用作药物的能够恢复肌肉强度的修饰的聚集蛋白片段的制作方法

专利名称：用作药物的能够恢复肌肉强度的修饰的聚集蛋白片段的制作方法
用作药物的能够恢复肌肉强度的修饰的聚集蛋白片段
背景技术：
本发明涉及用作药物的修饰的聚集蛋白片段。另外，本发明涉及修饰的聚集蛋白片段用于制备药物的用途，所述药物用于治疗不同的、特别是肌肉或运动神经元疾病，也用于治疗其它的神经胰蛋白酶相关的疾病。此外，本发明涉及修饰的聚集蛋白片段用于治疗不同的疾病的用途。最后，本发明涉及包含修饰的聚集蛋白片段的药物组合物并涉及特别修饰的聚集蛋白片段。60或60岁以上的老年人面临着不可抗拒的瘦体重(lean body mass)下降的问题。因为这是常见的，所以长期以来没有值得去研究其根本机理。目前，瘦体重的年龄相关下降被称作少肌症(sarcopenia)或虚弱(frailty)。就在老年人中的功能性和独立性而言，少肌症和虚弱二者都是高度相关的实体。 少肌症被认为是退行性的与年龄相关的肌肉质量和强度的下降，在其晚期导致虚弱和失能。少肌症患者的肌肉质量下降速率显著高于不受该疾病影响的人。少肌症不是静态病况， 而是随着年龄而加剧。由于其进展缓慢，人们一般不知晓少肌症，直至其已经达到了晚期。少肌症的肌肉质量的特征在于肌肉纤维数目的持续收缩。纤维大小更加异质， 并观察到纤维类型分组。纤维类型分组被认为是由重复性的去神经支配/神经再支配 (denervation/reinnervation)引起的。另外，老龄化肌肉的特征在于脂肪和结缔组织的浸润。所有这些引起肌肉强度和移动速度的下降。在很多肌肉中观察到的与年龄相关的变化被认为在某种程度上是由他们的肌肉纤维的神经支配中的与年龄相关的变化引起的。在衰老过程中，观察到功能运动单元(MU)的估计数目的显著性和渐进性下降。类似地，在患有运动神经元疾病例如肌萎缩侧索硬化(ALQ或较低严重形式的脊髓性肌萎缩(SMA)的个体中观察到与MU的大量丧失相关的明显的肌肉强度下降。肌肉纤维的去神经支配/神经再支配循环需要突触可塑性。突触可塑性的过程尚未被详细地理解。然而，在过去数年中，鉴定了神经肌肉连接(NMJ)的形成和维持中的几个关键参预者(Song and Balice-Gordon, 2008) 0已经良好表征的蛋白，聚集蛋白(Agrin) (Bezakova and Ruegg，2003)，通过辅助发育中的NMJ的突触后部件的形成和维持而在突触形成过程中发挥关键作用。聚集蛋白是大的类肝素蛋白聚糖，具有400_600kDa的分子量(数据库登记号 NP_940978)。蛋白核心由大约2000个氨基酸组成，其质量是大约225kDa。其是多结构域蛋白，由9个K Gomitz型)结构域、2个LE (层粘连蛋白-EGF-样)结构域、1个SEA (精子蛋白，肠激酶和聚集蛋白)结构域、4个EG(表皮生长因子样)结构域和3个LG(层粘连蛋白球形)结构域组成(图1)。聚集蛋白是非常重要的蛋白，聚集蛋白缺陷型小鼠由于呼吸衰竭而在出生时死亡。这是由下列事实造成的聚集蛋白是肌肉纤维的正确神经支配所必需的，这些小鼠不能建立正确的NMJ。聚集蛋白以数种剪接变体的形式存在，可以以包含N-末端NtA (N-末端聚集蛋白) 结构域的分泌蛋白的形式表达，这是最丰富的聚集蛋白的形式，是运动神经元中表达的主要形式。聚集蛋白在神经元的胞体中产生，沿轴突向下转运，并从运动神经的轴突末端释放进入NMJ的突触间隙。在那里其作为LRP4的激动剂发挥作用，也可以成为基底层的成分。 在CNS中，多数聚集蛋白通过在N末端的替代性剪接而表达为缺少N-末端NtA结构域的II 型跨膜蛋白(Bezakova and Ruegg，2003)。聚集蛋白中的富含丝氨酸/苏氨酸(S/T)的区段负责高度糖基化，包括数个糖基化和葡糖胺聚糖附着位点，产生大质量的蛋白聚糖。聚集蛋白的C-末端的、75kDa的部分 (从第一 EG结构域开始)是肌肉细胞上的乙酰胆碱受体(AChR)簇集活性中的完整活性所需的，虽然最C-末端的20kDa的片段足以诱导AChR聚集(Bezakova and Ruegg，2003)。聚集蛋白的相互作用伴侣(包括α-肌营养不良蛋白聚糖、肝素、一些整合素和LRP4)的几个结合位点定位于C-末端区域。大的硫酸类肝素侧链是肝素结合蛋白、例如一些生长因子的结合位点。在人聚集蛋白的C-末端部分有2个替代性剪接位点y和ζ。在y位点处可以有 0，4，17或2K4+17)个氨基酸的插入物，在ζ位点处可以有0，8，11或19(8+11)个氨基酸的插入物。y位点中的4个插入的氨基酸的功能是创建肝素结合位点。运动神经元主要表达y4聚集蛋白。就NMJ的成熟而言，聚集蛋白的最重要的剪接位点是ζ位点，其赋予聚集蛋白作为有活性的乙酰胆碱受体簇集剂的能力。众所周知，在存在剪接位点y中的4个氨基酸插入物的情况下，在ζ位点包含8个氨基酸的插入物的全长聚集蛋白(HzS)产生在培养的肌管簇集测验中具有35pM的半数最大AChR簇集活性的聚集蛋白变体。11个氨基酸的插入引起产生5nM的半数最大AChR簇集活性，而19个氨基酸的插入引起产生IlOpM的半数最大AChR簇集活性。在该位点不具有插入物的聚集蛋白在体外培养的肌管上的乙酰胆碱受体聚集中是无活性的(Bezakova and Ruegg，2003)。因此，簇集测验中最有活性的聚集蛋白形式是y4z8变体，其由运动神经元表达。发现包含LG2、EG4和LG3结构域的聚集蛋白的 40kDa的C-末端片段(HzS)在 AChR簇集中有活性，在AChR簇集活性中的EC50为130pM，而较短的片段仅具有较低活性。 具有z8插入物的C-末端LG3结构域显示出仅13nM的半数最大AChR簇集活性，是40kDa 片段的 1/100 (Bezakova and Ruegg，2003)。在NMJ的发育和成熟过程中，聚集蛋白是乙酰胆碱受体的簇集中涉及的分子的重要参预者。虽然NMJ被神经递质乙酰胆碱去稳定化，但是，由运动神经元分泌的聚集蛋白通过MuSK的磷酸化使AChR的聚簇稳定化并增加，MuSK是酪氨酸激酶的膜结合受体。聚集蛋白与MuSK之间的相互作用据推测是通过LRP4介导的，LRP4是低密度脂蛋白受体(LDLR) 相关的蛋白。发现相对于聚集蛋白(y4z0)而言，聚集蛋白(HzS)与LRP4的亲和性高10 倍，这使得在体外培养的肌管测验中观察到不同的聚集蛋白剪接变体的差别性AChR簇集活性。在与聚集蛋白结合之后，LRP4引起MuSK的自我磷酸化，然后其激活乙酰胆碱受体的表达和簇集的信号级联。神经胰蛋白酶被发现于脊髓提取物中，是由运动神经元产生的。神经胰蛋白酶是分泌的、胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，其是由CNS神经元以及运动神经元产生的(St印han等人，2008)。神经胰蛋白酶包含N-末端的非催化部分，包含富含脯氨酸的碱性(PB)区段、 kringle(KR)结构域、4个清道夫受体富含半胱氨酸(SRCR)的结构域和C末端蛋白酶结构域(Gsctwend等人，1997)。在人类中，外显子7中的4bp的删除导致严重的非综合征的精神发育迟滞。该突变导致产生缺少蛋白酶结构域的神经胰蛋白酶的截短形式，因此使该酶失去蛋白水解功能。目前，聚集蛋白是神经胰蛋白酶的唯一已知的靶标。神经胰蛋白酶在2个被称作 α位点和β位点的不同位点切割聚集蛋白(图1)。α位点相对于SEA结构域位于N-末端，β位点位于聚集蛋白的LG3结构域的前面。在α位点处的切割产生 IOOkDa C-末端聚集蛋白片段，其在4-12%biS-triS SDS凝胶中跑胶为 130kDa。在β位点处的切割释放C-末端的LG3结构域，其在凝胶中跑胶为 22kDa (Molinari等人，2002 ；Reif等人，
2007)。所有的C-末端片段在小鼠的脑提取物和脊髓提取物中都可检测到(St印han等人，
2008)。在神经胰蛋白酶敲除的小鼠中，检测不到任何所述片段。因此，神经胰蛋白酶似乎是在所述两个切割位点以显著的数量切割聚集蛋白的唯一蛋白酶。神经胰蛋白酶对聚集蛋白的切割促成神经肌肉的可塑性和重塑。发现过表达神经胰蛋白酶(NT)的小鼠、即所谓的少肌症小鼠(muslik，M491S) (Stephan等人，2008)显示出少肌症的早期发作。从少肌症小鼠的全身分析得出的详细发现证明存在与人类数据的良好关联。US 12/007，拟8给出了关于动物模型的描述。简而言之，少肌症小鼠(muslik M491S)显示出(i)小鼠膈的神经纤维向着各个终板生长；(ii)膈肌肉上的片断化的终板，最终导致各个终板的消失，即突触前和突触后位点的丧失；(iii)在过表达神经胰蛋白酶的动物中，小鼠比目鱼肌中的纤维数目的减少和纤维大小的勻质性的降低。少肌症小鼠具有减少的纤维数目(约30%)和增加的纤维大小的不勻质性。在WO 97/21811中提出，在治疗影响肌肉的疾病中使用聚集蛋白或聚集蛋白片段。然而，到目前为止，此类尝试未显示出成功。本发明的目标是提供用于涉及功能性NMJ和/或运动单元(MU)的减少的不同的肌肉病症的治疗法。

发明内容
本发明一般地提供了新的工程化的人或小鼠聚集蛋白变体，其对于神经胰蛋白酶的蛋白水解活性有抗性并作为生物治疗试剂用于治疗患有少肌症或其它与神经胰蛋白酶相关的疾病的人。对于神经胰蛋白酶活性的抗性可以通过例如修饰聚集蛋白片段的切割位点、尤其是β-切割位点或通过从片段中删除切割位点而获得。申请人:经研究证明，聚集蛋白片段的体内活性主要依赖于结构域LG2与LG3 二者的同时存在。1097/^21811显示了仅有LG3时的AChR簇集的体外活性。但是，不能显示LG3 的体内活性。似乎仅有LRP4的激活不足以实现完全的体内活性。所以，本发明的一个重要特征是结构域LG2和LG3不会由于神经胰蛋白酶的活性而在体内分离。为了避免此种分离，对根据本发明所使用的聚集蛋白片段进行了修饰，从而使得其不再包括任何在天然产生的聚集蛋白中的结构域LG2与LG3之间存在的神经胰蛋白酶的β-切割位点。本申请中所使用的术语LG2和LG3应该包括如上所提及的这些结构域的所有可能的不同的剪接变体。例如，SEQ ID NO :1显示了人结构域LG2的序列，其在y-位点具有4个氨基酸的插入物(SEQ ID NO 5) ；SEQ ID NO :2显示了结构域LG3的序列，其在ζ-位点具有8个氨基酸的插入物(SEQ ID NO 8)。在如SEQ ID NO 1所示的结构域LG2中，y-位点位于脯氨酸115与缬氨酸120之间。应该理解缬氨酸的位置可以根据y_剪接位点处的插入物的长度而变化。在如SEQ ID NO 2所示的结构域LG3中，ζ-位点位于丝氨酸19与谷氨酸观之间。同样，谷氨酸的位置显然可以根据ζ-剪接位点处的插入物的长度而变化。 以下给出了所提及的剪接位点处的插入物序列的另外的实例。因为可能存在另外的不影响生物活性的序列变体，所以本发明应该不限于结构域 LG2和LG3的不同剪接变体的所指明的序列，而是应该还包括具有至少90 %、优选95 %同一性的其变体。本发明提供了同时具有体内活性并且在体内不被神经胰蛋白酶切割的聚集蛋白片段。如本申请所使用的体内活性应该包括以下效应从防止少肌症小鼠(muslik M491S)的整体体重下降和肌肉强度下降到整体体重和肌肉强度的恢复。如本申请使用的术语聚集蛋白片段包括分泌或跨膜形式的聚集蛋白，其中，至少神经胰蛋白酶的识别位点β处以及也有可能位点α处的碱性氨基酸精氨酸和/或赖氨酸突变为任何其它氨基酸，从而产生至少部分神经胰蛋白酶抗性形式的聚集蛋白。其包括包含聚集蛋白的至少LG3和LG2结构域的片段，还包括另外包含至少一个在聚集蛋白中天然产生的其它结构域例如LGl和EG1-4结构域的片段。备选地，可以以阻止被神经胰蛋白酶或神经胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶蛋白水解切割的方式来化学地修饰聚集蛋白片段。另外，落在本发明范围内的聚集蛋白片段被指定为包含任何天然或非天然插入至剪接位点y和ζ的氨基酸。在一个实施方式中，本发明涉及包含至少神经胰蛋白酶β -切割位点的C-末端聚集蛋白片段，其中该切割位点以下列方式被修饰使得神经胰蛋白酶或神经胰蛋白酶样蛋白酶不能切割它。被称作神经胰蛋白酶抗性的C44Hz8K/A的特别优选的修饰的聚集蛋白片段包括如图2b所示的根据SEQ ID NO :3的氨基酸序列。简写K/A代表β -切割位点处的K (赖氨酸)突变为A (丙氨酸)。被称作C44 y0z8K/A (人)、C44 y0z8K/A (小鼠)、C44 HzOK/A(人)和C44 Hz8K/A(小鼠)的另外的优选的修饰的聚集蛋白片段包括如图7_10 所示的根据SEQ ID NO :11-14的氨基酸序列。此类聚集蛋白片段可以通过常规的重组工程获得，如在实施例中就聚集蛋白片段 C44 Hz8K/A所描述。在实验中，申请人使用了，通过使用在N-末端导入了 HisS而纯化的片段。在文本中被称作C44K/A的片段具有根据SEQ ID NO :4的序列。神经胰蛋白酶抗性的C44 y4z8K/A与C44K/A之间的唯一区别是后者蛋白另外包括在测试该片段之前未被除掉的HisS-标签。如实施例所示，根据本发明的修饰的聚集蛋白片段能够在患有少肌症的小鼠中诱导肌肉发育。所以，本发明的一个重要的方面是要求保护的聚集蛋白片段作为药物的用途。本发明的另一个方面是修饰的聚集蛋白片段用于治疗下列疾病的用途，或用于制备用于治疗下列疾病的药物的用途神经肌肉疾病或神经、肌肉和神经肌肉连接 (neuromuscular junction)的疾病，包括但不限于少肌症、肌肉虚弱、虚弱、肌萎缩和肌营养不良症、肌无力、肌强直、脊髓性肌萎缩、肌萎缩侧索硬化和原发性侧索硬化。除了上述疾病之外，修饰的聚集蛋白片段可用于一般性治疗所有的其中神经胰蛋白酶水平升高的疾病，其中神经胰蛋白酶水平的升高是由于例如过表达。另一方面是治疗具有质量和强度下降的肌肉的废用性萎缩(肌萎缩)，其可能在延长的不能移动(prolonged immobility)之后发生。延长的不能移动的实例有长期卧床休息，身体的一部分(例如四肢)处于石膏中，或患有肺病的患者的机械通气。也有很多疾病和病况引起肌肉质量的萎缩。例如，诸如癌症和AIDS的疾病诱导被称作“恶病质 (cachexia) ”的身体消耗综合征，这对于所见到的严重肌萎缩是值得注意的。这种类型的萎缩可以通过锻炼得以逆转，除非病况是严重性的。已知废用性萎缩在神经肌肉连接处引起重塑。所观察到的神经肌肉变化和可塑性不仅对于衰老(少肌症的)NMJ是特征性的，而且对于废用性萎缩是特征性的。本发明提供了包含处于药学上可接受的载体中的根据本发明的修饰的聚集蛋白片段的药物组合物，其用于治疗少肌症和肌肉疾病。此类治疗可以与治疗方法例如主动运动训练或营养优化相结合。一种优选的施用模式是皮下注射。因此，优选地，药物组合物包含允许此类注射的载体。然而，也可以通过肌肉内或静脉内或鞘内或口服或经真皮或经上皮或肺内或鼻内施用所述片段。可以使用以下制剂或装置微囊化、微注射脂质体、聚集蛋白片段的聚乙二醇化或聚乙二醇化衍生物，或纳米颗粒。此类药物组合物也包括在本发明内。


图1显示了聚集蛋白的结构域结构的示意图。图加是神经胰蛋白酶抗性的agrinC44的示意图。图2b是神经胰蛋白酶抗性的聚集蛋白C44 y4z8的氨基酸序列(SEQ ID NO :3)。图3是SDS-PAGE凝胶的代表图示，显示了通过IMAC纯化C44K/A (SEQ ID NO 4)。图4是SDS-PAGE凝胶的代表图示，显示了 C44K/A和人agrinC44y4z8被人神经胰蛋白酶的有限的蛋白水解消化。图5的图显示了以C44K/A或介质处理的小鼠的体重进展。图6a、b显示了以C44K/A或介质处理的野生型同窝出生的小鼠和少肌症小鼠在实验第13天时的前肢和后肢握力。图7是神经胰蛋白酶抗性的聚集蛋白C44 y0z8K/A(h)的氨基酸序列(SEQ ID NO 11)。图8是神经胰蛋白酶抗性的聚集蛋白C44 y0z8K/A(m)的氨基酸序列(SEQ ID NO 12)。图9是神经胰蛋白酶抗性的聚集蛋白C44 y4z0的氨基酸序列(SEQ ID NO 13)。图10是神经胰蛋白酶抗性的聚集蛋白C44Hz8K/A(m)的氨基酸序列(SEQ ID NO 14)。图11是SDS-PAGE凝胶的代表图示，显示了 C44K/A片段的有限的蛋白水解消化。图12显示了以介质(介质)或人C44K/A(0. 8)或小鼠C44K/A(0. 8)处理的少肌症小鼠G91S)和以介质处理的野生型同窝出生的小鼠(野生型介质)的总体重进展。
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图13a、b显示了以介质(介质)或人C44K/A(0. 8)或小鼠C44K/A(0. 8)处理的少肌症小鼠和以介质处理的野生型同窝出生的小鼠(野生型介质)的前肢和后肢握力。图1显示了聚集蛋白的示意图。聚集蛋白具有大约225kDa的核心蛋白质量。其是多结构域蛋白，由9个K Gomitz型)结构域、2个LE (层粘连蛋白-EGF-样)结构域、1 个SEA (精子蛋白，肠激酶和聚集蛋白)结构域、4个EG (表皮生长因子样)结构域和3个 LG(层粘连蛋白球形)结构域组成。在SEA结构域的两侧存在富含丝氨酸/苏氨酸(S/T)的区域。聚集蛋白以几种同种型存在。分泌的同种型包含被切掉的信号序列(SS)，后跟N-末端聚集蛋白结构域(NtA)。II型跨膜结合形式包含跨膜(TM)区，后面直接跟着第一 kimitz 型结构域。起始于第一 EG结构域的聚集蛋白的C-末端的75kDa部分是肌细胞上的乙酰胆碱受体(AChR)簇集活性的完整活性必需的，虽然多数C-末端20kDa片段足以以低效力诱导AChR聚集。聚集蛋白的相互作用伴侣(包括α-肌营养不良蛋白聚糖、肝素、一些整合素和LRP4)的几个结合位点定位于C-末端区域。大的硫酸类肝素侧链(巨头噬菌体链) 是肝素结合蛋白、例如一些生长因子的结合位点。巨头噬菌体表示糖基化位点。x、y、z分配聚集蛋白的C-末端区域中的替代性剪接位点。在χ-位点(在鸡和青蛙中缺失)，可以插入0、3或12个氨基酸，在y位点可以插入O或4个氨基酸，在ζ位点可以插入0、8、11或 19(8+11)个氨基酸。“α-和β-切割”表示两个保守性的神经胰蛋白酶切割位点。以上指明了在神经胰蛋白酶切割之后蛋白水解片段的大概的蛋白核心质量。图1中使用的缩写具有以下含义SS 信号序列；NtA :N-末端聚集蛋白结构域； TM 跨膜区段；K :kunitz型结构域；LE 层粘连蛋白EGF样结构域；S/T 富含丝氨酸/苏氨酸的区段；SEA 精子蛋白、肠激酶和聚集蛋白结构域；EG 表皮生长因子样结构域；LG 层粘连蛋白球形结构域。图加显示了根据本发明所使用的修饰的聚集蛋白片段的示意图。该片段包含聚集蛋白的C-末端结构域LG2、EG4和LG3。神经胰蛋白酶的β-切割位点被删除。图2b显示了聚集蛋白的神经胰蛋白酶抗性的C44Hz8K/A片段的氨基酸序列(SEQ ID NO :3)。该片段包含聚集蛋白的C-末端结构域LG2、EG4和LG3。通过使赖氨酸突变为丙氨酸而删除了神经胰蛋白酶的β-切割位点。图2中使用的缩写具有以下含义LG 层粘连蛋白球形结构域；EG 上皮生长因子样结构域；y和ζ表示聚集蛋白的C-末端部分的替代性剪接位点。删除的β-切割在神经胰蛋白酶的β-切割位点处的突变使得产生神经胰蛋白酶抗性的聚集蛋白片段。图3是Sypro ruby染色的SDS-PAGE凝胶，其显示了固定的金属亲和色谱中的 C44K/A的纯化过程。以包含C44K/A基因的pEAK8载体转染的HEK293细胞的培养物上清液被载入以Ni2+标记的IOmlIMAC柱。以合适的缓冲液洗涤该柱后，以含有500mM咪唑的缓冲液洗脱结合的蛋白(5-9)。道1 :Biorad Prescission plus蛋白标准物；道2 浓缩的培养物上清液；道3 流过的级份；道4 洗涤级份；道5-9 洗脱级份。图 4 =Sypro ruby 染色的 SDS-PAGE 凝胶，显示了 C44K/A 和人 agrinC44 y4z8 被人神经胰蛋白酶的蛋白水解消化。C44K/A或人agrinC44 y4z8与人神经胰蛋白酶在37°C温育3. 5小时(1+3)，然后进行SDS-PAGE。作为对照，聚集蛋白片段与缓冲液在相同的条件下温育0+4)。切割位点处的K至A的突变有效消除了聚集蛋白片段的切割。道1 :C44K/ A+人神经胰蛋白酶；道2 :C44K/A，不加人神经胰蛋白酶；道3 人agrinC44 Hz8+人神经胰蛋白酶；道4 人agrinC44 Hz8，不加人神经胰蛋白酶。图5显示了以介质或C44K/A处理的少肌症小鼠091S)和以介质处理的野生型同窝出生的小鼠(野生型介质)的总体重的进展。在整个实验过程中每日测定小鼠的重量， 直至第22天。小鼠重量表达为相对于以介质处理的野生型同窝出生小鼠的百分率。处理在第1天开始，在第13天结束。在第13天测定握力。图6a和b显示了以介质(介质)或C44K/A(C44K/A)处理的少肌症小鼠的前肢和后肢握力。在第13天测定握力。不同处理组的握力表示为相对于以介质处理的野生型同窝出生的小鼠的百分率。以误差条标示了标准偏差(对于每个组，N = 5)。图7显示了神经胰蛋白酶抗性的人聚集蛋白C44 y0z8K/A(h)的氨基酸序列(SEQ ID NO 11)。图8显示了神经胰蛋白酶抗性的小鼠聚集蛋白C44 y0z8K/A(m)的氨基酸序列 (SEQ ID NO 12)。图9显示了神经胰蛋白酶抗性的人聚集蛋白C44 y4zOK/A的氨基酸序列(SEQ ID NO 13)。图10显示了神经胰蛋白酶抗性的小鼠聚集蛋白C44 y4z8K/A(m)的氨基酸序列 (SEQ ID NO 14)。图7-10中显示的所有片段都包含聚集蛋白的C-末端结构域LG2、EG4和LG3。通过赖氨酸至丙氨酸的突变删除了神经胰蛋白酶的β-切割位点。图11是Sypro ruby染色的SDS-PAGE凝胶，其显示了神经胰蛋白酶测验中的其它的C44片段的蛋白水解消化。图7-10中所示的不同的C44片段和人聚集蛋白C44 y4z8K/ A(图2b)在测验中与人神经胰蛋白酶一起温育(hNT+)或不与之温育(hNT-)，在37°C持续3. 5小时，然后进行SDS-PAGE。作为对照，在相同的条件下温育precission标志物和在β-切割位点不含突变的人聚集蛋白C44y0z0。β-切割位点中K至A的突变再次明显地有效消除了突变的聚集蛋白片段被神经胰蛋白酶的切割。道1 =Precission标志物； 道2 不含突变的C44 yOzO(hNT-)；道3 具有突变的C44 yOzO (hNT+)；道4 人agrinC44 y4zOK/A (hNT-)；道 5 人 agrinC44 y4zOK/A (hNT+)；道 6 人 agrinC44 y0z8K/A (hNT-)；道 7:人 agrinC44 y0z8K/A (hNT+)；道 8 小鼠 agrinC44 y0z8K/A (hNT-)；道 9 小鼠 agrinC44 y0z8K/A (hNT+)；道 10 人 agrinC44 y4z8 (hNT-)；道 11 人 agrinC44 y4z8 (hNT+) -M 12 小鼠 agrinC44 y4z8K/A (hNT-)；道 13 小鼠 agrinC44 y4z8K/A (hNT+) 图12显示了以介质(介质)或人C44 y0z8K/A或小鼠C44 y0z8K/A处理的少肌症小鼠G91S)和以介质处理的野生型同窝出生的小鼠(野生型介质)的总体重的进展。在整个实验过程中每日测定小鼠的重量，直至第22天。小鼠重量表达为相对于以介质处理的野生型同窝出生小鼠的百分率。处理在第1天开始，在第13天结束。图13a和b显示了以介质(介质)或人C44 y0z8K/A或小鼠C44y0z8K/A处理的少肌症小鼠和以介质处理的野生型同窝出生的小鼠(野生型介质)的的前肢和后肢握力。 在第13天测定握力。不同处理组的握力表示为相对于以介质处理的野生型同窝出生的小鼠的百分率。以误差条标示了标准偏差(对于每个组，N = 5)。详细描述本申请人首次揭示了除了已知的缺陷以外，少肌症小鼠相对于健康的野生型小鼠
9还具有瘦体重的下降(图5)和降低的握力(图6)。从该事实开始，本申请人能够证明在例如图2中所示的并包含如图2b所示的序列的神经胰蛋白酶抗性的agrinC44K/A能够增加少肌症小鼠即过表达神经胰蛋白酶的小鼠的体重和握力，如图5 ；图6a、b所示。在皮下施用C44K/A片段之后达到了恢复性效应。该效应不是局部地限于注射位点，而是对于整个体重和肌肉强度具有有益效应。经治疗的少肌症小鼠更加强壮并且前肢和后肢均具有增强的握力。C44K/A的施用也促进异位AChR聚簇处的肌肉纤维的神经再支配，并导致新形成的NMJ的稳定化和成熟。因此，C44K/A的施用在需要肌肉纤维或肌肉的神经再支配的康复过程中也是有益的。与在本文中要求保护的神经胰蛋白酶抗性的人聚集蛋白不同，具有针对神经胰蛋白酶的完整切割位点的聚集蛋白片段(如在W097/21811中所描述)将没有益处，因为它们迅速被神经胰蛋白酶降解并将丧失它们的AChR簇集活性。聚集蛋白在两个位点被神经胰蛋白酶切割(图1)。α-切割位点位于精氨酸 1102(R1102)与丙氨酸1103(A1103)之间。β -切割位点位于赖氨酸1859 (K1859)与丝氨酸1860(S1860 ；编号对应于人聚集蛋白ΝΡ_940978)之间。神经胰蛋白酶在β-位点切割聚集蛋白会产生大约20kDa的片段(agrinC22)，该片段为从S1860至C-末端。根据本发明所使用的神经胰蛋白酶抗性的人聚集蛋白是C-末端聚集蛋白片段， 其由聚集蛋白的LG2、EG4和LG3结构域组成，并具有神经胰蛋白酶的失活的β _切割位点。 其Pl赖氨酸残基(Κ1859)突变为丙氨酸，这使得神经胰蛋白酶不再能够在该位点切割聚集蛋白(图3)。在本发明中定义的神经胰蛋白酶抗性的人agrinC44Hz8是SEQ ID NO :3的 44kDa C-末端聚集蛋白片段，其中碱性氨基酸赖氨酸1859(NP_940978)(或SEQ ID NO 3中的赖氨酸227)突变为丙氨酸，这引起产生不可被神经胰蛋白酶切割的聚集蛋白片段。该片段还可以在位于氨基酸P1751与V1752(NP_940978)之间的y位点不包含插入， 或在位于氨基酸S1884与E1885(NP_940978)之间的ζ位点不包含插入或包含8、11或 19个氨基酸的插入，或其组合。在y位点处插入的序列可以是KSRK(y4，SEQ ID NO :5)、 VLSASHPLTVSGASTPR(y17, SEQ ID NO 6)和 KSRKVLSASHPLTVSGASTPR(y21，SEQ ID NO 7)； 在 ζ 位点处插入的序列可以是 ELANEIPV(z8，SEQ ID NO 8), PETLDSGALHS (z 11, SEQ ID NO: 9)或 ELANEIPVPETLDSGALHS (ζ 19, SEQ ID NO :10，SEQ ID NO :8 与 SEQ ID NO :9 的组合)。如果在本申请中被称作人聚集蛋白C44Hz8，此类聚集蛋白片段应该对应于SEQ ID NO 3所示的片段，唯一区别是所示序列的位置227处的丙氨酸被替换为人聚集蛋白 C44 y4z8中的赖氨酸。在本发明中，术语“神经胰蛋白酶抗性的人agrinC44 Hz8”还包括SEQ ID NO 3 定义的蛋白的聚集蛋白变体，其中在1位点没有导入插入，或在ζ位点没有导入插入，或者在ζ位点不是插入8个氨基酸的插入，而是插入了对应于SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10的 11或19个氨基酸的插入。这包括通过在y和ζ位点导入可能的氨基酸而产生的所有可能的变体组合。术语“神经胰蛋白酶抗性的人agrinC44 y4z8"还包括在N-末端或C-末端包含另外的氨基酸的SEQ ID NO :3的聚集蛋白片段。N-末端处的此类另外的氨基酸的存在是由于例如，通过重组合成和在适当细胞中表达的制备方法。落在“神经胰蛋白酶抗性的人 agrinC44 Hz8”的定义内的此类蛋白的实例是根据实施例1制备的蛋白C44K/A SEQ ID NO :4，其包含His8标签，具有prescission蛋白酶切割位点以简化纯化(图4)。也包括不能被神经胰蛋白酶切割的、在N-末端包含一个或多个聚集蛋白的结构域的延伸、直至聚集蛋白的天然N-末端的蛋白，以及神经胰蛋白酶抗性的人聚集蛋白的糖基化的或以其它方式进行翻译后、酶促或化学修饰的蛋白变体。如实施例中所示，神经胰蛋白酶抗性的人agrinC44 y4z8具有使由于神经胰蛋白酶的过表达而引起的少肌症表型恢复的能力。由于运动神经的非天然高分泌神经胰蛋白酶会引起与LRP4复合的聚集蛋白的过度消化，所以通过MuSK诱导AChR簇集的正确信号传导被消除。这导致NMJ的丧失以及随后的相应的肌肉纤维的丧失并导致少肌症。神经胰蛋白酶抗性的人agrinC44 y4z8能够作为LRP4的激动剂，刺激MuSK途径。由于不能发生被神经胰蛋白酶的切割，所以在长时间内复合物保持稳定并维持信号传导。这导致AChR的表达和NMJ的维持。神经胰蛋白酶抗性的人agrinC44 y4z8对于治疗由于过量的神经胰蛋白酶引起的少肌症是有价值的，并且在那些存在NMJ的一般性去稳定化的疾病中也具有辅助意义。用于治疗少肌症的神经胰蛋白酶抗性的人agrinC44 y4z8的有效性的根本新机理是治疗神经衍生的失调，而非尝试影响肌肉纤维或整个肌肉的代谢。本发明还涉及神经胰蛋白酶抗性的人聚集蛋白用于脊髓损伤后的恢复性治疗的用途，例如，用于增强用途依赖性治疗。此类治疗法可以被神经胰蛋白酶抗性的人agrinC44 y4z8增强，这是因为其下列能力促进AChR簇集、维持完整的NMJ或促进长出的神经末梢向肌肉纤维上的异位性聚簇的附着、促进运动所需的新的NMJ的产生。还描述了神经胰蛋白酶抗性的人agrinC44 y4z8的制备，其中在合适的表达系统中表达编码神经胰蛋白酶抗性的人agrinC44 y4z8的DNA，然后纯化所得到的蛋白。有数种原核和真核表达系统适合于产生和分泌神经胰蛋白酶抗性的人agrinC44 y4z80原核表达系统包括但不限于在大肠杆菌中表达。真核表达系统包括在小鼠骨髓瘤细胞中表达、在昆虫细胞中进行杆状病毒介导的表达，以及在人胚胎肾(HEK)细胞中的表达，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的短暂表达和在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的稳定表达。这些系统具有下列优点它们能够容易地适应于无血清的条件以减少上清液中的污染性蛋白的量，并且能够适应于大规模生产。另外，可以使用多种细胞系，包括HEK293T和HEK293-细胞、COS细胞、CHO细胞、HeLa细胞、H9细胞、Jurkat细胞、NIH3T3细胞、C127细胞、CVl细胞、CAP细胞或SF细胞。为了纯化神经胰蛋白酶抗性的人agrinC44 Hz8，应用标准的蛋白纯化技术。可以使用IMAC纯化His标签化的蛋白，但是也可以使用离子交换色谱或使用肝素柱的亲和纯化。也可以使用通过针对聚集蛋白的C-末端部分所产生的抗体进行的纯化。然后可以使用羟磷灰石柱或通过凝胶过滤进一步纯化洗脱的蛋白。以下实施例例示了本发明而非限制本发明。本领域技术人员在阅读了这些实施例之后将能够应用其它相关的条件，这些也落在本发明的范围内。实施例 实施例1 神经胰蛋白酶抗性的人聚集蛋白的44-kd的C-末端片段(C44K/A)的克隆 首先，通过合适的限制性位点和引物，通过PCR将缺少N末端NtA结构域的全长人聚集蛋白yOzO(人聚集蛋白yOzOANTA起始于登记号NP_940978的蛋白序列的位置K156) 克隆进入PEAK8载体，该载体包含人calsyntenin-Ι的分泌信号的编码序列(Reif等人， 2007)。作为人聚集蛋白的模板，使用载体pCMV-XL5-Agrin (购自Origene USA)。在接下来的两个步骤中，使用标准技术通过定点诱变导入y4z8插入物所需的对应的密码子，得到包含全长人聚集蛋白y4z8 ANtA的pEAK8载体。使用该载体作为模板，扩增了编码人聚集蛋白的44-kd C-末端片段的基因，在翻译的蛋白的N-末端导入了 His8标签的编码区和prescission蛋白酶切割位点。使用引物在迅速改变诱变步骤中产生人聚集蛋白C44K/A的神经胰蛋白酶抗性形式，所述引物在聚集蛋白的切割位点的赖氨酸的密码子的位置处导入丙氨酸的密码子。该质粒在转染的细胞的培养物上清液中产生具有SEQ ID NO :4的序列的蛋白(无信号序列)，其中聚集蛋白部分的氨基酸起始于亮氨酸21。实施例2 人聚集蛋白C44和神经胰蛋白酶抗性的C44K/A的表达和纯化通过在Sorvall RC5C离心机中在100 χ g离心30分钟而使在Excell293培养基中生长至密度为1 X IO6个细胞/ml的500ml HEK293细胞沉淀。将细胞重悬于预温热至 37°C的500ml RPMI1640培养基中。将含有用于表达神经胰蛋白酶抗性的人AgrinC44 y4z8 的 1. 25mg pEAK8 在 25ml 150mM NaCl 中稀释。将 3. 75mg 的 25kDa 聚乙烯亚胺(PEI)在 25ml 150mM NaCl中稀释。汇合这两种溶液并在室温温育10分钟。然后，将该溶液加入到细胞悬浮液中，然后将该细胞悬浮液转移至1000ml的旋转瓶中。将细胞悬浮液在置于具有 5% CO2、温度37°C的潮湿空气的温育箱中的搅拌台上在75rpm下温育7天。7天后，通过在Sorvall RC5C离心机中以5000rpm离心而收获培养上清液。通过经由0. 22um Millipore无菌过滤设备过滤而除掉剩余的颗粒。使用Pellicon PLCGC IOkDa 截留切向流筒将经过滤的培养物上清液浓缩10倍，并以20mM MOPS pH8. 5,400mM NaCl进行至少1 1000的透析。透析液进行固定化金属亲和色谱(IMAC)，其利用了 HisS标签， 使用以Ni2+标记的IOml台式His选择柱。在装载了经浓缩和透析的细胞培养物上清液之后，以100ml透析缓冲液洗涤该柱并以含有500mM咪唑的IOml透析缓冲液洗脱结合的蛋白 5次。纯化成功之后进行SDS-PAGE (图D)。汇集阳性级份并以AMIC0N30kDa截留过滤装置在 3000x g 在 Sigma 4K15 离心机中浓缩 10 倍，并以 20mM MOPS pH8. 5，200mM NaCl 进行 1 10000透析。使用0.725cm7mg的消光系数通过紫外分光光度计测定纯化的C44K/A的浓度。实施例3 通过prescission蛋白酶切割除掉His8标签。在需要除掉Hi S8标签的情况下，将0. 5ml蛋白溶液的缓冲液交换为50mM Tris-HCL,pH7. 2，150mM NaCl，ImM DTT, ImMNa2EDTA,使用以该缓冲液预平衡的 NAP-5 柱。在 Iml相同的缓冲液中洗脱蛋白溶液。向蛋白溶液中加入Iul IM DTT，并通过倒转管数次而使之混勻。加入20ul Prescission蛋白酶(lU/ul)并通过倒转管数次而使之混勻。反应
12在4°c过夜进行。以补充了 ImM DTT的5mlPBS平衡0. 5ml重力流动谷胱甘肽琼脂糖柱。载入经消化的蛋白溶液，并收集流过物。以补充了 ImM DTT的Iml PBS洗涤该柱3次，在与之前的流过的级份相同的管中收集流过物。将收集的流过的级份针对5升20mM MOPS pH8. 5， 400mM NaCl透析2次2小时，以除掉DTT和EDTA。为了除掉切割的 His8 标签，进行第二次 IMAC。以 5ml 20mMM0PS pH8. 5,400mM NaCl平衡之前经Ni2+离子标记的Iml螯合性琼脂糖FF柱。将经透析的蛋白溶液应用至柱上并收集流过物。以lml20mM MOPS pH8. 5,400mM NaCl洗涤该柱3次并在相同的管中收集流过物。使用AMICON 30kDa截留浓缩器将汇集的级份浓缩至0.5ml，使用以20mM MOPS pH8. 5，200mM NaCl预平衡的NAP-5柱交换缓冲液。使用0. 725cm2/mg的消光系数通过紫外分光光度计测定浓度。将新鲜制备的蛋白用于进一步的实验或储存于_80°C直至使用。相应的蛋白的蛋白序列对应于SEQ ID NO 3的从甘氨酸19开始的部分。实施例4 人神经胰蛋白酶对于C44和C44K/A的体外消化a)为了证明神经胰蛋白酶不能消化神经胰蛋白酶抗性的人agrinC44Hz8K/A，将该蛋白进行神经胰蛋白酶测验。作为对照，使用人agrinC44 y4z80在该测验中使用浓度为IuM的agrinC44底物，并加入人神经胰蛋白酶。在2OmM MOPS pH8. 3,150mM NaCl,5mM CaCl2,0. 1% PEG 6000中进行反应。在37°C消化6小时。将物质载入4-12% NuPAGE SDS 凝胶上并以Sypro ruby染色(图4)。b)在类似于a)的另外的测验中，显示了如图2b和7-10所示的C44K/A片段不被神经胰蛋白酶消化(图11)。实施例5 在小鼠中施用神经胰蛋白酶抗性的人C44K/A实验中使用的少肌症小鼠模型是C57BL/6NCRL背景中thy-Ι驱动的神经胰蛋白酶过表达者(Stephan等人，2008)和它们的野生型同窝出生的小鼠。其中包括了雄性和雌性动物，因为在该年龄的幼鼠中，在性别之间不存在体重和肌肉强度上的差异。小鼠在P8(出生后8天)时参加实验。使用3组小鼠，每组3只1 以介质处理的野生型小鼠；2 以C44K/A处理的少肌症小鼠(M491S) ；3 以介质处理的少肌症小鼠。以C44K/A或介质皮下注射小鼠，总剂量为6.%ig/kg/天。在第1天开始给药，持续至第13天。对于实验中的所有小鼠，每天测定一次体重。对于每个处理组，取体重的平均值并针对每个实验天数作图(图5)。在实验开始时，已经在少肌症小鼠中见到了轻微的体重下降。相对于以介质处理的小鼠，以C44K/A处理少肌症小鼠引起体重的显著升高。以 C44K/A处理的少肌症小鼠完全恢复并取得了如在野生型同窝出生的小鼠中所观察到的相同的进展。在人类中，虚弱患者遭受每年^g以上的体重下降(Bauer and Sieber,2008 ； Lauretani等人，2003)。这对应于大约7 %的总体重下降。以介质对照处理的少肌症小鼠显示出明显的体重下降。在实验过程中，少肌症小鼠经历大约5%的体重下降。实施例6:握力的测定在实施例5描述的实验的第13天，使用数码力量表(Columbus Instruments, Columbus OH)测定前肢和后肢的握力，该数码力量表通过精确的力量计保留所施加的峰值力量。将力量表固定于固体基底并以力传导器连接至直径大约为Imm的三角形的牵引杆。通过RS232连接使用电脑在线收集数据，通过Grip Strength Meter软件(ColumbusInstruments)存储为.dat文件，并转移至excel进行数据管理和统计分析。用于测量最大力量的单位是克(g)。在测定之前，将小鼠转移至实验房并允许其习惯10分钟。允许每只小鼠以其前爪握住直径为大约3mm的金属杆。然后，小鼠靠近牵引杆，背对力量表并允许以其前爪或后爪握住牵引杆的线。小鼠被其尾巴(与牵引杆平行)拉向力量表，速度为大约 IOcm/sec ο保持在恒定速度牵弓I，直至小鼠的前肢分别与后肢分别释放开。一个实验部分由5 次后肢握力测试构成。在测试之间，允许小鼠休息约1分钟的时间段。在实际实验部分开始前的至少一天，以所述的程序训练小鼠。每个实验部分均以不知情方式进行以避免不想要的实验偏倚。按照以下方式进行数据分析对于每只小鼠，排除最高值和最低值，对剩余的3个数值取平均值。随后，对于每个处理组的数据取平均值并根据介质处理的野生型组进行标准化。在第13天，相对于野生型而言，以介质处理的少肌症小鼠具有大约20%的肌肉强度下降；而C44K/A处理的小鼠与介质处理的野生型具有相似的握力。对于人类而言，相对于大约20岁的成年人，大约70岁的个体的肌肉强度的下降是大约 20% -40%,90 岁的个体则增加至 50% 以上(Bauer and Sieber，2008 ；Lauretani 等人，2003)。在本实施例中，申请人证明在大约第14天防止了 20%的握力下降。这是首次显示聚集蛋白的片段在体内是有活性的。在皮下施用之后，蛋白C44K/A 在体内分布，并在患有少肌症样症状的小鼠中发挥出有益效应。实施例7 神经胰蛋白酶抗性的人C44 y0z8K/A和小鼠-AgrinC44y0z8K/A在小鼠中的施用在实验中使用的少肌症小鼠模型(如实施例5中)仍然是C57BL/6NCRL背景中 Thy-I驱动的神经胰蛋白酶过表达者(Stephan等人，2008)和它们的野生型同窝出生的小鼠。其中包括了雄性和雌性动物，因为在该年龄的幼鼠中，在性别之间不存在体重和肌肉强度上的差异。小鼠在P8(出生后8天)时参加实验。使用4组小鼠，每组4只1 以介质处理的野生型小鼠；2 以C44K/A(0，8)处理的少肌症小鼠(M491S) ；3 以小鼠-AgrinC44(0，8)K/A处理的少肌症小鼠(M491S) ；4.以介质处理的少肌症小鼠。皮下注射小鼠，总剂量为20mg/kg/天。在第1天开始给药，持续至第13天。对于实验中的所有小鼠，每天测定一次体重。对于每个处理组，取体重的平均值并针对每个实验天数作图。给出了每个处理组的相对于介质处理的野生型小鼠的百分率相对体重(图 12)。相对于以介质处理的少肌症小鼠，以人C44y0z8K/A或小鼠C44y0z8K/A处理少肌症小鼠引起显著的体重升高。以C44y0z8K/A处理的少肌症小鼠完全恢复并取得了如野生型同窝出生的小鼠中所观察到的相同的进展。在人类中，虚弱患者遭受每年^g以上的体重下降(Bauer and Sieber，2008 ;Lauretani等人，2003)。这对应于大约7%的总体重的下降。 以介质对照处理的少肌症小鼠显示出明显的体重下降。在实验过程中，少肌症小鼠经历大约5%的体重下降。实施例8:握力的测定根据实施例6的描述进行测定。
图13a和b显示了以介质(介质)或人C44y0z8K/A或小鼠C44y0z8K/A处理的少肌症小鼠和以介质处理的野生型同窝出生小鼠(野生型介质)的前肢和后肢的握力。在第 13天测定握力。不同处理组的握力表示为相对于以介质处理的野生型同窝出生小鼠的百分率。标准偏差表示为误差条(对于每个组，N = 5)。参考文献1. Bauer, J. Μ. and Sieber, C. C. (2008). Sarcopenia and frai 1 ty :a clinician' s controversial point of view.Exp. Gerontol. 43,674-678.2. Bezakova, G. and Ruegg，M. A. (2003). New insights into the roles of agrin. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4，295-308.3. Gschwend，T. P.，Krueger, S. R.，Kozlov, S. V.，Wolfer, D. P. and Sonderegger, P. (1997). Neurotrypsin, a novel multidomain serine protease expressed in the nervous system. Mol. Cell Neurosci. 9,207-219.4. Lauretani, F.，Russo，C. R.，Bandinelli，S.，Bartali, B.，Cavazzini, C.，Di, I. Α.，Corsi，A.M. , Rantanen, Τ. , Guralnik, J. Μ. and Ferrucci，L (2003). Age-associated changes in skeletal muscles and their effect on mobility :an operational diagnosis of sarcopenia. J Appl.Physiol 95,1851-1860.5. Molinari, F.，Rio, M.，Meskenaite，V.，Encha-Razavi, F.，Auge, J.，Bacq， D.，Briault，S.，Vekemans, Μ.，Munnich，Α.，ttie-Bitach，Τ·等人(2002). Truncating neurotrypsin mutation in autosomal recessive nonsyndromic mental retardation. Science 298,1779-1781.6. Reif，R.，Sales，S.，Hettwer，S.，Dreier，B.，GisIer，C.，Wolfel，J.，Luscher， D.，Zurlinden, A.，Stephan, A.，Ahmed，S·等人(2007). Specific cleavage of agrin by neurotrypsin, a synaptic protease linked to mental retardation. FASEB J 21， 3468-3478.7. Song, Y. and Balice-Gordon，R. (2008). New dogs in the dogma : Lr ρ 4 and Tidl in neuromuscular synapse formation. Neuron60,526-528.8. Stephan, A.，Mateos，J.M. ,Kozlov, S. V.，Cinelli，P.，Kistler，A. D. , Hettwer, S.，Rulicke，T.，Streit，P.，Kunz, B. and Sonderegger, P. (2008). Neurotrypsin cleaves agrin locally at the synapse. FASEB J.
权利要求
1.用作药物的具有体内活性的修饰的聚集蛋白片段，其至少包含共价互联形式的人或小鼠聚集蛋白的LG2和LG3结构域并按照使所述片段不能被神经胰蛋白酶切割的方式被修饰。
2.根据权利要求1的修饰的聚集蛋白片段，其特征在于其切割位点被删除或修饰。
3.根据权利要求1的修饰的聚集蛋白片段，其特征在于其包含根据SEQID Ν0:3的氨基酸序列。
4.根据权利要求1的聚集蛋白片段在制备用于治疗影响肌肉的神经肌肉疾病或神经、 肌肉和神经肌肉连接的疾病的药物中的用途。
5.根据权利要求4的用途，其特征在于所述影响肌肉的神经肌肉疾病或神经、肌肉和神经肌肉连接的疾病包括少肌症、肌肉虚弱、虚弱、肌萎缩和肌营养不良症、肌无力、肌强直、脊髓性肌萎缩、肌萎缩侧索硬化和原发性侧索硬化。
6.根据权利要求1的修饰的聚集蛋白片段，其用于治疗神经胰蛋白酶相关的疾病、特别是具有升高的神经胰蛋白酶水平的疾病。
7.根据权利要求1或6的修饰的聚集蛋白片段，其用于治疗神经肌肉疾病或神经、肌肉和神经肌肉连接的疾病。
8.根据权利要求7的修饰的聚集蛋白片段，其特征在于所述神经肌肉疾病或神经、肌肉和神经肌肉连接的疾病包括少肌症、肌肉虚弱、虚弱、肌萎缩和肌营养不良症、肌无力、 肌强直、脊髓性肌萎缩、肌萎缩侧索硬化和原发性侧索硬化。
9.根据权利要求1的修饰的聚集蛋白片段，其用于治疗废用诱导的肌萎缩或身体消耗综合征。
10.包含根据权利要求1或2的聚集蛋白片段和药学上可接受的载体的药物组合物。
11.具有体内活性的修饰的聚集蛋白片段，其至少包含共价互联形式的人聚集蛋白的 LG2和LG3结构域并按照使所述片段不能被神经胰蛋白酶切割的方式被修饰。
全文摘要
用作药物的具有体内活性的修饰的聚集蛋白片段，其至少包含共价互联形式的人聚集蛋白的LG2和LG3结构域并按照使所述片段不能被神经胰蛋白酶切割的方式修饰。
文档编号A61K38/17GK102481339SQ201080039028
公开日2012年5月30日 申请日期2010年9月1日 优先权日2009年9月4日
发明者J·W·弗里杰布勒德, S·库瑟拉, S·黑特韦尔 申请人:纽罗图恩股份公司