用于治疗肾脏损伤的造血干细胞的制作方法

专利名称：：用于治疗肾脏损伤的造血干细胞的制作方法用于治疗肾脏损伤的造血干细胞相关申请的交叉引用本申请要求2009年10月2日提交的美国临时专利申请第61/248，316号的优先权，该申请以引用的方式整体并入。
背景技术：
：尽管肾脏具有极大的再生能力，但是现在急性肾脏损伤后或反复性和慢性肾脏损伤两者后的慢性肾病和肾衰竭是全球发病率和死亡率的主要原因[1-3]。此外，慢性肾病已经被鉴定为心血管疾病和心血管死亡的主要独立风险因子W]。慢性肾病可表现为损伤后的不成功的或不完全的肾脏修复，当前很少有促进肾脏修复和再生的治疗[5]。肾脏肾小管周微血管近来已受到越来越多的关注，因为该脆弱的血管系统在损伤后通常不能再生。这可易于造成慢性肾脏缺血[12-15]，引发慢性炎症，肾小管萎缩和间质纤维化(慢性肾病的标志)[13，14]。已经提出，损伤后肾小管周毛细血管不能成功再生对于发展为慢性肾病至关重要[12-14]。骨髓干细胞的修复和生成血管的性质已受到大量关注W-8]，对在肾脏疾病小鼠模型的若干研究已经表明，小鼠骨髓间充质基质细胞(MSC)可(可能通过旁分泌或全身分泌机制)预防或减少肾脏损伤W，9，10]。然而，很少对造血干细胞(HSC)在肾脏修复中的可能的血管生成作用进行研究，并且没有研究确定在细胞疗法中收获人HSC以促进器官的修复和再生的可行性[11]。因此，本领域中存在开发用于治疗肾脏损伤的方法的需求。发明概述本文所述的研究首次证明了人CD34+干细胞被募集至受损的肾脏中，并改善存活率、血管再生和功能恢复。利用构建的小鼠缺血再灌注损伤模型对人CD34+造血干细胞促进肾脏修复和再生的能力进行了研究。肾脏损伤后(倒如)全身性施用的HSC被选择性地募集至小鼠的受损的肾脏中并主要集中于血管中和其周围。该募集与修复增强的肾脏微血管、肾小管上皮细胞、增强的功能恢复和提高的存活率相关。在某些情况下，HSC在肾脏中获得早期髓样和淋巴样的分化标记物，并且还显示获得内皮祖细胞标记物，但保留了募集至肾脏后的高水平促血管生成的转录物的合成。尽管输注的纯化HSC含有少量的循环内皮祖细胞和偶有的内皮细胞，但是在小鼠毛细血管壁中鉴定了仅极少数的人内皮细胞，这表明HSC-介导的肾脏修复是通过旁分泌机制，而非血管置换。这些研究提出人HSC对于促进肾脏损伤后修复而言是有前景的治疗策略。因此，本发明提供一种治疗患者的肾脏损伤的方法，该方法包括向患者施用造血干细胞(HSC)。将HSC以有效治疗肾脏损伤的量施用于患者，所述量在本文中有进一步描述。在本发明的某些实施方案中，延迟施用HSC;S卩，在肾脏损伤之后并不立即施用HSC。在本发明的一些方面中，在肾脏的修复期开始时，例如，损伤后至少约12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或M小时，向患者施用HSC。在其它实施方案中，在损伤后约M小时，或其后某段时间但在损伤后约14天之前，向患者施用HSC。关于HSC的施用时间的其它实施方案在本文中有详细描述。本文进一步提供包括施用HSC的相关方法。例如，预防患有肾脏损伤患者的肾脏疾病或肾脏医学状况的方法，提高患有肾脏损伤的患者的存活率的方法，和预防患有肾脏损伤的患者的由肾脏疾病或肾脏医学状况造成的或与之相关的非-肾脏疾病或非-肾脏医学状况的方法。在本发明的一些实施方案中，本发明方法中使用的HSC与药学上可接受的载体一起配制。因此，本发明提供一种药物组合物，其包含HSC群和药学上可接受的载体。在某些实施方案中，该药物组合物包含任选地与HSC缀合的其它治疗剂或诊断剂。此类药物组合物可用于将治疗剂或诊断剂递送至受损的肾脏。因此，本发明还提供向患者的受损肾脏递送治疗剂或治疗剂的方法，该方法包括向该患者施用与治疗剂或诊断剂缀合的HSC。在一些方面中，所述药物组合物包含异源细胞群，其中HSC(例如，⑶34+HSC)构成该细胞群的至少约25%(例如，至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或至少约98%)。本文中提供了本发明药物组合物及其用途的其它实施方案。附图简述图1显示了人造血干细胞被募集至N0D/SCID小鼠的缺血再灌注后受损的肾脏、脾和骨髓。(A)N0D/SCID小鼠(在IRI后第1天接受过继转移的人HSC)在IRI后第3天的肾脏的代表性共聚焦图像，显示出在肾小管周毛细血管(通过小鼠CD31标记表示)中的CMFDA标记的人细胞(箭头)。(B)示出IRI后第3天、5天和7天时，IRI后的肾脏和对照肾脏中鉴定的人HSC的数量的图。(C)N0D/SCID小鼠(IRI后M小时使用人HSC治疗)在IRI后第7天的肾脏中检测到的人HLA-I类(绿色，箭头)的代表性共聚焦图像。(D)示出IRI后第7天、14天和观天时，IRI后的肾脏和对照肾脏中每个切片中人HLA-I类细胞的数量。(E)IRI后第1天接受过继转移后，IRI后第3天脾中的CMFDA标记的人HSC的代表性共聚焦图像。(F)示出IRI后第3天、5天和7天时，脾脏中每个切片中CMFDA阳性细胞数量的图。(G)来自N0D/SCID小鼠(在IRI后第1天接受过继转移的HSC)在IRI后第7天肾脏中全部骨髓的CDllb(检测小鼠和人抗原)和人CD45的代表性流式细胞图。(H)示出在第1天和第2天时，小鼠骨HSC(E)中人CD45+细胞的百分比的图。注意在⑶中，在严重受损的肾小管中具有大量的细胞碎片，(E)中程度要低很多。(F)示出接受媒介物或HSC(n=3/时间点)小鼠的肾小管损伤指数的图。(G-H)IRI后第1天和第2天接受媒介物(G)或HSC(H)后，IRI后第观天的天狼猩红染色的肾脏的代表性图像。(I)示出接受媒介物或HSC(n=3/时间点)后小鼠的纤维化面积的图。平均值士标准偏差。*P<0.05，相比媒介物对照组(vehiclegroup)。(标尺=50μm)。图2显示肾脏缺血再灌注损伤后，向N0D/SCID小鼠过继转移的人HSC降低了死亡率并改善了肾功能。(A)损伤后第1天静脉注射PBS(媒介物，η=16)或2.5XIO6人HSC(HSC,n=10)，双侧IRI后第1天、第2天和第7天时的血浆肌酸酐水平。数据用平均值士标准偏差表示，P值<0.01。(B)对于损伤后第1天静脉注射PBS(媒介物)或2.5XIO6人HSC(HSC)后的双侧IRI小鼠，在每个时间点的存活率曲线和数量。P值=0.039。图3显示了肾脏缺血再灌注损伤后，过继转移的人HSC减少了肾小管周毛细血管损失并降低了肾小管内皮的损伤。(A-B)在第1天和第2天接受媒介物(A)或HSC(B)后，IRI后第7天外髓部的小鼠⑶31-标记的肾小管周毛细血管(PTC)的代表性图。注意(A)中显著的PTC损失。(C)示出接受媒介物或HSC(n=3/时间点)后，小鼠PTC指数的图。(D-E)来自IRI后第5天小鼠(第1天和第2天接受媒介物⑶或HSC(E))的外髓部的PAS染色肾切片的光图像。注意(D)中严重受损的肾小管中存在大量的细胞碎片，(E)中程度要低很多。(F)示出接受媒介物或HSC(n=3/时间点)后，小鼠肾小管损伤指数的图。(G-H)IRI后第1天和第2天接受媒介物(G)或HSC(H)后，IRI后第观天的天狼猩红染色的肾脏的代表性图。(I)示出接受媒介物或HSC(n=3，每个时间点)后，小鼠的纤维化面积的图。平均值士标准偏差，*P<0.05，相比媒介物对照组。(标尺=50μm)。图4显示人HSC在肾脏中的分化。外髓部的代表性共聚焦图像(A，C)和表观荧光(印ifuorescence)图像(E)显示，在损伤后第1天接受静脉注射HSC，人CD45(A)、人⑶68(C)和人⑶3(E)在IRI后第5天肾中的细胞(箭头)中的表达，共标记以显示小鼠血管系统的mCD31(红色)。图表示出在IRI后的肾脏和对照的肾脏中鉴定的人CD45(B)、人CD68(D)和人CD3(F)细胞的数量。数据为平均值士标准偏差，η=6/时间点。(G-H)NOD/SCID小鼠的IRI后第3天肾的代表性落射荧光图像，其中该N0D/SCID小鼠在第1天-第2天接受人HSC，其使用CMFDA(箭头)标记，使用抗人CD133(G)、CD146(H)和KDR(I)的抗体共标记。注意抗-KDR抗体也检测到小鼠内皮(箭头)(标尺=50μπι)。图5显示可在缺血性损伤和HSC灌注后的肾脏中检测到极少的人内皮细胞。(A-B)IRI后第观天肾的共聚焦图像，表明存在人⑶31表达的细胞，其中这些细胞中的一些似乎整合到毛细血管中(箭头)(A)，但大多数为形态学上的单核细胞和共表达的hCD45(箭头)(B)0(C)示出损伤后第1天过继转移HSC后，在IRI后肾脏中人CD31表达细胞的数量相对于时间的图。(D)人血管性血友病因子(vonWillebrandfactor,vWF)(箭头)而非小鼠vffF在IRI后肾脏中的细胞(缺乏人⑶45表达)中的特异表达(标尺=50μm)。图6显示在肾脏缺血性损伤后，人HSC在肾脏中产生血管生成旁分泌因子。与GAPDH比较，HSC(白色)、过继转移前的HSC和过继转移后48小时由IRI肾脏纯化的HSC中促血管生成转录物的相对基因表达。注意募集至肾脏的HSC保持很高水平的促血管生成转录物的表达。平均值士标准偏差，η=6/组。(标尺=50μm)。图7显示了HSC在损伤后的修复中的功能的模型。HSC被募集至该受损的肾，在其中它们获得了CEP标记物⑶146，并集中在受损的毛细血管内和间质内。局部产生的细胞因子包括血管生成素、血管内皮生长因子、肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子，通过旁分泌机制促进了细胞修复。发明详述本文公开的数据首次证明向患有肾脏损伤的哺乳动物施用的HSC的特异性定位，以及随后的受损的肾组织(包括但不限于肾小管周微血管)的修复，该修复由HSC所介导。因此，本发明提供治疗患者的肾脏损伤的方法，所述方法包括以有效治疗患者肾脏损伤的量向患者施用造血干细胞(HSC)。本文使用的术语"治疗"以及由其衍生的词语并不必然暗示目标医学状况的100%或完全改善。而是，具有本领域的普通技术人员所认为的具有效益的各种程度的治疗效果。就此而言，本文所述的方法对肾脏损伤提供任意量或任意水平的治疗有益效果，从而"治疗"该损伤。例如，在许多方面，治疗肾脏损伤的方法包括下列的一种或多种促进患者的受损肾脏的修复或再生、提高患者的存活、增强肾脏的功能恢复，或恢复肾脏的功能。在另一方面，由所述方法提供的治疗包括减轻由受损肾脏造成的一种或多种医学状况或症状。通过举例而非限制，本文所述的本发明方法实现下列的一种或多种肾小管周微血管(例如，肾小管周毛细血管)的修复或再生增强、肾脏中的血管(例如，肾小管周微血管(例如，肾小管周毛细血管))的形成或稳定、受损肾脏中的血管生成的诱导，或肾小管上皮细胞的修复增强，从而减少肾脏的负性重构的发生。肾脏损伤在本发明的多个方面，提供的方法旨在治疗患者的肾脏损伤，其为由下列一种或多种中的任一种对肾脏所造成的任一损伤缺血、毒素暴露、血管紧张肽转化酶抑制剂(ACEI)或血管紧张肽II受体阻断剂的使用、输血反应、肌肉损伤或创伤、手术、休克、低血压，或任一ARF或慢性肾病的病因，如在本文中进一步描述。目标肾脏损伤包括对肾脏内存在的任何组织的损伤，包括但不限于髓质、皮质、肾锥体、叶间动脉、肾动脉、肾静脉、肾门、肾盂、输尿管、肾小盏、肾被膜、上端肾被膜、下端肾被膜、叶间静脉、肾单位、肾大盏、肾乳头、肾小球、鲍曼囊(Bowman'scapsule)，和肾柱的组织，该组织的损伤足以造成部分或全部功能丧失。受损的肾脏组织包括出现在肾脏中的任何一种或多种不同的细胞类型，包括但不限于肾小球壁细胞、肾小球足细胞、肾小球内系膜细胞、肾小球内皮细胞、肾近端小管刷状缘细胞、髓袢细段细胞、升支粗段细胞、远端肾小管细胞、肾集合管细胞，和间质肾细胞。在本发明的某些实施方案中，肾脏损伤包括对肾小管周微血管的损伤。在某些方面中，肾脏损伤包括对肾小管周毛细血管的损伤。在一些实施方案中，肾脏损伤包括对肾小管(管状)上皮细胞的损伤。肾脏疾病肾病和肾脏医学状况的预防尽管肾脏具有巨大的自我修复或自我再生的能力，但是肾脏损伤通常导致形成肾脏疾病或肾脏医学状况的倾向性增加。理论上，本文提供的治疗患者肾脏损伤的方法能够使得肾脏成功的修复和再生，使得患者不具有增加的形成肾脏疾病或肾脏医学状况的倾向性。因此，本发明还提供预防患有肾脏损伤的患者的肾脏疾病或肾脏医学状况的方法。该方法包括以有效预防肾脏疾病或肾脏医学状况的量向患者施用HSC。在一些实施方案中，所述量为有效治疗肾脏损伤的量，例如，有效恢复肾脏功能、有效再生肾小管周微血管的量。本文使用的术语"预防"以及由其衍生的词语并不必然地指100%或完全预防。而是，具有本领域的普通技术人员所认为的具有潜在有益效果的各种程度的预防。就此而言，本文所述的预防方法提供了任意量或任意水平的肾脏疾病或肾脏医学状况的预防。在多个方面，所述预防方法为一种延迟、减缓、降低或减轻肾脏疾病或肾脏医学状况或其症状或医学状况的发作、形成、出现或进展的方法。在一些实施方案中，预防的肾脏疾病肾病或肾脏医学状况为急性肾衰竭、慢性肾病、肾间质性纤维变性、糖尿病性肾病、肾小球肾炎、肾积水、间质性肾炎、肾结石(肾石病)、肾脏肿瘤(例如，维尔姆斯瘤、肾细胞癌)、狼疮肾炎、肾微小病变疾病、肾病综合征、肾盂肾炎、肾衰竭(例如，非急性肾衰竭和慢性肾病)。急性肾衰竭本文使用的术语“急性肾衰竭”与“急性肾脏损伤”或“ARF”同义，均指由于对肾脏的损害而造成的肾脏功能的快速丧失。ARF是一种复杂的综合征，其标志为由肾脏正常代谢的含氮(例如，血清肌酸和/或尿液排出物)和不含氮废物的水平的突然变化。ARF的症状和诊断在本领域中是已知的。参见例如AcuteKidneyInjury,ContributionstoNephroloRY,Vol.156,Ronco等编，KargerPublishers,Basel,Switzerland,2007禾口Bellomo等，CritCare8(4):R204_R212，2004。在多个方面，取决于病因，ARF为肾前性ARF、内因性ARF或肾后性ARF。就此而言，肾前性ARF可由下列一种或多种所引起血容量不足(例如，因为休克、脱水、体液丧失或利尿剂过量使用)、肝肾综合征、血管问题(例如，动脉粥样硬化性栓塞性疾病、肾脏静脉血栓形成、与肾病综合征有关)、感染(例如，脓毒症)、重度烧伤、死骨形成(例如由于心包炎、胰腺炎)，和低血压(例如由于抗高血压、血管扩张药的使用)。内因性ARF可由下列一种或多种所引起毒素或药物(例如，NSAID、氨基糖苷类抗生素、碘化造影剂、锂、磷酸盐肾病变(例如，与使用磷酸钠的结肠镜检查肠制备物相关)、横纹肌溶解(例如，由损伤(例如，挤压伤或严重挫伤)、他汀类药物、刺激剂的使用引起)、溶血、多发性骨髓瘤、急性肾小球肾炎。肾后性ARF可由下列一种或多种所造成药物(例如，抗胆碱能药)、良性前列腺肥大或前列腺癌、肾结石、腹部恶性肿瘤(例如，卵巢癌、结肠直肠癌)、导尿管堵塞以及引起结晶尿或肌球蛋白尿或膀胱炎的药物。ARF可由患者中的缺血、毒素、血管紧张肽转化酶抑制剂(ACEI)或血管紧张肽II受体阻断剂的使用、输血反应、对肌肉的损伤或创伤、手术、休克和低血压而造成。引起ARF的毒素可为抗真菌剂或射线照相术的染料。此外，在一些实施方案中，ARF包括急性肾小管坏死或肾脏缺血再灌注损伤。慢性肾病在预防肾脏疾病肾病或肾脏医学状况的方法的一些实施方案中，肾病为慢性肾病(CKD)。在本文中所用的“慢性肾病”，也称为“慢性肾脏疾病”，是指在数月或数年期间肾功能的渐进性丧失。所治疗的CKD处于任一期，包括，例如，1期、2期、3期、4期或5期(也已知为被认定的CKD、晚期肾病(ESRD)、慢性肾脏衰竭(CKF)或慢性肾衰竭(CRF))。CKD可由多种因素中的任一种所引起，包括但不限于急性肾脏损伤、急性肾脏损伤的病因、导致糖尿病性肾病的I型和II型糖尿病、高血压、肾小球肾炎(肾脏滤过系统的炎症和损伤)、多囊性肾病、导致镇痛性肾病的镇痛药(例如，对乙酰氨基酚、布洛芬)的使用(例如，定期和过长持续时间)、导致缺血性肾病的动脉粥样硬化、尿液流动被结石阻塞、前列腺肥大、狭窄(变窄)、HIV感染、镰状细胞病、海洛因滥用、淀粉样变性、肾结石、慢性肾脏感染和某些癌症。非肾脏疾病和非肾脏医学状况的预防已经鉴定慢性肾病为心血管疾病和心血管死亡的主要独立风险因子。理论上，本文所述的HSC的施用还可用于预防除了肾脏疾病或肾脏医学状况外的疾病或医学状况。因此，本文进一步提供预防患有肾脏损伤的患者的非肾脏疾病或非肾脏医学状况的方法，该非肾脏疾病或非肾脏医学状况由肾脏疾病或肾脏医学状况引起或与其相关。所述方法包括以有效预防非肾脏疾病或非肾脏医学状况的量向患者施用HSC。在某些实施方案中，非肾脏疾病或非肾脏医学状况为心血管疾病。存活率提高急性肾脏损伤之后或反复性和慢性肾脏损伤两者之后的慢性肾病和肾衰竭现在为全球发病率和死亡率的主要原因。理论上，本文所述的HSC的施用还可用于预防患有肾脏损伤的患者的死亡(提高存活率)。因此，本文在还提供提高患有肾脏损伤的患者的存活率的方法。所述方法包括以有效提高患者存活率的量向患者施用HSC。造血干细胞(HSC)出于本发明的目的，术语“造血干细胞”或“HSC”指产生血液细胞类型的多能干细胞，包括例如，髓系(单核细胞和巨噬细胞、中性白细胞、嗜碱粒细胞、嗜酸粒细胞、红细胞、巨核细胞、血小板、树突细胞)，和淋巴系(T-细胞、B-细胞、自然杀伤(NK)细胞)。HSC可为多能的、寡能的或单能的HSC。获得HSC的方法和HSC的来源HSC可以通过本领域中已知的任一方法获得。在一些实施方案中，HSC自供体分离。本文使用的术语"分离的(isolated)“是指已经从其自然环境中移除。HSC分离自任一含HSC的成人、胎儿或胚胎组织，在多个方面中包括但不限于骨髓、脂肪组织、血液、卵黄囊、脊髓组织(例如，肝、脾中、胎儿中，例如，胎儿肝、胎儿脾)、脐带血、胎盘，和主动脉-性腺-中肾。HSC的供体为本文所述的关于患者的任一宿主。在一些方面，供体为哺乳动物。在具体方面，供体为人。在其它方面，HSC的供体与患者相同。就此而言，该HSC被认为与该患者是“自体同源的(autologous)”。在一些实施方案中，HSC的供体与该患者不同，但是该供体和患者属于同一物种。就此而言，该HSC被认为是“同种异体的(allogeneic)”。在一些实施方案中，利用注射器和针头将HSC从供体(例如供体髋部)的骨髓中分离。在其它实施方案中，HSC分离自血液(例如，外周血)。在某些方面，HSC分离自使用细胞因子对供体进行预治疗后的血液，所述细胞因子诱导或促进HSC从骨髓向血液(例如外周血)的移动。在某些情况下，细胞因子为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或AMD-3100。在一些实施方案中，HSC为原代细胞或新鲜分离的细胞。或者，HSC为培养的细胞、建立细胞系的细胞，和/或由冷冻的HSC储备液解冻得到。HSC可通过细胞库获得，例如，AmericanTissueCultureCollection(ATCC)^NationalStemCellResource(NSCR)、NationalStemCellBank(NSCB)，以及其它商业供应商。在其它方面，进行其它步骤以获得特定的HSC群。HSC在一些实施方案中是纯化的。本文使用的术语"纯化的"是指纯度已增加，其中"纯度"为相对术语，并不必然地被理解为绝对纯度。在多个方面，例如，纯度为至少约50%，可为60%以上、70%以上或80%以上，或可为100%。因此，在一些实施方案中，本发明的HSC为异源细胞群的一部分或为基本上同源的细胞群的一部分。例如，在一些方面中，HSC为克隆的HSC群，其中该群的每个细胞与该群的另一细胞在遗传上不同。该异源细胞群包含其它类型的细胞(不同于HSC的细胞)。例如，在一些方面，该异源细胞群包含除HSC外的白细胞(髓系或淋巴系的白细胞)、红细胞、内皮细胞、循环内皮前体细胞、上皮细胞、肾细胞、肺细胞、骨细胞、中幼粒细胞、神经元、平滑肌细胞。作为另外的选择或除此之外，该异源细胞群仅包含HSC，但该HSC不是克隆的，例如，在遗传上没有区别。该异源HSC群具有不同的表型，如本文进一步所讨论。分离具有特定表型的细胞(例如HSC)的适宜方法在本领域中是已知的，并且包括例如利用光学流式分选仪(例如，荧光活性细胞分选(FACS))的方法和利用非光学流式分选仪(例如，磁激活细胞分选)的方法。HSC表达的标记物HSC具有HSC的任一表型特征。在一些实施方案中，HSC对谱系标记物(即，Iin-)(的表达)为阴性。在一些情况下，HSC对下列的一种或多种(的表达)为阳性⑶34、⑶38、CD90、CD133、CD105、CD45和c_kit。在一些情况下，HSC为CD34+，在其它情况下，HSC为⑶45+。在其它方面，HSC为⑶34+和⑶45+。在某些实施方案中，一旦施用至患者，HSC的表型就发生变化。因此，在一些实施方案中，HSC为对标记物(例如，循环内皮祖细胞(CEP)标记物(在CEP上表达的标记物，例如⑶146、⑶133、⑶；34、⑶117、⑶31))的表达变成阳性的那些。HSC任选地为异源细胞群的一部分，其中该群中至少25%(例如，至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%)的细胞具有特定的表型。在本发明的一些实施方案中，HSC为异源细胞群的一部分，其中至少25%(例如，至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%)的细胞为⑶;34+HSC。在本发明的一些实施方案中，HSC为异源细胞群的一部分，其中至少25%(例如，至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%)的细胞为⑶45+HSC。在本发明的一些实施方案中，HSC异源细胞群的一部分，其中至少25%(例如，至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%)的细胞为HSC，其在施用至患者后变为⑶146+HSC。HSC的其它修饰步骤在一些方面中，HSC在分离和/或纯化后被进一步修饰。在一个替代性方案中，将细胞在体外培养，以用于扩增HSC群、将基因递送到HSC中、分化HSC，或使化合物(如治疗剂或诊断剂)与HSC缀合。实施这些其它步骤的方法是本领域所熟知的。参见例如Sambrook^,Mo1ecuIarCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,2001；Ogawa等，Blood81:2844-2853(1993)；美国专利7，144，731;Li等，FASEBJ15:586(2001)；Norol等，ExperimentalHematology35(4)653-661(2007)；Verhoeyen禾口Cosset,GeneTransfer:DeliveryandExpressionofDNAandRNA,Friedmann禾口Rossi编，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，2007。药物组合物本文中描述的HSC被任选地配制成组合物，如药物组合物。因此，本发明提供包含HSC和药学上可接受的载体的药物组合物。所述载体为任何常规使用的载体，并且其仅受化学-物理考虑因素(例如，溶解性和与活性化合物缺乏反应性)以及施用途径的限制。本文中描述的药学上可接受的载体，例如，媒介物、佐剂、赋形剂和稀释剂，对于本领域的技术人员是公知的，并且公众可易于获得。在一方面，药学上可接受的载体是对活性成分(例如造血干细胞)化学惰性的载体，以及在使用条件下没有不利副作用或毒性的载体。载体的选择部分由包含药物组合物的具体药剂，以及所用药物组合物的具体施用途径确定。因此，本发明的药物组合物存在多种适宜的制剂。施用途径在一些实施方案中，含HSC的药物组合物被配制用于肠胃外施用、皮下施用、静脉内施用、肌内施用、动脉内施用、鞘内施用或腹膜内施用。在其它实施方案中，药物组合物通过鼻内、喷雾剂、口服、气溶胶、直肠或阴道施用。施用HSC的方法在本领域中是已知的。参见，例如下列任一美国专利力423778、5550050、5662895、5800828、5800829、5811407、5833979、5834001、5834029、5853717、5855619,5906827,6008035,6012450,6049026,6083523,6206914,6303136,6306424,6322804,6352555,6368612,6479283,6514522,6534052,6541024,6551338,6551618,6569147,6579313,6599274,6607501,6630457,6648849,6659950,6692738,6699471,6736799,6752834,6758828,6787357,6790455,6805860,6852534,6863900,6875441,6881226,6884427,6884428,6886568,6918869,6933281,6933286,6949590,6960351,7011828、7031775、7033345、7033603、7049348、7070582、7074239、7097832、7097833、7135172、7145055、7157080、7166280、7176256、7244242、7452532、7470425和7494644。肠胃外在一些实施方案中，本文所述的药物组合物被配制为肠胃外施用。出于本发明的目的，肠胃外施用包括但不限于静脉内、动脉内、肌内、脑内、脑室内、心内、皮下、骨内、皮内、鞘内、腹膜内、膀胱内，和海绵体内注射或输注。适于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性的等渗无菌注射溶液(其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂，以及使得该制剂与目标受试者的血液等渗的溶质)、以及水性和非水性的无菌悬浮液(其可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂)。在多个方面，该药物组合物通过药物载体中的生理学上可接受的稀释剂施用，如无菌液体或液体的混合物，包括水、盐水、含水葡萄糖及相关的糖溶液、二醇如丙二醇或聚乙二醇、甘油、醚类、聚(乙二醇)400、油类、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯，或乙酰化脂肪酸甘油酯，添加或不添加药学上可接受的表面活性剂，如皂类(soap)或去污剂、悬浮剂如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素，或羧甲基纤维素，或乳化剂和其它药物佐剂。任选地用于肠胃外制剂的油类包括石油醚、动物油、植物油或合成的油类。油类的具体实例包括花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、凡士林油，和矿物油。用于肠胃外制剂的适宜的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是适宜的脂肪酸酯的实例。在一些实施方案中，肠胃外制剂包含防腐剂或缓冲剂。为了最小化或消除在注射部位处的刺激，此类组合物任选地包含一种或多种非离子型表面活性剂，其具有约12至约17的亲水亲油平衡值(HLB)。表面活性剂在此类制剂中的量通常在约5重量％至约15重量％的范围。适宜的表面活性剂包括聚乙二醇脱水山梨糖醇脂肪酸酯，如脱水山梨糖醇单油酸酯，以及通过环氧丙烷与丙二醇的缩合形成的环氧乙烷与疏水性碱的高分子量加合物。在多个方面中，肠胃外制剂存在于单剂量或多剂量密封容器(如安瓿和小瓶)中，并且可在冷冻-干燥(冻干)条件下储存，仅需在使用前立即添加无菌液体赋形剂，例如注射用水。在某些情况下，即用注射溶液和悬浮液由此前描述的无菌粉末、颗粒和片剂制备。注射制剂符合本发明。用于可注射组合物的有效药物载体的要求对于本领域的普通技术人员而目是公知白勺(参见例如PharmaceuticsandPharmacyPractice,J.B.LippincottCompany，Philadelphia，PA，Banker禾口Chalmers编，第238—250页(1982)，andASHPHandbookonInjectableDrugs，iToissel,第4版，第622-630页(1986))。细胞递送基质在一些实施方案中，HSC通过细胞递送基质施用。在某些实施方案中，细胞递送基质包含含有胶原、纤维蛋白、壳聚糖、MATRIGEL、聚乙二醇、葡聚糖(包括可化学交联的或可光致交联的葡聚糖)等的任一种或多种聚合物和水凝胶。在某些实施方案中，细胞递送基质包含下列的一种或多种胶原，包括收缩的和非收缩的胶原凝胶、水凝胶，包括但不限于纤维蛋白、藻酸盐、琼脂糖、明胶、透明质酸、聚乙二醇(PEG)、葡聚糖(包括适于可化学交联、可光致交联或两者的葡聚糖)、白蛋白、聚丙烯酰胺、聚羟基乙酸(polyglycolyicacid)、聚氯乙烯、聚乙烯醇、聚(正乙烯基-2-吡咯烷酮)、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、亲水性聚氨酯、丙烯酸衍生物、普郎尼克如聚氧化丙烯和聚氧化乙烯共聚物、35/65聚(ε-己内酯)(PCL)/聚(羟基乙酸)(PGA)、Panacryl生物可吸收的构建体、Vicryl羟乙基乳酸聚酯910、自组装肽，以及不可吸收的材料如含氟聚合物(例如，Teflon含氟聚合物)、塑料，和金属。在一些情况下，基质包含不可降解的材料，例如但不限于膨体聚四氟乙烯(ePTFE)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚对苯二甲酸丁二酯(PBT)、聚氨酯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、硅酮等，或选择性可降解材料，如聚(乳酸-乙醇酸共聚物；PLGA)、PLA或PGA。(还参见，Middleton等，Biomaterials21:23352346,2000；Middleton等，MedicalPlasticsandBiomaterials,1998年3月/4月，第3037页；HandbookofBiodegradablePolymers,Domb,Kost,andDomb编，1997,HarwoodAcademicPublishers,Australia；Rogalla,Minim.InvasiveSurg.Nurs.11:6769,1997；Klein,FacialPlast.Surg.Clin.NorthAmer.9:20518,2001；Klein等，J.Dermatol.Surg.Oncol.11:33739，1985；Frey等，J.Urol.154:81215，1995；Peters等，J.Biomed.Mater.Res.43:42227,1998；和Kuijpers等，J.Biomed.Mater.Res.51:13645，2000)。在一些实施方案中，基质包括生物相容性支架、格栅、自组装结构等，无论是否可生物吸收，是液体、凝胶或固体。此类基质在治疗性细胞治疗、外科手术修复、组织工程和伤口愈合领域中是已知的。在某些方面中，将基质用HSC预处理。在其它实施方案中，基质分布有与该基质或其空间紧密缔合的HSC细胞。HSC可黏附至基质或可被捕集或包含于基质空间内。在某些方面，当基质-HSC复合物中与基质紧密缔合的细胞正在生长，并且当用于治疗时，所述复合物刺激并支持患者自身肾脏细胞的生长、修复和/或再生，并同样刺激或支持适当的血管形成。基质-细胞组合物可以本领域中已知的任何的方式引入至患者体内，包括但不限于植入、注射、手术附着、与其它组织一起移植等。在一些实施方案中，基质在体内形成，或甚至更优选在原位形成，例如可原位聚合的凝胶可用于本发明。此类凝胶的实例在本领域中是已知的。在一些实施方案中，将HSC接种在三维构架或基质上，如支架、泡沫或水凝胶，并经此施用。在某些方面，构架被构造成各种形状，如基本上扁平的、基本上圆柱状的或管状的，或者可为完全自由的形状，正如所考虑的校正结构可能要求或需要的。在某些方面，当需要时，将两个或多个基本上扁平的构架放置在另一个顶上并固定在一起，以产生多层构^KO可用于本发明此方面的基质的实例(例如支架)包括垫子(纺织的、编织的，且更优选无纺的)多孔的或半多孔的泡沫、自组装肽等。无纺垫子可(例如)利用由天然或合成聚合物构成的纤维所形成。在一些实施方案中，将以商标名VICRYL出售^thicon，Inc.，Somerville,N.J.)的可吸收的羟基乙酸和乳酸的共聚物(PGA/PLA)用于形成基质。如在第6，355，699号美国专利中讨论，通过如冷冻-干燥或冻干加工形成的例如由聚(ε-己内酯)/聚(羟基乙酸)(PCL/PGA)共聚物构成的泡沫也可用作支架。凝胶也形成本文使用的适宜的基质。实例包括可原位聚合的凝胶和例如由自组装肽构成的水凝胶。在一些方面，这些材料用作组织生长的支持物。原位形成的可降解网络构造也适用于本发明(参见例如Anseth，K.S.等，2002，J.ControlledRelease78:199-209；Wang,D.等，2003，Biomaterials24:3969-3980；He等的美国专利公开2002/002洸76)。在一些方面，将这些材料配制为适于注射的流体，然后通过多种方法(例如，温度、PH变化、光暴露)进行诱导，以原位或在体内形成可降解水凝胶网络。在一些实施方案中，构架为毡(felt)，其可由生物可吸收材料(例如PGA、PLA、PCL共聚物或共混物，或透明质酸)所制成的多纤维纱线。在某些方面，利用由卷边、切削、梳理和针织组成的标准纺织加工技术将纱线制成毡。在某些方面，将HSC接种至可为复合材料结构的泡沫支架上。此外，在一些方面，将三维构架模制成有用的形状，如待修复、替换或扩张的肾脏中或其周围的特定结构。可在接种HSC之前对构架进行处理以增强细胞附着。例如，在使用HSC接种前，尼龙基质用0.IM乙酸处理，并在聚赖氨酸、PBS和/或胶原蛋白中温育以涂覆尼龙。在一些方面，使用硫酸对聚苯乙烯进行类似处理。在其它实施方案中，对三维构架的外表面进行改性以增强细胞的附着或生长和组织分化，如通过等离子涂布构架或添加一种或多种蛋白(例如，胶原蛋白、弹性纤维、网状纤维)、糖蛋白、糖胺聚糖(例如，硫酸肝素、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素)、细胞基质和/或其它材料，例如但不限于明胶、藻酸盐、琼脂、琼脂糖和植物胶寸。在一些实施方案中，支架包含使其不形成血栓的材料。在某些实施方案中，这些材料促进并支持内皮生长、迁移和胞外基质沉积。此类材料的实例包括但不限于天然材料如基膜蛋白如层粘连蛋白和IV型胶原、合成材料如ePTFE和嵌段聚氨酯脲硅酮，如PURSPAN(ThePolymerTechnologyGroup,Inc.,Berkeley,Calif.)。这些材料可被进一步处理以使得支架不形成血栓。此类处理包括抗血栓药如肝素，和改变材料的表面电荷的处理如等离子涂布。在某些实施方案中，包含HSC的药物组合物包含细胞递送基质的任何组分成分，包括本文所述的任何组分。剂量出于本发明的目的，施用的药物组合物的量或剂量足以在合理的时间框架内在受试者或动物中实现例如治疗性响应或预防性响应。例如，药物组合物的剂量足以在从施用时间起约1至4天或更长的时期内，例如，5天、6天、1周、10天、2周、16至20天或更长时间内，治疗或预防肾脏缺血再灌注损伤。在某些实施方案中，时间段甚至更长。剂量通过具体药物组合物的效力和动物(例如，人)的状况以及要治疗的动物(例如，人)的体重所确定。用于确定施用剂量的许多测定方法在本领域中是已知的。在一些实施方案中，使用测定方法来确定向哺乳动物施用的起始剂量，所述测定方法包括在一组各施用不同剂量HSC的哺乳动物中，在向哺乳动物施用给定剂量的HSC时比较HSC定位至受损肾脏的程度。在施用一定剂量时，HSC定位至受损肾脏的程度可通过本领域中已知的方法测试，例如，本文所述的方法。此外或可选择地，使用测定方法来确定向哺乳动物施用的起始剂量，所述测定方法包括比较特定剂量的HSC在肾脏损伤后造成的肾小管周围毛细血管损失的减少程度、肾小管上皮细胞的再生程度、长期纤维化的预防程度、死亡率的减少程度，或肾功能的改善程度。此类测试描述于本文实施例中。药物组合物的剂量还将由可能伴随施用具体药物组合物的任何副作用的存在、性质和程度来确定。典型地，主治医师将考虑各种因素(例如年龄、体重、总体健康状况、饮食、性别、要施用的药物组合物的治疗剂、施用途径和所治疗医学状况的严重程度)来确定用于治疗每个个体患者的药物组合物的剂量。通过举例但非对本发明构成限制，药物组合物的剂量可为使得至少约0.5X106(例如，至少约IXlO6U.5Χ106、2Χ106、2·5XIO6,3.OXIO6,5.OXlO6UO7UO8)个HSC被施用至患者。施用时机在所提供的方法中，将HSC在肾脏损伤的某一时间点施用至患者。在本发明的某些实施方案中，延迟施用HSC；即，在肾脏损伤后并不立即施用HSC(例如，在损伤后约30分钟之前、约1小时之前、约2小时之前、约3小时之前、约4小时之前、约5小时之前、约6小时之前、约7小时之前、约8小时之前、约9小时之前、约10小时之前、约11小时之前，或约12小时之前不施用)。在本发明的一些方面中，在肾脏损伤的修复期开始时向患者施用HSC。本文使用的术语“肾脏损伤修复期”是指损伤后观察到肾再生响应的时间，该响应表示为例如细胞已被破坏后存在的肾单位的再生、具有嗜碱性、扁平鳞状细胞的肾小管的内衬(lining)、肾小管细胞的正常形态的恢复、上皮细胞再分化、运动、增殖或再分化、肾单元整体功能的恢复、肾功能的恢复。哺乳动物中的肾的修复期已经过充分论述。参见例如Reimschuessel，ILARJ42=285-291(2001)0在一些实施方案中，HSC在损伤后至少约12小时(例如，至少约14小时、至少约16小时、至少约18小时、至少约20小时、至少约21小时、至少约22小时、至少约23小时、至少约M小时、至少约25小时、至少约沈小时、至少约28小时、至少约30小时、至少约32小时、至少约32小时、至少约34小时、至少约36小时、至少约38小时、至少约40小时、至少约42小时、至少约44小时、至少约46小时、至少约48小时、至少约50小时、至少约52小时、至少约M小时、至少约56小时、至少约58小时、至少约60小时、至少约62小时、至少约64小时、至少约66小时、至少约68小时、至少约70小时、至少约72小时)施用。在其它实施方案中，在如上所述的时间点且在损伤后约14天前(例如，约13天前、约12天前、约11天前、约10天前、约9天前、约8天前、约7天前、约6天前、约5天前、约4天前、约3天前)向患者施用HSC。在一些实施方案中，在损伤后约M小时，或其后某段时间，但在损伤后约14天前向患者施用HSC。在一些方面，在损伤后X时间后且在损伤后Y前施用HSC，其中X选自约20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、40小时、48小时、52小时、58小时、64小时、72小时、3.5天、4天、5天、6天、1周、8天、9天、10天，其中Y选自16天、15天、14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、1周，其中X小于Y。在本发明的一些方面中，在损伤后约20、21、22、23、24小时施用HSC0在本发明的一些实施方案中，HSC向患者施用一次以上。HSC可每天一次、每天两次、每天三次、每天四次、每周一次、每2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13或14天一次或每月一次施用。在一些实施方案中，在损伤后在损伤后约M小时(例如，在M小时)后施用HSC，且在损伤后约48小时(例如，在48小时)后再次施用。控释制剂在某些方面中，药物组合物被改良成储库形式，从而使得该药物组合物释放至要施用的身体的方式在时间和体内位点方面受到控制(参见例如美国专利No.4，450，150)。在多个方面中，储库形式为可植入的组合物，其包含治疗性或活性药剂和多孔或无孔材料，如聚合物，其中HSC被材料包封或扩散在整个材料，和/或降解无孔材料。然后将储库植入到体内的所需位置，并且HSC以预定速率从植入体释放。因此，在某些方面中，药物组合物被改良成具有任何类型的体内释放特征。在本发明的一些方面中，药物组合物为立即释放、控制释放、持续释放、延长释放、延迟释放或两相性释放制剂。缀合物在本发明的一些实施方案中，HSC附着或连接到第二部分，例如治疗剂或诊断剂。这些实施方案的HSC作为靶向剂，因为HSC能够特异性定位于受损的肾脏组织。因此，本发明一方面提供包含附着至治疗剂或诊断剂的HSC的组合物。用于本文目的的适宜的治疗剂和诊断剂在本领域中是已知的，并且包括但不限于任何本文中所提及的药剂。组合在一些实施方案中，本文所述的药物组合物(包含缀合物)单独施用。在其它实施方案中，药物组合物(包含缀合物)与其它治疗剂或诊断制剂组合施用。在一些实施方案中，药物组合物与已知用于治疗肾脏疾病或肾脏医学状况的其它治疗剂一起施用，包括例如细胞因子或生长因子、抗炎剂、TLR2抑制剂、ATF3基因或基因产物，和盐皮质激素受体阻断剂(例如，螺甾内酯)、溶血磷脂酸、2-甲基氨基色满O-methylaminochroman)(例如，U83836E)、21-氨基类固醇(21-aminosteroid)(例如，lazoroid(U74389F))、三甲氧苄嗪、血管紧张肽转化酶(ACE)抑制剂或血管紧张肽受体阻断剂(ARB)，和苏拉明(suramin)。在一些实施方案中，HSC与其它治疗剂一起施用，包括但不限于抗血栓形成剂、抗细胞凋亡剂、抗炎剂、免疫抑制剂(例如，环孢霉素、雷帕霉素)、抗氧化剂，或本领域中通常使用的治疗肾脏损伤或疾病的其它药剂，如伊罗地塞和雷公藤内酯、HMG-CoA还原酶抑制剂(例如，辛伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀、氟伐他汀、西立伐他汀和阿伐他汀)、细胞裂解物、可溶性细胞级分、膜富集细胞级分(membrane-enrichedcellfractions)、细胞培养基(例如，条件培养基)，或胞外基质营养因子(例如，肝细胞生长因子(HGF)、成骨蛋白-7(BMP-7)、β-转化生长因子(TGF-β)、基质金属蛋白酶_2(ΜΜΡ-2)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。患者类型对于本文所述的本发明方法，该患者为任何宿主。在一些实施方案中，宿主为哺乳动物。如在本文中所用的术语"哺乳动物"指任何哺乳纲类的脊椎动物，包括但不限于任一单孔类、有袋类和胎盘类动物。在一些实施方案中，哺乳动物为啮齿目类哺乳动物，例如小鼠和仓鼠，和兔形目哺乳动物(例如家兔)之一。在某些实施方案中，哺乳动物来自食肉目动物，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。在某些实施方案中，哺乳动物来自于偶蹄目，包括牛科动物(奶牛)和猪科动物(猪)或奇蹄目，包括马科动物(马)。在一些情况下，哺乳动物为灵长目、Ceboids或Simoids(猴)或类人猿亚目(人和猿类)。在特定实施方案中，哺乳动物为人。给出下列实施例仅仅是为了说明本发明，而不以任何方式限制其范围。实施例实施例1下列材料和方法用于实施例2-7。动物使用8-10周龄的免疫缺陷非肥胖型糖尿病(N0D/SCID)雄性小鼠(NOD.CB17-Prkdcscid/J)(JacksonLaboratories,BarHarbor,ME)注意这些小鼠未患糖尿病，但是缺少功能性T细胞和B细胞。所有小鼠均在滤盖笼中饲养，且接受已消毒的食物和酸化水°所有实验方案由HarvardCenterforAnimalResearchandComparativeMedicine批准。人外周血⑶34+细胞纯化和追踪人外周血CD34+干细胞选自获自正常健康成人供体的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员的血浆分离置换产物(目录号mPB(^6，AllCells,Berkeley,CA)。简言之，将G-CSF(10μg/kg/天)施用至供体连续5天以将CD34+细胞从骨髓动员至外周循环。在第5天和第6天对供体进行血浆分离置换以收集经动员的外周血单核细胞。利用ISOLEX300iMagneticCellPositiveSelectionSystem(片反本2.5，BaxterHealthcare，Deerfield,IL,USA)，根据仪器用户手册提供的方案使⑶34+细胞从血浆分离置换产物中高度富集。纯化的细胞通过流式细胞术表征(见下)。富集的所选细胞在25°C保持于RPMI(含0.5%人血清白蛋白)中，并在48小时内使用。为了测试活力，2X105个细胞的等分样品使用7-AAD(20μg/ml，20min,4°C，于100μ1PBS中)标记，使用FACS缓冲液(PBS/5%BSA)洗涤，然后通过流式细胞术分析。在一些实验中，为了追踪全身施用后的HSC，将人⑶34+细胞使用绿色荧光示踪剂5-氯甲基二乙酸萤光素(CMFDA，Invitrogen)标记，使用1μg/107个细胞，在25°C于IOml的RPMI中30分钟。将过量的CMFDA在离心Q50Xg5分钟)后通过再悬浮于IOml5%BSA(超纯)(Sigma)的RPMI(Invitrogen)而淬灭。再次离心后，将细胞再悬浮于1%BSA/RPMI(12.5XIO6个/ml)。CMFDA标记并未使活力产生任何变化(利用7-AAD检测(未示出))。动物模型根据先前描述的方法改良肾脏的缺血-再灌注损伤[1]。简言之，在第0天，麻醉的雄性小鼠(8-10周龄)的肾通过手术切开侧腹而暴露，并且在36.8-37.3°C的体中心温度下，将手术钳置于一个肾或两个肾的肾动脉和静脉上。确认肾脏变得暗黑，然后置于腹膜后腔27分钟(单侧模型)或25分钟(双侧模型)。撤去手术钳，目测确认向肾再灌注，并封闭伤口。为了测试人HSC的效果，将这些具有单侧IRI肾脏损伤的小鼠分为两组。在治疗组(n=6-10/组)中，肾脏损伤后的第1天和第2天，将200μ1的细胞悬浮液(含2.5XIO6个人⑶34+细胞，使用CMFDA标记)通过尾部静脉静脉内输注。在对照组中，仅给予小鼠媒介物。在肾IRI第3、5、7、14和观天处死小鼠。肾功能为了评价肾功能，将具有两侧IRI肾脏损伤的小鼠(do)随机分成两组。治疗组(η=10)，在第1天和第2天，通过尾部静脉静脉内输注接受2.5ΧIO6个人HSC。对照组(η=16)仅接受媒介物。分析血样中的血浆肌酸酐，血样是利用先前描述的方法在损伤后第1、2、5、7、14和28天取自尾部静脉[1]。损伤和修复的组织制备，免疫染色，成像和定量对小鼠灌注冰冷的PBS，然后将器官在高碘酸盐-赖氨酸多聚甲醛(PLP)溶液中固定2小时，然后用18%蔗糖固定16小时，然后保持于最佳切割温度(OCT)培养基(用于冷冻组织的包埋培养基，以确保最佳切割温度和以在低温恒温器上切片前包埋组织)(-SO0C)[2]，或将用于光学显微镜检查的组织在10%中性-缓冲的福尔马林中固定12小时，转移至70%乙醇中，然后加工用于石蜡切片(3mm)和切片，并使用过碘酸-希夫(PAS)或天狼猩红2染色。免疫荧光法标记在5mm冰冻切片上进行。为了检测在肾脏、脾和心脏中输注的人细胞，使用抗人白细胞抗原但对小鼠抗原没有交叉反应的抗体或CMFDA的荧光(直到第7天)。下列抗体用于其它地方描述的方法[1，2]抗-I型人白细胞抗原(HLA)-ABC(FITC，1200，eBioscience)、抗-人CD45(FITC，1200，eBioscience)、大鼠-抗-人CD45(1200，Abeam)、抗-人CD68(FITC，1200，eBioscience)、抗-人CD3(FITC，1200，eBioscience)、抗-人CD31(FITC，1200，eBioscience)、兔-抗-人vWF(l200，Abeam)、抗-人CD146(FITC，1100，Abeam)、生物素-抗-人CD133(1100，Miltenyi)、兔-抗-人-CD133(1100，CellSignaling)、山羊-抗-人KDR(1100，R&DSystems)和兔-抗-人KDR(1100，NeoMarkers)，接着为兔-抗FITCd200Jnvitrogen)、抗-大鼠Cy3或抗-兔Cy3或抗-山羊Cy3(l400,JacksonImmunosresearch)或抗—亲禾口素Cy3(1；3000,JacksonImmunosresearch)。为了标i己小鼠血管系统，使用大鼠-抗-小鼠⑶31(1200，eBioscience)，其对人抗原没有交叉反应，接着为抗-大鼠Cy3(l400，JacksonImmunosresearch)。将切片使用多聚甲醛(PFA)固定后(post-fixed)，然后使用DAPI固定于Vectashield。肾小管周毛细血管损失和肾小管损伤分别通过评价抗-CD31-Cy3标记的肾脏切片或PAS染色的石蜡切片，利用如前所报道的盲法评分来确定[3]。简言之，图像通过通过在整个矢状断面(包括皮质和外髓部)连续数字成像(X200)捕捉(10-20图像)。将每一图像分为252正方形格子。为了计算肾小管周毛细血管损失，每一正方形(没有肾小管周毛细血管)评为正分；最终的评分表示为正分的百分比。为了评估肾小管损伤，每一正方形(存在的肾小管损伤(肾小管压扁、坏死、凋亡或出现脱落))评为正分。最终的评分为每一图像中具有正分的正方形的百分比，其为来自单个肾脏的所有图像的平均值。表观图像使NikonTE2000显微镜，CoolSnap照相机(RoperScientific，Germany)，且利用IP实验室软件(BDBiosciences,SanJose,CA)处理。共聚焦图像利用NikonCID-Eclipse共聚焦显微镜生成。投影图像由在0.1mm步长时获得的IOZ-堆叠图像而生成。为了使得能够在切片之间进行比较，包含的共聚焦设置在切片之间保持恒定。流式细胞术分析和分选Isolex-富集的⑶34细胞利用下列人抗体组合，利用先前描述的方法进行分析抗-CD31-FITC(1100，BD)、抗_CD146_PE(1100，BD)、抗-KDR-FITC(1100，R&DSystems)、抗-CD45-FITC(1100，BD)、抗-CD140b_AlexaFluor488(1100，BD)、抗-CD29-PE(1100，BD)、抗-CD105-FITC(1100，R&DSystems)、抗-CD34-PE(1100，BD)、抗-CD99-FITC(1100，BD)、抗_CD144_PE(1100，R&DSystems)、抗-CD38-FITC(1100，BD)、抗-CD14-FITC(1100，BD)、抗-CD64-PE(1100，BD)、抗-CD6l-PerCP(l100，BD)、抗_CD133_APC(1100，Miltenyi)、抗-C)(CR4-APC(1100，BD)、抗-CD90-APC(1100，BD)、抗_CD117_APC(1100，BD)、抗-VEGFR1_APC(1100，R&DSystems)[1]0HSC的完全表征将在其它文献中论述(D.Μ.&A.C.未出版)。单细胞由肾脏、脾和骨髓如先前描述的那样制备[2]。简言之，将来自于肾脏、脾和骨髓的单细胞(IXlO5个)再悬浮于FACS缓冲液中，并使用抗人CD45(FITC，1200，eBioscience)和小鼠CDllb(PE，l200,eBioscience)的抗体培养30分钟。使用FACS洗涤缓冲液洗涤且再悬浮于200μ1FACS缓冲液后，利用BDFACSCalibur流式细胞仪进行分析细胞。将使用CMFDA标记的人HSC在注射后第2天通过FACS分选法利用FACSaria直接进行分选[2]。将自肾脏分选的CMFDA+细胞立即溶解，并利用RNAEasy(Qiagen)系统纯化RNA，以用于实时PCR。实时PCR利用试剂盒(RNAEasyQiagen)，按照制造商的说明由组织和细胞产生总RNA。纯度通过A260至A280确定。利用Kcript和引物(包含无规六聚物和聚去氧胸苷核苷酸)由1μg总RNA合成cDNA[2]。人和小鼠样本的实时PCR利用ABI7900HT序列检测系统(PerkinElmerLifeSciences,Boston,AppliedBioSystems,FosterCity,CA)在SYBR-Green(SYBRGreenPCRkit；Qiagen)的存在下，利用先前描述的方法进行W]。特异性人GAPDH、HPRT1、血管生成素I(ANGPTl)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子1(IGFl)、白介素-8(IL8)、血小板源性生长因子b(PDGFb)、转化生长因子b1(TGFb1)、血管内皮生长因子(VEGF)、TIEl的引物/探针集来源于Sabiosciences。等量的cDNA用于RT-PCR反应，并与即用反应混合物(Sabiosciences)混合。所有的反应一式三份进行。实时PCR的优化按照制造商的说明进行。为了确定标准曲线，使用所有样本集，这些样本以四步log2连续稀释，并对样本进行同时操作。各反应的总体积为20μ1，含有300ηΜ正向引物和300ηΜ反向引物和125ng的cDNA。对于各个反应进行适当的负对照。统计分析所有的值以平均值士标准偏差(SD)给出。使用Mantel-CoxLog-rank测试分析存活率。两组之间的比较通过未配对t-检验(双尾)进行。将配对t-检验用于直接比较动物或患病小鼠与假手术小鼠的左aRI)和右(对照)肾。认为小于0.05的P值在所有的统计检验中是显著的。实施例2Isolex-纯化的G-Csf-动员的造血干细胞的表征对来自造血肝细胞-动员的人供体⑶34+富集的白细胞分析活力和纯度。经7-AAD排除99%以上的HSC存活(未示出)。96%以上的白细胞为⑶45+、⑶34+，表明它们为造血干细胞(HSC)(参见表1)。少数表达⑶34，而非⑶45。利用细胞表面标记物⑶14、⑶34、⑶146、⑶133、⑶31、VEGFR2对富集的白细胞进行进一步表征，用于多向分化潜能的确证和假定内皮祖细胞的鉴定(参见表幻[19]。所述表征表明，除了HSC外，动员的人外周血CD34+细胞含有少量的循环内皮祖细胞(CEP)和极少数的循环内皮细胞(CEC)。表权利要求1.一种治疗患者的肾脏损伤的方法，所述方法包括在损伤后至少约20小时且在损伤后约14天之前向所述患者施用一定量的造血干细胞(HSC)，其中所述量可有效治疗所述患者的肾脏损伤。2.一种预防患有肾脏损伤的患者的肾脏疾病或肾脏医学状况的方法，所述方法包括在损伤后至少约20小时且在损伤后约14天之前向所述患者施用一定量的造血干细胞(HSC)，其中所述量可有效预防所述患者的肾脏疾病或肾脏医学状况。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述肾脏疾病或肾脏医学状况选自急性肾衰竭、慢性肾病和间质性纤维化。4.一种提高患有肾脏损伤的患者的存活率的方法，所述方法包括在损伤后至少约20小时且在损伤后约14天之前，向所述患者施用一定量的造血干细胞(HSC)，其中所述量可有效提高所述患者的存活率。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述肾脏损伤造成所述患者肾脏中的肾小管周毛细血管损失。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述急性肾脏损伤由患者中的下列一种或多种造成缺血、毒素、血管紧张肽转化酶抑制剂(ACEI)或血管紧张肽II受体阻断剂的使用、输血反应、对肌肉的损伤或创伤、手术、休克和低血压。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述肾脏损伤为肾脏缺血再灌注损伤。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述HSC在损伤后至少约20小时且在损伤后约7天之前施用。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述HSC在损伤后至少22小时且在损伤后约4天之前施用。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述HSC在损伤后约M小时施用。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括第二次施用HSC。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述HSC的第二次施用是在所述第一次施用之后至少约12小时施用。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述HSC的第二次施用是在所述第一次施用后至少约M小时施用。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HSC为其中至少30%的细胞为⑶34+HSC的细胞群的一部分。15.根据权利要求14所述的方法，其中至少50%的细胞为⑶34+HSC。16.根据权利要求15所述的方法，其中至少75%的细胞为⑶34+HSC。17.根据权利要求16所述的方法，其中75%以上的细胞为⑶34+HSC。18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HSC为分离自供体外周血的经动员的骨髓细胞。19.根据权利要求18的所述方法，其中所述供体为所述患者，并且所述HSC对于所述患者为自体同源的。20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中将至少2.5XIO6个HSC施用至所述^^ο21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HSC为肠胃外施用。22.—种药物组合物，其包含HSC群和药物载体。23.根据权利要求22所述的药物组合物，其配制用于肠胃外施用。24.根据权利要求22或23所述的药物组合物，其中将所述HSC与用于肾脏缺血再灌注损伤的治疗剂缀合。25.根据权利要求22-24中任一项所述的药物组合物，还包含用于治疗肾脏疾病或肾脏医学状况的治疗剂。26.根据权利要求25所述的药物组合物，其中所述治疗剂选自TLR2抑制剂、ATF3基因或基因产物、盐皮质激素受体阻断剂、溶血磷脂酸、2-甲基氨基色满、21-氨基类固醇、三甲氧苄嗪，和苏拉明。全文摘要本发明提供了治疗患者的肾脏损伤的方法，所述方法包括以有效治疗肾脏损伤的量向患者施用造血干细胞(HSC)。在一些实施方案中，延迟施用HSC，即肾脏损伤之后并不立即施用HSC。在某些方面，在肾脏修复期开始期间向患者施用HSC。本文描述了本发明的其它实施方案和方面，包括有关方法和用于其中的组合物。文档编号A61K35/14GK102573860SQ201080044549公开日2012年7月11日申请日期2010年9月30日优先权日2009年10月2日发明者凯瑟琳·M·霍夫,德拉拉·莫缇拉,戴维·L·埃姆拉尼,杰里米·杜菲尔德,艾米·科亨申请人:巴克斯特医疗保健股份有限公司,巴克斯特国际公司