用于免疫接种水禽物种的重组禽疱疹病毒载体和疫苗的制作方法

专利名称：用于免疫接种水禽物种的重组禽疱疹病毒载体和疫苗的制作方法
技术领域：
总的来说，本发明涉及免疫学和疫苗技术领域。具体来说，本发明涉及用于水禽免疫接种的疫苗，所述疫苗基于活的重组马立克氏病病毒(在后文中称为rMDV)、更具体为火鸡重组疱疹病毒(在后文中称为rHVT病毒)，其包含编码并表达水禽病原体的抗原性肽的至少一种核苷酸序列。还提供了免疫接种的方法。
背景技术：
马立克氏病病毒(MDV)是鸡的常见淋巴细胞增生性疾病——马立克氏病的病原体。在世界范围内，马立克氏病(MD)是鸡群中高度接触传染的疾病。已经鉴定到马立克氏病病毒(MDV)是MD的病原体。MDV在鸡中感染法氏囊来源和胸腺来源的淋巴细胞，并可能随后诱导胸腺来源淋巴细胞的淋巴瘤。MDV是一类禽疱疹病毒的名称。例如，MDV(MDVl)是鸡中的疱疹病毒强毒株，SB-I (MDV2)是鸡中天然减毒的疱疹病毒毒株，HVT(MDV3)是通常在火鸡中发现的非致病性疱疹病毒。对于宿主范围来说，只报道了鸡和火鸡被MDV和HVT自然感染。而到目前为止，发现其他鸟类对疾病或感染具有抵抗力。许多水禽鸟类例如鸭和鹅，由于被饲养以获取肉、蛋和羽毛，在经济上是重要的。 因此，对这些鸟类进行针对常见病原体的免疫接种，是提高这些家禽的质量的必要条件。此外，作为所有已知甲型流感病毒的天然宿主的野生水禽，是在家禽中引起高致命性疾病散在爆发的病毒的来源。最近在家禽中出现并随后在东南亚向人类传播的高致病性禽流感 (HPAI)毒株，其在家禽中的频繁爆发导致数以亿计动物的破坏，已经引起了关于致命疾病可能大流行蔓延的顾虑。为了限制病原体的这种传播，重要的是对天然宿主即水禽进行免疫接种。本申请人令人吃惊地发现，马立克氏病病毒(MDV)能够感染水禽物种，并能以潜伏感染或持续感染的状态在被感染的水禽宿主中复制、维持和存活，从而提供了有效的免疫接种手段。因此，本发明的疫苗能够实现水禽的有效免疫接种，并具有优越的免疫接种性质， 因为它们能够引起被免疫水禽宿主的长期持续的免疫。因此，有利情况下，通过给药其中插入了外来抗原基因的重组HVT或MDV，为水禽宿主提供了足够的免疫接种效果。发明概述本发明提供了用于对水禽物种进行免疫接种的重组马立克氏病病毒(rMDV)，具体为火鸡重组疱疹病毒(rHVT)，其包含引入到病毒基因组中的一种或多种异源或同源核苷酸序列，所述核苷酸序列能够在水禽物种细胞中编码并表达病原体的至少一种抗原性肽，并且还能够诱导针对在水禽中引起感染的病原体的稳定并长期持续的免疫应答。本发明还涉及用于对水禽物种进行免疫接种的疫苗，所述疫苗包含免疫接种有效量的rHVT或rMDV，其任选用溶剂、稳定剂、佐剂、稀释剂、防腐剂和其他赋形剂配制。本发明还涉及对水禽物种进行免疫接种的方法和免疫接种试剂盒。附图简述
图IHVT特异性PCR的结果(样品在免疫接种后4周收集)。使用的缩写CA_用细胞结合的HVT疫苗免疫接种的鸭；FD-用冷冻干燥的HVT疫苗免疫接种的鸭。样品被鉴定为疫苗缩写/取样器官。图2A-2D对应于同源质粒p45CMVH5HUNMod4999的核苷酸序列和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO :1)。图3A显示了火鸡疱疹病毒(HVT)基因组的示意图，并标出了长独特序列(Unique Long) (UL)44、UL 45和UL 46基因的位置。供体基因被插入到HVT基因组中UL 45与UL 46之间通过PCR产生的Sf i I位点中。图3B显示了 UL 44的一部分、完整UL 45、和UL 46的一部分，其可以在HVT基因组的1. 9千碱基(kb)的EcoRV-XhoI片段上分离到。加框部分显示了在Southern印迹中，被设计与插入位点两侧的序列结合的探针(插入位点探针或45/46探针)与1.0-kb PvuI-PvuI 片段退火的位置。图3C显示了分离插入位点序列的策略。图4A显示了在由8个单链负股RNA区段构成的禽流感病毒H5亚型基因组中分离红细胞凝集素(HA)基因。还显示了从每个区段表达的蛋白和这些蛋白的功能。图4B显示了使用分别向5’和3’末端添加BamHI和SalI限制性酶位点的正向引物和反向引物，通过反转录酶_聚合酶链反应从禽流感病毒RNA基因组扩增的HA基因。HA 基因的切割位点被改变成低致病性禽流感病毒毒株的典型的切割位点序列。切割位点的修饰通过聚合酶链反应来进行。图5显示了中间质粒pGICMVpA的构建。将巨细胞病毒立即早期启动子(CMV启动子)和SV40 polyA信号序列插入到pUC18载体中。图6显示了同源质粒p45CMVH5HU匪od4999的构建。图7显示了受调控的禽流感_马立克氏病疫苗H5亚型血清型3型活马立克氏病载体的制备。图8显示了受调控的禽流感_马立克氏病疫苗H5亚型血清型3型活马立克氏病载体的生产。图9显示了当用H5m高致病性禽流感病毒进化枝2A/DuCk/Hungary/l 180/2006 激惹时，从重组rHVT-AI/H5疫苗在番鸭中与未免疫接种的对照鸟类相比的效能测试获得的对比结果。^JL在本发明中，术语“重组”是指重组DNA技术，也称基因克隆或分子克隆，是指将 DNA从一种生物体转移到另一种生物体的技术。在本文中，术语“火鸡重组疱疹病毒”(rHVT)和/或“重组马立克氏病病毒”(rMDV) 是指现有的火鸡疱疹病毒，其基因组已通过插入至少一种异源核酸序列进行修饰，所述异源核酸序列是指对应于与HVT或MDV中天然存在的基因的核酸序列不一致的基因或其一部分的DNA。可选地，rHVT或rMDV可以通过在病毒基因组中引入同源核酸序列进行遗传修饰，所述同源核酸序列是指对应于与HVT或MDV中天然存在的基因同一的基因或其一部分的DNA。应该理解，得到的重组HVT (rHVT)和/或重组MDV (rMDV)可以通过各种方法来制造，并且一旦制成后，可以不使用其他重组DNA技术来繁殖。因此，“火鸡重组疱疹病毒”的结构根据DNA插入片段来描述。根据本发明，“水禽”物种打算是指适应于游泳、漂浮在水表面上并且在某些情况下在浅水中潜泳的鸟类。更准确来说，水禽物种包含雁形目鸭科的鸟类，例如鸭、鹅和天鹅， 并属于鸭亚科、雁亚科、斑鸭亚科、麻鸭亚科或树鸭亚科。例如，雁形目包含约170种鸟类物种，分成三个科叫鸭科(叫鸭)、鹊雁科(鹊鹅)和包括超过160种水禽的鸭科。该目中的所有物种都高度适应于在水表面处的水栖生活方式。全都在脚趾间有蹼，用于高效游泳 (尽管一些物种随后已变成主要陆生)。本发明的范围被扩展到这些宽泛的科下所覆盖的所有鸟类。术语“佐剂”被定义为引起免疫系统刺激的一种或多种物质。佐剂是非特异性增加对特定抗原的免疫应答，从而减少在任何给定疫苗中所需的抗原量和/或为了产生针对目标抗原的足够的免疫应答所需的给药频率的药剂。在本文中，佐剂被用于增强对本发明的疫苗的免疫应答。佐剂可以在疫苗给药之前、与疫苗联合或在疫苗给药之后给药于目标动物。当在本文中使用时，单词“致病的”是指由疾病或病害的生物因子对其宿主、在本发明的情况下具体为水禽宿主造成的。当在本文中使用时，术语“非翻译区”是指不具有ORF或不定义通过翻译进行表达的蛋白的氨基酸序列的核苷酸区域，以及其中ORF不参与任何转录、翻译或蛋白表达的核苷酸区域。该区域中包含的核苷酸序列可能是具有碱基取代、缺失或添加的核苷酸序列，除非它们包含0RF。发明详述因此，本发明提供了用于免疫接种水禽物种的重组马立克氏病病毒(rMDV)、具体为火鸡重组疱疹病毒(rHVT)，其包含插入到病毒基因组中，能够编码并在水禽物种细胞中表达病原体的至少一种抗原性肽，并且还能在水禽中诱导针对引起感染的病原体的稳定和长期持续的免疫应答的一种或多种异源或同源的核苷酸序列。只要对水禽是非致病的，任何马立克氏病病毒(MDV)(例如血清型1、2、3型、 CVI988、SB1等)或具体的火鸡疱疹病毒(HVT)都可以使用在本发明中。因此，用于本发明的MDV和HVT可以包括但不限于天然存在的或可以从保藏中心例如ATCC、CNCM等获得的， 例如 FC126 (ATCC VR-584B)、PB-THVU H_2、YT-7、WTHV-I 或 EPRS-26 毒株适合用作骨架病毒。其中，由于在禽类中使用安全，FC126最优选用于本发明中。用于插入到HVT或MDV基因组中的目标基因，可以是从能够在水禽物种中引起感染的任何致病性生物体获得的同源或异源核苷酸序列。典型情况下，目标基因可以源自于引起对家禽工业具有经济影响的疾病的病原体。目标基因也可以源自于在水禽中维持并通过水禽宿主传播到其他家禽和非家禽物种的病原体。基因还可以源自于已存在现有疫苗， 但是由于载体化技术的新优势而使源自HVT或MDV的疫苗对其更优越的生物体。此外，目标基因可以源自于目前还不存在针对其的疫苗，但是为了控制疾病而存在需求的病原体。 典型情况下，目标基因编码病原体的免疫原性肽，并且优选为表面蛋白、分泌蛋白和结构蛋白。因此，用于插入到MDV或HVT基因组中的同源或异源核苷酸序列可以是编码水禽病原体的抗原性肽的任何序列。本发明的核酸序列可以源自于任何来源，例如病毒、原核生物、真核生物或合成来源。所述核酸序列可以源自于在插入到病毒基因组中之后能够稳定表达以诱导针对水禽疾病的免疫力的病原体，优选为水禽物种的病原体。异源或同源核苷酸序列可以编码例如源自下列物种的抗原性肽禽流感病毒、1 型禽副粘病毒(新城疫病毒，NDV)、禽偏肺病毒、马立克氏病病毒、禽肾病病毒(传染性法氏囊病病毒IBDV)、鹅和番鸭细小病毒、鸭病毒性肠炎疱疹病毒、鹅疱疹病毒、鸭甲型、乙型和丙型肝炎病毒、鹅出血性多瘤病毒、鸭和鹅腺病毒、鹅和鸭圆环病毒、西尼罗病毒、鹅和番鸭呼肠孤病毒、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)物种、多杀巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)、鼻气管 Hflii (Ornithobacterium rhinotracheale) ^Χ^^^Ι .' Φ (Mycoplasma gallisepticum)、 鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae)、感染水禽物种的支原体微生物或球虫。在第一个实施方案中，这样的异源或同源核苷酸序列可以是例如流感病毒的表面蛋白红细胞凝集素(HA)和/或神经氨酸酶(NA)、马立克氏病病毒的蛋白、特别是gB、gC、 gD、gH和/或gL蛋白、新城疫病毒的F和/或HN蛋白、鹅和番鸭细小病毒的VP1、VP2和/ 或VP3蛋白、鹅和番鸭呼肠孤病毒的任何结构蛋白、鹅出血性多瘤病毒的VPl蛋白、鹅和番鸭病毒性肠炎疱疹病毒的抗原、鸭和鹅腺病毒的抗原、圆环病毒的衣壳蛋白或IBDV的VP2 蛋白。在另一个具体实施方案中，这样的异源或同源核苷酸可以编码US6，936，707中所述的未糖基化的NXB氨基酸序列，其中N是天冬酰胺，X是脯氨酸之外的任何氨基酸，B是苏氨酸，并且其能够表现出高免疫原性。在另一个实施方案中，异源或同源核苷酸序列也可以是融合蛋白，其包含具有鸡毒支原体的抗原性的肽和源自于疱疹病毒外膜蛋白的肽，如US 7, 348, 422中所述。 在另一个优选实施方案中，rHVT或rMDV还可以包含第二个异源核苷酸序列，其编码第二种抗原或免疫调节剂例如淋巴因子、干扰素或禽类细胞因子。为了构建本发明的重组MDV或HVT病毒，首先将上述病毒在适合的宿主细胞中繁殖，然后获得基因组DNA。用于繁殖病毒的宿主和条件根据需要来选择。作为宿主细胞，源自于鸡的细胞是优选的，并且可以使用CEF(鸡胚成纤维细胞)、鸡肾细胞等。它可以在培养基例如 Eagle' s MEM、Leibowitz-L-15/McCoy 5A(1 1 混合物)培养基中，在约 37°CT 培养3至4天。按照常规方法从如上培养的病毒感染的细胞中提取DNA。因此，将单层生长的细胞刮下，然后离心以收获上清液。在将蛋白在裂解缓冲液中变性并移除后，使用苯酚和乙醇提取 DNA。基因克隆和质粒构建对于本领域的普通专业人员来说是公知的，并可以基本上通过标准的分子生物学技术来进行(《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning A Laboratory Manual.)第三片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Woodbury, N. Y. 2001)。用于插入到病毒中的序列可以源自于任何适合的质粒、粘粒或噬菌体，质粒是最优选的，并且含有至少一种异源或同源核酸序列，其如果需要，与启动子可操作连接。所使用的启动子可以是合成或天然的、内源或异源的启动子，对此没有限制，只要它能够在用rHVT或rMDV感染的水禽细胞中有效发挥作用即可。因此，启动子的选择扩展到被重组HVT或MDV感染的水禽细胞中指导基因转录的任何真核、原核或病毒启动子。可以使用各种启动子，例如鸡β-肌动蛋白启动子、US 6，866，852中所述的修改的鸡β-肌动蛋白启动子、CMV(巨细胞病毒)立即早期启动子、SV40早期启动子、假狂犬病病毒立即早期启动子(PRV IE)、胸苷激酶(TK)或糖蛋白X(gX)启动子、单纯性疱疹病毒α-4启动子、 马立克氏病病毒的gB蛋白启动子、源自于RSV病毒(劳斯肉瘤病毒)LTR序列的启动子和 MDV或HVT启动子例如gB、gC、TK、RR2的启动子，或其保留启动子活性的任何片段。在所提到的启动子中，优选的启动子是强启动子，例如已显示出一定程度的效能的鸡肌动蛋白启动子、CMV(巨细胞病毒)立即早期启动子和SV40早期启动子，以及属于马立克氏病病毒、特别是血清型3型的一些基因的启动子。因此，编码所述水禽疾病的目标抗原的同源或异源核苷酸序列，可以与上述启动子可操作连接，并进一步插入到病毒基因组的插入区中。插入区具体来说被理解为是指对于基因间区域来说没有缺失或具有几个碱基缺失，并且对于ORF来说具有完全或部分缺失或没有缺失的插入。可以将同源或异源核苷酸和启动子序列插入到例如TK区域中，如Ross L.等Gen. Virol. ,74:371-377(1993)所述。优选情况下，将核苷酸和启动子序列插入到病毒基因组的非翻译区中。一般来说，对基因组DNA的非翻译区进行鉴定，然后将上述的同源或异源核苷酸序列插入到区域中。插入位点的实例选自UL44与UL45之间、UL45与UL46之间、UL41与UL42之间、 UL40与UL41之间、位于gB基因下游的区域、UL53与UL54之间或UL36与UL37之间。在第 16 寸mi (Proceedings of the 16th Herpes Virus Workshop) (1991 年7月7-12日在美国加利福尼亚的Pacific Grove举办)中，它们被描述用于HSV-1。其中，由于同源性，优选的位点在UL45与UL46之间和位于gB基因下游的区域中，更优选在 UL45与UL46之间。将所述核酸序列和启动子导入到基因组HVT或MDV DNA片段中，所述片段含有亚克隆在重组DNA分子中的本文中所定义的插入区序列。位于异源或同源核酸序列两侧的插入区序列一般具有适合的长度，以允许与病毒基因组进行体内同源重组。如果需要，可以制造含有例如源自于相同或不同病原体的两个或多个不同异源或同源核酸序列的构建物，所述序列两侧带有本文中所定义的HVT或MDV的插入区序列。这样的重组DNA分子可用于生产表达两种或多种不同抗原性肽的重组HVT或MDV，以提供多价疫苗。其次，可以在含有两侧带有适合的HVT序列的异源或同源核酸序列的重组DNA分子存在下，将细胞用病毒DNA 进行转染，由此在重组DNA分子的插入区序列与HVT中的插入区序列之间发生重组。通过用含有两侧带有适合的侧翼插入区序列的异源或同源核酸序列而没有重组DNA分子序列的核酸序列转染被感染的细胞，也可以产生重组。为了在HVT或MDV的非翻译区中插入外来基因，需要将含有非翻译区的序列事先克隆到载体中，但是对质粒没有限制。例如，可以提到的质粒是例如PBR322、pBR325、 pBR327、pBR328、pUC18、pUC19、pUC7、pUC8 和 pUC9,以及噬菌体例如 λ 噬菌体和 Μ13 噬菌体，和粘粒例如pHC79。将如上所述获得的非翻译区按照常规方法整合到这些质粒中。为了将一种或多种异源或同源核苷酸序列插入到如上整合的非翻译区中，可以在如上所述克隆到质粒中的非翻译区的特定位点处进行突变，以制造新的限制性酶切割位点，然后将外来基因插入到位点中。执行突变的方法可以是常规方法，并且可以使用本领域的专业技术人员公知的方法例如体外诱变和PCR。因此，在PCR方法中，在PCR引物中进行突变，例如1至2个核苷酸的缺失、取代或添加，然后将引物用于产生突变。将如上所述获得的已将一种或多种异源或同源核苷酸序列插入到HVT或MDV非翻译区中的质粒，使用电穿孔、磷酸钙、基于Iipofectin的方法、基因枪方法等导入到HVT感染的细胞中。因为导入效率高，电穿孔或使用Iipofectin的方法是优选的。当待导入的质粒的量在0. 1至1000 μ g范围内时，细胞中通过HVT-DNA与质粒的同源区之间的重组而产
生重组病毒的效率变高。然后在细胞培养物中产生重组病毒后代，并可以使用已知的筛选技术对其进行基因型或表型上的筛选，例如通过杂交，检测与异源或同源核酸序列一起共整合的基因所编码的酶活性，或免疫学检测由重组HVT或MDV表达的抗原性肽。可以将所选的重组HVT或 MDV在细胞培养物中大规模培养，随后可以收集含有肽的重组HVT或MDV。为了能够筛选rHVT或rMDV，可以将几种标志物整合在质粒的非翻译区中。这样的酶基因的实例包括半乳糖苷酶基因。因此，通过将用整合有这种基因的病毒感染的细胞在增补有特定底物的培养基中进行培养，能够筛选病毒感染的细胞。通过重复这个程序， 可以纯化重组病毒。得到的本发明的重组病毒，可以在所述重组病毒能够繁殖和生长的细胞培养基中繁殖。在获得所需的病毒生长之后，使用刮刀或用胰蛋白酶将细胞与孔分开，并通过离心将被感染的细胞与上清液分离开。在本发明的优选实施方案中，可以使用CEF、孵化卵、鸡肾细胞等作为繁殖 rHVT或rMDV的宿主细胞。可以将本发明的重组病毒在培养基例如Eagle ‘ s MEM、 Leibowitz-L-15/McCoy 5A(1 1混合物)培养基中，在约37°C下培养3至4天。将由此获得的被感染细胞悬浮在含有10%二甲基亚砜(DMSO)的培养基中，并在液氮下冷冻保存。为了用作疫苗，可以在使用前将上述冷冻制品溶解在100倍体积的磷酸盐缓冲液中。对于用于在液氮下储存所述被感染细胞的稳定剂和其他组分没有限制，只要它们能够允许病毒感染的细胞稳定生长并且它们是可药用的即可。本发明还提供了用于对水禽物种进行免疫接种的疫苗，所述疫苗包含有效量的重组MDV或HVT，其在基因组中带有编码并在水禽物种细胞中表达至少一种上述抗原性蛋白的至少一种异源或同源核苷酸序列。本发明的重组HVT或MDV优选可以用作活疫苗，尽管其他可选方案例如灭活疫苗或减毒疫苗也在本技术领域的专业人员的技术范围之内。正如本申请人所证实的，rHVT或rMDV载体引发了针对水禽疾病的长期持续的保护性免疫力。具体来说，正如在实施例中所证实的，重组病毒载体能够在法氏囊、脾脏、胸腺和羽囊中的水禽细胞中感染和复制。具体来说，rHVT或rMDV具有在被免疫接种的水禽体内以潜伏感染状态永久存活的性质，因此在免疫接种的水禽的整个生命期内产生长期持续的保护作用。本发明的重组HVT或MDV可以含有并表达一种或多种不同异源肽或蛋白，可以用作单价或多价疫苗。它们也可以与其他病毒或细菌混合，以便构成多价免疫原性制剂或多价疫苗。病毒或细菌选自待免疫接种的水禽物种特征性的禽病原体。本发明还进一步涉及多价疫苗，其作为混合物或待混合物包含至少两种如上所定义的活rHVT疫苗，所述疫苗包含不同的插入序列，特别是来自不同病原体的插入序列。例如，本发明的疫苗可以引入源自于一种以上水禽病原体的一种以上的抗原，例如源自于禽流感(Al)病毒和源自于新城疫病毒的抗原。或者，多价疫苗可以包含rHVT或rMDV载体，其携带例如在双向启动子控制之下的编码抗原性肽或蛋白的一种以上异源或同源核苷酸序列。本发明的疫苗还可以包含适合的溶剂，例如水性缓冲液或磷酸盐缓冲液。优选情况下，疫苗还包含佐剂。本发明的佐剂可以从多种来源的任一种获得，包括来自天然来源、 重组来源和/或通过化学合成等。佐剂的实例包括增强免疫系统对抗原的应答的化学和多肽免疫刺激剂。这样的佐剂可以包括例如弗氏完全佐剂或不完全佐剂、无机凝胶、铝化合物例如氢氧化铝、磷酸铝和明矾；表面活性剂，例如十六胺、十八胺、溶血卵磷脂、二甲基双十八烷基溴化铵、N，N-双十八烷基-N' ,N'-双(2-羟甲基)丙二胺、甲氧基十六基甘油和pluronic多元醇；聚阴离子，例如吡喃、硫酸葡聚糖、聚IC、聚丙烯酸；肽类，例如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸和促吞噬素(tuftsin)；以及油乳液、植物和动物油以及矿物油、油包水乳液、细菌毒素、几丁质衍生物和壳聚糖、聚合物、ISCOM' s (免疫刺激复合物)、维生素和矿物质(包括但不限于维生素E、维生素A、硒和维生素B12)、Quil A (皂草苷类)、与聚烯基醚或二乙烯基二醇交联的丙烯酸聚合物、细菌和真菌细胞壁组分(例如脂多糖、脂蛋白、糖蛋白、胞壁酰肽、0-1，3/1，6-葡聚糖)、源自植物的各种复合糖类(例如聚糖、乙酰化甘露聚糖(acemarman))、源自于动物的各种蛋白和肽类(例如激素、细胞因子、辅助刺激因子)以及源自于病毒和其他来源的新型核酸(例如双链RNA、CpG)等，其可以与疫苗一起以足以增强免疫应答的量给药。本发明的优选佐剂是壳聚糖。此外，上面提到的物质的任何数量的组合可以提供佐剂效果，因此可以形成本发明的佐剂。本发明的疫苗还可以与一种或多种其他添加剂一起配制，以维持等渗性、生理pH 和稳定性，例如缓冲剂如生理盐水(0. 85%)、磷酸缓冲盐水(PBQ、柠檬酸缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、Tris缓冲盐水等，和/或防腐剂例如硫柳汞、福尔马林、戊二醛，或抗生素例如新霉素或链霉素等。给药方法可以由专业技术人员进行选择。本发明的水禽疫苗容易通过任何途径给药，包括口腔、眼(例如通过滴眼液)、使用气溶胶的眼-鼻给药、鼻内、泄殖腔、饲料中、饮水中、或通过喷雾、卵内、局部或通过注射(例如静脉内、皮下、肌肉内、眼框内、眼内、真皮内和/或腹膜内)免疫接种。专业技术人员将会认识到，疫苗组合物优选被适合地配制以用于每种类型的给药途径。例如，疫苗组合物可以通过饮用水、喷雾或滴眼液给药于孵化后的幼鸟(几日至几周龄)。本文中也考虑到了卵内给药。例如，胚胎可以在孵化前的适合时间接种。每种疫苗药剂可以含有足以在水禽物种中弓I发保护性免疫应答的适合剂量。这种剂量的优化在本技术领域中是公知的。每种药剂的抗原量可以通过已知方法，使用抗原/ 抗体反应例如通过ELISA方法来确定。用于免疫或接种水禽的程序具体来说可以包含向水禽一次或两次给药。也可以提供加强给药。本技术领域的专业人员具备精确确定用于每种免疫接种方案的每种疫苗的注射次数和剂量所需的能力。本发明的疫苗的另一个优点，在于通过以没有任何副作用的非常低的剂量对小至1日龄的鸟进行免疫接种，它们可用于确保为水禽提供针对各种疾病的完全保护。更具体来说，疫苗在免疫接种2周后，赋予水禽物种针对传染病激惹的至少20% 至30%的保护作用，并且在免疫接种5至6周后，赋予水禽物种针对传染病激惹的至少 50%至60%的保护作用。优选情况下，本发明的疫苗在免疫接种5至6周后，赋予水禽物种针对传染病激惹的高达80%至100%的保护作用。上述的针对特定病原体的主动免疫接种方案，可以适用于在水禽物种中引发保护性免疫力。此外，已经被特定病原体感染的水禽也可以用包含抗体的抗血清治疗，所述抗体由本发明的携带编码致病抗原的异源或同源基因的重组HVT或MDV引发。可以通过用有效量的所述重组HVT对水禽进行免疫接种以便引发适当的免疫应答，来制备针对本发明的重组HVT或MDV的抗血清。然后从动物取血，并且可以制备抗血清。因此，本发明包含了将可以通过用有效量的rHVT或rMDV对水禽进行免疫接种并通过从水禽取血而获得的针对rHVT 或rMDV的抗血清，用作兽药。在本发明的优选实施方案中，rHVT或rMDV携带并表达在内源或异源启动子控制之下的编码禽流感病毒的红细胞凝集素(HA)糖蛋白的核苷酸序列。因此，这种含有编码HA 的异源核苷酸序列的rHVT或rMDV，对于用作兽药保护水禽对抗流感来说特别有用。感染鸟类的流感病毒被称为禽流感病毒或甲型流感病毒。只有甲型流感病毒感染鸟类，并且甲型流感病毒的所有已知亚型都能感染鸟类。禽流感病毒在全世界鸟类中流通。某些鸟类、特别是水禽，通过在肠道中携带病毒并排泄它而作为流感病毒的宿主。被感染的鸟类在唾液、鼻分泌物和粪便中排泄病毒。易感鸟类当与来自被感染鸟类的污染的鼻、 呼吸道或粪便物质接触时，可以被禽流感病毒感染。粪-口传播是鸟类之间最常见的传播方式。最通常情况下，作为病毒宿主的野生鸟类不患病，但是它们能够将流感传播给其他鸟类。某些甲型禽流感病毒(例如某些H5和H7毒株)感染可能在某些驯养鸟类物种中引起大面积疾病和死亡。驯养鸟类通过与被感染水禽或其他被感染家禽的直接接触，或通过与被病毒污染的表面(例如污物或笼子)或物质(例如水或饲料)接触，可能被禽流感病毒感染。人、运输工具和其他无生命物体例如笼子，可能是流感病毒从一个农场传播到另一个农场的媒介。当发生这种情况时，可能在家禽中出现禽流感爆发。甲型流感病毒也能感染人类以及其他宿主，例如猪、鲸、马、海豹等。禽流感病毒分类在正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、甲型流感病毒属中。禽流感病毒的基因组由8区段单链负股RNA构成。病毒基因组编码10种蛋白，其中8种蛋白是结构蛋白，包括HA和神经氨酸酶(NA)，两种蛋白是非结构蛋白。甲型流感病毒根据HA和NA 蛋白的抗原性分成不同亚型。已识别到16种HA抗原和9种NA抗原。HA被认为是能够在鸟类中引发保护性抗体的主要抗原。禽甲型流感病毒根据其致病性分成两种致病型高致病性禽流感(HPAI)病毒和低致病性禽流感(LPAI)病毒。大多数禽流感病毒具有低毒力，但是几种H5和H7亚型能够引起导致高死亡率的严重系统性疾病。红细胞凝集素基因可以从禽流感病毒的任何亚型或任何毒株获得。优选情况下， HA基因从H5亚型的禽流感病毒获得。更优选情况下，HA基因从H5W亚型的禽流感病毒获得。最优选情况下，HA基因从流感病毒H5m(SWan/Hungary/4999/2006)毒株获得。核苷酸和相应的氨基酸序列提供在图2C中。
或者，HA基因从禽流感病毒A/Turkey/Wi scons in/68 (H5N9)毒株获得。来自A/Turkey/Wi scons in/68 (H5N9)毒株的HA基因的核苷酸序列描述在美国专利申请 2008/0241188中。该序列与已发表的A/Turkey/Wisconsin/68 (H5N9)毒株的HA基因的核苷酸序列(M. Garcia 等，1997，Virus Res. 51 :115-124，GenBank 登记号 U79456)有几个碱
基的差别。根据本发明的这个优选实施方案，在病毒基因组中启动子与HA基因可操作连接， 典型位于HA基因的5’区域，以控制HA基因的表达和HA蛋白的产生。优选情况下，HA基因在巨细胞病毒立即早期启动子(CMV启动子)、鸡β-肌动蛋白启动子(T.A.Kost等， 1983，Nucleic Acids Res. 11 :8287-8301)或修饰的鸡 β-肌动蛋白启动子(U.S.Pat. No. 6，866，852)的控制之下。CMV启动子的核苷酸序列描述在文献中(M. Boshart等，1985， Cell 41 :521-530,GenBank登记号K03104)。或者，CMV启动子可以具有如US 2008/0241188 中所示的从原始序列略微修饰的序列。此外，如上所述，插入区域可以是病毒基因组中对于病毒生长来说非必需的区域。 换句话说，非必需区域可以被定义为其中修饰或插入外来基因不阻止病毒在体外或体内成功复制的区域。已经报道了 HVT基因组中几个非必需区域。如上所述，HA基因和CMV启动子可以插入到例如但不限于UL43 (W0 89/01040)、US2 (W0 93/25665)或UL44与UL46之间的ORF间区域(W0 99/18215)中。最优选情况下，HA基因和CMV启动子被插入到UL45与 UL46之间的OFR间区域中。因为HA蛋白是禽流感病毒的保护性抗原，并且骨架HVT是活马立克氏病疫苗，因此含有本发明的HA基因的重组HVT可以用作对抗禽流感和马立克氏病的双价疫苗，或作为对抗禽流感的单价疫苗。此外，本发明的疫苗可以使用在与任何重组或非重组病毒例如MDV 血清型1型或血清型2型疫苗毒株的混合物中。本发明的表达特定病原体的一种或多种不同的异源或同源肽的重组HVT或MDV以及疫苗，对于免疫接种对这些病原体易感的上述水禽物种、特别是雁形目包括鸭科的水禽物种例如鸭、鹅和天鹅，以及鸭亚科、麻鸭亚科或树鸭亚科的水禽物种来说，特别有用。正如在下面的实施例中所证实的，使用这样的活载体疫苗免疫接种后，重组HVT 在被接种的宿主内复制，在水禽细胞中体内表达异源或同源肽或蛋白。然后，异源或同源免疫原性肽或蛋白引发稳定的、长期持续的免疫应答。如果源自于特定病原体的抗原性肽或蛋白能够刺激保护性免疫应答，那么用本发明的重组HVT接种的水禽将对随后该病原体的感染以及MDV的感染免疫。因此，本发明的引入到HVT基因组插入区中的异源或同源核酸序列可以在体内连续表达，提供了对病原体的稳定、安全和长期持续的免疫力。本发明还涉及上述疫苗在免疫接种水禽物种中的应用，以及通过给药免疫有效量的本发明的疫苗对水禽物种进行免疫接种的方法。疫苗可以通过真皮内、皮下、肌肉内、口腔、卵内、通过粘膜给药或经眼-鼻给药，有利地给药于水禽物种。最后，本发明涉及用于免疫接种水禽物种的免疫接种试剂盒，所述试剂盒包含有效量的如上所述的rHVT或MDV疫苗，以及用于将所述组分给药于所述物种的工具。这样的试剂盒可以包含装填有本发明的rHVT或rMDV疫苗的注射装置，以及用于真皮内、皮下、肌肉内或卵内注射的说明书。可选地，试剂盒包含装填有本发明的rHVT或rMDV疫苗的喷雾剂/气溶胶或滴眼液装置，以及用于眼-鼻、口腔或粘膜给药的说明书。
下面的实施例详细描述了本发明的说明性方法和技术。 实施例实施例1 :HVT疫苗测试了两种可商购HVT (火鸡疱疹病毒，MDV血清型3型)疫苗细胞结合的HVT 疫苗(Marek HVT血清型3型活病毒，Wineland)和冷冻干燥的HVT疫苗(Bio Marek HVT, Fatro)ο实施例2 动物和实验组在实验中使用32日龄雄性鸭(无菌的，北京鸭与番鸭的属间杂交)。将16只鸭用细胞结合疫苗免疫接种，另外16只鸭用冷冻干燥疫苗免疫接种。两种疫苗都在第1日皮下给药。实施例3 通过PCR检测HVT病毒每周取样来自每个组的四只鸭(在免疫接种后第7、14、21和观日)。在每个日期收集法氏囊、脾脏、胸腺和羽尖样品(羽尖只从免疫接种后第14日起收集)，并测试HVT疫苗病毒的存在。将器官样品在无菌PBS中勻浆，以获得10m/V%悬液。使用QIAmp DNA小提试剂盒OlIAGEN，Hilden，德国)按照制造商的说明书纯化DNA。使用特异性针对HVT病毒的引物进行PCR。按照Handberg等(Avian pathol. (2001)pp 243-249)描述的方法，扩增505个核苷酸长的US3基因区段(第4245-4227位)。PCR产物在1. 5%琼脂糖凝胶上在溴化乙锭染色后进行分析。在所有试验中包含了 HVT阴性和阳性对照样品。实施例4 水禽物种的预防接种从接种后第7日(内部器官)或第14日(羽毛)起，从使用细胞结合或冷冻干燥疫苗免疫接种的所有鸟类检测疫苗病毒。结果概述在下表中并显示在

图1中。表1 在用细胞结合疫苗免疫接种后的鸭的不同器官中通过PCR检测HVT疫苗病
权利要求
1.一种用于免疫接种水禽物种的疫苗，所述疫苗包含免疫接种有效量的重组马立克氏病病毒(rMDV)，其包含插入到病毒基因组中、编码并在水禽物种细胞中表达至少一种抗原性肽的至少一种异源或同源的核苷酸序列。
2.权利要求1的疫苗，其中重组马立克氏病病毒是血清型1型、血清型2型或血清型3 型病毒。
3.权利要求1或2的疫苗，其中重组马立克氏病病毒是火鸡重组疱疹病毒(rHVT)血清型3型。
4.前述权利要求任一项的疫苗，其中核苷酸序列编码来自下列物种的抗原性肽禽流感病毒、1型禽副粘病毒(新城疫病毒，NDV)、禽偏肺病毒、马立克氏病病毒、禽肾病病毒(传染性法氏囊病病毒IBDV)、鹅和番鸭细小病毒、鸭病毒性肠炎疱疹病毒、鹅疱疹病毒、鸭甲型、乙型和丙型肝炎病毒、鹅出血性多瘤病毒、鸭和鹅腺病毒、鹅和鸭圆环病毒、西尼罗病毒、鹅和番鸭呼肠孤病毒、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)物种、多杀巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、鸭疫里默氏杆菌 (Riemerella anatipestifer)、鼻气管鸟杆菌(Ornithobacterium rhinotracheale)、鸡毒支原体(Mycoplasma gallis印ticum)、鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae)、能够感染水禽物种的支原体微生物或球虫。
5.前述权利要求任一项的疫苗，其中编码抗原性肽的核苷酸序列选自禽流感病毒的表面蛋白红细胞凝集素(HA)和/或神经氨酸酶(NA)、马立克氏病病毒的蛋白、特别是gB、gC、 gD、gH和/或gL蛋白、新城疫病毒的F和/或HN蛋白、鹅和番鸭细小病毒的VP1、VP2和/ 或VP3蛋白、鹅和番鸭呼肠孤病毒的任何结构蛋白、鹅出血性多瘤病毒的VPl蛋白、鹅和番鸭病毒性肠炎疱疹病毒的抗原、鸭和鹅腺病毒的抗原、圆环病毒的衣壳蛋白、鹅出血性多瘤病毒的VPl蛋白或IBDV的VP2蛋白。
6.权利要求5的rHVT或rMDV，其包含编码流感病毒红细胞凝集素(HA)的异源核酸序列，其用作兽药保护水禽对抗流感。
7.前述权利要求任一项的疫苗，其中水禽物种属于雁形目。
8.前述权利要求任一项的疫苗，其中水禽物种属于鸭科。
9.前述权利要求任一项的疫苗，其中水禽物种属于鸭亚科、雁亚科、斑鸭亚科、麻鸭亚科或树鸭亚科。
10.前述权利要求任一项的疫苗，其中rMDV或rHVT还包含一种或多种其他同源或异源核苷酸序列。
11.前述权利要求任一项的疫苗，其中rHVT还包含编码免疫调节剂的另一种核苷酸序列。
12.权利要求11的疫苗，其中免疫调节剂是淋巴因子、干扰素或禽细胞因子。
13.前述权利要求任一项的疫苗，其中核苷酸序列被插入到骨架病毒基因组的非编码区或ORF之间的区域中。
14.前述权利要求任一项的疫苗，其中核苷酸序列被插入到HVT病毒基因组的非翻译区中。
15.前述权利要求任一项的疫苗，其中核苷酸序列被插入到位于UL44与UL45之间、 UL45与UL46之间、UL41与UL42之间、UL40与UL41之间的非翻译区、位于gB基因下游、位于UL53与UL54之间或UL36与UL37之间的的区域。
16.前述权利要求任一项的疫苗，其中核苷酸序列被插入到位于病毒基因组的UL45与 UL46之间的非编码区中。
17.前述权利要求任一项的疫苗，其中核苷酸序列在内源或异源启动子的控制之下。
18.权利要求17的疫苗，其中启动子是鸡β-肌动蛋白启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、SV40启动子或其保留启动子活性的任何片段。
19.前述权利要求任一项的疫苗，其中所述被感染的细胞是水禽物种的法氏囊、脾脏、 胸腺和羽囊细胞。
20.前述权利要求任一项的疫苗，其中所述水禽物种在至少1日龄时免疫接种。
21.前述权利要求任一项的疫苗，其通过真皮内注射、皮下注射、肌肉内注射、卵内注射、口腔给药、粘膜给药或经眼_鼻给药来给药。
22.前述权利要求任一项的疫苗，其还包含适合的溶剂。
23.权利要求22的疫苗，其中适合的溶剂包含水性缓冲液或磷酸盐缓冲液。
24.前述权利要求任一项的疫苗，其还包含佐剂。
25.权利要求24的疫苗，其中佐剂是壳聚糖。
26.前述权利要求任一项的疫苗，其中所述疫苗在免疫接种2周后，赋予水禽物种针对传染病激惹的至少20%至30%的保护作用。
27.前述权利要求任一项的疫苗，其中所述疫苗在免疫接种5至6周后，赋予水禽物种针对传染病激惹的至少50%至60%的保护作用。
28.前述权利要求任一项的疫苗，其中所述疫苗在免疫接种5至6周后，赋予水禽物种针对传染病激惹的高达80%至100%的保护作用。
29.前述权利要求任一项的疫苗，其是多价疫苗并包含至少两种疫苗的混合物，所述至少两种疫苗之一是前述权利要求任一项中限定的重组HVT或MDV疫苗。
30.前述权利要求任一项的疫苗，其是多价疫苗，并包含表达单一或不同免疫接种蛋白抗原的两种或多种重组HVT或MDV。
31.前述权利要求任一项的疫苗在免疫接种水禽物种中的应用。
32.权利要求31的疫苗的应用，其中疫苗通过真皮内注射、皮下注射、肌肉内注射、卵内注射、口腔给药、粘膜给药或经眼_鼻给药来给药于水禽物种。
33.一种针对rHVT或rMDV的抗血清，所述抗血清通过用有效量的权利要求1至6任一项中限定的rHVT或rMDV对水禽进行免疫接种，并在从水禽取血后回收抗血清来获得。
34.一种对水禽物种进行免疫接种的方法，所述方法包含向所述物种给药免疫接种有效量的权利要求1至30任一项的疫苗。
35.权利要求34的对水禽物种进行免疫接种的方法，其中给药通过真皮内注射、皮下注射、肌肉内注射、卵内注射、口腔给药、粘膜给药或经眼-鼻给药来进行。
36.一种用于对水禽物种进行免疫接种的免疫接种试剂盒，所述试剂盒包含下列组分(a)有效量的权利要求1至30任一项的疫苗，以及(b)将所述组分给药于所述物种的工具。
37.权利要求34的试剂盒，其包含装填有权利要求1至30任一项的疫苗的注射装置，以及用于真皮内、皮下、肌肉内或卵内注射的说明书。
38.权利要求34的试剂盒，其包含装填有权利要求1至30任一项的疫苗的喷雾剂、气溶胶或滴眼液装置，以及用于眼_鼻、口腔或粘膜给药的说明书。
全文摘要
本发明涉及用于水禽免疫接种的疫苗，所述疫苗基于活的重组马立克氏病病毒(在后文中称为rMDV)、更具体为火鸡重组疱疹病毒(在后文中称为rHVT病毒)，其包含编码并表达水禽病原体的抗原性肽的至少一种核苷酸序列。还提供了免疫接种的方法。
文档编号A61K39/255GK102405058SQ201080017170
公开日2012年4月4日 申请日期2010年4月15日 优先权日2009年4月15日
发明者彦尼克·贾丁, 维尔莫斯·帕尔亚 申请人:法国诗华大药厂