专利名称：猫爪草抗结核的有效部位及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及中医药，尤其涉及一种猫爪草抗结核的有效部位及其制备方法和用 途。
背景技术：
结核病(TB)是当今全球范围对人类最具威胁性的感染性疾病之一，近年来，由于 耐药、耐多药(multidrugresistanttuberculosis, MDR — TO) 结核分枝杆菌的产生和传 播及结核合并HIV感染，使得曾经控制在很低水平的结核病疫情死灰复燃。较其它疾病的 治疗更易产生耐药性、治疗周期长，是结核病治疗难度大的主要原因。目前，国际公众推崇 的综合运用二联复方制剂(如Rif inah，卫肺宁)和三联复方制剂(如Rifater，卫肺特)，采用 2+4的治疗方案，依然至少需要6个月的治疗时间，而且需要联合用药，更增加了抗结核药 物的消费量及毒副反应。因此，研制新型抗结核药物来缩短治疗周期、减少化疗药物的毒副 反应及控制耐药性依然是结核病防治工作的难点、重点。
猫爪草为毛茛科毛茛属植物小毛茛ternatus Thunb.)的干燥块茎。 具有清热解毒、散结消瘀的功效，治疗肺结核、淋巴结核、咽喉炎等有显著效果。系统的化学 成分研究表明猫爪草含甾醇、Y -酮-δ -戊内酯、5-羟甲基糠醛、4-[R)rmyl-5-(methOXym ethyl)-ΙΗ-pyrrol-l-yl] butanoate等多种化合物，我们通过药理活性指导，追踪到猫爪 草抗结核的有效部位，采用系统分离的手段证实该有效部位主要含有344-0-i3-D-葡萄 糖基]-苯基]-2-丙烯酸、4-[Formyl-5-(methoxymethyl)-lH-pyrrol-l_yl] butanoate, 5-羟甲基糠醛三种成分；并通过体内、体外的药效评价证实该有效部位对结核分支杆菌标 准株、耐药结核菌株均具有显著的治疗作用，可以开发成抗结核的中药新药，对结核病的临 床治疗具有重要意义。发明内容
本发明的目的是提供一种猫爪草抗结核的有效部位及其制备方法和用途。
猫爪草抗结核的有效部位含有3- [4-0- β -D-葡萄糖基]-苯基]-2-丙烯酸、4_ [F ormyl-5-(methoxymethyl)-ΙΗ-pyrrol-l-yl] butanoate， 5-羟甲基糠醛三种组成成分。
所述的有效部位三种组成成分的含量采用HPLC法测定，其中，3-[4-0-β -D-葡萄 糖基]-苯基]-2-丙烯酸的质量百分含量为10% 15%、5_羟甲基糠醛的质量百分含量为 10% 15%>4- [Formy 1-5- (methoxymethy 1)-1 H-pyrrο 1 -1 -y 1 ] butanoate 的质量百分含量 为 70% 80%ο
所述的有效部位由猫爪草采用乙醇提取结合大孔树脂纯化的方法制得。
猫爪草抗结核的有效部位的制备方法是1重量份猫爪草加入5 15重量份的 水或含水乙醇，采用回流、超声、冷浸或渗滤方法提取2 4次，每次提取时间1 3 h，过 滤，浓缩至0. 25 2g生药/mL浓度，过滤或离心分离，上清液通过大孔树脂分离柱分离，按 生药计上清液上样量与干大孔树脂的重量比为1:3 10，上样流速1 6 BV/h，径高比为1 2 1 10，上样后的大孔树脂，依次采用水、含水乙醇洗脱，其中，水洗脱2 8个柱体积， 乙醇洗脱2 8个柱体积，洗脱流速2 8BV/h，收集乙醇洗脱液，浓缩，烘干、减压干燥、红 外干燥或微波干燥，粉碎，得到猫爪草抗结核的有效部位。
所述的含水乙醇的质量百分比浓度为30% 80%。
所述的按生药计上清液上样量与干大孔树脂的重量比为1:5 10，上样流速1 4 BV/h，径高比为1:5 1:8，上样后的大孔树脂，依次采用水、含水乙醇洗脱，其中，水洗脱 3 5个柱体积，含水乙醇洗脱3 5个柱体积，洗脱流速为2 4BV/h，。
猫爪草抗结核的有效部位用于制备治疗结核病的药物。
本发明制备的猫爪草有效部位，采用最小二倍稀释法测定体外抗结核菌实验，结 果显示其对结核分支杆菌标准株H37Rv、耐多药结核分支杆菌(MDR-TB)、全耐药结核分支 杆菌UDR-TB)均具有良好的抑制作用，最小抑菌浓度均为2. 5mg/mL。
由此方法制备的猫爪草有效部位，体内抗结核实验证实，其对荷结核杆菌小鼠具 有显著的治疗作用，能减少小鼠感染器官的荷菌数，延长生存时间。
由此方法制备的猫爪草有效部位，体内抗结核实验证实，与异烟胼联合使用能显 著减少荷结核菌小鼠感染器官的荷菌数，延长生存时间。
由此方法制备的猫爪草有效部位，添加辅料或赋形剂后，可以制成胶囊剂、片 剂、颗粒剂等药物剂型，成为治疗结核病的药物。
图1是猫爪草抗结核有效部位的高效液相(HPLC-DAD)分析图谱。
具体实施方式
下面实验例用于进一步说明但不限于本发明。
猫爪草抗结核的有效部位含有3-W-O-β -D-葡萄糖基]-苯基]-2-丙烯酸、4-[F ormyl-5-(methoxymethyl)-ΙΗ-pyrrol-l-yl] butanoate， 5-羟甲基糠醛三种组成成分。
所述的有效部位三种组成成分的含量采用HPLC法测定，其中，3-[4-0-β -D-葡萄 糖基]-苯基]-2-丙烯酸的质量百分含量为10% 15%、5_羟甲基糠醛的质量百分含量为 10% 15%>4- [Formy 1-5- (methoxymethy 1)-1 H-pyrrο 1 -1 -y 1 ] butanoate 的质量百分含量 为 70% 80%ο
所述的有效部位由猫爪草采用乙醇提取结合大孔树脂纯化的方法制得。
猫爪草抗结核的有效部位的制备方法是1重量份猫爪草加入5 15重量份的 水或含水乙醇，采用回流、超声、冷浸或渗滤方法提取2 4次，每次提取时间1 3 h，过 滤，浓缩至0. 25 2g生药/mL浓度，过滤或离心分离，上清液通过大孔树脂分离柱分离，按 生药计上清液上样量与干大孔树脂的重量比为1:3 10，上样流速1 6 BV/h，径高比为 1:2 1:10，上样后的大孔树脂，依次采用水、含水乙醇洗脱，其中，水洗脱2 8个柱体积， 乙醇洗脱2 8个柱体积，洗脱流速2 8BV/h，收集乙醇洗脱液，浓缩，烘干、减压干燥、红 外干燥或微波干燥，粉碎，得到猫爪草抗结核的有效部位。
所述的含水乙醇的质量百分比浓度为30% 80%。
所述的按生药计上清液上样量与干大孔树脂的重量比为1:5 10，上样流速1 4 BV/h，径高比为1:5 1:8，上样后的大孔树脂，依次采用水、含水乙醇洗脱，其中，水洗脱 3 5个柱体积，含水乙醇洗脱3 5个柱体积，洗脱流速为2 4BV/h，。
猫爪草抗结核的有效部位用于制备治疗结核病的药物。
实施例11重量份猫爪草加入5重量份的水或含水乙醇，采用回流提取2次，每次提取时间1 h， 过滤，浓缩至0. 25g生药/mL浓度，过滤，上清液通过大孔树脂分离柱分离，按生药计上清液 上样量与干大孔树脂的重量比为1:3，上样流速1 BV/h，径高比为1:2，上样后的大孔树脂， 依次采用水、含水乙醇洗脱，其中，水洗脱2个柱体积，乙醇洗脱2个柱体积，洗脱流速2BV/ h，收集乙醇洗脱液，浓缩，烘干、减压干燥、红外干燥或微波干燥，粉碎，得到猫爪草抗结核 的有效部位。
实施例21重量份猫爪草加入15重量份的水或含水乙醇，采用超声提取2 4次，每次提取时 间3 h，过滤，浓缩至2g生药/mL浓度，离心分离，上清液通过大孔树脂分离柱分离，按生药 计上清液上样量与干大孔树脂的重量比为1:10，上样流速6 BV/h，径高比为1:10，上样后 的大孔树脂，依次采用水、含水乙醇洗脱，其中，水洗脱8个柱体积，乙醇洗脱8个柱体积，洗 脱流速8BV/h，收集乙醇洗脱液，浓缩，烘干、减压干燥、红外干燥或微波干燥，粉碎，得到猫 爪草抗结核的有效部位。
实施例3取粉碎后的猫爪草药材2 kg，加6倍量10%乙醇，加热回流提取4次，每次lh，过滤， 合并提取液，浓缩至0. 25 g生药/mL ；过滤后通过DlOl型大孔树脂，提取液按猫爪草总苷 含量计与干树脂的比例为1:5，上柱流速lBV/h，树脂径高比为1:3 ；用水洗涤树脂:3BV，洗 脱流速为2BV/h，水洗脱液弃去；用含30%含水乙醇洗脱8BV，流速为2BV/h，收集乙醇洗 脱液；乙醇洗脱液减压浓缩至相对密度为1. 1，减压干燥，得猫爪草有效部位。HPLC法测得 3- [4-0- β -D-葡萄糖基]-苯基]-2-丙烯酸的含量为17%，5-羟甲基糠醛为35%，4- [Formy 1-5-(methoxymethyl)-ΙΗ-pyrrol-l-yl] butanoate 的含量为 40%。该有效部位粉碎，加 入5%的微粉硅胶，装入1号胶囊，即得胶囊剂。
实施例4将猫爪草饮片1kg，加15倍量80%乙醇，加热回流提取4次，每次3h，过滤，合并提取 液，浓缩至2. 0 g生药/mL ；离心后通过AB-8型大孔树脂的层析柱，提取液按猫爪草总苷含 量计与干树脂的比例为1 :10，上柱流速4BV/h，树脂径高比为1:9 ；用水洗涤树脂8BV，洗脱 流速为4BV/h，水洗脱液弃去；用含95%含水乙醇洗脱，流速为4BV/h，收集乙醇洗脱液；乙 醇洗脱液减压浓缩至相对密度为1.25，减压或喷雾干燥，得猫爪草有效部位。HPLC法测得 3- [4-0- β -D-葡萄糖基]-苯基]-2-丙烯酸的含量为11%，5-羟甲基糠醛为28%，4~ [Formy 1-5-(methoxymethyl)-ΙΗ-pyrrol-l-yl] butanoate 的含量为 50%。该有效部位粉碎，加 入5%的糊精、1%的硬脂酸镁，再加入1%的阿斯巴甜，制成颗粒剂，即得。
实施例5取粉碎后的猫爪草药材^g，加8倍量70%乙醇，加热回流提取3次，每次lh，过滤，合 并提取液，浓缩至1.0 g生药/mL ；离心(4000转/分钟)后通过AB-8型大孔树脂，药液按 猫爪草总苷含量计与干树脂的比例为1:5，上柱流速2BV/h，树脂径高比为1:5 ；用水洗涤树5脂3BV，洗脱流速为4BV/h，水洗脱液弃去；用含70%水乙醇洗脱:3BV，流速为2BV/h，收集乙 醇洗脱液；乙醇液减压浓缩至相对密度为1. 1 (50°C热测)，减压干燥，得猫爪草有效部位。 HPLC法测得344-0- β -D-葡萄糖基]-苯基]-2-丙烯酸的含量为24%，5-羟甲基糠醛为 34%,4-[Formy 1 -5-(methoxymethy 1)-1 H-pyrro 1 -1 -y 1 ] butanoate 的含量为 47%。该有效 部位粉碎，加入3%的淀粉，1%的蔗糖，压制成片，即得片剂。
实施例6猫爪草药材饮片^g，加10倍量50%乙醇，加热回流提取2次，每次1. 5h，过滤，合并 提取液，浓缩至0. 5g生药/mL ；过滤后通过D201型大孔树脂，药液按猫爪草总苷含量计与 干树脂的比例为1:9，上柱流速!3BV/h，树脂径高比为1:7 ；用水洗涤树脂5BV，洗脱流速为 4BV/h，水洗脱液弃去；用含50%水乙醇洗脱10BV，流速为4BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇 液减压浓缩至相对密度为1.25 (50°C热测)，喷雾干燥，得猫爪草有效部位。HPLC法测得 3- [4-0- β -D-葡萄糖基]-苯基]-2-丙烯酸的含量为11%，5-羟甲基糠醛为28%，4~ [Formy 1-5-(methoxymethyl)-ΙΗ-pyrrol-l-yl] butanoate 的含量为 50%。该有效部位粉碎，加 入5%的半乳糖，压制成片，即得片剂。
实施例7猫爪草药材饮片^g，加15倍量30%乙醇，加热回流提取3次，每次0. 5h,过滤，合并提 取液，浓缩至0. 25g生药/mL ；离心(8000转/分钟)后通过HPD450大孔树脂，药液按猫爪草 总苷含量计与干树脂的比例为1:6，上柱流速4BV/h，树脂径高比为1:9 ；用水洗涤树脂2BV， 洗脱流速为3BV/h，水洗脱液弃去；用含50%水乙醇洗脱5BV，流速为!3BV/h，收集乙醇洗脱 液；乙醇液减压浓缩至相对密度为1.2(50°C热测)，喷雾干燥，得猫爪草有效部位。HPLC法 测得3-W-O-β -D-葡萄糖基]-苯基]-2-丙烯酸的含量为3%，5_羟甲基糠醛为5%，4-[R) rmyl-5- (methoxymethyl) -ΙΗ-pyrrol-l-yl] butanoate 的含量为 21%。该有效部位粉碎, 加入5%的硬脂酸镁，装入2号胶囊，即得胶囊剂。
实验例1高效液相色谱法检测猫爪草有效部位中主要成分的含量 采用高效液相色谱法测定猫爪草有效部位的组成成分4-[Formyl-5-(methoxymethyl )-lH-pyrrol-l-yl] butanoate,5-羟甲基糠醛、3-[4_0-β -D-葡萄糖基]-苯基]_2_ 丙 烯酸的含量。仪器Shimadzu 20Α高效液相色谱仪-DAD紫外检测器(Japan)。色谱柱TC RP-C18色谱柱，250mmX 4. 6 mm(Aglient，USA)。流动相甲醇_0. 4%醋酸水(梯度洗脱)。洗 脱程序为:0. 01min-35min 甲醇 5%_19%，醋酸水 95%-81% ；35min_45min 甲醇 19%_19%，醋酸 水81%-81%。流速1.0 mL/min。柱温40 °C。检测波长290 nm。进样量10 μ L。保留 时间(RT):3-W-O-β-D-葡萄糖基]-苯基]-2-丙烯酸(化合物1)为8-10 min，5-羟甲基 糠酸为 12-15 min, 4-[Formyl-5-(methoxymethyl)-ΙΗ-pyrrol-l-yl] butanoate 为 39-42 min。采用外标法测定344-0-β -D-葡萄糖基]-苯基]_2_丙烯酸、5-羟甲基糠醛、4_[R) rmyl-5- (methoxymethyl) -ΙΗ-pyrrol-l-yl] butanoate 白勺含量。
实验例2猫爪草有效部位体外抗结核菌实验 材料和方法1)培养基7H9液体培养基(含10%ADC、0. 03%琼脂)。
2)药物及其处理(试管二倍稀释法)猫爪草有效部位、异烟胼(INH) 二甲基亚砜溶解制成初溶液(储备液)，流通蒸气灭菌后，使其在培养基中为所设计的浓度。
3)结核菌及其在培养基中浓度实验菌为结核分支杆菌标准株H37Rv，MDR-TB、 )(DR-TB。将在改良罗氏培养基上生长良好的菌株，用玛瑙乳钵磨成菌悬液，使其在培养基中 的浓度为IXlO5 CFU/mL。
4)培养与观察置37°C培养，以培养四周的结果为准。
结果在7H9培养基中，猫爪草有效部位针对H37Rv、耐多药结核分支杆菌(MDR-TB)、全耐药 结核分支杆菌UDR-TB)的最小抑菌浓度(MIC)均为2. 5 mg/mL，表明猫爪草有效部位对结 核菌标准株及耐药株均有良好体外抑制作用。
实验例3猫爪草有效部位体内抗结核实验1)实验动物SPF级C57BL/6小鼠，6_8周龄，雌性和雄性小鼠各半。称重，标记，随机 分组。
2)实验试剂或材料结核杆菌H37Rv毒株；改良罗氏培养基(谷氨酸钠，磷酸二氢钾，硫酸镁，枸橼酸 镁，甘油，蒸馏水，全卵液，洲孔雀绿，马铃薯淀粉)；Middlebrook 7H9液体培养基以及 Middlebrook 7H11固体培养基；生理盐水；磷酸缓冲盐溶液(PBS)；甲醛。
3)药物供试药物猫爪草有效部位；中药对照猫爪草胶囊(为市售的临床现用的治疗结核病的中成药)； 西药对照异烟胼(为市售的临床现用的治疗结核病的药物)。
4)取在改良罗氏培养基上生长2周的、并在动物体内复毒的人型结核菌H37Rv 的培养物，用研磨器磨成lmg/ml的均勻菌悬液(灭菌生理盐水溶液或PBQ。将待建结核 病模型的小鼠麻醉后，每只小鼠滴鼻10 yL上述菌悬液。
5)将建模成功的小鼠随机分组，分别为模型组、阴性对照组、猫爪草有效部位高、 中、低剂量组、中药阳性药对照组(猫爪草胶囊)、西药阳性药对照组(异烟胼)、猫爪草有效 部位高、中、低剂量加入异烟胼对照组(联合用药高、中、低剂量组)，每天灌胃给以不同浓度 的药物或蒸馏水，持续给药8周。
6 )实验结束后，测定各组小鼠感染器官-肺、脾的荷菌数。
结果对感染结核菌H37Rv的豚鼠，猫爪草有效部位能显著减少荷菌小鼠肺、脾的荷菌数，致 病指数明显降低(P < 0.01)，效果略次与异烟胼，猫爪草有效部位与异烟胼合用，致病指 数进一步降低(P < 0.001)，效果优于异烟胼(表1)。
表1猫爪草总苷及联合利福平、异烟胼对豚鼠脏器病变指数的影响权利要求
1.一种猫爪草抗结核的有效部位，其特征在于有效部位含有344-0-i3-D-葡萄糖 基]-苯基]_2_ 丙烯酸、4-[Formyl-5-(methoxymethyl)-lH-pyrrol_l-yl] butanoate， 5-羟甲基糠醛三种组成成分。
2.根据权利要求1所述的一种猫爪草抗结核的有效部位，其特征在于所述的有效部 位三种组成成分的含量采用HPLC法测定，其中，3-[4-0-β -D-葡萄糖基]-苯基]-2-丙烯 酸的质量百分含量为10% 15%、5_羟甲基糠醛的质量百分含量为10% 15%、4-Pormyl-5- (methoxymethyl) -ΙΗ-pyrrol-l-yl] butanoate 的质量百分含量为 70% 80%。
3.根据权利要求1所述的一种猫爪草抗结核的有效部位，其特征在于所述的有效部 位由猫爪草采用乙醇提取结合大孔树脂纯化的方法制得。
4.一种如权利要求1所述的猫爪草抗结核的有效部位的制备方法，其特征在于1重量 份猫爪草加入5 15重量份的水或含水乙醇，采用回流、超声、冷浸或渗滤方法提取2 4 次，每次提取时间1 3 h，过滤，浓缩至0. 25 2g生药/mL浓度，过滤或离心分离，上清液 通过大孔树脂分离柱分离，按生药计上清液上样量与干大孔树脂的重量比为1:3 10，上 样流速1 6 BV/h,径高比为1 2 1 10，上样后的大孔树脂，依次采用水、含水乙醇洗脱， 其中，水洗脱2 8个柱体积，乙醇洗脱2 8个柱体积，洗脱流速2 8BV/h，收集乙醇洗 脱液，浓缩，烘干、减压干燥、红外干燥或微波干燥，粉碎，得到猫爪草抗结核的有效部位。
5.根据权利要求4所述的一种猫爪草抗结核的有效部位的制备方法，其特征在于所 述的含水乙醇的质量百分比浓度为30% 80%。
6.根据权利要求4所述的一种猫爪草抗结核的有效部位的制备方法，其特征在于所 述的按生药计上清液上样量与干大孔树脂的重量比为1:5 10，上样流速1 4 BV/h，径 高比为1 5 1 8，上样后的大孔树脂，依次采用水、含水乙醇洗脱，其中，水洗脱3 5个柱 体积，含水乙醇洗脱3 5个柱体积，洗脱流速为2 4BV/h。
7.—种如权利要求1所述的猫爪草抗结核的有效部位的用途，其特征在于用于制备 治疗结核病的药物。
全文摘要
本发明公开了一种猫爪草抗结核的有效部位及其制备方法和用途，该有效部位主要含有3-[4-O-β-D-葡萄糖基]-苯基]-2-丙烯酸、4-[Formyl-5-(methoxymethyl)-1H-pyrrol-1-yl]butanoate，5-羟甲基糠醛，该有效部位是采用猫爪草提取经大孔树脂富集而成。运用HPLC法制定了该有效部位的质量标准其中，3-[4-O-β-D-葡萄糖基]-苯基]-2-丙烯酸的含量在10%-15%之间、5-羟甲基糠醛的含量在10%-15%之间、4-[Formyl-5-(methoxymethyl)-1H-pyrrol-1-yl]butanoate的含量在70%-80%之间，该有效部位可以制备抗结核菌及耐药结核菌的药物，并可与临床现有治疗结核的药物联合使用，提高治疗效果及降低复发率。
文档编号A61K36/71GK102028764SQ20101060638
公开日2011年4月27日 申请日期2010年12月27日 优先权日2010年12月27日
发明者应弘梅, 张琳, 戚中杰, 田景奎, 荣语媚, 陈润泽 申请人:浙江大学