抗病毒作用的第一作用剂，也可以是阻断病毒mRNA翻译、 抑制病毒核酸合成的作用剂，如可以是干扰素，比如I型干扰素(干扰素α lb、干扰素 α lb、干扰素β，干扰素ω)。本发明中，所述的具有调节机体免疫应答以获取机体免疫反应的第二作用剂，可以是通过提高机体体液免疫应答，以获取机体免疫增强反应，如可以是疫苗制剂，或质粒。
本发明中，所述的具有调节机体免疫应答以获取机体免疫反应的第二作用剂，是一种通过刺激机体免疫应答获取机体细胞免疫反应的作用剂。细胞免疫是T细胞受到抗原刺激后，分化、增殖、转化为致敏T细胞，当相同抗原再次进入机体，致敏T细胞对抗原的直接上上作用及致敏T细胞所释放的淋巴因子的协同杀伤作用。比如，这种获取刺激机体免疫应答以获取机体细胞免疫反应的作用剂，比如说可以是一种τ细胞生长因子，在体内促进B细胞、T细胞、自然杀伤细胞以及淋巴细胞活化杀伤细胞等增值和分化这种作用剂，可以是协同刺激APC和T细胞活化，促进B细胞增殖和分泌抗体以产生细胞免疫调节，比如白细胞介素1 ；也可以使通过活化T细胞，促进细胞因子产生，刺激NK 细胞增殖，增强NK杀伤活性剂产生细胞因子，诱导LAK细胞产生，并促进B细胞增殖和分泌抗体、激活巨噬细胞以获取细胞免疫调剂的作用剂，比如白细胞介素2，白细胞介素15 ；或者是通过激活和增强NK细胞杀伤活性剂诱导IFN-的产生，促进ThO向Thl细胞分化，增强CD8+CTL细胞杀伤活性，诱导LAK细胞产生以获取细胞免疫调剂的作用剂，如白细胞介素 12。也可以是通过其它途径获取细胞免疫调节白细胞介素细胞因子。本发明中，第二作用剂除了白细胞介素这一些列的细胞因子外，还可以是其它具有调节机体细胞免疫活性的细胞因子，比如IFN- γ，γ干扰素通过增加细胞表面MHC II类分子的表达，调节巨噬细胞、T细胞、B细胞之间的关系，增强免疫应答能力。本发明中，优选的第一作用剂为IFN-alb、IFN_a2b、IFN-；更优选为IFN_a2b。优选的第二作用剂为IFN-Y或白介素15。本发明中，通过将第一作用剂I型干扰素与具有免疫调节作用的第二作用剂细胞因子结合使用，在治疗病毒感染引起的疾病时，可以降低I型干扰素的用量，减轻由于需要高剂量使用I型干扰素以获取较好的抗病毒效果而产生的一系列副作用的风险。本发明中，所述的通过增强机体免疫应答以获得细胞免疫的第二作用剂，还可以是植物提取物，比如一些多糖类的提取物(包括香菇多糖、灵芝多糖、黄芪多糖等)，或者明显提示具有免疫调节作用的天然植物，比如人参、黄芪、灵芝等；或者是通过发酵而获得的菌丝体(如杏鲍菇菌丝体)，或者是海洋藻类、深海动植物类的具有免疫调节作用的有效成分。本发明中，所述的肠道病毒引起的疾病，包括手足口病，其中肠道病毒为柯萨奇病毒或肠道EV71病毒。
具体实施例本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。实施例一病毒增殖将IXlO5PFU的EV71病毒接种于单层横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)上，加维持液置37°C、5% C02培养箱中培养7 后出现90%以上的病变，冻融3次后吹打离心，定量分装，-80°C冰箱冻存备用。将IXlO5PFU的CoxA16病毒接种于单层宫颈癌细胞(Hela细胞)培养瓶中，37°C、 5% C02培养箱中培养7 后出现90%以上的病变，冻融3次后吹打离心，定量分装，-80°C 冰箱冻存备用实施例二毒力测定分别将备用的EV71病毒和CoxAie病毒用维持液(含2%新生胎牛血清)做10 倍比系列稀释，纵向重复3孔，分别横向接种在96孔板内的单层RD细胞上和96孔板内的单层Hela细胞上，37°C、5% C02培养，每日观察病变，96h后将板孔内液体吸弃，加1 %中性红100μ 1置37°C染色2h，弃染液，用洗液将多余染料充分洗脱，加脱色液100 μ 1，室温脱色lOmin，用酶标仪在540nm波长测定OD值，通过计算得到EV71病毒TCID50为10-5. 2， CoxA 16 病毒 TCID50 为 10-4. 8。实施例三病毒检测使用Trizol法提取病毒RNA，并及时分装保存于_80 °C，用RT-PCR扩增病毒 VPl基因片段，琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR结果。根据国际标准株的全基因序列，并且参考亚洲的地方株基因序列，利用软件DNASTAR和Primer premier 5. O设计如下引物EV71 病毒的上游引物GCA GCC CAA AAG AAC TTC，下游引物ATT TCAGCA GCT TGG AGTG,目的片段22^p。CoxA 16病毒的上游引物CCTATTGCAGACATGATTGAC，下游引物 TGTTGTTATCTTGTCTCTAC,目的片段 900bp。实施例四干扰素a2b抑制EV71病毒增殖试验将Iml 干扰素 a2b(lX108IU/mg)稀释为 lX107IU/ml、lX105IU/ml、lX103IU/ml 后， 分别纵向重复3孔，依次横向96孔板EV71感染的RD单层细胞加入10 μ 1干扰素a2b，同时设阴性对照。37°C、5%C02培养，每日观察病变，5天后终止。结果表明，干扰素a2b处理组的细胞CPE为31. 2士2. 1%，显著低于阴性对照细胞组69. 1 士5. 1%，说明干扰素a2b能够有效的抑制EV71病毒引起的细胞病变和凋亡。实施例五建立手足口病小鼠动物模型通过给7日鼠龄的Balb/C小鼠分别进行腹腔注射EV71和CoxA16病毒，建立EV71 和CoxA16动物模型，EV71病毒和CoxA16病毒的感染剂量TCID50均为1X107，接种1周后， 小鼠出现精神萎靡不振、活动减少、弓背、食欲不振、反应迟钝等症状，随机抽取部分小鼠安乐死，分别取血液、肌肉、脑、肠进行RT-PCR检测，结果表明，腹腔注射病毒1周后，模型组小鼠在血液、肌肉和肠道中均能检测到病毒，但是在脑中没有检测到病毒的存在，初步评价已经建立了手足口病的实验动物模型。实施例六干扰素a2b和干扰素a2b+白介素2的体内抑制病毒效果取40只EV71病毒的实验模型小鼠，分为4组B :pBS阴性处理组；C 干扰素a2b处理组IXlO5IU ；C =IXlO4IU白介素2处理组； D =IXlO5IU干扰素a2b+lX104IU白介素2处理组，每天给药1次，连续2周，另设正常对照组 A (未接种病毒的Balb/C鼠10只)，给予等量的pBS溶液。1、组织中病毒存在情况检测给药2周后，小鼠猝死，分别取血液、肌肉、脑、肠组织，-70°C冷冻备用，然后进行RT-PCR检测，检测给药处理组小鼠和对照组小鼠各组织和器官内的EV71病毒存在情况，结果见表1 表1各模型组小鼠组织、器官内的病毒检测情况
权利要求
1.一种治疗肠道病毒感染引起的疾病的药物组合物，包括在细胞内阻断病毒HiRNA翻译、抑制病毒核酸合成的第一作用剂；和通过调节机体免疫应答以获得细胞免疫的第二作用剂。
2.根据权利要求1所述的治疗肠道病毒引起的疾病的药物组合物，其特征是所述的在细胞内阻断mRNA翻译、抑制病毒核酸合成的第一作用剂为I型干扰素。
3.根据权利要求2所述的治疗肠道病毒感染引起的疾病的药物组合物，其特征是所述的I型干扰素为α、β或ω中的任意一种。
4.根据权利要求2所述的治疗肠道病毒感染引起的疾病的药物组合物，其特征是所述的I型干扰素为α干扰素。
5.根据权利要求2所述的治疗肠道病毒感染引起的疾病的药物组合物，其特征是所述的I型干扰素为干扰素α Ib或α 2b。
6.根据权利要求1所述的治疗肠道病毒感染引起的疾病的药物组合物，其特征是所述的第二作用剂可以是选自干扰素Y或白细胞介素。
7.根据权利要求6所述的治疗肠道病毒感染引起的疾病的药物组合物，其特征是所述的白细胞介素为白细胞介素2、白细胞介素12或白细胞介素15中的任意一种。
8.根据权利要求6所述的治疗肠道病毒感染引起的疾病的药物组合物，其特征在于， 所述的白细胞介素为白细胞介素15。
9.根据权利要求1至8任意一权利要求所述的治疗肠道病毒感染引起的疾病的药物组合物，其特征在于所述的肠道病毒为柯萨奇病毒或肠道EV71病毒。
全文摘要
本发明涉及一种药物组合物，具体是由一种抗病毒药物——通过在细胞内阻断病毒mRNA翻译、抑制病毒核酸合成-的第一作用剂；和一种免疫调节的第二作用剂组成，本发明药物组合物可用于治疗由肠道病毒感染引起的机体病变，如手足口病。
文档编号A61K38/21GK102309758SQ20101021594
公开日2012年1月11日 申请日期2010年7月2日 优先权日2010年7月2日
发明者侯建华, 周德胜, 张春丽, 熊国裕 申请人:北京凯因生物技术有限公司, 北京凯因科技股份有限公司