专利名称：作为补体抑制剂的经修饰的omci的制作方法
技术领域：
本发明涉及可用于治疗补体介导的疾病和病症的新颖组合物，且特别涉及经修饰的源自蜱的特异性补体抑制剂及其在治疗补体介导的疾病和病症中的应用。
背景技术：
补体系统是重要的固有免疫防御系统。其参与保护身体不受外界因子侵害，并参与炎症进程。已知有超过30种血清和细胞表面蛋白参与补体系统的功能和调控。补体的激活有三种途径经典途径、旁路途径和凝集素途径。经典途径由IgM或 IgG复合物或者碳水化合物激活。旁路途径由非自身表面和细菌内毒素激活。凝集素途径由与病原体表面上的甘露糖结合的甘露聚糖结合凝集素(MBL)激活。补体的三种途径包括并行的级联反应，其中相似形式的C3-转化酶和C5-转化酶分别裂解并活化成分C3和C5， 从而产生C3a和C3b以及C5a和C5b。这些具活性的补体片段负责介导多种免疫效应。C3a和Cfe触发肥大细胞的脱颗粒，并提高血管渗透性和平滑肌收缩。Cfe还充当趋化蛋白并募集免疫细胞。Ob发挥调理作用并提高对病原体的吞噬。(恥负责启动攻膜复合物(MAC)的形成。在健康的个体中，这三种补体途径的激活在生理条件下受到精细调控。鉴于补体在免疫系统中的重要作用以及不适当的补体激活的后果，存在多种机制共同作用来调控补体途径的激活。补体途径的主要调控因子是补体调节蛋白。这些蛋白在血浆中的表达浓度高于补体成分本身。一些补体调节蛋白表达于身体自身细胞的表面，从而防止这些细胞不适当地成为补体的靶标。此外，很多具活性的补体成分，例如C3a和C5a，其半衰期很短，并因此在其活化后在血浆中仅具有短期的活性。调控补体激活的调节机制的失效可以对身体自身的组织造成伤害。已显示补体调节机制的失效与多种病理上的病症和疾病有关。已知与补体途径缺乏调节有关的病症包括老年性黄斑变性(AMD)、阿尔茨海默病、变态反应性脑脊髓炎、同种异体移植、包括类风湿性关节炎在内的各种关节炎、哮喘、成人型呼吸窘迫综合征、灼伤、癌、克罗恩氏病、皮肤肌炎、肾小球性肾炎、溶血性贫血、血液透析、遗传性血管性水肿、特发性膜性肾病、宫内生长受限(IUGR)、缺血再灌注损伤、运动神经元疾病、多系统器官衰竭、多发性硬化、重症肌无力、心肌梗塞、肾炎、类天疱疮、心肺转流术后、干癣、败血性休克、自然流产、中风、系统性红斑狼疮、葡萄膜炎、血管渗漏综合征和异种移植。由于对补体途径的精细调控的重要性，对于用于预防或治疗已知与补体调控失效有关的病症和疾病的补体抑制剂的开发已有很多关注。研究已致力于开发特定补体成分的抗体、RNA适体和靶向补体受体的分子。类二十烷酸(eicosanoid)是一族已氧化的具生物活性的脂类中介因子，其源自 20碳脂肪酸花生四烯酸(AA)并诱发对各种细胞类型和器官的多种效应。白细胞三烯(LK) 是具有多种效果的类二十烷酸亚族，所述效果包括调节毛细血管和微静脉的血管紧张度和渗透性、使肌肉收缩或松弛(半胱氨酰LK)、控制恶性细胞的生长和/或扩散(^Awartz等，2005 ；Aya, 2006)和活化白细胞，特别是在自身免疫和炎症病症(LK，HETE)中(Samuelsson， 1983 ；Kim 等，2006)。白细胞三烯B4(LTB4)是已描述的最有效的具趋化性和化学激动性的类二十烷酸， 并促使嗜中性粒细胞通过上调整联蛋白而黏附至血管内皮(Hoover等，1984)。其还是嗜中性粒细胞的完全促分泌素，诱使嗜中性粒细胞聚集并提高微血管的渗透性。LTB4募集并活化自然杀伤细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞。其增加超氧自由基的形成(Harrison和 Murphy, 1995)，并调节基因表达，所述基因表达包括可以扩大和延长组织炎症的大量促炎细胞因子和中介因子的产生(Ford-Hutchinson，1990 ;Showell等，1995)。LTB4还在诱导和管理适应性免疫应答中起作用。例如，调节向引流淋巴结迁移的树突状细胞(Klaas等， 2005 ；Del Prete 等，2007)、Th2 细胞因子 IL-13 从肺 T 细胞的产生(Miyahara 等，2006)、 抗原特异性效应CD8+T细胞的募集(Taube等，2006)和人类B淋巴细胞的活化及增殖 (Yamaoka 等，1989)。W02004/106369 描述了一种源自软蜱(毛白钝缘蜱(Ornithodoros moubata)) 的补体(C)抑制剂OmCI，其通过与补体成分C5直接结合来同时抑制经典和旁路补体途径 (Nurm等，200 。OmCI源自食血性节肢动物的唾液腺。已证明其具有治疗潜力Ofepburn 等，2007)。最近已据显示，OmCI可结合类二十烷酸，特别是LK，尤其是LTB4。
发明内容
已据显示能够修饰OmCI来降低或消除其白细胞三烯/羟基类二十烷酸(LK/E)结合活性。特别的是，本发明人已示出，在特定残基处修饰OmCI多肽可降低或消除LK/E结合活性。因此，本发明涉及缺乏LK/E结合活性的经修饰的OmCI多肽，且涉及编码这种经修饰的OmCI多肽的多核苷酸。特别的是，本发明涉及因对OmCI结合口袋内特定残基的修饰而缺乏LK/E结合活性的OmCI多肽，且涉及编码所述多肽的多核苷酸。本发明还涉及结合补体成分但不结合LK/E的OmCI多肽。这种经修饰的OmCI多肽、或编码这种经修饰的OmCI 多肽的多核苷酸充当补体抑制剂，并且可以用于预防或治疗补体介导的疾病和病症且不干扰LK/E的作用。因此，本发明的一个方面提供缺乏LK/E结合活性的OmCI多肽。根据本发明的优选实施方式，所述OmCI多肽含有(a)氨基酸序列SEQ ID NO :3，其已经过修饰而消除了 LK/E结合活性；(b)与氨基酸序列SEQ ID NO 3的一致性至少为60%的变体氨基酸序列，其已经过修饰而消除了 LK/E结合活性；(c) SEQ ID NO 2的变体氨基酸序列，所述变体氨基酸序列与SEQ ID NO 2的氨基酸残基19至168间的氨基酸序列的一致性至少为60%，且其已经过修饰而消除了 LK/E结合活性；或(d)缺乏LK/E结合活性的氨基酸序列(a)、(b)或(c)的片段。本发明还提供编码本发明的OmCI多肽的多核苷酸。本发明还提供包含本发明的多核苷酸的载体。本发明还提供包含本发明的多核苷酸或载体的宿主细胞。本发明还提供药物组合物，所述药物组合物包含药物可接受的载剂和以下物质缺乏白细胞三烯/羟基类二十烷酸(LK/E)结合活性的OmCI多肽；编码缺乏白细胞三烯/ 羟基类二十烷酸(LK/E)结合活性的OmCI多肽的多核苷酸；或包含编码缺乏白细胞三烯/ 羟基类二十烷酸(LK/E)结合活性的OmCI多肽的多核苷酸的载体。本发明还提供用于治疗补体介导的疾病或病症的组合物，所述组合物包含缺乏白细胞三烯/羟基类二十烷酸(LK/E)结合活性的OmCI多肽；编码缺乏白细胞三烯/羟基类二十烷酸(LK/E)结合活性的OmCI多肽的多核苷酸；或包含编码缺乏白细胞三烯/羟基类二十烷酸(LK/E)结合活性的OmCI多肽的多核苷酸的载体。本发明还提供治疗或预防有此需要的受试者的由补体介导的疾病或病症的方法， 所述方法包括向受试者施用治疗有效量的缺乏白细胞三烯/羟基类二十烷酸(LK/E)结合活性的OmCI多肽或编码缺乏白细胞三烯/羟基类二十烷酸(LK/E)结合活性的OmCI多肽的多核苷酸。
图1 结合有棕榈油酸(图中央)的经细菌表达的OmCI (bOmCI)的晶体结构局部。图2 酶免疫测定(EIA)，显示了 41. 2yg bOmCI与12 (S)-HETE的结合，即在将 12500pg/ml的12 (S)-HETE单独预温育或与PBS、OmCI, RaHBP2预温育20分钟后溶液中 12(S)-HETE(pg/ml)。图3 :b0mCI和LTB4的吸收光谱。(A)添加OmCI前溶液中的LTB4 (上部线)，和添加并随后通过超滤除去bOmCI:LTB4复合物后对同一溶液的重新测量(下部线)；(B)通过超滤浓缩至200 μ 1后的bOmCI LTB4复合物(上部线)和仅bOmCI (下部线)。图4 :结合有LTB4(图中央)的bOmCI的晶体结构细节。在C_5和C-12的羧基和羟基处，示出了 LTB4的氧原子。这些基团与结合腔中的氨基酸之间形成氢键(虚线)(参见实施例3的文字)。图5 对在细菌中表达的重组OmCI中存在的脂肪酸的气相色谱分析。通过质谱测定和与参照标准的比较，确认了棕榈油酸和反油酸的存在。图6 结合口袋被大氨基酸色氨酸封闭了的突变0mCI(y0mCI-F36W和y0mCI-G59W) 在一定的蛋白浓度范围内显示出明显低于野生型yOmCI的与LTB4的结合。图7 经典途径的溶血测定，其对RaHBP2(阴性对照蜱脂质运载蛋白，其不抑制补体)、野生型重组OmCI、以及不与LTB4结合的突变的y0mCI-F36W及y0mCI_G59W进行了比较。图8 结合口袋被大氨基酸色氨酸(W)封闭了的突变的y0mCI-F36W和y0mCI_G59W 以与野生型OMCI等同的效力抑制补体激活的经典途径。图9 带放射性标记的LTB4与仅OMCI的结合和与复合有人类C5的OMCI的结合是
(a)可饱和的且b)具有相似的结合动力学。图(a)代表3次实验且显示了原始数据。图
(b)代表2次实验且显示了减去平均阴性对照c.p.m(n= 16)后的c. p. m值。对数回归线函数显示为0MCI，y = 134. 67Ln (χ)+521. 6，R2 = 0. 98 ；0MCI:hC5,y = 132. 87Ln (χ)+479. 2， R2 = 0. 97。序列说明SEQ ID N0:1是毛白钝缘蜱的OmCI的多核苷酸序列及所编码的蛋白序列。
SEQ ID NO 2是毛白钝缘蜱的OmCI的氨基酸序列。SEQ ID NO :3是SEQ ID NO :2所示的氨基酸19 168的氨基酸序列，是不含SEQID NO 2的蛋白的起始氨基酸序列(即信号序列)的OmCI氨基酸序列。SEQ ID NO 4和5分别是OmCI的多核苷酸及所编码的蛋白的序列和OmCI的蛋白序列，其中经修饰将Asn78变为Gin、将Asnl02变为Gln，且密码子从AAT和AAC分别变为 CAA，用于在酵母中表达时避免高糖基化。SEQ ID NO 6是毛白钝缘蜱的0mCI_F36W突变蛋白的多核苷酸序列及所编码的蛋白序列。SEQ ID NO 7是毛白钝缘蜱的0mCI_F36W突变蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO :8是SEQ ID NO :6所示的氨基酸19 168的氨基酸序列，是不含SEQID NO 6的蛋白的起始氨基酸序列(即信号序列)的0mCI-F36W突变蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO 9是毛白钝缘蜱的0mCI_F59W突变蛋白的多核苷酸序列及所编码的蛋白序列。SEQ ID NO 10是毛白钝缘蜱的0mCI_F59W突变蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO 11是SEQ ID NO 9所示的氨基酸19 168的氨基酸序列，是不含 SEQID NO :9的蛋白的起始氨基酸序列(即信号序列)的0mCI-F59W突变蛋白的氨基酸序列。因此，本发明提供缺乏LK/E结合活性的OmCI多肽或编码所述OmCI多肽的多核苷酸。本文所用的LK/E结合活性是指野生型OmCI结合白细胞三烯和羟基类二十烷酸(包括但不限于LTO4、B4异白细胞三烯及其任何羟基化衍生物、HETE、HPETE和EET)的能力。OmCI 蛋白可以是从毛白钝缘蜱的唾液中分离出的源自蜱的补体抑制剂，或者可以是其功能等价物(包括其同源物)以及其或其功能等价物的片段。本发明的OmCI蛋白优选为来自毛白钝缘蜱的OmCI。该蛋白最初分离自该蜱的唾液腺，并且已发现其可以抑制经典和旁路补体途径。该蛋白的氨基酸序列示于SEQID NO 2 中。本发明的多肽可以包括SEQ ID NO :2所示的完整序列，其已经过修饰而特定地消除了 LK/E结合活性。作为另一选择，所提供的多肽不包括构成信号序列的该蛋白序列的起始的 18个氨基酸，且其已经过修饰而特定地消除了 LK/E结合活性。因此，本发明的多肽可以是 SEQ ID NO 3的多肽，即SEQ ID NO 2的氨基酸序列的氨基酸19 168，其经额外修饰而消除了 LK/E结合活性。本发明提供来自毛白钝缘蜱的OmCI蛋白的变体(例如同源物)或片段，所述变体或片段同样缺乏LK/E结合活性。同源物可以包括SEQ ID NO :2或3所示的OmCI序列的旁系同源物和直系同源物，并且已经过修饰而特定地消除了 LK/E结合活性，其包括例如来自其他蜱物种的OmCI蛋白序列，所述其他蜱物种包括具尾扇头蜱、血红扇头蜱、囊状扇头蜱、美洲钝眼蜱、卡延钝眼蜱、希伯来钝眼蜱、微小牛蜱、具环牛蜱、消色牛蜱、网纹革蜱、安氏革蜱、边缘革蜱、变异革蜱、铁角血蜱、犬血蜱、刻点血蜱、小亚璃眼蜱、骆驼璃眼蜱、边缘璃眼蜱、蓖子硬蜱、全沟硬蜱、肩突硬蜱、六角形硬蜱、波斯锐缘蜱、鸽锐缘蜱、游走钝缘蜱、 毛白钝缘蜱、毛白钝缘蜱猪亚种和萨氏钝缘蜱。术语“同源物”还旨在包括来自下述动物的 OmCI蛋白序列蚊物种，包括库蚊属、按蚊属和伊蚊属的物种，特别是致乏库蚊、埃及伊蚊和冈比亚按蚊；跳蚤物种，例如猫栉首蚤(猫蚤)；马蝇；白蛉；墨蚊；舌蝇；虱；螨；水蛭；和扁形虫。在一个实施方式中，OmCI多肽含有(a)氨基酸序列SEQ ID NO :3，其已经过修饰而消除了 LK/E结合活性；(b)与氨基酸序列SEQ ID NO 3的一致性至少为60%的变体氨基酸序列，其已经过修饰而消除了 LK/E结合活性；(c)与SEQ ID NO 2的氨基酸残基19至168间的氨基酸序列的一致性至少为60% 的SEQ ID NO 2的变体氨基酸序列，其已经过修饰而消除了 LK/E结合活性；或(d)缺乏LK/E结合活性的氨基酸序列(a)、(b)或(c)的片段。变体多肽是如下多肽其氨基酸序列与SEQ ID NO :2或3的氨基酸序列不同，但其保留了与本发明的OmCI多肽相同的本质特征，并且已经过修饰而消除了 LK/E结合活性。通常将下述多肽认为是上述蛋白的变体所述多肽不仅在与本发明的经修饰的 OmCI多肽中所见位置等同的位置上具有一个或多个LK/E结合活性消除性修饰，而且与SEQ ID NO 2或3的氨基酸序列的一致性超过约50 %、55 %、60 %或65 %，优选为至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %，且特别优选为至少95 %、至少97 %或至少99 %。只要所述肽可保持本发明的OmCI多肽的活性，此类变体可以包括等位基因变体以及在蛋白序列内的单个氨基酸或氨基酸组的缺失、修饰或添加；而且此类变体经额外修饰而消除了 LK/E结合活性。SEQ ID NO :3变体的一致性可以在SEQ IDNO :3所示序列的至少50个、至少100个、 至少130个或至少140个或更多个连续氨基酸的区域上测量，或更优选在全长SEQ ID NO 3上测量。氨基酸一致性可以用任何适合的算法来计算。例如，UWGCG软件包提供了可以用来计算同源性的BESTFIT程序(例如以其默认设置来使用)(Devereux等(1984)Nucleic Acids Research 12,387-395)。PILEUP和BLAST算法可以用来计算同源性或用来排列序列 (例如鉴定等价序列或对应序列(通常用其默认设置))Jf^nAltschul S. F. (1993) J Mol Evol 36 :290-300 和 Altschul，S，F 等(1990) J Mol Biol 215 :403-410 中所述。执行BLAST分析的软件通过美国国家生物技术信息中心(http//www. ncbi. nlm. nih.gov/)而向公众开放。该算法包括首先通过鉴定查询序列中的长度为W的短字段来鉴定出高分值序列对(HSP)，所述短字段在与数据库序列中长度相同的字段进行比对时会形成匹配或满足某个正值的阈值评分Τ。T称作邻近字段评分阈值(neighbourhood word score threshold) (Altschul等，见上)。这些初始的邻近字段命中项(hit)可作为种子来启动搜索，从而发现包含其的HSP。只要累积比对评分能够得到提高，字段命中项就会始终沿每个序列进行双向延伸。在下述情况发生时，字段命中项沿每个方向的延伸中止累积比对评分从其曾经达到的最高值下落了量X ；累积评分因一个或多个负分残基比对的积累而变为0或更低；或者已达到了序列的任一末端。BLAST算法的参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用的默认设置为字段长度(W)为11，评分矩阵为BL0SUM62(参见 Henikoff 和 Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915-10919)，比对数(B) 为50，期望值(E)为10，M = 5，N = 4，且对两条链都进行比较。BLAST算法对两个序列的相似性进行统计学分析；参见例如Kar 1 in和 Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873_5787。BLAST 算法所提供的一种相似性度量是最小概率总和(smallest sum probability) (P(N))，其提供两条核苷酸或氨基酸序列间会随机出现匹配的概率的指示。例如，认为一条序列与另一条序列相似的条件是在将第一序列与第二序列进行比较时最小概率总和小于约1、优选小于约0. 1、更优选小于约 0.01、最优选小于约0. 001。 变体序列的差异通常为至少1、2、3、5、10、20、30、50或更多个突变(其可以是氨基酸的替换、缺失或插入)。例如，可以做出1 50、2 40、3 30或5 20个氨基酸替换、 缺失或插入。所述替换优选为保守性替换，例如表1所示。在第二列的同一区块中的氨基酸、优选在第三列同一行中的氨基酸可以相互替换。
权利要求
1.一种OmCI多肽，其具有降低的白细胞三烯/羟基类二十烷酸(LK/E)结合活性或缺乏白细胞三烯/羟基类二十烷酸(LK/E)结合活性。
2.如权利要求1所述的OmCI多肽，其中，所述OmCI多肽是毛白钝缘蜱的源自蜱的补体抑制剂或其功能等价物，所述功能等价物具有降低的白细胞三烯/羟基类二十烷酸(LK/E) 结合活性或缺乏白细胞三烯/羟基类二十烷酸(LK/E)结合活性。
3.如权利要求1或2所述的多肽，其中，所述OmCI多肽含有(a)氨基酸序列SEQID NO :3，所述序列已经过修饰而消除或降低了 LK/E结合活性；(b)与所述氨基酸序列SEQID NO :3的一致性至少为60%的变体氨基酸序列，所述变体氨基酸序列已经过修饰而消除或降低了 LK/E结合活性；(C)SEQ ID NO :2的变体氨基酸序列，所述变体氨基酸序列与SEQ ID NO 2的氨基酸残基19至168间的氨基酸序列的一致性至少为60 %，且所述变体氨基酸序列已经过修饰而消除或降低了 LK/E结合活性；或(d)缺乏LK/E结合活性的氨基酸序列(a)、(b)或(c)的片段。
4.如前述权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述OmCI多肽的结合腔内的一个或多个氨基酸残基已突变。
5.权利要求4的多肽，其中，待突变的一个或多个氨基酸残基选自W!e36、Arg54、 Leu57、Gly59、Val72、Met74、Phe76、Trp87、Phe89、Glnl05、Argl07、Hisll9、Aspl21 和 Trpl33，其中氨基酸的编号参考SEQ ID NO :2。
6.权利要求4或5的多肽，其中，至少一个氨基酸突变选自Wie36Trp和Gly59Trp。
7.如前述权利要求中任一项所述的多肽，其缺乏LTB4结合活性。
8.一种多核苷酸，其编码前述权利要求中任一项所述的OmCI多肽。
9.一种载体，其包含权利要求8所述的多核苷酸。
10.一种宿主细胞，其包含权利要求8所述的多核苷酸或权利要求9所述的载体。
11.一种药物组合物，其包含药物可接受的载剂和(a)缺乏LK/E结合活性的OmCI多肽；(b)编码缺乏LK/E结合活性的OmCI多肽的多核苷酸；或(c)包含编码缺乏LK/E结合活性的OmCI多肽的多核苷酸的载体。
12.一种用于治疗由补体介导的疾病或病症的组合物，其包含(a)具有降低的LK/E结合活性或缺乏LK/E结合活性的OmCI多肽；(b)编码具有降低的LK/E结合活性或缺乏LK/E结合活性的OmCI多肽的多核苷酸；或(c)包含编码具有降低的LK/E结合活性或缺乏LK/E结合活性的OmCI多肽的多核苷酸的载体。
13.如权利要求11或12所述的组合物，其中，所述OmCI多肽如权利要求1 5中任一项所定义，所述编码OmCI多肽的多核苷酸如权利要求6或7所定义，或所述载体如权利要求9所定义。
14.如权利要求11 13中任一项所述的组合物，其中，所述疾病或病症选自老年性黄斑变性(AMD)、阿尔茨海默病、变态反应性脑脊髓炎、同种异体移植、包括类风湿性关节炎在内的各种关节炎、哮喘、成人型呼吸窘迫综合征、灼伤、癌、克罗恩氏病、皮肤肌炎、肾小球性肾炎、溶血性贫血、血液透析、遗传性血管性水肿、特发性膜性肾病、宫内生长受限(IUGR)、缺血再灌注损伤、运动神经元疾病、多系统器官衰竭、多发性硬化、重症肌无力、心肌梗塞、 肾炎、类天疱疮、心肺转流术后、干癣、败血性休克、自然流产、中风、系统性红斑狼疮、葡萄膜炎、血管渗漏综合征和异种移植。
15. 一种治疗或预防有需要的受试者的由补体介导的疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的缺乏LK/E结合活性的OmCI多肽或编码缺乏LK/E结合活性的OmCI多肽的多核苷酸。
全文摘要
本发明的方法涉及缺乏LK/E结合活性的经修饰的OmCI多肽或编码经修饰的OmCI多肽的多核苷酸，并且涉及此类多肽和多核苷酸在治疗补体介导的疾病或病症中的应用。
文档编号A61P37/00GK102341407SQ201080010762
公开日2012年2月1日 申请日期2010年2月4日 优先权日2009年2月5日
发明者M·A·怒恩, P·C·罗韦尔西, S·M·莱 申请人:自然环境研究会