脑膜炎球菌h因子结合蛋白和肺炎球菌结合糖的组合物的制作方法

专利名称：脑膜炎球菌h因子结合蛋白和肺炎球菌结合糖的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及联合疫苗领域，特别是含结合型肺炎球菌荚膜糖和脑膜炎球菌fHBP 抗原的联合疫苗。
背景技术：
脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis，脑膜炎球菌)是革兰氏阴性球菌。目前的脑膜炎疫苗也是基于荚膜糖。这些包括单价C群结合疫苗(MENJUGATE 、MENINGITEC 和 NEISVAC-C )和A、C、W-135及Y群的4价结合混合物(MENACTRA )。目前没有批准抗B群 (‘MenB，)的通用有效疫苗。当前制备MenB疫苗的研究集中于外膜囊泡(例如MENZB 、 ΗΕΧΑΜΕΝ 、Ν0ΝΑΜΕΝ )或来自外膜的纯化成分，如脂寡糖和外膜蛋白。肺炎链球菌(Sti^ptococcus pneumoniae，肺炎球菌)是革兰氏阳性球菌。目前的肺炎球菌疫苗是基于荚膜糖。批准的儿童疫苗有仏斤1 ￥離1^，来自4、68、抓、14、18(、19卩与23F型的7价结合糖混合物，(b) SYNFL0RIX ,还包括1、5和7F型的10价结合混合物，和 (c)PREVNAR 13 ，还包括3、6A禾口 19A型的13价结合混合物。还已知其它9、10、11和13价结合组合物。与PREVNAR 相同的7种血清型也已与来自B群脑膜炎球菌菌株的外膜囊泡复合体(iOMPC')结合[1]。参考文献2公开了抗肺炎球菌和MenB免疫的组合物，通过联合13价肺炎球菌结合疫苗(‘13vPnC，；惠氏公司(Wyeth))与9价MenB外膜囊泡疫苗(NONAMEN , NVI)而形成。参考文献3讨论了一种类似的组合产品。仍需要其它和改善的疫苗组合以提供保护抵抗B群脑膜炎球菌和肺炎球菌。发明描述不同于参考文献2所示联用3种不同的改造外膜囊泡的组合物，本发明组合物中的B群脑膜炎球菌抗原是基于少量纯化抗原。目标是避免组合物中存在MenB的抗原复合体或不确定混合物(例如，如参考文献1和2所用的外膜囊泡)。具体地，本发明的组合物包括纯化脑膜炎球菌H因子结合蛋白(fHBP)抗原。已发现将肺炎球菌结合物加入fHBP可增强抗脑膜炎球菌应答，将fHBP加入肺炎球菌结合物可增强抗肺炎球菌应答。因此，本发明提供的免疫原性组合物包括⑴结合型肺炎球菌荚膜糖，和(ii)脑膜炎球菌H因子结合蛋白(fHBP)抗原。所述组合物优选不包括脑膜炎球菌外膜囊泡(包括在细菌生长期间自发形成并释放到培养基中的天然产生膜囊泡，和通过例如去污剂处理或超声处理脑膜炎球菌形成的人造外膜囊泡)。优选的组合物包括(i)磷酸铝佐剂；(ii)来自至少4、68、抓、14、18(、19 和23卩各型肺炎球菌的结合型肺炎球菌荚膜糖，所述糖各与CRM197载体蛋白结合；和(iii)至少 2种不同的脑膜炎球菌H因子结合蛋白抗原，这些抗原各自至少部分吸附于磷酸铝。肺炎球菌结合糖也可吸附于磷酸铝。所述组合物可包括氯化钠和/或缓冲剂。本发明也提供了制备本发明免疫原性组合物的方法，包括步骤(i)将至少一种结合型肺炎球菌荚膜糖与磷酸铝佐剂混合以形成结合物/佐剂混合物；和(ii)将所述结合物/佐剂混合物与至少一种脑膜炎球菌H因子结合蛋白混合。本发明还提供了制备本发明免疫原性组合物的方法，包括步骤(i)将至少一种结合型肺炎球菌荚膜糖与至少一种脑膜炎球菌H因子结合蛋白混合以形成抗原混合物；和 ( )将所述抗原混合物与磷酸铝佐剂混合。本发明也提供了制备本发明免疫原性组合物的方法，包括步骤(i)将至少一种脑膜炎球菌H因子结合蛋白与磷酸铝佐剂混合以形成蛋白/佐剂混合物；和(ii)将所述蛋白/佐剂混合物与至少一种结合型肺炎球菌荚膜糖混合。在一个较不优选的实施方式中，本发明也提供制备本发明免疫原性组合物的方法，包括步骤(i)将至少一种脑膜炎球菌H因子结合蛋白与磷酸铝佐剂混合以形成蛋白/ 佐剂混合物；和(ii)将至少一种结合型肺炎球菌荚膜糖与磷酸铝佐剂混合以形成结合物/ 佐剂混合物；和(iii)将所述蛋白/佐剂混合物与结合物/佐剂混合物混合。本发明方法优选不包括将氢氧化铝佐剂与以下任意组分混合的步骤(i)脑膜炎球菌H因子结合蛋白，(ii)磷酸铝佐剂，(iii)结合型肺炎球菌荚膜糖，(iv)结合物/佐剂混合物，(ν)抗原混合物，或(vi)蛋白/佐剂混合物。因此，氢氧化铝不加入成为所述免疫原性组合物的组分。结合型肺炎球菌荚膜糖本发明的组合物包括至少一种肺炎球菌荚膜糖。所述荚膜糖与载体蛋白结合。本发明可包括来自一种或多种不同肺炎球菌血清型的荚膜糖。组合物包括来自超过1种血清型的糖抗原时，所述抗原优选单独制备，单独结合，并随后组合。本领域已知纯化肺炎球菌荚膜糖的方法(例如参见参考文献4)且早已知道以来自23种不同血清型的纯化糖为基础的疫苗。也已描述了这些方法的改进，例如参考文献5描述了 3型的改进，或参考文献6描述了 1、4、5、6A、6B、7F和19A的改进。肺炎球菌荚膜糖通常选自以下血清型:1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、 12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 / 或 33F。因此，组合物总共可包括来自 1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 种或更多不同血清型的荚
膜糖。包含至少6B型糖的组合物是有益的。有用的血清型组合是7价组合，例如包括来自4、6B、9V、14、18C、19F和23F各血清型的荚膜糖。另一种有用的组合是9价组合，例如包括来自1、4、5、6B、9V、14、18C、19F* 23F各血清型的荚膜糖。另一种有用的组合是10价组合，例如包括来自1、4、5、6B、7F、9V、 14、18C、19F和23F各血清型的荚膜糖。11价组合物还可包括来自3型的糖。12价组合物可在10价混合物中加入血清型6A禾口 19A ；6A和22F ； 19A和22F ；6A禾口 15B ； 19A禾口 15B ；或 22F和15B ；13价组合物可在11价混合物中加入血清型19A和22F ；8和12F ；8和15B ；8 禾口 19A ；8 禾口 22F ； 12F 禾口 15B ； 12F 禾口 19A ； 12F 禾口 22F ； 15B 禾口 19A ； 15B 禾口 22F ；6A 禾口 19A 等。因此，有用的13价组合物包括来自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19(或 19A)、19F和23F的荚膜糖，如参考文献7_10所述制备。一种这类组合物包括约8 μ g/ml的 6B型糖和浓度各约4 μ g/ml的其它12种糖。另一种这类组合物包括各约8 μ g/ml的6A和6B型糖以及各约4μ g/ml的其它11种糖。结合物的适当载体蛋白包括细菌毒素，如白喉或破伤风毒素，或其类毒素或变体。 这些常用于结合疫苗。例如，可用CRM197白喉毒素突变体[11]。其它合适载体蛋白包括合成肽[12，13]、热激蛋白[14，15]，百日咳蛋白[16，17]，细胞因子[18]，淋巴因子[18]， 激素[18]，生长因子[18]，含来自不同病原衍生抗原的多种人CD4+T细胞表位的人造蛋白[19]如附9[20]，来自流感嗜血杆菌(H. influenzae)的蛋白D[21-23]，肺炎球菌溶血素[24]或其无毒衍生物[25]，肺炎球菌表面蛋白PspA[沈]，摄铁蛋白[27]，来自艰难梭菌 (C. difficile)的毒素A或B口8]，重组铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外蛋白 A(rEPA) [29]等。参考文献1使用的OMPC在本文中排除在肺炎球菌糖的可能载体之外，因为OMPC是脑膜炎球菌外膜囊泡。特别有用的肺炎球菌结合疫苗载体蛋白是CRM197、破伤风类毒素、白喉类毒素和流感嗜血杆菌蛋白D。CRM197用于PREVNAR 。13价混合物可使用CRM197作为13种结合物中每一种的载体蛋白，CRM197可以约55-60 μ g/ml存在。组合物包括来自超过1种肺炎球菌血清型的结合物时，各单独结合物可使用同一载体蛋白或采用不同载体蛋白。尽管在这2种情况中，制备不同结合物的混合物常通过单独制备各血清型结合物，然后将其混合以形成单独结合物的混合物。参考文献30描述了在多价肺炎球菌结合疫苗中使用不同载体蛋白的潜在优势，但PREVNAR 产品成功地对7种不同血清型中的每一种使用了同一载体。载体蛋白可直接或经接头共价结合于肺炎球菌糖。已知多种接头。例如可经羰基连接，可通过修饰糖的游离羟基与CDI反应[31，32]，然后与蛋白反应以形成氨基甲酸酯连接来形成羰基连接。也可使用碳二亚胺缩合[33]。可使用己二酸接头，可通过偶联游离 NH2基(例如通过胺化引入糖)与己二酸(使用例如二酰亚胺活化)，然后偶联蛋白与所得糖-己二酸中间体形成该接头[34，35]。其它接头包括β-丙酰胺基[36]、硝基苯乙胺 [37]、卤代酰基卤化物[38]、糖苷键[39]、6_氨基己酸[40]、Ν_琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫)_丙酸酯(SPDP) [41]、己二酸二酰胼々0机42]、(；到(12部分[43]等。可使用经还原性胺化的结合。首先用过碘酸盐氧化糖以引入醛基，随后该醛基能通过还原性胺化反应与载体蛋白如赖氨酸的ε_氨基形成直接共价连接。若每个糖分子包括多个醛基，则此连接技术可产生交联产物，其中多个醛与多个载体氨基反应。此交联结合技术对于至少4、6B、9V、14、18C、19F和23F型肺炎球菌特别有用。肺炎球菌糖可包括制备自肺炎球菌的全长完整糖，和/或可包括全长糖的片段， 即所述糖可比细菌中所见天然荚膜糖短。因此，可解聚所述糖，解聚在糖纯化期间或在糖纯化后但结合前进行。解聚缩短所述糖的链长度。使用解聚以提供针对免疫原性的最优链长度和/或为了糖的物理可控性缩短链长度。使用超过1种肺炎球菌血清型时，可采用各血清型的完整糖、各血清型的片段，或采用一些血清型的完整糖和其它血清型的片段。组合物包括来自任何4、68、抓、14、19 和23 型的糖时，这些糖优选是完整的。相反，组合物包括来自18C型的糖时，该糖优选是解聚的。3型糖也可解聚。例如，3型糖可进行酸水解以解聚[7]，例如使用乙酸。然后，所得片段可氧化以激活(例如高碘酸盐氧化，可在二价阳离子如MgCl2存在下进行)，在还原条件(例如使用氰基硼氢化钠)下与载体(例如CRM197)结合，且随后(可选地)所述糖中的任何未反应醛能加帽(例如使用硼氢化钠)[7]。结合可在冻干材料上进行，例如在活化糖与载体共冻干后。1型糖可至少部分脱-0-乙酰化，例如通过碱性pH缓冲液处理完成[8]，如通过使用碳酸氢盐/碳酸盐缓冲液。这样的(部分)脱-ο-乙酰化糖可氧化以激活(例如高碘酸盐氧化)，在还原条件(例如使用氰基硼氢化钠)下与载体(例如CRM197)结合，且随后 (可选地)所述糖中的任何未反应醛能加帽(例如使用硼氢化钠)[8]。结合可在冻干材料上进行，例如在活化糖与载体共冻干后。19A型糖可氧化以激活(例如高碘酸盐氧化)，还原条件下在DMSO中与载体(例如CRM197)结合，且随后(可选地)所述糖中的任何未反应醛能加帽(例如使用硼氢化钠) [44]。结合可在冻干材料上进行，例如在活化糖与载体共冻干后。一种或多种肺炎球菌荚膜糖结合物可以冻干形式存在。理想地，肺炎球菌结合物能引发结合相关糖的抗荚膜抗体，例如引起的抗糖抗体水平> 0. 20 μ g/mL[45]。可通过酶免疫测定(EIA)和/或测量调理吞噬活性(OPA)来评估抗体。EIA方法已充分确认且抗体浓度与疫苗功效间存在关联。脑膜炎球菌H因子结合蛋白本发明的组合物包括至少一种脑膜炎球菌H因子结合蛋白(fHBP)。fHBP抗原已详细鉴定。它也称为蛋白‘741，[参考文献56中的SEQ ID 2535和 2536]、‘NMB1870，、‘GNA1870，[参考文献 46-48]、‘P2086，、‘LP2086，或 ‘0RF2086，[49-51]。 它是天然的脂蛋白且在所有脑膜炎球菌血清群中表达。fHbp的C末端免疫显性结构域 (‘fHbpC’ )的结构已由NMR[52]确定。该蛋白部分形成八链β桶，其链通过可变长度环连接。所述桶之前是短的α螺旋和挠性N末端尾。fHBP抗原分成3种不同变体[53]且发现抗给定家族的血清在同一家族内具有杀菌性，但对表达另外两个家族之一的菌株没有活性，即族内交叉保护，但非族间交叉保护。 本发明的组合物可包括单一 fHBP变体，但优选包括来自2或3种变体的fHBP。组合物包括单一 fHBP变体时，它可包括以下之一(a)含有第一氨基酸序列的第一多肽，其中所述第一氨基酸序列包括的氨基酸序列⑴与SEQ ID NO 1有至少序列同一性和/或(ii)由SEQ ID NO 1的至少χ个连续氨基酸的片段组成；(b)含有第二氨基酸序列的第二多肽，其中所述第二氨基酸序列包括的氨基酸序列⑴与SEQ ID NO 2有至少序列同一性和/或(ii)由SEQ ID NO 2的至少y个连续氨基酸的片段组成；(c)含有第三氨基酸序列的第三多肽，其中所述第三氨基酸序列包括的氨基酸序列⑴与SEQ ID NO 3有至少序列同一性和/或(ii)由SEQ ID NO 3的至少ζ个连续氨基酸的片段组成。组合物包括2种不同脑膜炎球菌fHBP抗原时，它可包括以下的组合(i)上述的第一和第二多肽；(ii)上述的第一和第三多肽；或(iii)上述的第二和第三多肽。优选第
一和第三多肽的组合。组合物包括2种不同脑膜炎球菌fHBP抗原时，尽管它们可共享一些序列，第一、第二和第三种多肽具有不同的fHBP氨基酸序列。
给予对象含有第一氨基酸序列的多肽时会引发抗体应答，包括与具新生氨基酸序列SEQ ID N0:60(MC58)的野生型脑膜炎球菌蛋白结合的抗体。在一些实施方式中，这些抗体中的一些或全部不与具新生氨基酸序列SEQ ID NO :61的野生型脑膜炎球菌蛋白或具新生氨基酸序列SEQ ID NO 62的野生型脑膜炎球菌蛋白结合。给予对象含有第二氨基酸序列的多肽时会引发抗体应答，包括与具新生氨基酸序列SEQ ID N0:61(2996)的野生型脑膜炎球菌蛋白结合的抗体。在一些实施方式中，这些抗体中的一些或全部不与具新生氨基酸序列SEQ ID NO :60的野生型脑膜炎球菌蛋白或具新生氨基酸序列SEQ ID NO 62的野生型脑膜炎球菌蛋白结合。给予对象含有第三氨基酸序列的多肽时会引发抗体应答，包括与具新生氨基酸序列SEQ ID NO :62(M1239)的野生型脑膜炎球菌蛋白结合的抗体。在一些实施方式中，这些抗体中的一些或全部不与具新生氨基酸序列SEQ ID NO :60的野生型脑膜炎球菌蛋白或具新生氨基酸序列SEQ ID NO 61的野生型脑膜炎球菌蛋白结合。在一些实施方式中，SEQ ID NO 1的至少χ个连续氨基酸的片段也不存在于SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3内。类似地，SEQ ID NO :2的至少y个连续氨基酸的片段也可不存在于SEQ ID NO 1或SEQ ID NO :3内。类似地，SEQ ID NO 3的至少ζ个连续氨基酸的片段也可不存在于SEQ ID NO :1或SEQ ID Ν0:2内。在一些实施方式中，当来自SEQ ID NO: 1-3之一的所述片段作为连续序列与另外2种SEQ ID NO比对时，所述片段与另外2种SEQ ID NO间的同一性各低于75%，例如低于70%，低于65%，低于60%等。a 值至少为 80，例如 82、84、86、88、90、92、94、95、96、97、98、99 或更高。b 值至少为 80，例如 82、84、86、88、90、92、94、95、96、97、98、99 或更高。c 值至少为 80，例如 82、84、 86、88、90、92、94、95、96、97、98、99或更高。a、b和c的值可以相同或不同。在一些实施方式中，a、b和c相同。χ 值至少为 7，例如 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。 y 值至少为 7，例如 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。ζ 值至少为 7，例如 8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、 60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。x、y 和 ζ 的值可以相同或不同。在一些实施方式中，x、y和ζ相同。片段优选包括来自相应SEQ ID NO:序列的表位。其它有用的片段缺失相应SEQ ID NO 序列C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更
多)，而保留其至少一个表位。相较SEQ ID NO :1、2或3，本发明使用的氨基酸序列包括一个或多个(例如1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10等)保守氨基酸取代，即一个氨基酸被另一个有相关侧链的氨基酸取代。遗传编码的氨基酸通常分成4族(1)酸性，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性，即赖氨酸、 精氨酸、组氨酸；(3)非极性，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电、极性，即甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸一起归类为芳族氨基酸。通常，单个氨基酸的族内置换不会对生物活性产生显著影响。所述多肽可相对参比序列有一个或多个(例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)单一氨基酸缺失。所述多肽也可相对参比序列包括一个或多个 (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)插入(例如各插入1、2、3、4或5个氨基酸)。一种有用的第一氨基酸序列与SEQ ID NO 1有至少85%同一性(例如> 95%或 100%)。另一有用的第一氨基酸序列与SEQ ID NO :66有至少95%同一性(例如>98%或 100%)。另一有用的第一氨基酸序列与SEQ ID NO :67有至少95%同一性(例如>98% 或 100% )。一种有用的第三氨基酸序列与SEQ ID NO 3有至少85%同一性(例如> 95%或 100%)。另一有用的第三氨基酸序列与SEQ ID NO :68有至少95%同一性(例如>98% 或 100% )。含基于SEQ ID NO 66和68 (或其接近变体)的第一和第三序列混合物的组合特别有用。另一有用的组合包括基于SEQ ID NO :67和68 (或其接近变体)混合物的第一和第三序列混合物。因此，组合物可包括含氨基酸序列SEQ ID NO :63的多肽和含氨基酸序列 SEQ ID NO 65 的多肽。在一些实施方式中，fHBP多肽在例如N末端半胱氨酸处脂化。然而，在其它实施方式中，fHBP多肽未脂化。对于脂化的fHBP，结合于半胱氨酸的脂质通常包括棕榈酰残基，例如作为三棕榈酰-S-甘油酰-半胱氨酸(Pam3Cys)、二棕榈酰-S-甘油酰半胱氨酸 (Pam2Cys)、N_乙酰(二棕榈酰-S-甘油酰半胱氨酸)等。成熟的脂化fHBP序列的示例有 SEQ ID NO :63(包括 SEQ ID NO 66)、SEQ ID NO :64(包括 SEQ ID NO 67)和 SEQ ID NO 65(包括 SEQ ID NO 68)。给予fHBP优选引发能结合脑膜炎球菌多肽的抗体，所述多肽由氨基酸序列SEQ ID NO :1、2或3组成。本发明使用的优选fHBP抗原在给予对象后可引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。fHBP多肽总量通常为1-500 μ g/剂量，例如60-200 μ g/剂量或120-500 μ g/ml。其它抗原除了结合型肺炎球菌荚膜糖和脑膜炎球菌H因子结合蛋白，本发明的组合物可包括来自脑膜炎球菌、肺炎球菌和/或更多病原的其它抗原。脑膜炎球菌多肽抗原除了含有脑膜炎球菌fHBP多肽抗原，组合物可包括一种或多种其它脑膜炎球菌多肽抗原。因此，组合物可包括选自下组的多肽抗原287、NadA, NspA, HmbR, NhhA, App和 /或0mp85。这些抗原优选作为纯化多肽例如重组多肽存在。所述抗原优选在给予对象后引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。在本发明的一些实施方式中，免疫原性组合物仅包括一种脑膜炎球菌PorA亚型，或优选不包括PorA外膜蛋白。本发明的组合物可包括287抗原。所述287抗原作为基因NMB2132 (GenBank登录号GI =7227388 ；本文中的SEQ ID NO 9)包含在B群脑膜炎球菌菌株MC58的公开基因组序列中[54]。此后已公开了许多菌株的287抗原序列。例如，287的等位基因形式可见于参考文献55的图5和15、参考文献56的实施例13和图21 (其中的SEQ ID 3179到3184)。 也报道了 287抗原的不同免疫原性片段。本发明使用的优选287抗原包括氨基酸序列(a) 与 SEQ ID NO :9 有 50%或更高的同一性(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ IDN0:9的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更多(例如8、10、12、14、16、 18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。(b)的优选片段包含 SEQ
ID NO :9的表位。本发明最有用的287抗原可在给予对象后引发抗体，所述抗体能结合由氨基酸序列SEQ ID NO :9组成的脑膜炎球菌多肽。本发明使用的优选287抗原可在给予对象后弓I发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。本发明的组合物可包括NadA抗原。所述NadA抗原作为基因NMB 1994 (GenBank 登录号GI =7227256 ；本文中的SEQ ID NO 10)包含在B群脑膜炎球菌菌株MC58的公开基因组序列中[54]。此后已公开了许多菌株的NadA抗原序列，该蛋白作为奈瑟菌粘附素的活性已充分报道。也报道了 NadA的不同免疫原性片段。本发明使用的优选NadA抗原包括氨基酸序列(a)与SEQ ID NO :10有50%或更高的同一性(例如60%、65%、70%、75%、 80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%或更高)；和 /或(b)含有SEQ IDN0:10的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。(b) 的优选片段包含SEQ ID N0:10的表位。本发明最有用的NadA抗原可在给予对象后引发抗体，所述抗体能结合由氨基酸序列SEQ ID NO :10组成的脑膜炎球菌多肽。本发明使用的优选NadA抗原可在给予对象后引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。SEQ ID NO :6就是一个这类片段。本发明的组合物可包括NspA抗原。所述NspA抗原作为基因NMB 0663((ienBank登录号GI =7225888 ；本文中的SEQ ID NO :11)包含在B群脑膜炎球菌菌株MC58的公开基因组序列中[54]。先前已从参考文献57和58中了解该抗原。此后公开了许多菌株的NspA抗原序列。也报道了 NspA的不同免疫原性片段。本发明使用的优选NspA抗原包括氨基酸序列:(a)与 SEQ ID NO 11 有 50%或更高的同一性(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有SEQ ID NO :11的至少'η'个连续氨基酸片段，其中'η'是7或更多(例如8、10、12、 14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。(b)的优选片段包含SEQ ID N0:11的表位。本发明最有用的NspA抗原可在给予对象后引发抗体，所述抗体能结合由氨基酸序列SEQ ID NO :11组成的脑膜炎球菌多肽。本发明使用的优选NspA抗原可在给予对象后引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。本发明的组合物可包括脑膜炎球菌HmbR抗原。全长HmbR序列作为基因NMB 1668(本文中的SEQ ID NO :7)包含在B群脑膜炎球菌菌株MC58的公开基因组序列中[54]。 参考文献59报道了来自另一菌株的HmbR序列(本文中的SEQ ID NO :8)。SEQ ID N0:7和 8长度差1个氨基酸且具有94. 2%同一性。本发明可使用含全长HmbR序列的多肽，但常用含部分HmbR序列的多肽。因此，在一些实施方式中，根据本发明使用的HmbR序列可包括与 SEQID NO :7有至少序列同一性的氨基酸序列，其中i的值是50、60、70、80、90、95、99或更高。在其它实施方式中，根据本发明使用的HmbR序列可包括SEQ ID NO :7的至少j个连续氨基酸的片段，其中 j 的值是 7、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、 100、150、200、250或更多。在其它实施方式中，根据本发明使用的HmbR序列可包括氨基酸序列⑴与SEQ ID NO 7有至少序列同一性和/或(ii)含有SEQ ID NO 7的至少j个连续氨基酸片段。优选的j个氨基酸片段包含SEQ ID NO :7的表位。这些表位通常包含位于HmbR表面的氨基酸。有用的表位包括具有参与HmbR与血红蛋白结合的氨基酸的表位， 因为结合这些表位的抗体能阻断细菌结合宿主血红蛋白的能力。参考文献60研究了 HmbR 的拓扑结构和其关键功能残基。本发明最有用的HmbR抗原可在给予对象后引发抗体，所述抗体能结合由氨基酸序列SEQ ID NO :7组成的脑膜炎球菌多肽。本发明使用的优选HmbR 抗原可在给予对象后引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。本发明的组合物可包括NhhA抗原。所述NhhA抗原作为基因NMB0992 (GenBank登录号GI =7226232 ；本文中的SEQ ID NO 12)包含在B群脑膜炎球菌菌株MC58的公开基因组序列中[54]。此后如参考文献55和61已公开了许多菌株的NhhA抗原序列，并已报道了 NhhA的不同免疫原性片段。它也称为Hsf。本发明使用的优选NhhA抗原包括氨基酸序列:(a)与 SEQ ID NO :12有 50%或更高的同一性(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有SEQ ID NO: 12的至少'η'个连续氨基酸片段，其中'η'是7或更多(例如8、10、12、 14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。(b)的优选片段包含SEQ ID N0:12的表位。本发明最有用的NhhA抗原可在给予对象后引发抗体，所述抗体能结合由氨基酸序列SEQ ID NO: 12组成的脑膜炎球菌多肽。本发明使用的优选NhhA抗原可在给予对象后弓I发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。本发明的组合物可包括App抗原。所述App抗原作为基因NMB1985 (GenBank登录号GI =7227246 ；本文中的SEQ ID NO 13)包含在B群脑膜炎球菌菌株MC58的公开基因组序列中[54]。此后已公开了许多菌株的App抗原序列。也报道了 App的不同免疫原性片段。本发明使用的优选App抗原包括氨基酸序列(a)与SEQ ID NO :13有50%或更高的同一性(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%, 97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和/或(b)含有SEQ ID N0:13的至少'η'个连续氨基酸片段，其中'η'是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、 90、100、150、200、250或更多)。(b)的优选片段包含SEQ ID NO 13的表位。本发明最有用的App抗原可在给予对象后引发抗体，所述抗体能结合由氨基酸序列SEQ ID N0:13组成的脑膜炎球菌多肽。本发明使用的优选App抗原可在给予对象后弓I发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。本发明的组合物可包括0mp85抗原。所述0mp85抗原作为基因NMB0182 (GenBank 登录号GI =7225401 ；本文中的SEQ ID NO :14)包含在B群脑膜炎球菌菌株MC58的公开基因组序列中[54]。此后已公开了许多菌株的0mp85抗原序列。关于0mp85的进一步信息见参考文献62和63。也报道了 0mp85的不同免疫原性片段。本发明使用的优选0mp85抗原包括氨基酸序列(a)与SEQ ID NO :14有50%或更高的同一性(例如60%、65%、70%、75%、 80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%或更高)；和 /或(b)含有SEQ ID N0:14的至少'η'个连续氨基酸片段，其中'η'是7或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。(b) 的优选片段包含SEQ ID N0:14的表位。本发明最有用的0mp85抗原可在给予对象后引发抗体，所述抗体能结合由氨基酸序列SEQ ID NO :14组成的脑膜炎球菌多肽。本发明使用的优选0mp85抗原可在给予对象后引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
脑膜炎球菌脂寡糖除了含有脑膜炎球菌fHBP多肽抗原，组合物可包括一种或多种脑膜炎球菌脂寡糖(LOS)抗原。脑膜炎球菌LOS是在细菌外膜外部单层中发现的基于葡糖胺的磷脂。它包括脂质A部分和核心寡糖区，脂质A部分作为膜的疏水锚。寡糖核心内的异质性产生不同脑膜炎球菌菌株间的结构和抗原多样性，其可用于将菌株细分成12种免疫型(Li到L12)。 本发明使用来自任何免疫型例如Li、L2、L3、L4、L5、L6、L7和/或L8的LOS。L2和L3 α链天然包括乳糖_Ν_新四糖(LNnT)。本发明使用来自L2或L3免疫型的LOS时，该LNnT可缺失。此缺失可通过使用突变菌株方便地完成，改造所述菌株以破坏其在合成α链内LNnT四糖的能力。已知可通过敲除负责相关生物合成加成的酶实现此目标[64，65]。例如，敲除LgtB酶防止LNnT的末端半乳糖加成，以及防止下游加成α链末端唾液酸。敲除LgtA酶防止LNnT的N-乙酰葡糖胺加成以及下游加成。LgtA敲除可伴随 LgtC敲除。类似地，敲除LgtE和/或GalE酶防止内部半乳糖加成，敲除LgtF防止葡萄糖加成入H印1残基。可单独或联合使用任何这些敲除以破坏L2、L3、L4、L7或L9免疫型菌株中的LNnT四糖。优选敲除至少LgtB，因为这提供了保留有效免疫原性且同时去除LNnT表位的LOS。作为突变以破坏LNnT表位的补充或替代，敲除galE基因也提供有用的修饰L0S，类似地可敲除脂质A脂肪转移酶基因[66]。至少一种主要0连接脂肪酸可从LOS中移除[67]。也可使用每分子LOS 二级酰基链数量减少的L0S[68]。所述LOS 通常包括至少GlcNAc-Η印2磷酸乙醇胺-KDO2-脂质A结构[69]。所述LOS可包括 GlcNAc β l-3Gal β l_4Glc 三糖而没有 LNnT 四糖。本发明组合物可包括不同形式的LOS。LOS可以其自身纯化形式使用。它可与载体蛋白结合。结合LOS时，可以经LOS的脂质A部分或通过任何其它适当部分例如其KDO 残基结合。如果缺失LOS的脂质A部分，则需要这类替代连接。LOS的结合技术可参见例如参考文献67、69、70、71等。前面讨论了这些结合物的优选载体蛋白，例如细菌毒素，如白喉或破伤风毒素或其类毒素或变体。LOS可以来自菌株(例如遗传改造的脑膜炎球菌菌株)，该菌株具有如参考文献72 所述的固定(即无相变量)L0S免疫型。例如，可固定L2和L3L0S免疫型。这些菌株的免疫型间转换率可比原始野生型菌株降低超过2倍(甚至> 50倍)。参考文献72公开了如何通过修饰IgtA和/或IgtG基因产物获得此结果。LOS可以在结合其庚糖II残基的GlcNac残基上0_乙酰化，例如用于L3[73]。免疫原性组合物可包括超过一种L0S，例如来自脑膜炎球菌免疫型L2和L3的 LOS0例如，可使用参考文献74所述的LOS组合。LOS抗原优选在给予对象后引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。然而，本发明的优选组合物没有脑膜炎球菌脂寡糖。脑膜炎球菌荚膜糖抗原除了含有脑膜炎球菌fHBP多肽抗原，组合物可包括一种或多种脑膜炎球菌荚膜糖结合物。本发明的组合物可包括来自1、2、3或4种脑膜炎球菌血清群A、C、W135和Y的一种或多种荚膜糖结合物，例如 A+C、A+W135、A+Y、C+W135、C+Y、W135+Y、A+C+W135、A+C+Y、 A+W135+Y、A+C+W135+Y等。理想的组合物含有C群糖或含有来自所有4种血清群A、C、W135和Y的糖。 A群脑膜炎球菌的荚膜糖是(α 1 — 6)连接的N-乙酰-D-甘露糖胺磷酸盐的均聚物，在C3和C4位置有部分0-乙酰化。C3位置的乙酰化可以是70-95%。用于纯化糖的条件可导致脱-0-乙酰化(例如在碱性条件下)，但保留C3位置的OAc是有益的。在一些实施方式中，A群糖中至少50% (例如至少60%、70%、80%、90%、95%或更多)甘露糖胺残基在C3位置0-乙酰化。乙酰基可用阻断基团取代以防止水解[75]，这种改良糖仍是本发明意义内的A群糖。C群荚膜糖是(α 2 — 9)连接的唾液酸(N-乙酰神经氨酸，或‘NeuNAc’)的均聚物。 所述糖结构写为一9)-Neu ρ NAc 7/80Ac-(a2—。大部分C群菌株在唾液酸残基的C7和 /或C8有0-乙酰基，但约15%的临床分离物没有这些0-乙酰基[76，77]。有或没有OAc基团会产生独特的表位，抗体结合所述糖的特异性可影响其抗0-乙酰化(OAc+)和脱-0-乙酰化(OAc-)菌株的杀菌活性[78-80]。本发明使用的C群糖可从OAc+或OAc-菌株中制备。已批准的 MenC 结合疫苗包括 OAc- (NEISVAC-C )和 OAc+ (MENJUGATE 与 MENINGITEC ) 糖。在一些实施方式中，生成C群结合物的菌株是OAc+菌株，例如16型，PL 7a, 1亚型等。 因此，可使用C:16:P1. 7a，l OAc+菌株。Pl. 1亚型中的OAc+菌株如Cll菌株也有用。W135群糖是唾液酸-半乳糖二糖单元的聚合物。与C群糖类似，它具有可变的 0-乙酰化，但这是在唾液酸7和9位置[81]。所述结构写为一4) -D-Neup5Ac (7/90Ac) - α -(2 — 6)-D-Gal-α -(1 —。Y群糖与W135群糖类似，但二糖重复单元包括葡萄糖而不是半乳糖。与W135群类似，它在唾液酸7和9位置具有可变的0-乙酰化[81]。Y群结构写为一4) -D-Neup5Ac (7 /90Ac) - α - (2 — 6) -D-Glc- α - (1 —。本发明所用的糖可如上所述0-乙酰化(例如具有与天然荚膜糖中所见相同的 ο-乙酰化模式)，或它们可在糖环的一个或多个位置部分或全部脱-ο-乙酰化，或它们可相对其天然荚膜糖高-0-乙酰化。结合物中的糖部分可包括制备自脑膜炎球菌的全长糖，和/或可包括全长糖的片段，即所述糖可以比细菌中所见的天然荚膜糖短。因此，所述糖可解聚，解聚在糖纯化期间或在糖纯化后但结合前进行。解聚缩短糖的链长度。一种解聚方法包括使用过氧化氢。将过氧化氢加入糖(例如用于产生1 %的H2O2终浓度)，然后孵育所述混合物(例如在约55°C ) 直到获得所需的链长度缩短。另一解聚方法包括酸水解。本领域已知其它解聚方法。用于制备本发明所用结合物的糖可通过任何这些解聚方法获得。可使用解聚以提供针对免疫原性的最优链长度和/或为糖的物理可控性缩短链长度。在一些实施方式中，糖具有以下范围的平均解聚程度(Dp) =A = 10-20 ；C = 12-22 ；W135 = 15-25 ；Y = 15-25。就分子量而非 Dp 而言，所有血清群的有用范围是< IOOkDa ；5kDa_75kDa ；7kDa_50kDa ；8kDa_35kDa ； 12kDa-25kDa ； 15kDa_22kDa。在一些实施方式中，来自各脑膜炎血清群A、C、W135和Y的糖的平均分子量可以大于 50kDa，例如彡 75kDa、彡 IOOkDa, ^ IlOkDa, ^ 120kDa、彡 130kDa 等[82]，甚至高达 1500kDa，具体由MALLS测定。例如MenA糖可以在50_500kDa范围内，例如60_80kDa ；MenC 糖可以在100_210kDa范围内；MenW135糖可以在60_190kDa范围内，例如120_140kDa ；和/ 或MenY糖可以在60-190kDa范围内，例如150_160kDa。
组合物中脑膜炎球菌糖质量/血清群通常为1 μ g-20 μ g，例如2_10 μ g/血清群， 或约4 μ g或约5 μ g或约10 μ g。当所包括的结合物来自超过1种血清群时，这些结合物可以基本相等的质量存在，例如各血清群糖的质量彼此相差+10%以内。作为等比例的替代，A 群糖可使用双倍质量。因此，疫苗可包括10 μ g的MenA糖和各5 μ g的MenC、W135和Y糖。上面讨论了有用的载体蛋白和链接化学。有用的载体包括白喉类毒素、破伤风类毒素和CRM197。可使用糖蛋白比例(w/w)为1 5(即过量蛋白)_5 1(即过量糖)的结合物， 例如1 2-5 1的比例和1 1.25-1 2. 5的比例。如参考文献83所述，混合物中的不同脑膜炎球菌血清群可具有不同的糖蛋白比例，例如一种可具有1 2-1 5之间的比例，而另一种具有5 1-1 1.99之间的比例。如参考文献84所述，混合物包括一种具有直接糖/蛋白连接的结合物和另一种经接头连接的结合物。当使用来自不同脑膜炎球菌血清群的糖结合物时这种设置尤其有用， 例如MenA和MenC糖经接头结合而MenW135和MenY糖直接结合载体蛋白。肺炎球菌多肽抗原除了含有结合型肺炎球菌荚膜糖，组合物可包括一种或多种肺炎球菌多肽抗原。 因此，组合物可包括以下一种或多种(1) spr0057抗原；(2) spr0286抗原；(3) spr0565抗原；(4) sprl098 抗原；(5) sprl345 抗原；(6) sprl416 抗原；(7) sprl418 抗原；(8) spr0867 抗原；(9)sprl431抗原；(10)肺炎球菌溶血素；(11) spr2021抗原；(12) spr0096抗原；(13) sprl433 抗原；和 / 或(14) sprl707 抗原。组合物可包括以下一种或多种⑴PspA多肽；(2)PsaA多肽；(3)PspC多肽；(4) LytA 多肽；(5) PhtA 多肽；(6) PhtA 多肽；(7) PhtA 多肽；和 / 或(8) PhtD 多肽。组合物可包括肺炎球菌菌毛亚基，如RrgA、RrgB和/或RrgC。优选肺炎球菌多肽抗原可在给予对象后引发保护性抗体。原始的'spr0057 ‘序列在参考文献85中标注为'β _N_乙酰-己糖胺酶前体'(参见GI :15902101)。出于参比目的，本文以SEQ ID NO 18给出R6菌株中发现的全长spr0057氨基酸序列。本发明使用的优选spr0057多肽包括的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO 18 有 50%或更高的同一性(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%, 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID NO 18 的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、 25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。这些 spr0057 蛋白包括 SEQ ID N0:18的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID NO 18的表位。其它优选片段缺失SEQ ID NO 18C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留 SEQ ID NO :18的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。SEQ ID NO :32是一个合适片段，其缺少天然前导肽和分选酶识别序列。原始的'spr0286'序列在参考文献85中标注为'透明质酸酶前体'(参见GI 15902330)。出于参比目的，本文以SEQ ID NO 19给出R6菌株中发现的全长spr0286氨基酸序列。本发明使用的优选spr0286多肽包括氨基酸序列(a)与SEQ ID NO: 19有50% 或更高的同一性(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ IDN0:19 的至少'η' 个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。这些 spr0286 蛋白包括 SEQ ID N0:19 的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID N0:19的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:19C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO 19的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。SEQ ID NO :33是一个合适片段，其缺少天然前导肽和分选酶识别序列的。其它合适片段是SEQ ID N0:34和35。原始的'spr0565'序列在参考文献85中标注为'β-半乳糖苷酶前体'(参见 GI :15902609)。出于参比目的，本文以SEQ ID NO :20给出R6菌株中发现的全长spr0565氨基酸序列。本发明使用的优选spr0565多肽包括氨基酸序列(a)与SEQ ID N0:20有50% 或更高的同一性(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID N0:20 的至少'η' 个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。这些 spr0565 蛋白包括 SEQID NO 20 的变体(例如SEQ ID而66;见下)。(b)的优选片段包含SEQ ID NO 20的表位。其它优选片段缺失SEQ ID NO :20C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、 25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、 25个或更多)，而保留SEQ ID NO :20的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。SEQ ID NO :36是一个合适片段，其缺少天然前导肽和分选酶识别序列。其它合适片段是 SEQ ID NO 37 和 38。本文中spr0565的一个变体形式是SEQ ID NO :39。参考文献86报道了此变体形式(其中的SEQ ID NO 178)用于免疫。有用的spr0565多肽可包括氨基酸序列(a) 与 SEQ ID NO :39 有 50%或更高的同一性(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID N0:39的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更多(例如8、10、12、14、 16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。这些多肽包括 SEQ ID N0:39的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID NO 39的表位。其它优选片段缺失SEQ ID NO :39C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和 /或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO :39的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。参考文献86 的表1指出了 SEQ ID NO 39的免疫原性片段。由于spr0565天然是长多肽(> 2000个氨基酸)，更易表达片段。因此，本发明使用的spr0565适当形式可以小于1500个氨基酸长(例如< 1400，< 1300，< 1200，< 1100 等)。这种 spr0565 短形式包括 ^ρΓΟδθδΑ' (SEQ ID NO :37)和 ^ρΓΟδθδΒ' (SEQ ID NO: 38)。原始的'sprl098 ‘序列在参考文献85中标注为'分选酶'(参见GI 15903141)。出于参比目的，本文以SEQ ID NO :21给出R6菌株中发现的全长sprl098氨基酸序列。本发明使用的优选sprl098多肽包括氨基酸序列(a)与SEQ ID NO 21有50%或更高的同一性(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ IDN0:21 的至少'η' 个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。这些 sprl098 蛋白包括 SEQ ID NO :21 的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID N0:21的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:21C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO 21的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。SEQ ID NO :40是一个合适片段，其缺少天然前导肽序列。原始的'sprl345'序列在参考文献85中标注为'假拟蛋白'(参见GI: 15903388)。出于参比目的，本文以SEQ ID NO :22给出R6菌株中发现的全长sprl345氨基酸序列。本发明使用的优选sprl345多肽包括氨基酸序列(a)与SEQ ID N0:22有50% 或更高的同一性(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID N0:22 的至少'η' 个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。这些 sprl345 蛋白包括 SEQ ID NO :22 的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID N0:22的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:22C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO 22的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。SEQ ID NO 41是一个合适片段，其缺少天然前导肽和分选酶识别序列。原始的'sprl416'序列在参考文献85中标注为'假拟蛋白'(参见GI: 15903459)。出于参比目的，本文以SEQ ID NO :23给出R6菌株中发现的全长sprl416氨基酸序列。本发明使用的优选sprl416多肽包括氨基酸序列(a)与SEQ ID NO 23有50% 或更高的同一性(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID N0:23 的至少'η' 个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。这些 sprl416 蛋白包括 SEQ ID NO :23 的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID N0:23的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:23C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID N0:23的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。原始的'sprl418'序列在参考文献85中标注为'假拟蛋白'(参见GI: 15903461)。出于参比目的，本文以SEQ ID NO :24给出R6菌株中发现的全长sprl418氨基酸序列。本发明使用的优选sprl418多肽包括氨基酸序列(a)与SEQ ID N0:24有50% 或更高的同一性(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID N0:24 的至少'η' 个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。这些 sprl418 蛋白包括 SEQ ID NO 24 的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID N0:24的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:24C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO 24的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。原始的'spr0867 ‘序列在参考文献85中标注为'内切β_Ν_乙酰葡糖胺酶'(参见GI :15902911)。出于参比目的，本文以SEQ ID NO :25给出R6菌株中发现的全长spr0867氨基酸序列。本发明使用的优选spr0867多肽包括氨基酸序列(a)与SEQ ID NO :25 有 50%或更高的同一性(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID NO 25 的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、 25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。这些 spr0867 蛋白包括 SEQ ID NO 25的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID NO 25的表位。其它优选片段缺失SEQ ID NO 25C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留 SEQ ID NO :25的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。SEQ ID NO :42是一个合适片段，其缺少天然前导肽序列。原始的'sprl431 ‘序列在参考文献85中标注为'1，4_β _N_乙酰胞壁质酶'(参见GI 15903474)。它也称为‘LytC，，其免疫用途报道于参考文献100。出于参比目的，本文以SEQ ID N0:26给出R6菌株中发现的全长sprl431氨基酸序列。本发明使用的优选sprl431多肽包括氨基酸序列(a)与SEQ ID NO 26有50%或更高的同一性(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%、99. 5%或更高)；和/或(b)含有SEQ ID N0:26的至少'η'个连续氨基酸的片段， 其中'η'是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、 150、200、250或更多)。这些sprl431蛋白包括SEQ ID NO :26的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID N0:26的表位。其它优选片段缺失SEQ ID NO :26C末端的一个或多个氨基酸 (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸 (例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25 个或更多)，而保留 SEQ ID NO 26 的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。SEQ ID NO :43是一个合适片段，其缺少天然前导肽序列。本文以SEQ ID NO :27给出R6菌株中发现的全长肺炎球菌溶血素氨基酸序列。本发明使用的优选肺炎球菌溶血素多肽包括氨基酸序列(a)与SEQ ID N0:27有50%或更高的同一性(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%, 96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 /或(b)含有 SEQ ID N0:27 的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、 70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些肺炎球菌溶血素蛋白包括SEQ ID NO :27的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID NO :27的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:27C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO: 27的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。本领域已知免疫用途的肺炎球菌溶血素突变形式[25，87-92]，本发明可使用这些突变形式。通过C末端截短(例如参见参考文献93)如缺失34个氨基酸、45个氨基酸、7个氨基酸[94]等实现脱毒。根据SEQ ID NO 27编号的其它突变包括Pro325 — Leu (例如SEQ ID NO 44)和/或Trp433 — Phe (例如SEQ ID NO 45)。这些突变可与C末端截短联用，例如联用Pro325 — Leu突变与7聚体截短(例如 SEQ ID NO 46)。原始的'spr2021'序列在参考文献85中标注为'通用应激蛋白GSP-781 ‘(参见GI :15904062)。出于参比目的，本文以SEQ ID NO :28给出R6菌株中发现的全长spr2021 氨基酸序列。本发明使用的优选spr2021多肽包括氨基酸序列(a)与SEQ ID NO :28有 50% 或更高的同一性(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99·5%或更高)；和/或(b)含有SEQ ID NO :28 的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、 35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。这些 spr2021 蛋白包括 SEQID NO 28 的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID N0:28的表位。其它优选片段缺失SEQ ID NO :28C 末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N 末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO :28的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。SEQ ID NO :47是一个合适片段，其缺少天然前导肽序列。参考文献86将spr2021标注为与GbpB同源的分泌 45kDa蛋白并公开其作为免疫原的用途(其中的SEQ ID NO :243 ;SP2216)。参考文献86的表1 (第73页)指出了 spr2021的免疫原性片段。spr2021的另一有用片段是参考文献95 的 SEQ ID NO 1(本文中 SEQ ID NO 28 的氨基酸 28-278)。原始的'Spr0096'序列在参考文献85中标注为'假拟蛋白'(参见GI: 15902140)。出于参比目的，本文以SEQ ID NO :29给出R6菌株中发现的全长spr0096氨基酸序列。本发明使用的优选spr0096多肽包括氨基酸序列(a)与SEQ ID N0:29有50% 或更高的同一性(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID N0:29 的至少'η' 个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。这些 spr0096 蛋白包括 SEQ ID NO 29 的变体(例如SEQ ID NO 40 ；见下)。(b)的优选片段包含SEQ ID NO 29的表位。其它优选片段缺失SEQ ID NO :29C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25 个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25 个或更多)，而保留SEQ ID NO :29的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。本文的SEQ ID NO :48是spr0096的一个变体形式，在其相对SEQ ID NO :29的C 末端附近有插入。参考文献86报道了此变体的免疫用途(其中的SEQID N0:150)，所述变体标注为LysM结构域蛋白。因此，本发明使用的spr0096包括氨基酸序列(a)与SEQ ID NO :48 有 50%或更高的同一性(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%或更高)；和/或(b)含有SEQ ID NO :48 的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、 30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。这些多肽包括 SEQ ID NO 48 的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID N0:48的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:48C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO :48的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。参考文献86的表1指出 T SEQ ID NO 48的免疫原性片段。spr0096多肽可以二聚体如同二聚体形式使用。原始的'sprl433'序列在参考文献85中标注为'假拟蛋白'(参见GI: 15903476)。出于参比目的，本文以SEQ ID NO :30给出R6菌株中发现的全长sprl433氨基酸序列。本发明使用的优选sprl433多肽包括氨基酸序列(a)与SEQ ID N0:30有50% 或更高的同一性(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID N0:30 的至少'η' 个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。这些 sprl433 蛋白包括 SEQ ID NO 30 的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID N0:30的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:30C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO 30的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。原始的'sprl707'序列在参考文献85中标注为'ABC转运蛋白底物结合蛋白-寡肽转运'(参见GI :15903749)。出于参比目的，本文以SEQ ID NO :31给出R6菌株中发现的全长sprl707氨基酸序列。本发明使用的优选sprl707多肽包括氨基酸序列(a) 与 SEQ ID NO :31 有 50%或更高的同一性(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ IDN0:31的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更多(例如8、10、12、14、16、 18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。这些 sprl707 蛋白包括 SEQ ID NO 31的变体(例如SEQ ID NO :100 ；见下)。(b)的优选片段包含SEQ ID NO 31 的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:31C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO :31的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。本文的SEQ ID NO 49是sprl707的一个变体形式，其与SEQ ID NO 31差4个氨基酸。参考文献86报道了 SEQ ID NO :49(该文献中的SEQ ID NO :220)的免疫用途。因此，本发明使用的sprl707多肽包括氨基酸序列(a)与SEQ ID NO :49有50 %或更高的同一性(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%, 97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和/或(b)含有SEQ ID N0:49的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、 80、90、100、150、200、250或更多)。这些多肽包括SEQ ID NO :49的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID N0:49的表位。其它优选片段缺失SEQ ID NO :49C末端的一个或多个氨基酸 (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸 (例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25 个或更多)，而保留 SEQ ID NO 49 的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。参考文献86的表1指出了 SEQ ID N0:49的免疫原性片段。PspA是肺炎球菌表面蛋白A。出于参比目的，本文的SEQ ID NO :50是全长PspA 的氨基酸序列。在R6基因组中，PspA是spr0121[85]。本发明使用的优选PspA多肽包括氨基酸序列(a)与SEQ ID而50有50%或更高的同一性(例如60%、65%、70%、75%、 80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%或更高)；和 /或(b)含有SEQ IDN0:50的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。这些 PspA蛋白包括SEQ ID N0:50的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID NO 50的表位。其它优选片段缺失EQ ID NO :50C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、 20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、 20,25个或更多)，而保留SEQ ID NO 50的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。参考文献96报道了 PspA的免疫用途。它可有利地与PspC联合给予。PsaA是肺炎球菌表面粘附素。出于参比目的，本文的SEQ ID NO :51是全长PsaA 的氨基酸序列。本发明使用的优选PsaA多肽包括氨基酸序列(a)与SEQ ID N0:51有50% 或更高的同一性(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ IDN0:51 的至少'η' 个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。这些 PsaA 蛋白包括 SEQ ID NO :51 的变体。 (b)的优选片段包含SEQ ID N0:51的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:51C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO: 51的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。参考文献95中的SEQ ID NO 3 (对应于本文SEQ ID NO :51中氨基酸21-519)是有用的PsaA片段。参考文献97报道了 PsaA的免疫用途。它可与PspA和/或PspC联用。PspC是肺炎球菌表面蛋白C [98]，也称为胆碱结合蛋白A (CbpA)。参考文献99和 100报道了它的免疫用途。在R6菌株中，它是sprl995，且出于参比目的，本文的SEQ ID N0:52是全长sprl995的氨基酸序列。本发明使用的优选PspC多肽包括氨基酸序列(a) 与 SEQ ID 而52有50%或更高的同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID N0:52的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更多(例如8、10、12、14、 16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。这些 sprl995 蛋白包括SEQ ID NO 52的变体(例如SEQ ID NO 27 ；见下)。(b)的优选片段包含SEQ ID NO 52的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:52C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO :52的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。PspC的一个变体称为‘Hie’。它类似于PspC，如参考文献101的

图1所示，该文献报道Hic结合H因子(fH)。出于参比目的，本文的SEQ ID NO :53是全长Hic的氨基酸序列。本发明可使用Hic蛋白作为PspC多肽的补充或替代。本发明使用的优选HiC多肽包括氨基酸序列(a)与SEQ ID NO :53有50%或更高的同一性(例如60%、65%、70%、75%、 80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%或更高)；和 /或(b)含有SEQ IDN0:53的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。这些 Hic蛋白包括SEQ ID NO 53的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID NO 53的表位。其它优选片段缺失SEQ ID NO :53C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、 20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、 20,25个或更多)，而保留SEQ ID NO 53的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。PspC和/或Hic可有利地与PspA和/或PsaA联用。LytA是N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(自溶素)。出于参比目的，本文的SEQ ID NO :54是全长LytA的氨基酸序列。在R6基因组中，LytA是sprl754[85]。本发明使用的优选LytA多肽包括氨基酸序列(a)与SEQ ID NO 54有50%或更高的同一性(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%、99. 5%或更高)；和/或(b)含有SEQ ID N0:54的至少'η'个连续氨基酸的片段， 其中'η'是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、 150,200,250或更多)。这些LytA蛋白包括SEQ ID NO 54的变体(例如GI =18568354)。 (b)的优选片段包含SEQ ID N0:54的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:54C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO: 54的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。参考文献102报道了 LytA的免疫用途，特别是含与异源混合性T辅助细胞表位融合的LytA胆碱结合域。PhtA是肺炎球菌组氨酸三联体蛋白A。出于参比目的，本文的SEQ ID NO :55是全长PhtA前体的氨基酸序列。在R6基因组中，PhtA是sprl061 [85]。本发明使用的优选 PhtA多肽包括氨基酸序列(a)与SEQ ID NO :55有50%或更高的同一性(例如60%、65%、 70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5% 或更高)；和/或(b)含有SEQ ID N0:55的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。这些PhtA蛋白包括SEQ ID N0:55的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID NO :55的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:55C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO :55的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。参考文献103和104报道了 PhtA的免疫用途。PhtB是肺炎球菌组氨酸三联体蛋白B。出于参比目的，本文的SEQ ID NO 56是全长PhtB前体的氨基酸序列。位于残基578的Xaa可以是赖氨酸。本发明使用的优选PhtB 多肽包括氨基酸序列(a)与SEQ ID N0:56有50%或更高的同一性(例如60%、65%、 70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5% 或更高)；和/或(b)含有SEQ ID N0:56的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。这些WitB蛋白包括SEQ ID NO 56的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID NO 56的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:56C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO :56的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。参考文献103、104和105报道了 WrtB的免疫用途。WitD是肺炎球菌组氨酸三联体蛋白D。出于参比目的，本文的SEQ ID NO :57是全长WitD前体的氨基酸序列。在R6基因组中，PhtD是spr0907[8U。本发明使用的优选 WitD多肽包括氨基酸序列(a)与SEQ ID NO :57有50%或更高的同一性(例如60%、65%、 70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5% 或更高)；和/或(b)含有SEQ ID N0:57的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。这些WitD蛋白包括SEQ ID N0:57的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID NO :57的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:57C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO :57的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。参考文献103、104和106报道了 WrtD的免疫用途。WitE是肺炎球菌组氨酸三联体蛋白E。出于参比目的，本文的SEQ ID NO :58是全长WitE前体的氨基酸序列。在R6基因组中，PhtE是spr0908[8U。本发明使用的优选 WitE多肽包括氨基酸序列(a)与SEQ ID NO :58有50%或更高的同一性(例如60%、65%、 70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5% 或更高)；和/或(b)含有SEQ ID N0:58的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。这些WitE蛋白包括SEQ ID N0:58的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID NO :58的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:58C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO :58的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。参考文献103和104报道了 WitE的免疫用途。更多来自其它病原体的抗原除了结合型肺炎球菌荚膜糖和脑膜炎球菌H因子结合蛋白，本发明的组合物可包括来自更多病原体的抗原。例如，所述组合物可包括以下更多抗原中的一种或多种-来自乙肝病毒的抗原，如表面抗原HBsAg。-来自百日咳鲍特菌(Bordetellapertussis)的抗原，如百日咳全毒素(PT)和来自百日咳鲍特菌的丝状血凝素(FHA)，还可选与百日咳杆菌粘附素和/或凝集原2和3联用。-白喉抗原，如白喉类毒素。-破伤风抗原，如破伤风类毒素。-来自B型流感嗜血杆菌(Hib)的糖抗原，通常是结合型。-灭活的脊髓灰质炎病毒抗原。
所述组合物包括白喉抗原时，优选也包括破伤风抗原和百日咳抗原。类似地，所述组合物包括破伤风抗原时，优选也包括白喉抗原和百日咳抗原。类似地，所述组合物包括百日咳抗原时，优选也包括白喉抗原和破伤风抗原。因此，优选DTP组合。杂合多肽脑膜炎球菌H因子结合蛋白可作为独立多肽存在于组合物中，或可作为“杂合”多肽的部分存在，即至少2种(例如2、3、4、5种或更多)抗原以单一多肽链形式表达，如参考文献107的脑膜炎球菌抗原所示。此杂合多肽方法也能用于任何其它脑膜炎球菌多肽和/ 或肺炎球菌多肽。杂合多肽提供了 2个主要优点首先，本身不稳定或表达较差的多肽可通过加入克服所述问题的合适杂合伴侣而得到改善；其次，由于仅需采用一次表达和纯化以生成2 种抗原性多肽而简化商业生产。杂合多肽可包括上述2种或更多脑膜炎球菌或肺炎球菌多肽序列。可使用由来自 2、3、4、5、6、7、8、9或10种抗原的氨基酸序列组成的杂合体。具体地，优选由来自2、3、4或 5种抗原的氨基酸序列组成的杂合体，如2或3种抗原。杂合多肽可以式NH2-A- {-X-L-} n-B_C00H表示，其中X是上述替代脑膜炎球菌或肺炎球菌抗原的氨基酸序列；L是可选的接头氨基酸序列；A是可选的N末端氨基酸序列；B 是可选的C末端氨基酸序列；11是2或更大的整数(例如2、3、4、5、6等)。通常η是2或3。在一些实施方式中，至少1个-X-部分是fHBP。在其它实施方式中，至少2个-X-部分是fHBP，例如不同fHBP变体。在其它实施方式中，fHBP可作为单独多肽存在且杂合多肽中的至少一个-X-部分是非fHBP的脑膜炎球菌多肽和/或肺炎球菌多肽。如果-X-部分具有其野生型形式中的前导肽序列，在杂合蛋白中可包含或缺少此前导肽。在一些实施方式中，缺失除位于杂合蛋白的N末端-X-部分的前导肽以外的前导肽，即保留X1的前导肽，但缺少χζ··χη的前导肽。这等同于缺失所有前导肽并使用X1的前导肽作为-A-部分。对于{-X-L-}的各个η情况，可以有或没有接头氨基酸序列-L-。例如，当n = 2时， 杂合体可以是 NH2-X1-L1-X2-L2-COOH, NH2-X1-X2-COOH, NH2-X1-L1-X2-COOH, NH2-X1-X2-L2-COOH 等。接头氨基酸序列-L-通常较短(例如20个或更少氨基酸，即20、19、18、17、16、15、14、 13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括促进克隆的短肽序列，聚甘氨酸接头(即包含Glyn，其中η = 2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高)，和组氨酸标签(即Hisn，其中η = 3、4、5、 6、7、8、9、10或更高)。其它合适的接头氨基酸序列对于本领域技术人员显而易见。一个有用的接头是 GSGGGG (SEQ ID NO 15)或 GSGSGGGG (SEQ ID NO 16)，从 BamHI 限制性位点形成Gly-Ser 二肽，因而有助于克隆和操作，且(Gly)4四肽是典型的聚甘氨酸接头。其它合适接头，尤其用作最终Ln的接头是Leu-Glu 二肽或SEQ ID NO :59。-A-是可选的N末端氨基酸序列。它通常较短(例如40个或更少氨基酸，即40、39、 38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、 13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括指导蛋白运输的前导肽，或者促进克隆或纯化的短肽序列(例如组氨酸标签，即见\，其中11 = 3、4、5、6、7、8、9、10或更高)。其它适当 N末端氨基酸序列对本领域技术人员显而易见。如果X1缺乏其自身N末端甲硫氨酸，-A-优选是提供N末端甲硫氨酸的寡肽(例如有1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸)如Met-Ala-Ser，或是单一 Met残基。-B-是可选的C末端氨基酸序列。它通常较短(例如40个或更少氨基酸，即39、 38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、 13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括指导蛋白运输的序列，促进克隆或纯化的短肽序列(例如包含组氨酸标签，即Hisn，其中n = 3、4、5、6、7、8、9、10或更高，如SEQ ID NO: 17)，或提高蛋白稳定性的序列。其它适当C末端氨基酸序列对本领域技术人员显而易见。参考文献107和108公开了一种特别有用的含fHBP抗原的脑膜炎球菌多肽抗原组合，因而本发明的组合物可包括结合型肺炎球菌荚膜糖，fHBP，和以下的1、2、3或4种 (1) ‘NadA，蛋白；(2) ‘936，蛋白；(3) ‘953，蛋白；和(4) ‘287，蛋白。例如，组合物可包括结合型肺炎球菌荚膜糖和(i)具有氨基酸序列SEQ ID NO 4的第一多肽；(ii)具有氨基酸序列SEQ ID NO 5的第二多肽；和(iii)具有氨基酸序列SEQ ID NO 6的第三多肽。佐剂本发明的组合物可包括免疫佐剂。因此，例如，它们可包括铝盐佐剂或水包油乳液 (如水包鲨烯乳液)。也可使用其它佐剂。合适的铝盐包括氢氧化物(例如羟基氧化物)、磷酸盐(例如羟基磷酸盐、正磷酸盐)(例如参见参考文献109的第8与9章)或其混合物。所述盐可采用任何适当形式(例如凝胶、晶体、无定形等)。给予病人的组合物中Al+++浓度优选低于5mg/ml，例如彡4mg/ ml、彡3mg/ml、彡2mg/ml、彡lmg/ml等。优选的范围在0. 3和lmg/ml之间。优选最大为 0. 85mg/ 剂量。本发明使用的一种优选铝盐是磷酸铝。此佐剂与fHBP以及PREVNAR 和 SYNFL0RIX 肺炎球菌结合疫苗相容。称为“磷酸铝”的所述佐剂一般是羟基磷酸铝，通常还包含少量硫酸盐(即羟基磷酸硫酸铝)。可通过沉淀获得该佐剂，沉淀期间的反应条件和浓度影响所述盐中磷酸根取代羟基的程度。羟基磷酸盐的P04/A1摩尔比通常为0. 3-1. 2。 羟基磷酸盐与严格AlPO4W区别在于存在羟基。例如，3164CHT1处的IR谱带(例如加热至 200°C时)指示存在羟基结构。磷酸铝佐剂的P/A1摩尔比通常为0. 3-1. 2，优选0. 8-1. 2，或0. 85-1. 0，更优选约 0. 9。P/A1摩尔比至少为0. 5可提供老化性能更好的佐剂。磷酸铝佐剂通常无定形(即对X射线无定形)。它一般是颗粒(例如透射电子显微镜所见的板状形态)。板的典型直径是lO-lOOnm，且板形成0. 5-20 μ m(例如约1_10 μ m) 大小的聚集物。对于磷酸铝佐剂，报道了 PH 7. 4时吸附力为0. 7-1. 5mg蛋白/mg Al+++。一种典型佐剂是P/A1摩尔比为0. 84-0. 92的无定形磷酸铝，可以0. 6mg Al3+/ml 包含此佐剂。给予病人的组合物中Al+++浓度优选低于5mg/ml，例如彡4mg/ml、彡3mg/ml、 (2mg/ml、彡lmg/ml等。优选的范围在0. 2到lmg/ml之间。优选0. 85mg/剂量的最大Al+++ 浓度。磷酸铝的零电荷点(PZC)与磷酸根取代羟基程度逆相关，此取代程度可能取决于通过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度。通过改变溶液中游离磷酸根离子浓度(更多磷酸根=更多酸性PZC)或加入缓冲剂如组氨酸缓冲剂(使PZC碱性更强)也可改变PZC。本发明所用磷酸铝的PZC通常为4. 0-7. 0，更优选5. 0-6. 5，例如约5. 7。
称为“氢氧化铝”的佐剂通常是羟基氧化铝，其通常至少部分是晶体。羟基氧化铝可由式AlO(OH)表示，其与其它铝化合物的区别在于红外(IR)光谱，特别是在1070cm—1处的吸附带和SOgOHOOcnT1处的较强肩峰[参考文献109的第9章]。氢氧化铝佐剂的PZC 通常为约11.4。在本发明的一个实施方式中，佐剂组分包括氢氧化铝和磷酸铝的混合物。在此情况中可能磷酸铝多于氢氧化铝，例如重量比为至少2 1，如彡5 1、彡6 1、彡7 1、 >8 1、>9 1等。然而，佐剂组分最优选不包括氢氧化铝。因此，组合物可包括羟基磷酸铝但没有羟基氧化铝。在发明的优选组合物中，fHBP吸附于磷酸铝佐剂。组合物中至少50 %的总fHBP可被吸附，例如> 50%、> 60%、> 70%、> 80%、> 90%、> 95%或基本100%。通过改变配置中的盐浓度和/或PH可控制所吸附fHBP的比例，例如通常较高的NaCl浓度能降低fHBP 吸附。为促进稳定的fHBP吸附，可使用3种有用的技术(i)吸附在pH等于或低于所述佐剂的PZC下进行；(ii)选择fHBP和佐剂以使fHBP的pi和佐剂的PZC都在5. 0-7. O范围内；和(iii)如果fHBP的等电点高于佐剂的PZC，则加入缓冲液以使该pH在PZC的1. 2pH 单位内。用于制备本发明组合物的铝盐悬浮液可以，但不一定包含缓冲剂(例如磷酸盐或组氨酸或Tris缓冲剂)。所述悬浮液优选无菌且无热原。悬浮液可包括游离水性磷酸根离子，例如存在浓度为1. 0-20mM,优选5-15mM，更优选约IOmM的磷酸根离子。所述悬浮液也可包括氯化钠。作为铝盐的替代物，已知不同的水包油乳液佐剂。这些乳液通常包括至少一种油和至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂可生物降解(可代谢)和生物相容。乳液中的油滴直径一般小于5 μ m,甚至可具有亚微米直径，用微流化床实现这些小尺寸以提供稳定乳液。优选尺寸小于220nm的液滴，因为这些液滴能进行过滤除菌。本发明可使用油，如来自动物(如鱼)或植物来源的油。植物油来源包括坚果、种籽和谷物。花生油、大豆油、椰子油和橄榄油是最常见的坚果油例子。可使用例如获自霍霍巴豆的霍霍巴油。籽油包括红花籽油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物组，玉米油最易获取，但也可使用其它谷物的油，如小麦、燕麦、黑麦、稻米、画眉草、黑小麦等。甘油和 1，2_丙二醇的6-10碳脂肪酸酯尽管不天然存在于籽油中，但可从坚果和籽油开始通过水解、分离和酯化合适物质来制备。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油可代谢，因而可用于实施本发明。本领域熟知从动物源获得纯化油所需的分离、纯化、皂化和其它方法过程。大部分鱼包含易回收的可代谢油。例如，鳕鱼油、鲨鱼肝油和鲸肝油如鲸蜡是本文可使用的一些鱼油的例子。一些支链油以5-碳异戊二烯单元生化合成且通常称为萜类化合物。鲨鱼肝油包含称为鲨烯的支链不饱和萜类化合物，2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22- 二十四碳六烯)，其在本文中特别优选。鲨烯的饱和类似物鲨烷也是优选的油。鱼油，包括鲨烯和鲨烷的鱼油，可从商业来源方便地得到，或可通过本领域已知方法获得。其它优选的油是生育酚。可使用油的混合物。组合物包括生育酚时，可使用α、β、Υ、δ、ε或ξ生育酚中的任一种，但优选 α_生育酚。生育酚可采用多种形式，例如不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等。D-α-生育酚和DL-α-生育酚都可使用。优选的α -生育酚是DL-α-生育酚，此生育酚的优选盐是琥珀酸盐。表面活性剂可通过其‘HLB’ (亲水/亲脂平衡)分类。本发明优选表面活性剂的 HLB至少为10，优选至少15且更优选至少16。可与本发明一起使用的表面活性剂包括但不限于聚氧乙烯去水山梨醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80 ；以商品名D0WFAX 出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或氧化丁烯(BO) 的共聚物，如线性Ε0/Ρ0嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1，2-乙二基)基团数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇-9(曲通X-100，或叔辛基苯氧聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽表面活性剂)，如三乙二甘醇单月桂醚(苄泽30)；和去水山梨糖醇酯(通常称为司盘)，如去水山梨糖醇三油酸(司盘 85)和去水山梨糖醇单月桂酸酯。乳液所含的优选表面活性剂是吐温80 (聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85 (去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。可使用表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85的混合物。聚氧乙烯去水山梨糖醇酯如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧聚乙氧基乙醇 (曲通X-100)的组合也适合。另一种有用的组合包括月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯去水山梨醇酯和/或辛苯聚醇。表面活性剂的优选量(重量％)是聚氧乙烯去水山梨醇酯(如吐温 80)0. 01-1%，特别是约0. ；辛基或壬基苯氧聚氧乙醇(如曲通X-100或曲通系列的其它去污剂)0. 001-0. 1%，特别是0. 005-0. 02% ；聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0. 1-20%, 优选0. 1-10%且特定是0. 1-1%或约0.5%。本发明使用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于·鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。所述乳液体积组成可以是约5%鲨烯、 约0. 5%聚山梨醇酯80和约0. 5%司盘85。按重量计，这些比例是4. 3%鲨烯、0. 5%聚山梨醇酯80和0.48%司盘85。此佐剂称为‘MF59，[110-112]，详见参考文献109的第10章和参考文献113的第12章。所述MF59乳液可包括柠檬酸盐离子，例如IOmM柠檬酸钠缓冲液。 鲨烯、生育酚和聚山梨醇酯80(吐温80)的乳液。所述乳液可包括磷酸盐缓冲盐水。它也可包括司盘85 (例如1%)和/或卵磷脂。这些乳液可具有2-10%鲨烯、2-10%生育酚和0. 3-3%吐温80，鲨烯生育酚的重量比优选为彡1，因为这提供了更稳定的乳液。 鲨烯和吐温80可以约5 2的体积比或约11 5的重量比存在。可通过以下方法制备一种这样的乳液将吐温80溶于PBS以产生2%溶液，然后混合90ml该溶液与(5g DL- α -生育酚和5ml鲨烯)混合物，随后微流化该混合物。所得乳液可具有亚微米油滴，例如平均直径为100-250nm，优选约180nm。所述乳液也可包括3-脱-0-酰化单磷酰脂质A (3d_MPL)。 此类型另一种有用乳液的每人剂量可包括0. 5-10mg鲨烯、0. 5-llmg生育酚和0. Hmg聚山梨醇酯80 [114]。·鲨烯、生育酚和曲通去污剂(例如曲通X-100)的乳液。所述乳液也可包括 3d-MPL。所述乳液可包含磷酸盐缓冲液。·含有聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯80)、曲通去污剂(例如曲通X-100)和生育酚(例如琥珀酸α-生育酚)的乳液。所述乳液可包括质量比约75 11 10的这三种成分(例如75(^8/1111聚山梨醇酯80，11(^8/1111曲通X-100和100 μ g/ml α -琥珀酸生育酚)，该浓度应包括抗原中这些成分的任何贡献。所述乳液也可包括鲨烯。所述乳液还可包括3d_MPL。所述水相可包含磷酸盐缓冲液。·鲨烯、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆401的乳液(“普流罗尼克 L121”)。所述乳液可在PH 7. 4的磷酸盐缓冲盐水中配制。此乳液是胞壁酰二肽的有用递送载体，且已在 “SAF-1”佐剂中与苏氨酰-MDP[115] (0. 05-1 % Thr-MDP，5%鲨烯，2. 5%普流罗尼克L121和 0. 2%聚山梨醇酯80) —起使用。它也能不与Thr-MDP使用，例如用“AF”佐剂[116] (5%鲨烯，1. 25%普流罗尼克L121和0. 2%聚山梨醇酯80)使用。优选微流体化。·含有鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子表面活性剂(例如聚氧乙烯 (12)十六十八醚)和疏水性非离子表面活性剂(例如去水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，如去水山梨醇单油酸酯或‘司盘80’)的乳液。所述乳液优选热可逆和/或其中至少90%的油滴(按体积计)尺寸小于200nm[117]。所述乳液也可包括以下一种或多种糖醇；冷冻保护剂(例如糖，如十二烷基麦芽糖苷和/或蔗糖)；和/或烷基多糖苷。这类乳液可冻干。·含0. 5-50%油、0. 1-10%磷脂和0. 05_5%非离子表面活性剂的乳液。如参考文献118所述，优选的磷脂成分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴尺寸。·不可代谢油(如轻矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂，吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包括添加剂，如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂偶联物(如参考文献119所述通过葡萄糖醛酸的羧基将脂族胺添加到脱酰基皂苷上而生成的 GPI-0100)、二甲基双十八烷基溴化铵和/或N，N-双十八烷基-N，N-双(2-羟乙基)丙二胺。·含有矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯_聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[120]。·含有矿物油、非离子亲水性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯_聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[120]。·皂苷(例如QuilA或QS21)和甾醇(例如胆固醇)结合成螺旋胶束形式的乳液 [121]。水包油乳液本身可用作佐剂，或作为其它免疫刺激化合物如免疫刺激寡核苷酸、 3d-MPL等的载体。药物组合物本发明涉及给予病人的药物组合物。这些通常包括药学上可接受的载体。关于药学上可接受载体的充分讨论见参考文献122。有效剂量体积可常规确定，但该组合物的典型人用剂量提及约为0. 5ml，例如用于肌肉内注射。这是PREVNAR 产品、基于RIVM OMV的疫苗和MeNZB 的剂量体积。这些剂量体积通常用于肌肉内注射，但类似剂量可用于其它递送途径，例如基于OMV的鼻内雾化疫苗可具有每次喷雾提及约100μ 1或约130μ 1，4次喷雾给药产生约0. 5ml的总剂量。本发明组合物的pH通常为6-8，更优选6. 5-7. 5 (例如约7)。组合物可包括缓冲剂，例如Tris缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、琥珀酸纳缓冲剂或组氨酸缓冲剂。所述组合物可以无菌和/或无热原。本发明的组合物可以与人体等张。
给予病人的本发明组合物为免疫原性，更优选为疫苗组合物。本发明所述的疫苗可以是预防性(即，用于防止感染)或治疗性(即，用于处理感染)，但通常是预防性。用作疫苗的免疫原性组合物包括免疫有效量的抗原以及其它所需组分。“免疫有效量”指将该量以单剂量或作为系列的一部分给予个体可有效治疗或预防。该量根据待治疗个体的健康和身体情况、年龄、待治疗个体的分类组(例如非人的灵长类动物、灵长类动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需保护程度、疫苗配方、治疗医师对医疗状况的评估和其它相关因素而变化。预期该量将落入常规试验确定的较宽范围内。本发明组合物的抗原含量通常以蛋白量/剂量的形式表示。脑膜炎球菌和肺炎球菌影响身体的不同区域，因此本发明的组合物可以多种液体形式制备。例如，所述组合物可制备成溶液或悬浮液形式的注射剂。可制备所述组合物用于肺部给予，例如通过吸入器，使用细雾。可制备所述组合物用于鼻、耳、眼部给予，例如作为喷雾或滴剂。用于肌肉内给予的注射剂是典型形式。本发明的组合物可包括抗菌剂，特别是以多剂量形式包装时。抗菌剂如硫柳汞和 2-苯氧乙醇常用于疫苗，但优选使用无汞的防腐剂或完全没有防腐剂。本发明的组合物可包括去污剂，例如吐温(聚山梨醇酯)如吐温80。去污剂通常以低水平如< 0.01%存在。本发明的组合物可包括钠盐(例如氯化钠)以产生张力。NaCl浓度通常为 10 士 2mg/ml，例如约 9mg/ml。处理方法本发明也提供了在哺乳动物中引起免疫应答的方法，包括将本发明的组合物给予哺乳动物。所述免疫应答优选提供保护抵御脑膜炎球菌和肺炎球菌(至少针对组合物中表现的脑膜炎球菌血清群和肺炎球菌血清型)且优选涉及抗体。在已接受初免的患者中该方法可产生加强应答。哺乳动物优选是人。疫苗用于预防性用途时，人优选是儿童(例如幼童或婴儿) 或青少年；疫苗用于治疗性用途时，人优选是成人。用于儿童的疫苗也可给予成人，例如用于评估安全性、剂量、免疫原性等。本发明也提供本发明组合物用作药物。所述药物优选如上所述用于弓丨起哺乳动物中的免疫应答(即，该药物是免疫原性组合物)且更优选是疫苗。本发明也提供以下成分生产用以引起哺乳动物免疫应答的药物中的应用(i)至少一种结合型肺炎球菌荚膜糖；和(ii)脑膜炎球菌H因子结合蛋白(fHBP)抗原。这些用途和方法优选用于预防和/或治疗脑膜炎奈瑟菌和/或肺炎链球菌引起的疾病，例如细菌性(或更具体地，脑膜炎球菌和/或肺炎球菌)脑膜炎或败血症。一种检查治疗性处理功效的方法，包括在给予本发明组合物后监测脑膜炎球菌和 /或肺炎球菌感染。一种检查预防性处理功效的方法，包括在给予组合物后监测针对抗原的免疫应答。可通过将本发明的组合物给予测试对象(例如12-16个月大的儿童，或动物模型[123])随后确定标准参数包括脑膜炎球菌的血清细菌抗体(SBA)和ELISA效价(GMT)， 以确定本发明组合物的免疫原性。通常在给予组合物后约4周测定这些免疫应答，并与给予组合物前测定的值作比较。优选SBA增加至少4倍或8倍。给予超过1剂量的组合物时， 可进行超过1次的给予后测定。
本发明的组合物通常直接给予病人。通过胃肠外注射(例如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或组织间隙)或任何其它适当途径可完成直接递送。本发明可用于引发全身和 /或粘膜免疫。优选肌肉内给予大腿或上臂。注射可以经针头(例如皮下针头)，但可替代使用无针注射。典型的肌肉内剂量是0.5ml。剂量处理可以是单剂量方案或多剂量方案。多剂量可用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。初次剂量方案之后可以是加强剂量方案。可常规确定初次剂量间的适当间隔 (例如4-16周之间)以及初次和加强之间的适当间隔。通常采用多剂量(例如2或3剂量)确立对肺炎球菌和脑膜炎球菌的免疫。在本发明的一些实施方式中，所述肺炎球菌和脑膜炎球菌抗原可共同或单独给予，即2种抗原可同时、单独或依序给予。然而，通常混合2种抗原以同时联合给予。概述除非另有说明，本发明的实施采用本领域内的化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药学的常规方法。这些技术在文献中已详细解释，参见例如参考文献1M-130等。术语“包括”涵盖“包含”以及“由…组成”，例如组合物“包括” X可完全由X组成或可包含额外物质，例如X+Y。涉及数值χ的术语“约”是可选的，并指例如χ士 10%。本发明涉及“表位”时，此表位可以是B细胞表位和/或T细胞表位，但通常是 B细胞表位。这种表位可凭经验鉴定(例如使用PEPSCAN[131，132]或类似方法)，或可预测(例如使用Jameson-Wolf抗原指数[133]、基于矩阵的方法[134]、ΜΑΡΙΤ0ΡΕ [135]、 TEPIT0PE[136，137]、神经网络[138]、OptiMer 和 EpiMer [139，140]、ADEPT [141]、 Tsites [142]、亲水性[143]、抗原指数[144]或参考文献145-149所述方法等)。表位是能被抗体或T细胞受体的抗原结合位点识别并与之结合的抗原部分，且它们也可称为“抗原决定簇”。本发明使用“纯化”抗原时，该抗原从其天然产生的环境分离。例如，除存在的任何其它纯化抗原，所述抗原基本无其它脑膜炎球菌成分。纯化抗原的混合物通常通过单独纯化各抗原随后将它们重组来制得，即使所述2种抗原天然存在于混合物中。2种氨基酸序列间的序列同一性百分数是指比对时，2种所比较序列中相同氨基酸的百分数。此比对和同源性或序列同一性百分数可用本领域已知的软件程序确定，例如参考文献150的7. 7. 18部分所述程序。优选的比对通过史密斯-沃特曼(Smith-Waterman) 同源性搜索方法确定，使用仿射缺口搜索，缺口开放罚分为12且缺口延伸罚分为2，BL0SUM 矩阵计62。参考文献151描述了史密斯-沃特曼同源性搜索方法。单词“基本”不排除“完全”，例如组合物“基本无” Y可以是完全没有Y。必要时， 本发明的定义可省略单词“基本”。附图简要说明图1显示抗6B芬兰(Finland)肺炎球菌的调理吞噬活性结果。该图显示抗血清稀释的OPA杀死％。下文解释小鼠组1到7的符号，除了实心菱形( )显示来自阳性对照抗6B血清的数据、实心三角形(▲)显示采用免疫前血清的数据。一些线由于沿X轴延伸(即0%活性)而不可见。实施本发明的方式
在寻找提供保护抵御B群脑膜炎球菌和肺炎球菌的疫苗中，将脑膜炎球菌fHBP抗原(菌株MC58 ；50 μ g/ml)与7价肺炎球菌荚膜糖结合物混合物(4 μ g/ml的4、9V、14、18C、 19F和23F血清型；8 μ g/ml的6B)联合。将组合物以两剂量方案(第0和21天)腹膜内给予7组⑶1小鼠(每组8只小鼠)。使用磷酸铝佐剂。所述组合物都不包含脑膜炎球菌外膜囊泡。将5种不同组合物(A到E)给予小鼠。
权利要求
1.一种免疫原性组合物，所述组合物包含(i)结合型肺炎球菌荚膜糖和(ii)脑膜炎球菌H因子结合蛋白(fHBP)抗原，但不包括脑膜炎球菌外膜囊泡。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述荚膜糖来自2种或更多不同肺炎球菌血清型。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述荚膜糖选自以下肺炎球菌血清型1、 2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F。
4.如权利要求2或3所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含来自4、6B、9V、14、 18CU9F和23F各血清型的荚膜糖。
5.如权利要求2或3所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含来自1、3、4、5、6A、 6B、7F、9V、14、18C、19、19F和23F各血清型的荚膜糖。
6.如权利要求2到5中任一项所述的组合物，其特征在于，所述各血清型的糖单独结合于选自CRM197、破伤风类毒素、白喉类毒素和流感嗜血杆菌蛋白D的载体蛋白，其中所述用于不同血清型的载体蛋白相同或不同。
7.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括的单一fHBP 多肽含有(a)与SEQ ID NO 1有至少85%序列同一性的氨基酸序列和/或所含氨基酸序列由SEQ ID NO 1的至少7个连续氨基酸的片段组成；或(b)与SEQ ID NO 2有至少85% 序列同一性的氨基酸序列和/或所含氨基酸序列由SEQ ID NO :2的至少7个连续氨基酸的片段组成；或(c)与SEQ ID NO :3有至少85%序列同一性的氨基酸序列和/或所含氨基酸序列由SEQ ID NO 3的至少7个连续氨基酸片段组成。
8.如权利要求1到6中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括2种不同 fHBP多肽(a)第一多肽，含有的氨基酸序列与SEQ ID NO 1有至少85%序列同一性和/或所含氨基酸序列由SEQ ID NO :1的至少7个连续氨基酸的片段组成；(b)第二多肽，含有的氨基酸序列与SEQ ID NO :3有至少85%序列同一性和/或所含氨基酸序列由SEQ ID NO: 3的至少7个连续氨基酸的片段组成。
9.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有所含氨基酸序列与SEQ ID NO :3有至少93%序列同一性和/或所含氨基酸序列由SEQ ID NO :3的至少40个连续氨基酸的片段组成的多肽。
10.如权利要求1到6中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括2种不同 fHBP多肽(a)第一多肽，含有的氨基酸序列与SEQ ID NO 1有至少85%序列同一性和/或所含氨基酸序列由SEQ ID NO 1的至少7个连续氨基酸的片段组成；(b)第二多肽，含有的氨基酸序列与SEQ ID NO :2有至少85%序列同一性和/或所含氨基酸序列由SEQ ID NO: 2的至少7个连续氨基酸的片段组成。
11.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括磷酸铝佐剂。
12.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括(i)磷酸铝佐剂； (ii)来自各4、6B、9V、14、18C、19F和23F型肺炎球菌的结合型肺炎球菌荚膜糖，所述糖各与CRM197载体蛋白结合；和(iii)至少2种不同的脑膜炎球菌H因子结合蛋白抗原，各自至少部分吸附于磷酸铝佐剂。
13.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述结合型肺炎球菌糖中至少一种吸附于磷酸铝佐剂。
14.如权利要求12或13所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括氯化钠和/或缓冲剂。
15.如权利要求1到6中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括3种不同 fHBP多肽(a)第一多肽，含有的氨基酸序列与SEQ ID NO :1有至少85%序列同一性和/或所含氨基酸序列由SEQ ID NO :1的至少7个连续氨基酸的片段组成；(b)第二多肽，含有的氨基酸序列与SEQ ID NO 2有至少85%序列同一性和/或所含氨基酸序列由SEQ ID NO 2的至少7个连续氨基酸的片段组成；和(c)第三多肽，含有的氨基酸序列与SEQ ID NO 3 有至少85%序列同一性和/或所含氨基酸序列由SEQ ID NO 3的至少7个连续氨基酸的片段组成。
16.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述fHBP多肽在N末端半胱氨酸处脂化。
17.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物中的fHBP多肽总量小于600 μ g。
18.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物中的fHBP多肽总量小于200 μ g。
19.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物中的fHBP多肽总量小于60 μ g。
20.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括来自1、 2、3或4种脑膜炎球菌血清群A、C、W135和Y的一种或多种荚膜糖结合物(例如包括C群脑膜炎球菌荚膜糖的结合物)。
21.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括羟基磷酸铝佐剂。
22.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物没有氢氧化铝。
23.一种引起哺乳动物中免疫应答的方法，所述方法包括将前述权利要求中任一项所述的组合物给予哺乳动物。
24.如权利要求1到22中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物用作药物。
25.一种制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括步骤(i)将至少一种结合型肺炎球菌荚膜糖与磷酸铝佐剂混合以形成结合物/佐剂混合物；和(ii)将所述结合物/佐剂混合物与至少一种脑膜炎球菌H因子结合蛋白混合。
26.一种制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括步骤(i)将至少一种结合型肺炎球菌荚膜糖与至少一种脑膜炎球菌H因子结合蛋白混合以形成抗原混合物；和(ii)将所述抗原混合物与磷酸铝佐剂混合。
27.一种制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括步骤(i)将至少一种脑膜炎球菌 H因子结合蛋白与磷酸铝佐剂混合以形成蛋白/佐剂混合物；和(ii)将所述蛋白/佐剂混合物与至少一种结合型肺炎球菌荚膜糖混合。
28.一种制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括步骤(i)将至少一种脑膜炎球菌 H因子结合蛋白与磷酸铝佐剂混合以形成蛋白/佐剂混合物；和(ii)将至少一种结合型肺炎球菌荚膜糖与磷酸招佐剂混合以形成结合物/佐剂混合物；和(iii)将所述蛋白/佐剂混合物与结合物/佐剂混合物混合。
29.如权利要求25到28中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法不包括将氢氧化铝佐剂与以下任意一种混合的步骤(i)脑膜炎球菌H因子结合蛋白，(ii)磷酸铝佐剂， (iii)结合型肺炎球菌荚膜糖，(iv)结合物/佐剂混合物，(ν)抗原混合物，或(vi)蛋白/ 佐剂混合物。
全文摘要
一种免疫原性组合物，其包含(i)结合型肺炎球菌荚膜糖；和(ii)脑膜炎球菌H因子结合蛋白(fHBP)抗原，但不包括脑膜炎球菌外膜囊泡，所述组合物用于免疫对象抵御细菌性脑膜炎。
文档编号A61K39/02GK102438649SQ201080023586
公开日2012年5月2日 申请日期2010年3月24日 优先权日2009年3月24日
发明者M·吉利亚尼, P·鲁格洛 申请人:诺华有限公司