专利名称：含有源自包括野山参或人参的人参类形成层植物干细胞系作为活性成分的增强免疫用组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于增强免疫的组合物，该组合物含有源自人参类形成层细胞系、其裂解物、其提取物或其培养液作为活性成分。
背景技术：
免疫大体上可分为出生就具有的先天免疫(innate immunity)和适应后天生活过程等中获得的后天免疫(acquired immunity)两大类。在此，先天免疫又称为“自然免疫”，其对抗原进行非特异性反应，且不具有特定的免疫记忆。先天免疫系统包括阻断抗原入侵的皮肤、粘液组织、低PH值胃酸，承担噬菌作用去除侵入体内入侵者的巨噬细胞 (macrophage)、多形核白细胞等噬菌细胞。这种先天免疫实际上防止了大部分感染。另外， 后天免疫由于对第一次入侵抗原具有记忆功能，当再次发生入侵时，其具有进行特异性反应有效去除抗原的特点。一旦上述免疫功能降低就可能发生如下多种免疫疾病哮喘、季节性或常年性鼻炎、过敏性鼻窦炎、结膜炎、过敏性皮炎、荨麻疹、红细胞溶血、急性肾小球肾炎等。对上述免疫疾病的预防要比治疗重要，但实际上通过服用现在市面销售的治疗剂来进行预防是比较困难的。因此需要一种无需服用可能有副作用的免疫增强剂也能预防和治疗免疫紊乱的方法。一直以来，人们进行了大量的能够预防和治疗免疫紊乱的新药物的研究和制剂开发工作，尤其是集中关注于有关副作用小的天然物抗癌物质的开发的研究上。曾经开发出用于增强免疫的源自韩国产海藻类的用于增强免疫的提取物(韩国公开专利 10-2000-00063617)，但是对优异的源自天然物的免疫增强剂的需求仍然从没有间断过。另外，增强免疫功能的免疫增强剂的概念由罗曼(Roman)提出，随着“比起单纯的疫苗给药，如果同时进行某种增强免疫物质和疫苗的给药，疫苗效果会增强”这一观点的明确而开始被大家所了解。而且，免疫增强剂是指能够提高宿主的特异或非特异免疫反应和细胞性免疫及体液性免疫反应的所有物质，最近，随着将免疫强化应用于感染或肿瘤的治疗中，引起了人们对免疫增强剂的极大关注。因此，发明人为了开发出一种在最小化副作用的同时，能够预防和治疗免疫紊乱的新的用于增强免疫的组合物而努力研究的结果，确认了从包括野山参和人参的人参类形成层中诱导出的同质细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液能够增强NK细胞活性，并且以抗原特异性方式提高了淋巴结细胞的增殖速度，由此完成了本发明。
发明内容
本发明目的在于提供一种使现有免疫增强剂的副作用最小化并且显示出增强免疫活性的源自天然物的组合物。为了实现上述目的，本发明提供一种用于增强免疫的组合物，该组合物含有获自人参类(Panax ginseng)形成层且为天然未分化(innately undifferentiated)状态的细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的任意一种或一种以上。本发明还提供一种用于增强免疫的功能性食品，该功能性食品含有上述细胞系、 其裂解物、其提取物及其培养液中的任意一种或一种以上。本发明还提供一种增强动物免疫的方法，其特征在于，使用上述细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的任意一种或一种以上进行给药。本发明还提供一种上述细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的任意一种或一种以上的用于增强免疫的用途。本发明还提供一种用于预防或治疗贫血的组合物，其含有上述细胞系、其裂解物、 其提取物及其培养液中的任意一种或一种以上。本发明还提供一种预防或治疗贫血的方法，上述方法包括应用上述细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的任意一种或一种以上的步骤。本发明还提供一种上述细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的任意一种或一种以上用于预防或治疗贫血的用途。通过以下详细说明及附加的权利要求书，本发明的其它特征和具体实施方式
将更加清楚。
图1为一组照片，示出了本发明细胞系的分离过程(a)和源自野山参形成层的细胞系((b)A)及源自人参子叶的愈伤组织的细胞系(韩国典型菌种保藏中心，KCTC PC10224)((b) B)。图2为本发明细胞系的给药前及给药14天后，对照组(A)和实验组(B、C)的体重测量图。图3为本发明细胞系的给药前及给药14天后，对照组㈧和实验组(B、C)的脾细胞数测定结果图。图4为本发明细胞系的给药前及给药14天后，对照组(A)和实验组(B、C)的胸腺细胞数测定结果图。图5为本发明细胞系的给药前及给药14天后，对照组㈧和实验组(B、C)的NK 细胞活性测定结果图。图6为本发明细胞系的给药前及给药14天后，表示当E T比为10 1、20 1 及40 1的实验结果的测定对照组(A)和实验组(B、C)中的NK细胞活性图。图7为本发明细胞系的给药前及给药沈天后，对照组(野山参)和实验组(A细胞，A培养液)中的NK细胞活性测定结果图。图8为表示本发明细胞系在给药10天后，经抗原刺激后对小鼠淋巴结增殖带来的影响的图。图9为本发明细胞系的给药前及给药14天后，对照组㈧和实验组(B、C)的骨髓细胞数测定结果图。图10为本发明细胞系在给药沈天后，对照组(野山参)和实验组(A细胞，A培养液)的骨髓细胞数测定结果图。
图11及12示出了在给药本发明源自野山参形成层的细胞系给药前后，测定的血红蛋白、血小板、红细胞及白细胞的数值测定结果。
具体实施例方式在没有用其它方式进行定义的前提下，本发明中所使用的全部技术和科学术语都具有如本领域普通技术人员所通常理解的那样的相同含义。一般来讲，本说明书中所使用的命名法为本领域公知的并且常规适用于本领域。本发明详细说明等中所使用的关于主要术语的定义如下。在本申请中，“形成层(cambium)，，是指使植物的茎和根变粗，能够使植物材积生长的组织。据报道，形成层作为细胞分裂最为活跃的分生组织，用作植物组织培养的外植体时，能够快速大量地生成细胞(韩国专利No. 0533120)。本申请中，“裂解物”是指通过使用去垢剂(detergent)等化学方法或物理方法等破坏细胞，从而获得的细胞溶解物。细胞系的“提取物”是指将细胞溶解于溶剂后进行分离后获得的物质，所述提取物可以通过蒸馏或蒸发进行浓缩。在本申请中，细胞系的概念包括根据培养条件进行分化的细胞系或有用物质的生产能力和/或分泌能力得到提高的细胞系。此外，术语“培养液”是指细胞培养后，除细胞之外剩余的细胞培养液。本申请中“天然未分化状态(innately undifferentiated) ”并非指经过脱分化过程并以未分化状态存在的，而是指从最初开始就维持分化之前的状态。本发明的一个观点是本发明涉及一种用于增强免疫的组合物，其含有源自人参类(Panax ginseng)形成层的细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的任意一种或一种以上作为活性成分。在本发明中，人参类(Panax ginseng)包括野山参或人参(Lian M.L.等·，J.Plant Biology, 45 :201,2002 ； Han J. Y.等.，J.Plant Biology, 49 :26,2006 ； Teng W. L.等，Tissue and Organ Culture，68 :233，2002)。此时，本发明中的上述野山参或人参包括露天人参或组织培养的人参类(不定根和源自不定根的细胞系)。本发明中源自人参类形成层的细胞系，其特征为天然未分化状态。此时，上述细胞系进一步进行悬浮培养时其特征在于，以单细胞水平存在。其中“悬浮培养时单细胞水平” 是指与源自人参类形成层之外的组织细胞系或在脱分化的愈伤组织中诱导出的细胞等相比，在悬浮培养时，表示为以单细胞数量更多或以直径更小的细胞团块(cell aggregates) 方式存在。另外，还具有如下特征(a)其形态学特征为具有多个液泡(vacuole) ； (b)同源自人参类形成层之外的组织细胞系相比，在生物反应器中对剪应力(shear stress)具有低敏感性；及(c)同源自人参类形成层以外的组织细胞系相比，生长速度快且能够稳定培养。 另外，还具有上述细胞系为同质细胞系的特征。在本发明中，上述细胞系的特征在于根据包括如下步骤的分离方法获得(a)获得含有人参类形成层的贮藏根组织；(b)在含有IAA (3-吲哚乙酸)或IBA (3-吲哚丁酸)的培养基中进行培养，诱导源自形成层的细胞系，其中，在该培养过程中或培养前期或后期向上述含有形成层的组织施加渗透胁迫；以及(c)收集上述被诱导的源自形成层的细胞系。此时，在上述步骤(b)中，上述渗透胁迫工序是为了形成层特异性诱导细胞系而进行的，优选在包括上述IAA或IBA的培养基中进行培养之前进行，这样，在形成层之外的一般组织，即皮层(cortex)、韧皮部(phloem)、木质部(xylem)、木髓(pith)会丧失分化潜能(differentiation potential)，从而使它们在后续的用IAA或IBA等形成层分裂特异性激素进行培养时坏死。此时将渗透剂的含量控制为0. 5-2M，优选为在冷藏或常温条件下施加16至M小时的渗透胁迫处理后，去除渗透胁迫。但是由于渗透剂的浓度、处理时间和温度按照不同植物、不同组织的状态而不同，因此并不限于此。还有，在上述步骤(b)中，上述 IAA或IBA的含量优选为含有0. l-5mg/L。另外，在上述步骤(C)中，其特征在于优选为将被诱导的源自形成层的细胞系在含有选自2，4-W2，4-二氯苯氧乙酸)、毒莠定(picloram)和IBA中的一种或一种以上的培养基内进行增殖，然后回收源自形成层的细胞系。此时，上述2，4-D、毒莠定及IBA中任一种含量优选为l_5mg/L，更优选为以2mg/L的含量使用。另外，其特征还在于，进一步包括在含有激发子的培养基中培养所述步骤(C)中收集的细胞系并收集细胞系的步骤。这样的激发子为选自如下物质组成的组粗糖或食糖； 以及茉莉铜酸甲酯(methyl jasmonate)、真菌类提取物、细菌类提取物、酵母(yeast)提取物、壳聚糖、葡甘露聚糖(glucomanan)、葡聚糖(glucan)、苯基丙氨酸(phenylalanine)、 苯甲酸(benzoic acid)、水杨酸(salicylic acid)、花生四烯酸(arachonic acid), STS、 甲羟戊酸(mevalonate)、N-苯甲酰基甘氨酸(N-benzoylglycine)、ABA、SNP, IPP, BHT, CCC> Z^MM (ethephon)、马尿酸(hippuic acid)、石肖酸 I安(amminoium eerie nitrate) > AgN03、硫酸氧钒(vanadyl sulfate)、对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)、油菜素类固酉享(brassinosteroids)、海藻酸钠(sodium alginate)、乙酸钠(sodium acetate)。另夕卜， 作为激发子，可进行紫外线、热、光、光周期、剪应力、乙烯、抗真菌剂、抗生素、重金属盐及高浓度盐等处理，从而施加物理、化学应力。优选使用茉莉铜酸甲酯或粗糖。此时，作为激发子而添加的粗糖或茉莉铜酸甲酯的添加浓度可优选为粗糖按照3-5重量％ (g/L)添加，茉莉铜酸甲酯按照50-150 μ M的浓度添加。本发明中所使用的培养基为通常进行植物组织培养时使用的培养基，可例举Ν6 培养基、SH培养基、MS培养基、AA培养基、LS培养基、Β5培养基、WPM培养基、LP培养基、怀特培养基，GD培养基、DKff培养基、DCR培养基，但不限于此。本发明中，上述提取物，其特征在于其是使用蒸馏水、一元醇、丙酮、DMSO(二甲基亚砜)以及它们的混合溶剂所组成的组中选出的溶剂进行提取的。此时，上述一元醇可以使用甲醇、乙醇等碳原子数为1-5的醇。在本发明的一个实施例中确认了如下结果通过源自本发明人参类形成层细胞系的给药，承担先天性免疫的细胞，即NK细胞的活性大大增强。已知NK细胞在抗肿瘤免疫反应和抗病毒免疫反应中发挥非常重要的作用。尤其是在使用经过作为激发子的粗糖及茉莉铜酸甲酯处理的培养基中进一步培养后获得的源自野山参形成层的同质性细胞系时，显示为NK细胞活性增加幅度更大。此外，在本发明其它实施例中，同进行野山参培养根给药的对照组相比，可以确认进行源自本发明人参类形成层的细胞系及其培养液的给药时，NK细胞活性得以增强，由此可知源自本发明人参类形成层的细胞系及其培养液的增强免疫效果更为优异。另外，在本发明及其它实施例中，源自本发明人参类形成层的细胞系给药结果如下将之前暴露的抗原被重新导入时，淋巴结细胞数量更加显著地快速增加，由此可确认本发明的细胞系具有提高抗原特异性淋巴结细胞增殖速度的效果。因此可确认，源自本发明人参类形成层的细胞系是一种能够增强先天免疫及后天免疫的优异的免疫增强剂。并且，在本发明中即使没有能够揭示含有上述细胞系裂解物、提取物或培养液的组合物显示免疫增强效果的具体实施例，但如上所述，能够确认上述细胞系具有免疫增强活性，所以含有本发明细胞系裂解物、提取物或培养液的组合物也能够显示免疫增强效果，这对具有通常知识的本领域技术人员而言是显而易见的。含有本发明细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的一种或一种以上的用于增强免疫的组合物，可以分别单独含有上述细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的一种或一种以上，或者可以进一步含有药用的载体、赋形剂、或稀释剂中的一种以上作为药物组合物来提供。药物组合物中的上述细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液可以根据疾病及其病重程度、患者的年龄、体重、健康状态、性别、给药途径和治疗期限等以药学上有效的量适当地含有。上述的术语药用组合物是指生理上允许并对人体给药时，通常情况下不发生胃功能障碍、眩晕等过敏反应或与之类似反应的组合物。上述载体、赋形剂及稀释剂可例举乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石粉、硬脂酸镁及矿物油等。上述药物组合物还可以含有填充剂、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、香料、乳化剂及防腐剂等。另外，可利用本领域的公知方法将本发明中的组合物制成制剂，从而对哺乳动物给药后活性成分能够迅速、持续或延缓释放。剂型可为粉末、颗粒、片剂、乳剂、糖浆、气雾剂、软质或硬质明胶胶囊、灭菌注射液、灭菌粉末等形态。同时，源自本发明人参类形成层的细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液能够作为食品添加剂进行使用。因此，从其它观点来讲，本发明涉及用于增强免疫的功能性食品， 该功能性食品含有来自上述人参类形成层的细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的一种或一种以上。本申请中的“功能性食品”意味着通过向普通食品添加本发明中的细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液来提高食品功能性。另外，已确认在本发明其它实施例中，经过源自本发明人参类形成层的细胞系给药能够有效增加骨髓细胞数量。同时，还可确认与普通野山参制品(野山参培养根)相比， 本发明的细胞系及培养液的给药能够更有效地增加骨髓细胞数量。目前在进行癌的放疗和化疗时，由于抑制骨髓血细胞生成的副作用，必然存在免疫功能下降的问题。本发明细胞系显示能够增加骨髓细胞数量，显然本发明的细胞系、该细胞系的裂解物、提取物及培养液作为能够阻止这种免疫功能下降的免疫增强剂是非常有效的。此外，这种骨髓细胞增加意味着本发明的细胞系具有强化造血功能的作用，这种造血功能的强化起到预防和治疗贫血的作用。因此，从其它观点来讲，本发明涉及一种用于预防或治疗贫血的组合物，该组合物含有源自上述人参类形成层的细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的一种或一种以上。实施例以下，通过实施例对本发明进行更为详细的说明。具有通常知识的本领域技术人员应该明白，这些实施例仅用于对本发明进行举例说明，不对本发明范围进行任何限制。尤其是，在以下实施例中，虽然只确认了来自野山参形成层的细胞系及其培养液的免疫增强作用，但使用其裂解物或其提取物也能获得相同结果，这对具有通常知识的本领域技术人员来讲是显而易见的。实施例1.制备源自人参类形成层的同质细胞系1-1 准备植物材料图1(a)的A显示了本发明中所使用野山参的典型外观。准备好野山参(江原道产)后，为了使用野山参的主根部分，用流水去除附在外表面的土或其它污染物，再用液体去垢剂清洗主根表面，之后放到流水中。将清洗干净的组织放入到洁净工作台上准备好的经过灭菌处理的烧瓶中，用70 %的乙醇灭菌30秒至1分钟左右。之后用无菌水漂洗，用1 % 至1. 5%次氯酸钠(sodium hypochlorite, Junsei,日本)消毒液进行5-15分钟左右的消毒处理。此时，为了使消毒液能够有效地渗透到组织内，滴入几滴TWEEN 20(聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯，Junsei,日本)该处理过程结束后，使用无菌水漂洗3至5次左右。然后，为了防止经灭菌处理后组织的褐变，将灭菌后的主根放入包含抗氧化剂的BIM(褐变抑制培养基)中进行30分钟至1小时左右的振荡培养，然后放到灭菌的滤纸上除去水分。使用的BIM的组成与使用浓度参见表1。表1 BIM的组成及使用浓度
权利要求
1.一种用于增强免疫的组合物，其特征在于，其含有获自人参类(Panax ginseng)形成层且为天然未分化状态(innately undifferentiated)的细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的一种或一种以上。
2.根据权利要求1所述的用于增强免疫的组合物，其特征在于，所述细胞系进行悬浮培养时以单细胞水平存在。
3.根据权利要求1所述的用于增强免疫的组合物，其特征在于，所述细胞系还具有如下特征(a)其形态学特征为具有多个液泡(vacuole)；(b)同源自人参类形成层以外的组织的细胞系相比，在生物反应器中对剪应力(shear stress)具有低敏感性；及(c)同源自人参类形成层以外的组织的细胞系相比，生长速度快且能够稳定培养。
4.根据权利要求1所述的用于增强免疫的组合物，其特征在于，所述细胞系是采用包括如下步骤的分离方法获得的(a)获得含有人参类形成层的贮藏根组织；(b)在含有IAA(3-吲哚乙酸)或IBA (3-吲哚丁酸)的培养基中进行培养，诱导源自形成层的细胞系，其中，在该培养过程中或培养前期或后期向上述含有形成层的组织施加渗透胁迫；以及(c)回收上述被诱导的源自形成层的细胞系。
5.根据权利要求4所述的用于增强免疫的组合物，其特征在于，所述步骤(c)中，将被诱导的源自形成层的细胞系在含有选自2，4-^2，4-二氯苯氧基乙酸)、毒莠定(picloram) 和IBA中的一种或一种以上的培养基内进行增殖，然后收集源自形成层的细胞系。
6.根据权利要求4所述的用于增强免疫的组合物，其特征在于，其进一步包括在含有激发子的培养基中培养所述步骤(c)中收集的细胞系并收集细胞系的步骤。
7.根据权利要求6所述的用于增强免疫的组合物，其特征在于，所述激发子是粗糖或茉莉铜酸甲酯。
8.根据权利要求1所述的用于增强免疫的组合物，其特征在于，所述提取物是使用选自下组的溶剂提取细胞系获得的蒸馏水、一元醇、丙酮、二甲基亚砜(Dimethyl Sufoxide, DMS0)及它们的混合物。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的用于增强免疫的组合物，其通过增加NK细胞活性具有免疫增强作用。
10.根据权利要求6或7所述的用于增强免疫的组合物，其通过增加抗原特异性淋巴结细胞数具有免疫增强作用。
11.一种用于增强免疫的的功能性食品，其特征在于，其含有获自人参类形成层且为天然未分化状态的细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的一种或一种以上。
12.根据权利要求11所述的用于增强免疫的功能性食品，其特征在于，所述细胞系进行悬浮培养时以单细胞水平存在。
13.根据权利要求11所述的用于增强免疫的功能性食品，其特征在于，所述细胞系是采用包括如下步骤的分离方法获得的(a)获得含有人参类形成层的贮藏根组织；(b)在含有IAA(3-吲哚乙酸)或IBA (3-吲哚丁酸)的培养基中进行培养，诱导源自形成层的细胞系，其中，在该培养过程中或培养前期或后期向上述含有形成层的组织施加渗透胁迫；以及(c)收集上述被诱导的源自形成层的细胞系。
14.根据权利要求13所述的用于增强免疫的功能性食品，其特征在于，其进一步包括在含有激发子的培养基中培养所述步骤(c)中收集的细胞系并收集细胞系的步骤。
15.一种增强动物免疫的方法，其特征在于，使用获自人参类形成层并为天然未分化状态的细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的一种或一种以上。
16.根据权利要求15所述增强动物免疫的方法，其特征在于，所述细胞系在悬浮培养时以单细胞水平存在。
17.根据权利要求15所述增强动物免疫的方法，其特征在于，所述细胞系是采用包括如下步骤的分离方法获得的(a)获得含有人参类形成层的贮藏根组织；(b)在含有IAA(3-吲哚乙酸)或IBA (3-吲哚丁酸)的培养基中进行培养，诱导源自形成层的细胞系，其中，在该培养过程中或培养前期或后期向上述含有形成层的组织施加渗透胁迫；以及(c)收集上述被诱导的源自形成层的细胞系。
18.根据权利要求17所述增强动物免疫的方法，其特征在于，其进一步包括在含有激发子的培养基中培养所述步骤(c)中收集的细胞系并收集细胞系的步骤。
19.一种用于预防或治疗贫血的组合物，其特征在于，其含有获自人参类形成层且为天然未分化状态的细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的一种或一种以上。
20.根据权利要求19所述的用于预防或治疗贫血的组合物，其特征在于，所述细胞系在悬浮培养时以单细胞水平存在。
21.根据权利要求19所述的用于预防或治疗贫血的组合物，其特征在于，所述细胞系是采用包括如下步骤的分离方法获得的(a)获得含有人参类形成层的贮藏根组织；(b)在含有IAA(3-吲哚乙酸)或IBA (3-吲哚丁酸)的培养基中进行培养，诱导源自形成层的细胞系，其中，在该培养过程中或培养前期或后期向上述含有形成层的组织施加渗透胁迫；以及(c)收集上述被诱导的源自形成层的细胞系。
22.根据权利要求21所述的用于预防或治疗贫血的组合物，其特征在于，其进一步包括在含有激发子的培养基中培养所述步骤(c)中收集的细胞系并收集细胞系的步骤。
全文摘要
本发明涉及一种用于增强免疫的组合物，该组合物含有源自包括野山参、人参在内的人参类(Panax ginseng)形成层细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液作为活性成分。由于本发明的组合物的细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液源自天然物，因此其不仅将现有的免疫增强剂的副作用降至最低，对人体安全的同时有效增强了具有先天免疫功能的NK细胞的活性。同样，当本发明的组合物的细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液在特异性免疫反应中再暴露于抗原中时，能够大大增加淋巴结细胞的增殖速度，此表明其也具有增强后天免疫反应的效果，因此其作为免疫增强剂非常有效。尤其是，其还可以有效增加骨髓细胞的数量，因此不仅作为免疫反应佐剂非常有效，而且还可用于由于造血作用所引起的贫血的预防及治疗。
文档编号A61P37/00GK102325538SQ201080008985
公开日2012年1月18日 申请日期2010年2月23日 优先权日2009年2月23日
发明者李银庆, 林敏贞, 陈英雨 申请人:云火公司