抗对虾白斑综合症病毒工程蛋白tat-vp28及制备和用途的制作方法

专利名称：抗对虾白斑综合症病毒工程蛋白tat-vp28及制备和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因生物工程技术领域。更具体涉及一种重组融合蛋白TAT-VP^亚单位疫苗，同时还涉及一种大肠杆菌基因工程菌株的制备方法，具体涉及构建和高效表达可溶一种蛋白转导结构域多肽(TAT-PTD)和对虾白斑综合症病毒(WSSV)囊膜蛋白VP^融合蛋白的基因工程菌株；还涉及上述菌株表达的融合蛋白在抗对虾白斑综合症病毒的药物中的用途。
背景技术：
上世纪80年代以来，世界对虾养殖业高速发展，随着环境的日益破坏，病害问题加剧，已经成为阻碍对虾养殖业发展的重要因素。对虾白斑综合症病毒(WSSV)是对全球对虾养殖业危害最大的病原之一。对虾白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV) 自1992年首次在台湾爆发以来，先后分别在日本、东南亚、北美等国家爆发，在全球范围内对虾养殖业造成了巨大的经济损失。1995年，联合国粮油组织(FAO)，国际兽药局(OIE) 以及亚太地区水产养殖发展网络中心(NACA)将其列为需要报告的水生动物病毒性疫病之一。近年来各国专家学者们对白斑综合症病毒进行了深入研究，探讨了其形态结构、基因组成、分类学、感染宿主以及与病毒感染相关的蛋白。为防治WSSV感染提供了重要的理论依据。WSSV是一种有囊膜的环状双链DNA病毒，其形态学与杆状病毒相似，呈长杆状，具有双层囊膜。完整的病毒粒子主要包括囊膜、核衣壳及病毒核心三部分。WSSV有较广的宿主范围，除了可以感染虾、蟹类等甲壳动物外，桡足类及部分节肢动物也可以成为该病毒的传播者及携带者。WSSV的主要结构蛋白有VP15、VP19、VP24, VP26, VP^，编码这些蛋白的阅读框通过对其N-端氨基酸序列的测定已确定。VP19、VP^是主要的囊膜蛋白。对VP^ 蛋白的结构分析可以发现，VP28蛋白的结构中存在5个潜在的N-糖基化位点，2个潜在的 0-糖基化位点及9个可能的磷酸化位点。同时，在蛋白的N-端存在强疏水区，且这个区域中包含一个理论上的跨膜结构域。van Hulten第一次利用VP^蛋白的抗体中和实验证明了该蛋白与 WSSV 感染的早期过程有关(van Hulten，Μ. C. W.，ffitteveldt, J.，Snippe， Μ. , Vlak, J. Μ. . White spot syndrome virus envelope protein VP28 is involved in the systemic infection of shrimp[J] · Virology,2001b,285 :228-233.)。在van Hulten 的研究基础上，Yi进一步研究了 VP^蛋白在WSSV感染过程中的具体作用，进一步证明了 VP28蛋白参与WSSV对虾细胞的吸附及侵入过程(Yi, G.，Wang，Ζ.，Qi，Y.，Yao, L.，Qian, J., Hu, L. . VP28 of white spot syndrome virus is involved in the attachment and penetration into shrimp cells [J]. J. Biochem. Mol. Biol，2004，37 :726-734.)。近年来研究发现能够与VP^蛋白相互作用的宿主细胞表面蛋白主要有PmRab7、HSP70 (heat shock cognate protein 70) > STAT (signal transducer and activator of transcription)。近年来各国学者一直致力于对WSSV流行病学及致病机理的研究，以寻找防治WSSV感染的措施和方法。目前防治方法主要有利用免疫增强剂来增强对虾抗病毒的感染能力、利用抗体中和作用来阻断WSSV的感染、利用疫苗提高对虾抗WSSV病毒的能力。目前研究证明能够增强对虾抗WSSV感染能力的免疫增强剂主要有脂多糖 (Lip0p0lySacCharides，LPQ，葡聚糖(Glucan)。Zhu研究的灭活疫苗能够在虾体内诱导产生免疫应答并保护虾抵抗WSSV的感染，灭活疫苗是以二乙烯亚胺(Binary ethylenimine, BEI)作为灭活剂的，BEI作为灭活剂时WSSV的囊膜蛋白可以保持完整(Fei Zhu, Huahua Du, Zhi-Guo Miao, Hai-Zhi Quan, Zi-Rong Xu. Protection of Procambarus clarkii against white spot syndrome virus using inactivated WSSV[J]. Fish & Shellfish Immunology. 2009,26 :685-690)。Witteveldt利用原核表达载体在大肠杆菌中重组表达 VP28融合蛋白，将纯化的VP^融合蛋白通过肌肉注射到对虾体内，在肌肉注射后第2天及第25天分别进行病毒攻击实验，结果发现与对照组相比，VP^融合蛋白注射组存在较高的相对存活率(Jeroen ffitteveldt, Just M. Vlak, Marielle C. W. , van Hulten. Protection of Penaeus monodon against white spot syndrome virus using a WSSV subunit vaccine [J], Fish & Shellfish Immunology. 2004，16 :571-579)。Du 利用昆虫细胞表达系统来表达重组的VP^蛋白，重组蛋白经肌肉注射进入鳌虾体内。并注射后第10天进行病毒攻击实验，结果发现昆虫细胞表达的重组蛋白与对照组相比，对鳌虾有较好的保护作用(Huahua Du, Zirong Xu, Xiaofeng ffu, Weifen Li, Wei Dai. Increased resistance to white spot syndrome virus in Procambarus clarkii by injection of envelope protein VP28 expressed using recombinant baculovirus[J]. Aquaculture. 2006,260 39-43)。Xu利用杆状病毒(HyNPV)表达系统在家蚕体内分别表达重组的VP^及VP19蛋白，并将带有重组蛋白的家蚕勻浆液包裹虾饲料，连续投喂克氏原鳌虾30天。投喂结束后即进行病毒攻击，结果发现与对照组相比，VP^蛋白组及VP19蛋白组的相对存活率分别为94. 7%和89. 5%。这说明与肌肉注射相比，口服的亚单位疫苗同样可以对克氏原鳌虾产生保护作用(Zirong Xu a, Huahua Du, Yaxiang Xu, Jianyi Sun, Jian Shen. Crayfish Procambarus clarkii protected against white spot syndrome virus by oral administration of viral proteins expressed in silkworms[J]. Aquaculture. 2006 253,179-183) ο Xu利用毕赤酵母(Pichia pastoris)对VP^及VP19蛋白进行真核表达， 并将表达的重组蛋白经虾饲料包裹后投喂克氏原鳌虾。连续投喂25天后，分别在结束投喂后的第3天及第21天进行病毒攻击实验，结果发现与对照组相比，VP28及VP19蛋白投喂组存在较高的相对存活率(Zi Rong Xu, Shi Juan Bai，Jian Yu Sun, Wei Fen Li and Jian Shen. Protection of Procambarus clarkii against white spot syndrome virus using recombinant oral vaccine expressed in Pichia pastoris[J]Fish & Shellfish Immunology April 2007，Pages 295-307)。Fu利用枯草芽孢杆菌高效地分泌表达重组的 VP^蛋白，并将表达的重组蛋白经虾饲料包裹后投喂中国对虾，连续投喂20天后，分别于第3天、14天、观天进行病毒攻击，结果发现与对照组相比，蛋白投喂组的相对存活率达到了 83.3%。Rajesh以壳聚糖纳米颗粒作为转运载体，将带有vp^基因的DNA疫苗包裹在其中，并通过口服的方式免疫对虾。在免疫后第7、15、30天分别进行病毒攻击实验，并得到了较好的保护效果，相对存活率分别为85%、65%、50% (S. Rajesh Kumar, C. Venkatesan, Μ. Sarathi, V. Sarathbabu, John Thomas, K. Anver Basha, Α. S.Sahul Hameed. Oral delivery of DNA construct using chitosan nanoparticles to protect the shrimpfrom white spot syndrome virus (WS SV)[J].Fish& Shellfish Immunology. 2009,26 6429-437.)。Ning以减毒的沙门氏菌作为转运载体，将带有基因的真核表达载体 pcDNA3. 1转化入减毒的沙门氏菌中，并将重组菌以口服的方式免疫克氏原鳌虾。在免疫后第7、15、25天分别进行病毒攻击实验，结果得到的相对存活率分别为88. 3%,66. 7%和 56. 7 % (Jian-Fang Ning, Wei Zhu, Jin-Ping Xu, Cong-Yi Zheng, Xiao-Lin Meng. Oral delivery of DNA vaccine encoding VP28 against white spot syndrome virus in crayfish by attenuated Salmonella typhimurium. Vaccine[J]· 2009,27 :1127-1135)。蛋白质转导结构域(protein transduction domain,PTD)或称细胞穿膜肽(cell penetrating peptides, CPPs)是一条以肽为载体的有效运输各种物质进入细胞及细胞核的系统。通过PTD携带的物质有全长蛋白质、DNA、化学药物、寡核苷酸、40nm磁珠和200nm 脂质体等。现在研究最多、应用范围最广的蛋白转导域来源于人免疫缺陷病毒1型(HIV-I)
(Trans-activating transcriptional activator, Tat) Tat 胃白 43. 3个功能结构域，分别是位于N-端的酸性区，主要起反式激活的功能；位于第22-37位氨基酸之间的DNA结合区，该区域富含半胱氨酸；位于第47-60位氨基酸之间的碱性区，是主要的蛋白转导结构域，参与Tat蛋白的细胞内化作用。Tat蛋白共有86个氨基酸，是HIV复制所必需的调节因子。khwarze等确定具有蛋白转导功能的最小肽段是47-57，由11个氨基酸组成，其序列为YGRKKRRQRRR，该段等电点12. 7，为碱性多肽，转导速度快，效率高。TAT 可以将与之相连的多肽或全长蛋白质在数分钟内转导进入细胞，而且在体内可以通过血液循环运输至脑组织，跨越血脑屏障进入神经元或胶质细胞内。目前已有几十种化合物和蛋白质被成功转导进入不同的细胞或者跨越血脑屏障，并表现出了相应的生物活性，而且已将多种变性的蛋白质，如半乳糖苷酶转导进入小鼠体内并恢复了生物活性，被带入细胞的分子基本上保留了它们各自原有的活性。TAT蛋白质转导结构域序列中由于有6个精氨酸和2个赖氨酸残基，因此是带有高度正电荷的多肽。以不带电荷的丙氨酸替代其中的任何一个碱性氨基酸残基都会使穿膜活性降低，而替代序列中的其他氨基酸残基时穿膜活性则不会发生改变。这说明TAT穿膜肽所带的正电荷是其穿膜功能所必需的，因此推测这些正电荷很可能是能够与真核细胞的细胞膜发生强的静电作用，从而介导了穿膜过程。对TAT蛋白质转导结构域的亲和性分析发现，它能够与许多细胞膜表面的阴离子通过静电作用强烈地结合，与之结合的细胞表面分子可以是核仁素、蛋白聚糖等。此外，研究发现TAT蛋白质转导结构域不会因为手性结构的改变而影响其穿膜活性，其手性分子与自然结构具有相同的穿膜活性。这说明这种TAT蛋白质转导结构域很可能不依赖于特定的结合位点。然而，多肽的长度是影响穿膜效率的重要因素。穿膜效率与精氨酸的个数有关，含有6个或者更多精氨酸的多肽要比含有少于5 个精氨酸多肽的穿膜效率高一些，在多肽小于15个氨基酸时，穿膜效率会随着多肽大小的增加而增强。大于15个氨基酸的多肽虽然也可具有穿膜活性，但其效率却会明显减小。尽管对于TAT蛋白质转导结构域的穿膜功能研究的比较多，但是到目前为止，关于TAT蛋白质转导结构域进入细胞的分子机制还没有完全研究清楚。早期研究认为是通过直接转运机制穿过细胞膜，且是不依赖于能量的，但最近的研究也有与这一观点不同的结果。尽管其进入细胞的机制还没有完全研究透彻，但TAT蛋白质转导结构域的应用已经十分广泛。

发明内容
本发明的目的是在于提供了一种大肠杆菌基因工程菌株，该菌株可以表达蛋白转导结构域多肽(TAT-PTD)和对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白VP^基因工程融合蛋白 TAT-VP^。其优点是表达量大且可溶，易于工业化生产，成本低，安全性好。本发明的另一个目的是在于提供了一种重组融合蛋白TAT-VP^亚单位疫苗的制备方法，能够预防对虾白斑综合症(WSS)，与表达的重组融合蛋白VP^亚单位疫苗相比，在预防对虾白斑综合症上有更高，更长的保护效果。本发明的再一个目的是基因工程融合蛋白在制备治疗或预防对虾白斑综合症病毒的药物中的应用。本发明提供的融合蛋白TAT-VP^能够有效的预防对虾白斑综合症(WSS)。重组融合蛋白TAT-VP^经过鳌虾口服后，融合蛋白TAT-VP^可以穿过虾肠组织而进入鳌虾血淋巴，使亚单位疫苗可以不经肌肉注射而直接进入血淋巴中，通过血淋巴在虾体内的循环，使其融合蛋白到达不同的组织，增加了于WSSV病毒的竞争中和的作用，同时也争强了虾的免疫酶活作用。本发明的创新之处在于，本发明专利利用大肠杆菌表达TAT蛋白转导结构域和 WSSV囊膜蛋白VP^的融合蛋白，意在防治WSS。通过基因工程生产的TAT-VP^融合蛋白可以作为抗WSS病原的微生物药物应用于对虾养殖业，能够显著提高对虾的免疫力和抗病能力。本发明另一个创新之处在于，将蛋白转导结构域多肽TAT和VP^融合表达。TAT可以携带VP^蛋白不经肌肉注射而直接进入血淋巴中。蛋白转导结构域多肽TAT目前还没有直接应用于养殖业，但其独特的穿膜效率十分具有吸引力。解决了使亚单位疫苗可以不经肌肉注射而直接进入血淋巴中，使其具有实际操作的可行性。而且本发明公开的基因工程菌株的构建方法可以应用于大规模的养殖业中，表达量大，操作简单，成本低。本发明的技术方案如下本发明的技术要点之一是表达基因工程重组融合蛋白TAT-VP^的大肠杆菌基因工程菌株的构建及诱导表达。本实验所涉及的分子生物学方法为常规方法，为本领域人员所熟悉。本发明中未详细阐述的请参见《分子克隆实验指南》J.萨姆布鲁克，D. W.拉塞尔等主编。一种重组融合蛋白TAT-VP^亚单位疫苗的制备方法，其步骤如下1. WSSV的VP^基因的制备(I)WSSV病毒基因组的制备在冰上取患病对虾的鳃、胃和心脏，冰浴勻浆，然后加入蛋白酶K(100ug/ml)，在沸水中煮15分钟，立即冰浴5分钟，12000rpm离心10分钟，取
其上清置4°C保存。(2) PCR 扩增 VP28 基因根据 GeneBank 中已经发表的 WSSV (GeneBank :EU414753) 的序列设计PCR引物，以上述上清作为模板DNA，PCR扩增目的基因VP^，PCR产物通过DNA 凝胶电泳检测，回收PCR产物并将其克隆到pGEM-T载体(在promega公司购置)中，转化到大肠杆菌JM109(在INVITR0GEN公司购置)，挑取单菌落培养，用碱裂解法小量(15-20ug) 提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含VP^基因的大肠杆菌， 命名为 pGEM-T-vp28。
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2.融合基因tat-vp^的制备及表达载体的构建(I)PCR扩增1站-叩观基因上游引物为3条、下游引物为1条分三次PCR合成 tat-vp28 以 pGEM-T-vp28 质粒为模板，上游引物 Pl :CAGCGTCGTCGTGGATCCATGGATCTTTCTT TCA，下游引物 1 :GGCCTCGAGCTACTCGGTCTCAGTGCCAGAGTA (划线处为 Xhol 位点)，退火温度 56°C，做PCR扩增目的片段(片段大小为636bp)，电泳并作回收；以上一步回收产物为模板，上游引物 P2 CGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTGGATCC，下游引物 1 GGCCTCGAGCTACTCGGT CTCAGTGCCAGAGTA (划线处为Xhol位点)，退火温度56°C做PCR，做PCR扩增目的片段电泳并作回收；以上一步回收产物为模板，上游引物P3 GCGGAATTCGGCTATGGCCGTAAAAAACGTCGT (划线处为 EcoRI 位点)，下游引物 1GGCCTCGAGCTACTCGGTCTCAGTGCCAGAGTA (划线处为 Biol 位点)，退火温度56°C做PCR。PCR扩增目的基因TAT-VP^ (片段大小为666bp)，，PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物并将其克隆到pGEM-T载体(在promega公司购置) 中，转化到大肠杆菌JM109 (在INVITR0GEN公司购置)，挑取单菌落培养，用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含TAT-VP^基因的大肠杆菌，命名为 pGEM-T-tat-vp28。(2)融合基因tat-vp^表达载体的构建用EcoR I和Biol I双酶切质粒 PGEMT-TAT-VP28 和质粒 pET48a(+)(在 INVITROGEN 公司购置)，目的片段 TAT-VP28 和开环pET48a(+)胶回收后16°C连接过夜，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，挑取单菌落培养， 用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，得到的阳性克隆子即为包含TAT-VP^基因的大肠杆菌，命名为 pET48a(+) -TAT-VP^。3大肠杆菌基因工程菌的制备将质粒pET48a(+)-TAT-VP28(Iul)转化大肠杆菌BL21 (DE3)(大肠杆菌BL21 (DE3) 本实验室保存，这样描述绝对不行，请将大肠杆菌BL21 (DE3)的来源写明，写明文献出处) 感受态细胞。PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够融合表达 TAT-VP^ 的重组基因工程菌株 Escherichia coli BL21 (pET_28a-TAT_VP28)。4基因工程融合蛋白TAT-VP^的表达重组基因工程菌株Escherichia coli BL21 (pET-28a-TAT-VP28)的单菌落接种到20ml新鲜液体MDG(含终浓度为的30ug/ml卡纳霉素)培养基中。37°C 200rpm摇床培养过夜。将5ml过夜培养物分别同时接种到200ml乳糖自动诱导ZYM5052 (含终浓度为的30ug/ml卡纳霉素)培养基。200rpm摇床培养3小时后，18°C低温自动诱导IMi后，离心12000g，4°C，IOmin收集菌体，用IOmMPBS(pH8. 0)重悬超声波破碎，离心收集上清和沉淀并用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。以优化后的条件扩大培养，超声波破碎后，离心(12000g，4°C，20min)收集上清。融合蛋白TAT-VP^的纯化按Ni-NTA说明书进行，用 SDS-PAGE检测蛋白纯化结果，得到纯化的TAT-VP^。其特征在于融合蛋白具有穿虾肠功能和融合蛋白的分子量为27. SKDa0本发明的技术要点之二是鳌虾口服TAT-VP^蛋白的穿肠功能鉴定。在本发明的一个实施例中提供了鳌虾口服基因工程融合蛋白后，融合蛋白在虾体内穿肠鉴定的方法，即ELISA检测TAT-VP^蛋白的穿肠功能。方法如下(1)将纯化的VP^抗体于PBS缓冲液中稀释100倍，并于96孔酶标板中每孔加入 100 μ L。将酶标板的小孔用封口膜封口后置于37°C恒温培养箱中温育池，使抗体包被于酶标板底部。(2)弃去酶标板小孔中的样品，于每空中加入100 μ L 5% (质量体积比)BSA，用封口膜封口后置于冰箱中4°C封闭过夜。(3)甩干酶标板小孔中的封闭液，于每孔中加入300 μ L PBST缓冲液，浸泡5min，
并间歇振动酶标板使洗涤更加充分。重复操作本步骤三次。(4)分别吸取抗凝血淋巴100 μ L加入酶标板小孔中，同时以只加PBS缓冲液不加抗凝血淋巴的酶标板小孔作为空白对照。将酶标板的小孔用封口膜封口后置于37°C恒温培养箱中温育lh，使血淋巴中的抗原与包被在酶标板中的抗体充分结合。(5)重复步骤(3)三次。(6)将辣根过氧化物酶(HRP)标记的VP^抗体于PBST缓冲液中稀释200倍，于酶标板小孔中每孔加入100 μ L。用封口膜封口后置于37°C恒温培养箱中温育lh，使HRP标记的VP^抗体与抗原充分结合。(7)重复步骤(3)三次。(8)于酶标板小孔中每孔中加入300 μ L PBS缓冲液，浸泡5min，并间歇振动酶标板使洗涤更加充分。(9)于酶标板小孔中每孔加入100μ L显色液，用封口膜封口后于37°C恒温培养箱中避光显色20min。(10)于酶标板小孔中每孔加入50 μ L终止液，终止显色反应。并用酶标仪在490nm 波长下测定各孔的光吸收值。本发明ELISA结果表明以镍离子亲和层析分别纯化TAT-VP^及VP^蛋白，纯化后的蛋白经口免疫克氏原鳌虾1. 5小时后，抽取血淋巴并利用双抗体夹心ELISA检测抗原VP^。结果表明鳌虾口服TAT-VP^蛋白后，鳌虾血淋巴中检测到了阳性结果，而VP^蛋白组则未检测到阳性结果。这一结果表明，TAT能够携带与其融合表达的VP^蛋白穿过鳌虾的肠组织，并进入鳌虾血淋巴中。一种大肠杆菌基因工程菌株，其特征在于，该菌株为重组基因工程菌株 Escherichia coli BL21 (DE3)pET-28a-TAT-VP28, CCTCC NO :M2010296。所述的重组基因工程菌株Escherichia coli BL21 (D&)pET_28a-TAT_VP28，重组质粒hcherichia coli BL21 (DE3)pET48a-TAT-VP^为本发明所构建。所述的重组大肠杆菌菌株 Escherichia coli BL21 (DE3)pET-28a-TAT-VP28 是具有质粒 Escherichia coli BL21 (DE3)pET-28a-TAT-VP28 的大肠杆菌菌株，保藏编号CCTCC NO :M201(^96，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，保藏日期2010年11月 10 日，分类命名大肠杆菌 BL21(D&)pET-28a-TAT-VP28 Escherichia coli BL21(DE3) pETj8a-TAT-VP^。所述的编码基因 BL21 (DE3) pET-28a-TAT-VP28 是具有 SEQUENCE NO. 1 的核苷酸序列的蛋白编码基因。所述的蛋白BL21 (DE3) pET-28a-TAT-VP28是具有SEQUENCE NO. 2的氨基酸序列的蛋白。一种分离的蛋白质，其序列为SEQUENCE NO. 2所示的氨基酸序列。该大肠杆菌菌株有以下特征最适生长温度为37°C，在普通LB琼脂培养基上菌落形态为光滑型，菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈白灰色。E. coli. BL21 (DE3)用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体 DE3区，该区整合于BL21的染色体上。
本发明与现有报道的单一 VP^亚单位疫苗相比，其优势在于(1)本发明所涉及的TAT-VP^重组蛋白，TAT可以携带VP^蛋白不经肌肉注射而直接进入血淋巴中。解决了使亚单位疫苗可以不经肌肉注射而直接进入血淋巴中，使其具有实际操作的可行性。而且本发明公开的基因工程菌株的构建方法可以应用于大规模的养殖业中，表达量大，操作简单，成本低。( 与表达的VP^亚单位疫苗在预防对虾白斑综合症上有更高，更长的保护效果。TAT-VP^重组蛋白通过血淋巴在虾体内的循环，使其融合蛋白到达不同的组织，增加了于WSSV病毒的竞争中和的作用，同时也争强了虾的免疫酶活作用。


图1为一种重组表达质粒pET_28a (+) -TAT-VP28的构建过程示意图。图2为一种重组表达质粒pET_28a (+) -TAT-VP28的酶切和PCR鉴定示意图。1. D2000 2. TAT-VP28 PCR 3. pET_28a (+) -TAT-VP28 质粒 4. pET_28a (+) -TAT-VP28 单切/Xho I 5. pET18a(+)-TAT-VP28 双切/EcoR I、Xho I 6. MarkerIV0图3为一种SDS-PAGE鉴定示意图。M 蛋白 Marker (Fermentas #SM0431)1 未诱导的 pET18a-vp^ (BL21)2 自动诱导后破碎的pET18a-vp^ (BL21)3 自动诱导后的pET18a_vp^(BL21)上清4 纯化的VP^融合蛋白5 未诱导的 pET-28a-tat_vp^ (BL21)6 自动诱导后破碎的 pET18a-tat-vp^ (BL21)7 自动诱导后的 pET18a-tat-vp^ (BL21)上清8 纯化的TAT-VP^融合蛋白图4为一种鳌虾血淋巴的ELISA检测示意图。图5为一种重组融合蛋白TAT-VP^亚单位疫苗的保护效果示意图。
具体实施例方式下面结合附图及具体实施例子对本发明作进一步说明。在实施例中涉及的所有培养基和分子生物学操作方法为本领域技术人员所熟知。本实验所涉及的分子生物学方法为常规方法，为本领域人员所熟悉。本发明中未详细阐述的请参见《分子克隆实验指南》J.萨姆布鲁克，D. W.拉塞尔等主编。实施例1 :tat_vp^基因的制备。(I)WSSV病毒基因组的制备在冰上取患病对虾的鳃、胃和心脏，冰浴勻浆，然后加入蛋白酶K(100ug/ml)，在沸水中煮15分钟，立即冰浴5分钟，12000rpm离心10分钟，取
其上清置4°C保存。(2) PCR 扩增 VP28 基因根据 GeneBank 中已经发表的 WSSV (GeneBank :EU414753) 的序列设计PCR引物，以上述上清作为模板DNA，PCR扩增目的基因VP^，PCR产物通过DNA 凝胶电泳检测，回收PCR产物并将其克隆到pGEM-T载体(在promega公司购置)中，挑取单菌落用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序得到的阳性克隆子即为包含VP^基因的大肠杆菌，命名为pGEM-T-vp^，用于基因的增殖和保藏。(3) PCR扩增tat-vp^基因上游引物为3条、下游引物1 分三次PCR合成 tat-vp28 以 pGEM-T-vp28 质粒为模板，上游引物 Pl :CAGCGTCGTCGTGGATCCATGGATCTTTCTT TCA,下游引物 1 GGCAAGCTTCTACTCGGTCTCAGTGCCAGAGTA,退火温度 56°C，做 PCR 扩增目的片段，电泳并作回收；以上一步回收产物为模板(蘸取少许)，上游引物P2 :CGTAAAAAACGTC GTCAGCGTCGTCGTGGATCC,下游引物 1GGCAAGCTTCTACTCGGTCTCAGTGCCAGAGTA,退火温度 56 °C 做PCR，电泳并作回收；以上一步回收产物为模板(蘸取少许)，上游引物P3 :GCGGAATTCG GCTATGGCCGTAAAAAACGTCGT,下游引物 1GGCAAGCTTCTACTCGGTCTCAGTGCCAGAGTA,退火温度 56°C做 PCR。PCR 反应体系 JOXiTaq Buffer with KCl 2. 5uL, MgCl2 (25mM) 1. 5uL, dNTP Mixture (2. 5mM) luL，上下游引物各 luU25pmol)，模板 IuL, Taq DNA 聚合酶(1U/uL) IuL, 加无菌水至终体积50uL。PCR反应条件为；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 50s (30个循环)； 72°C IOmin0 得到 TAT-VP28 的 PCR 产物。实施例2 :PCR产物的回收、纯化和亚克隆。将实施例1中得到的TAT-VP^的PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下迅速切下欲回收的条带，用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化，将单一的目的DNA条带放入干净的Eppendorf管中，称取重量。向胶块中加入三倍体积的溶胶液PN(凝胶重为0. Ig, 其体积可视为IOOuL,以此类推)。50°C水浴10分钟，其间每2分钟温和上下翻转Eppendorf 管，以确保胶块充分溶解。将所得溶液取750uL加入到一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室温O0-25°C以下相同)放置2分钟，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入600uL漂洗液，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。再向吸附柱中加入600uL漂洗液，12000rpm离心1分钟， 倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。空柱12000rpm离心2分钟，尽量除尽漂洗液。将吸附柱放入一个干净的Eppendorf管中，室温放置数分钟，彻底晾干，防止残留的漂洗液影响下一步的实验。向吸附膜中间位置悬空滴加30uL洗脱缓冲液，室温放置2分钟， 12000rpm离心2分钟。PCR产物的亚克隆将回收、纯化的PCR产物与pGEM-T (在promega公司购置)连接，连接体系如下
IOxLigation BufferIulpGEM-T载体2ul纯化后的PCR产物6ulT4 DNALigaseIul总反应体系IOul连接反应液4°C水浴放置过夜。实施例3 质粒pGEM-tat-vp^的构建。氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞其步骤是(1)用接种环挑取固体LB平板上新活化的大肠杆菌JM109单菌落，接种到20ml 液体LB培养基(将Ig蛋白胨、0. 5g酵母粉、Ig NaCl溶解在75ml ddH20中，调整pH值至7. 0，最后加ddH20定容至100ml，分装于五个三角瓶里，115磅灭菌处理20min后备用)中， 37 0C，250rpm摇床活化过夜。(2)无菌条件下取60ul上述活化的大肠杆菌于新鲜的20ml液体LB培养基中， 370C，250rpm摇床培养3小时左右至OD6tltl值为0. 4-0. 6。(下述所有步骤均需无菌操作)(3)无菌条件下取1. 5ml上述菌液于无菌Eppendorf管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0°c。4000rpm，4°C离心10分钟，用移液枪吸干上清。(4)加入300ul冰预冷的0. IMCaCl2溶液重悬菌体沉淀，冰浴30分钟，4000rpm，4°C 离心10分钟，用移液枪吸干上清。(5)加入IOOul冰预冷的0. IMCaCl2溶液重悬沉淀，即得感受态细胞，置于4°C保存，24小时内使用为宜。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞其步骤是(1)无菌条件下取连接反应液IOul，加入到IOOul大肠杆菌JM109感受态细胞中， 轻轻混勻，冰浴30分钟。(下述所有步骤均需无菌操作)(2) 42 °C水浴中热激90秒，迅速移至冰中冰浴2_3分钟。(3)加入800ul液体LB培养基，37°C，150rpm轻摇，温育45分钟使细菌复苏。(4)4000rpm离心10分钟，吸取700ul上清弃去，将剩余菌液用移液枪轻轻混勻。(5)将上述菌液用无菌三角玻棒均勻涂布在含IOul IM IPTG，40ul 20mg/ml X-gal,10ul 200mg/ml Amp的LB平板上，正向放置1_2小时，直至液体被全部吸收，倒置平板于37°C培养箱中培养过夜。有此法可以制备得到E. coli JM109 pGEMT_TAT_VP^的菌落。阳性正向重组子pGEMT-TAT-VP^的酶切鉴定用碱裂解法小量(15_20ug)提取Ε· coli PGEMT-TAT-VP28，对所提质粒进行双酶切，酶切体系如下(1)重组质粒pGEMT-TAT-VP^的双酶切
质粒pGEMT- TAT-VP28 IOx Buffer Xhol I EcoR I加无菌水至终体积20ul。酶切反应条件均为37°C，反应时间2-3个小时，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳分析结果。实施例4 融合基因的制备和表达质粒的构建。(1)重组表达质粒pET48a(+)-TAT-VP^的构建其步骤是用EcoR I 和 Xhol I 双酶切质粒 pGEMT_TAT_VP28 和质粒 pET18a(+)(在 INVITR0GEN公司购置)，目的片段TAT-VP^和开环pET48a (+)胶回收后16°C连接过夜，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，方法如下①无菌条件下取连接反应液IOul，加入到IOOul大肠杆菌JM109感受态细胞中，轻
JM109 pGEMT-TAT-VP28 质粒
8ul 2ul Iul Iul
11轻混勻，冰浴30分钟。(下述所有步骤均需无菌操作)下表为连接体系
IOxLigation BufferIul
pET-28a ( + )载体2ul
纯化后的PCR产物6ul
T4 DNALigaseIul
总反应体系IOul②42 V水浴中热激90秒，迅速移至冰中冰浴2分钟。③将上述菌液用无菌三角玻棒均勻涂布在含终浓度为30ug/ml卡纳霉素的LB平板上，正向放置1-2小时，直至液体被全部吸收，倒置平板于37°C培养箱中培养过夜。挑取单克隆pET-28a (+) -TAT-VP28/JM109于500ul新鲜液体LB培养基(含终浓度为的30ug/ml 卡纳霉素)中，37°C，300rpm摇床培养3_4小时，以此菌液为模板，上游引物P1、P2、P3、下游引物1为引物进行PCR初步鉴定，其产物为TAT-VP^全长融合基因。将PCR鉴定所得阳性克隆的菌液转接50ul于20ml新鲜液体LB培养基(含终浓度为30ug/ml的卡纳霉素)中， 37°C，300rpm摇床培养过夜，碱裂解法小量(15_20ug)提取质粒，用EcoR I和Biol I双酶切鉴定阳性重组子，重组质粒命名为pET48a(+)-TAT-VP28，并测序与DNA序列完全一致， 符合翻译阅读框。重组表达质粒pET48a(+)-TAT-VP^的构建过程见附图1，酶切及PCR鉴定见附图2。实施例5 大肠杆菌基因工程菌的制备。将质粒pET48a(+)-TAT-VP28 (Iul)转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞。PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够融合表达TAT-VP^的重组基因工程菌株 Escherichia coli BL21 (pET-28a-TAT-VP28) 实施例6 基因工程融合蛋白TAT-VP^的表达。重组基因工程菌株hcherichia coli BL21 (pET48a-TAT-VP28)的单菌落接种到 20ml新鲜液体MDG(含终浓度为的30ug/ml卡纳霉素)培养基中。37°C 200rpm摇床培养过夜。MDG培养基配方称取0. 55g葡萄糖-H20、0. 28g天门冬氨酸盐-H2O,用移液器分别吸取 20 X 的混合盐 5ml (其中含有 500mmol/L 的 Nei2HPO4、500mmol/L 的 KH2P04、lmol/L 的 NH4C1、 1 OOmmo 1/L 的 Na2SO4) UOOX 的 MgSO4 (200mmol/L) 1ml，加入去离子水定容至 100ml。115°C 高压灭菌20min备用。将5ml过夜培养物分别同时接种到200ml乳糖自动诱导ZYM5052(含终浓度为的30ug/ml卡纳霉素)培养基。ZYM5052培养基配方称取IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物、 0. 55g葡萄糖-H20、2. Ig乳糖-H20、6. 3g甘油，用移液器吸取20X的混合盐50ml (其中含有 500mmol/L 的 Na2HPO4,500mmol/L 的 KH2PO4Umol/L 的 NH4Cl、100mmol/L 的 Na2SO4) ,U00X 的MgSO4 10ml，加入去离子水定容至1000ml。115°C高压灭菌20min备用。37°C，200rpm摇床培养3小时后，18°C低温自动诱导16h。将诱导前和诱导后小量取样的Eppendorf管于室温以12000rpm离心1分钟，弃去上清，加IOOul无菌水重悬菌体沉淀。分别取上述样品各 20ul 于 20ul 2XSDS 凝胶加样缓冲液(IOOmM Tris_Cl、200mM β-巯基乙醇、4% SDS、0. 2%溴酚蓝、20%甘油)中，100°C加热10分钟，样品可贮存于-4°c，以备在凝胶上加样。 融化样品，于室温以12000rpm离心1分钟。取IOul加样到丙烯酰胺浓度为12% SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。电泳结束后，卸下凝胶，在考马斯亮蓝染色液(Ig考马斯亮蓝R_250，450ml甲醇， 450ml ddH20, IOOml冰醋酸)中染色2个小时，然后用脱色液GOml甲醇，IOml乙酸，50ml ddH20)脱色，每隔30分钟换液一次，直至背景脱干净为止。融合蛋白TAT-VP^W SDS-PAGE 鉴定见附图3。实施例7 融合蛋白TAT-VP^的纯化。(1)融合蛋白TAT-VP^提取。按照实施例6中的诱导表达方法发酵IL重组基因工程coli BL21 (pET-28a-TAT-VP28)，于室温4000rpm离心20min，收集并称量湿菌体。取Ig湿菌体加入到 30ml lysis buffer (1 OmM咪唑，20mM Tris-HCl, 500mM NaCl 溶解于400ml ddH20，调整 PH至7. 9，最后加ddH20定容至500ml)，于_20°C反复冻融三次，在进行超声破碎，工作 4秒，间歇4秒)，待菌液破碎至清亮。将破碎后的菌液于4°C，IOOOOrmp离心20分钟，分别收集菌体沉淀和上清液。(2) Ni-NTA Superflow柱亲和层析法纯化融合蛋白TAT-VP^。①将上述30ml上清液用滤头(微孔滤膜尺寸Φ 25mm，孔径0. 45ul)过滤，然后加入到平衡好的柱子中，用蠕动泵以lml/min的速率，4°C三次循环上样，使融合蛋白前端的Hk6与Ni2+充分结合。收集流出液，即穿漏液。(下述所有步骤均在4°C下进行)②用50ml lysis Buffer以lml/min的速率洗柱，以洗脱下柱内未与Ni2+结合的蛋白。③用50ml 含 20mM 咪唑的 Wash BufferQOmM 咪唑，20mM Tris-HCl, 500mM NaCl 溶解于400ml ddH20,调整PH至7. 9，最后加ddH20定容至500ml)以lml/min的速率洗柱，以洗脱下Ni2+柱上的非目的蛋白。④用Elute Buffer Q50mM咪唑，20mM Tris-HCl, 500mM NaCl 溶解于400ml ddH20, 调整PH至7. 9，最后加ddH20定容至500ml)以lml/^iin的速率洗柱，收集目的蛋白 TAT-VP^。一个 Eppendorf 管 1ml，收集 10 管。⑤取收集的蛋白进行丙烯酰胺浓度为12% SDS-PAGE检测纯化效果。(3)超滤浓缩纯化后的融合蛋白TAT-VP^并置换Elute Buffer。①将纯化后的蛋白用移液枪转移至超滤管(截留分子量为10KD)中，4°C，4700g离心20分钟，弃去收集管中的废液。②加入PBS(8gNaCl，0. 2gKCl，1. 44gK2HP04，0. 24gKH2P04，HCl 调 pH 值至 7. 4，加水定容至IOOOml，15磅20min灭菌处理后备用)至刻度线，4°C，4700g离心20分钟，弃去收集
管中的废液。重复次步骤3次。③不加PBS，4°C，4700g离心20分钟，弃去收集管中的废液，用200ul的移液枪小
心地收集样品。实施例8 =ELISA检测TAT-VP^蛋白的穿肠功能。(1)酶联免疫吸附测定(ELISA)相关溶液显色液
称取0. 47g柠檬酸，0. 92g Νει2ΗΡ04-12Η20，定容至100ml，即配制成底物缓冲液。临用时于底物缓冲液中加入40mg邻苯二胺、0. Iml H2O2，混勻即可。终止液2mol/L的 H2S04。PBS 缓冲液分别称取8.5g NaCl,2. 85g Na2HPO4-12H20,0. 2g KC1、0. 27g KH2PO4,加入去离子水定容至1000ml。PBST 缓冲液于1000ml PBS缓冲液中加入0. 5_2ml吐温-20。5% (质量体积比)BSA 称取0. 5g BSA，溶于IOml PBST缓冲液中。(2)实验材料实验用克氏原鳌虾(Cambarus clarkii)购自武汉市水产市场，体重15_20g左右， 购回后饲养于本实验室，饲养温度26°C左右，同时每天喂食换水一次。新购买的鳌虾于实验室至少喂养十五天待鳌虾状态稳定后方可用于实验。(3)VP28抗血清的纯化兔抗VP^蛋白的抗血清由本实验室制备，并保存于_70°C。利用^witrogen公司的ftOtein A作为亲和层析介质纯化VP^抗血清，具体步骤如下①取Iml抗血清用ftOtein A亲和层析专用的Binding Buffer稀释至IOml，于冷冻离心机中4°C、10，OOOrpm离心IOmin0②取上清，并用0. 4 μ m滤膜过滤，以备上样。③用移液器吸取ftOtein A Sepharose CL-4B填料装入层析柱至1ml，用大量去离子水冲洗填料，并用Binding Buffer平衡。④将过滤好的样品借助恒流泵以一定的流速缓慢流过平衡好的填料，并将穿漏液重复上样两次。⑤样品与填料充分结合后，用适量的Binding Buffer以一定的流速流过填料，流出液用蛋白核酸检测仪检测0D·，待OD值持续为0时即停止洗涤。⑥Elution Buffer以缓慢的速度流过填料洗脱IgGs，并将洗脱液分别收集于印pendorf管中。为了较好的保持IgGs的抗体活性，立即向每管洗脱液中加入IOOyL Neutralizing Buffer 并混勻。④SDS-PAGE电泳分析纯化的IgGs，测定IgGs的蛋白浓度。(4)抗凝血淋巴的制备将纯化并已测定浓度的TAT-VP^及VP^分别投喂鳌虾，每只鳌虾投喂200 μ L蛋白溶液。同时将只投喂PBS缓冲液的鳌虾作为阴性对照。1. 后用Iml —次性无菌注射器于鳌虾的围心腔内取血淋巴200 μ L，并立即加入含有等体积抗凝剂的印pendorf管中， 以防止血淋巴凝固。将血淋巴在离心机中于300g离心5min后，吸取上清液用于ELISA检测。鳌虾血淋巴抗凝剂(27mmol/L柠檬酸、336mmol/LNaCl、115mmol/L 葡萄糖-H20、 9mmol/L EDTA)分别称取 7. 74g 柠檬酸、19. 65g NaCl、22. 77g 葡萄糖-H20,3. 35g EDTA-Na2,加入适量去离子水使其完全溶解，并加入NaOH调pH至7. 0，最后加入去离子水定容至1000ml。(5)双抗体夹心ELISA检测抗原①将纯化的VP^抗体于PBS缓冲液中稀释100倍，并于96孔酶标板中每孔加入 100 μ L。将酶标板的小孔用封口膜封口后置于37°C恒温培养箱中温育池，使抗体包被于酶标板底部。②弃去酶标板小孔中的样品，于每空中加入100 μ L 5% (质量体积比)BSA，用封口膜封口后置于冰箱中4°C封闭过夜。③甩干酶标板小孔中的封闭液，于每孔中加入300 μ L PBST缓冲液，浸泡5min，并
间歇振动酶标板使洗涤更加充分。重复操作本步骤三次。④分别吸取抗凝血淋巴100 μ L加入酶标板小孔中，同时以只加PBS缓冲液不加抗凝血淋巴的酶标板小孔作为空白对照。将酶标板的小孔用封口膜封口后置于37°C恒温培养箱中温育lh，使血淋巴中的抗原与包被在酶标板中的抗体充分结合。⑤重复步骤(3)三次。⑥将辣根过氧化物酶(HRP)标记的VP^抗体于PBST缓冲液中稀释200倍，于酶标板小孔中每孔加入100 μ L。用封口膜封口后置于37°C恒温培养箱中温育lh，使HRP标记的VP^抗体与抗原充分结合。⑦重复步骤(3)三次。⑧于酶标板小孔中每孔中加入300 μ L PBS缓冲液，浸泡5min，并间歇振动酶标板使洗涤更加充分。⑨于酶标板小孔中每孔加入100 μ L显色液，用封口膜封口后于37°C恒温培养箱中避光显色20min。⑩于酶标板小孔中每孔加入50 μ L终止液，终止显色反应。并用酶标仪在490nm 波长下测定各孔的光吸收值。数据见下表表一双抗体夹心ELISA检测抗原VP^实验数据
权利要求
1.一种分离的基因工程融合蛋白，其序列为SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
2.一种分离的基因工程融合蛋白，其序列为SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
3.一种大肠杆菌基因工程菌株，其特征在于，该菌株为重组基因工程菌株federicAia coli BL21 (DE3) pET-28a-TAT-VP28，CCTCC NO: M2010296。
4.权利要求3所述的一种大肠杆菌基因工程菌株的制备方法，其步骤是A、WSSV的VP^基因的制备首先在冰上取患病对虾的鳃、胃和心脏，冰浴勻浆，然后加入蛋白酶K :100ug/ml，在沸水中煮15分钟，立即冰浴5分钟，12000rpm离心10分钟，取上清置4°C保存，设计PCR引物，以上清作为模板DNA，PCR扩增目的基因VP28，PCR产物通过 DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物并将其克隆到pGEM-T载体中，转化大肠杆菌JM109，挑取单菌落用碱裂解法提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含VP^ 基因的大肠杆菌，为PGEM-T-VP28，用于基因的增殖和保藏；TAT-VP28融合基因的制备通过PCR的方法扩增蛋白转导结构域多肽TAT，并与VP^ 基因融合，将PCR产物克隆到pGEM-T载体中，转化大肠杆菌JM109，挑取单菌落用碱裂解法提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含TAT-VP^基因的大肠杆菌，为pGEM-T- TAT-VP28，用于基因的增殖和保藏；C、融合基因表达载体的构建首先双酶切重组质粒pGEM-T-TAT-VP^和质粒pET_28a (+ )，胶回收含TAT-VP^基因的片段和开环pETj8a ( + )片段，16°C连接后转化到感受态 E. coli JM109中，所得到的阳性克隆子是本发明涉及的TAT-VP^融合基因的大肠杆菌，命名为 pET-28a ( + ) -TAT-VP28 ；D、大肠杆菌基因工程菌的制备将质粒ρΕΤ48ει( + )-TAT-VP^转化到感受态BL21 (DE3)中，PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为表达TAT-VP^的大肠杆菌基因工程菌株；E、基因工程融合蛋白的制备将上述活化的基因工程菌转接到乳糖自动诱导培养基中发酵，融合蛋白TAT-VP^表达。
5.权利要求1或2所述的一种基因工程融合蛋白在制备治疗或预防对虾白斑综合症病毒的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抗对虾白斑综合症病毒工程蛋白TAT-VP28及制备和用途。其序列为SEQIDNO1所示的核苷酸和SEQIDNO2所示的氨基酸序列，菌株为重组基因工程菌株EscherichiacoliBL21(pET-28a-TAT-VP28)。从对虾虾体中提取WSSV并通过PCR获得VP28基因，通过PCR的方法扩增TAT-VP28序列，然后构建重组质粒pET-28a(+)-TAT-VP28。将重组质粒pET-28a(+)-TAT-VP28转化大肠杆菌BL21(DE3)。基因工程融合蛋白在制备治疗或预防对虾白斑综合症病毒的药物中的应用。表达量大且可溶，易于工业化生产，成本低，安全性好。在预防对虾白斑综合症上有更高，更长的保护效果。
文档编号A61P31/12GK102206660SQ201010572930
公开日2011年10月5日 申请日期2010年12月3日 优先权日2010年12月3日
发明者孟小林, 宁建芳, 张毅, 徐进平, 王健 申请人:武汉凯肽来生物科技有限公司