治疗方法和组合物的制作方法

专利名称：治疗方法和组合物的制作方法
技术领域：
本申请属于癌症、肿瘤和纤维变性疾病的领域。
背景技术：
肿瘤发生的广泛临床证据和小鼠模型支持微环境在促进肿瘤生长和转移中的关键作用。已显示通过肿瘤细胞募集和激活成纤维细胞、血管细胞和炎症细胞可促进转移潜能并能影响治疗结果。胰腺、乳腺、前列腺、结肠、肺和子宫的上皮性恶性肿瘤通常包含由肿瘤相关成纤维细胞(TAF)和积聚的胞外基质(matrix)构成的促结缔组织增生间质(stroma)，其与预后较差相关联。认为这些TAF部分通过刺激肿瘤血管生成而有助于肿瘤发生。TAF表现出肌成纤维细胞的平滑肌样收缩特性，这在引起纤维化的器官病理重构中起到重要作用。近期研究提供了改变微环境的因素在疾病进展中作用的进一步证据，表明胞外基质机械张力的改变可导致细胞形态、信号途径活化、组织重塑和病理的显著变化。这些发现凸显出新治疗策略能用于肿瘤学和纤维化，靶向那些调节胞外基质组成和机械性质的蛋白。赖氨酰氧化酶型酶(L0X/L)包括5种酶组成的家族，这些酶共有保守性C末端酶结构域与多样性N末端。L0X/L是含铜的酶，其催化特定赖氨酸残基中e氨基的氧化脱氨作用以促进蛋白共价交联，如促结缔组织生成间质主要成分胶原纤维I的共价交联。有证据显示某些L0X/L在肿瘤和纤维化疾病的起始和进展中起作用，并已表明赖氨酰氧化酶(LOX)在转移的发展和转移生境(metastatic niche)形成中起作用。参见例如，名为 “Methods and compositions for treatment and diagnosis of fibrosis, tumorinvasion, angiogenesis & metastasis (治疗和诊断纤维化、肿瘤侵袭、血管生成和转移的方法和组合物)”的共有美国专利申请公开号US2009/0104201 (2009年4月23日)，其通过引用全文纳入本文用于描述赖氨酰氧化酶型酶的不同生物学方面的目的。赖氨酰氧化酶样2(L0XL2)mRNA在许多不同的实体肿瘤和肿瘤细胞系中高表达。据报道，L0XL2在由L0XL2表达型癌细胞形成的乳腺肿瘤和胶质瘤中增强胶原体内积聚和沉积。先前已描述乳腺和食管癌、以及鳞状癌中的L0XL2蛋白的表达，主要是胞内定位，而近期报道支持分泌的L0XL2在促进胃癌中肿瘤细胞侵袭方面的作用。也已把L0XL2水平增加与退行性和纤维化疾病相关联，例如在威尔逊氏病或原发性胆汁性肝硬化患者的肝细胞和肾小管间质纤维化中。发明概沭本文中，发明者鉴定了 L0XL2在(I)产生肿瘤微环境和(2)成纤维细胞激活中的作用。由此，本文提供了减少肿瘤和纤维化疾病中结缔组织形成和成纤维细胞激活的方 法和组合物，包括但不限于以下实施方式I. 一种抑制肿瘤环境中成纤维细胞激活的方法，所述方法包括抑制赖氨酰氧化酶样2(L0XL2)的活性。2.如实施方式I所述的方法，其中所述成纤维细胞激活由转化生长因子-P (TGF-P)信号来介导。3.如实施方式I所述的方法，其中L0XL2活性的抑制导致胞外基质解体。4.如实施方式3所述的方法，其中胞外基质的解体导致肿瘤间质中细胞的细胞骨架破裂。5.如实施方式I所述的方法，其中所述成纤维细胞是肿瘤相关成纤维细胞(TAF)。6.如实施方式I所述的方法，其中所述成纤维细胞是肌成纤维细胞。7. 一种抑制肿瘤环境中结缔组织形成的方法，所述方法包括抑制赖氨酰氧化酶样2 (L0XL2)的活性。8.如实施方式7所述的方法，其中所述肿瘤是转移性肿瘤。9. 一种抑制肿瘤环境中血管发生的方法，所述方法包括抑制赖氨酰氧化酶样2 (L0XL2)的活性。10.如实施方式9所述的方法，其中所述血管发生包括将血管细胞或血管细胞祖细胞募集到肿瘤环境。11.如实施方式9所述的方法，其中所述血管发生包括血管分支。12.如实施方式9所述的方法，其中所述血管发生包括血管长度增加。13.如实施方式9所述的方法，其中所述血管发生包括血管数量增加。14. 一种减少肿瘤间质中肿瘤相关成纤维细胞(TAF)数量的方法，所述方法包括抑制赖氨酰氧化酶样2 (L0XL2)的活性。15. 一种抑制肿瘤环境中胶原沉积的方法，所述方法包括抑制赖氨酰氧化酶样
2(L0XL2)的活性。16. 一种调节肿瘤环境的方法，所述方法包括抑制赖氨酰氧化酶样2 (L0XL2)的活性。17.如实施方式16所述的方法，其中所述调节包括结缔组织形成减少。18.如实施方式16所述的方法，其中所述调节包括肿瘤相关成纤维细胞(TAF)数量减少。19.如实施方式16所述的方法，其中所述调节包括肌成纤维细胞数量减少。20.如实施方式16所述的方法，其中所述调节包括重构细胞的细胞骨架。21.如实施方式20所述的方法，其中所述细胞是肿瘤细胞。22.如实施方式20所述的方法，其中所述细胞是成纤维细胞。23.如实施方式20所述的方法，其中所述细胞是内皮细胞。24.如实施方式16所述的方法，其中所述调节包括肿瘤脉管系统减少。25.如实施方式16所述的方法，其中所述调节包括胶原生成减少。26.如实施方式16所述的方法，其中所述调节包括成纤维细胞激活减少。27.如实施方式16所述的方法，其中所述调节包括抑制成纤维细胞募集到肿瘤环境中。28.如实施方式16所述的方法，其中所述调节包括编码间质组分的基因表达降低。29.如实施方式28所述的方法，其中所述间质组分选自下组a平滑肌肌动蛋白、I型胶原、波形蛋白、基质金属蛋白酶9和纤连蛋白。30. 一种调节肿瘤环境中生长因子生成的方法，所述方法包括抑制赖氨酰氧化酶样2(L0XL2)的活性。31.如实施方式30所述的方法，其中所述生长因子选自下组血管内皮生长因子(VEGF)和间质细胞衍生因子-I (SDF-I)。32. 一种提高肿瘤中坏死的方法，所述方法包括抑制赖氨酰氧化酶样2 (L0XL2)的活性。33. 一种提高肿瘤中固缩的方法，所述方法包括抑制赖氨酰氧化酶样2 (L0XL2)的活性。34.如实施方式1、7、9、14、15、16、30、32或33中任一项所述的方法，其中所述L0XL2的活性用抗L0XL2抗体抑制。35.如实施方式34所述的方法，其中所述抗体包括SEQ ID NO :1所列的重链序列和SEQ ID NO 2所列的轻链序列。36.如实施方式34所述的方法，其中所述抗体是人源化抗体。37.如实施方式36所述的方法，其中所述抗体包括SEQ ID NO 3所列的重链序列和SEQ ID NO: 4所列的轻链序列。38.如实施方式1、7、9、14、15、16、30、32或33中任一项所述的方法，其中所述L0XL2的活性用核酸抑制。39.如实施方式38所述的方法，其中所述核酸是siRNA。40. 一种鉴定L0XL2抑制剂的方法，所述方法包括分析测试分子调节肿瘤环境的能力。 41.如实施方式40所述的方法，其中所述调节包括结缔组织形成减少。42.如实施方式40所述的方法，其中所述调节包括肿瘤相关成纤维细胞(TAF)数量减少。43.如实施方式40所述的方法，其中所述调节包括肌成纤维细胞数量减少。
44.如实施方式40所述的方法，其中所述调节包括重构细胞的细胞骨架。45.如实施方式44所述的方法，其中所述细胞是肿瘤细胞。46.如实施方式44所述的方法，其中所述细胞是成纤维细胞。47.如实施方式44所述的方法，其中所述细胞是内皮细胞。48.如实施方式40所述的方法，其中调节包括肿瘤脉管系统减少。49.如实施方式48所述的方法，其中肿瘤脉管系统减少由⑶31和/或血管内皮生长因子(VEGF)的水平降低证明。50.如实施方式40所述的方法，其中所述调节包括胶原生成减少和/或胶原交联 程度降低。51.如实施方式40所述的方法，其中所述调节包括成纤维细胞激活减少。52.如实施方式40所述的方法，其中所述调节包括抑制成纤维细胞募集到肿瘤环境中。53.如实施方式40所述的方法，其中所述调节包括编码间质组分的基因表达降低。54.如实施方式53所述的方法，其中所述间质组分选自下组a平滑肌肌动蛋白、I型胶原、波形蛋白、基质金属蛋白酶9和纤连蛋白。55.如实施方式40所述的方法，其中所述调节包括降低肿瘤环境中间质细胞衍生因子-I (SDF-I)的水平。56.如实施方式40所述的方法，其中所述调节包括提高肿瘤细胞坏死和/或固缩的发生率。57.如实施方式40所述的方法，其中所述测试分子是分子量小于IkD的有机小分子。58.如实施方式40所述的方法，其中所述测试分子是多肽。59.如实施方式58所述的方法，其中所述多肽是抗体。60.如实施方式40所述的方法，其中所述测试分子是核酸。61.如实施方式60所述的方法，其中所述核酸是siRNA。62. 一种用于抑制肿瘤环境中成纤维细胞激活的L0XL2抑制剂。63. 一种用于抑制肿瘤环境中结缔组织形成的L0XL2抑制剂。64. 一种用于抑制肿瘤环境中血管发生的L0XL2抑制剂。65. 一种用于减少肿瘤间质中肿瘤相关成纤维细胞(TAF)数量的L0XL2抑制剂。66. 一种用于抑制肿瘤环境中胶原沉积的L0XL2抑制剂。67. 一种用于调节肿瘤环境的L0XL2抑制剂。68. 一种用于调节肿瘤环境中生长因子生成的L0XL2抑制剂。69. 一种用于提高肿瘤中坏死的L0XL2抑制剂。70. 一种用于提高肿瘤中固缩的L0XL2抑制剂。71.如实施方式62-70中任一项所述的抑制剂，其中所述L0XL2抑制剂是抗L0XL2抗体。72.如实施方式71所述的抑制剂，其中所述抗体包括SEQ ID NO :1所列的重链序列和SEQ ID NO 2所列的轻链序列。
73.如实施方式71所述的抑制剂，其中所述抗体是人源化抗体。74.如实施方式73所述的抑制剂，其中所述抗体包括SEQ ID NO 3所列的重链序列和SEQ ID NO :4所列的轻链序列。75.如实施方式62-70中任一项所述的抑制剂，其中所述抑制剂是核酸。76.如实施方式75所述的抑制剂，其中所述核酸是siRNA。77. 一种用于抑制肿瘤环境中成纤维细胞激活的药物组合物，其中所述组合物包括L0XL2抑制剂和药学上可接受的赋形剂。78. 一种用于抑制肿瘤环境中结缔组织形成的药物组合物，其中所述组合物包括L0XL2抑制剂和药学上可接受的赋形剂。 79. 一种用于抑制肿瘤环境中血管发生的药物组合物，其中所述组合物包括L0XL2抑制剂和药学上可接受的赋形剂。80. 一种用于减少肿瘤间质中肿瘤相关成纤维细胞(TAF)数量的药物组合物，其中所述组合物包括L0XL2抑制剂和药学上可接受的赋形剂。81. 一种用于抑制肿瘤环境中胶原沉积的药物组合物，其中所述组合物包括L0XL2抑制剂和药学上可接受的赋形剂。82. 一种用于调节肿瘤环境的药物组合物，其中所述组合物包括L0XL2抑制剂和药学上可接受的赋形剂。83. 一种用于调节肿瘤环境中生长因子生成的药物组合物，其中所述组合物包括L0XL2抑制剂和药学上可接受的赋形剂。84. 一种用于提高肿瘤中坏死的药物组合物，其中所述组合物包括L0XL2抑制剂和药学上可接受的赋形剂。85. 一种用于提高肿瘤中固缩的药物组合物，其中所述组合物包括L0XL2抑制剂和药学上可接受的赋形剂。86.如实施方式77-85中任一项所述的组合物，其中所述L0XL2抑制剂是抗L0XL2抗体。87.如实施方式86所述的组合物，其中所述抗体包括SEQ ID NO :1所列的重链序列和SEQ ID NO 2所列的轻链序列。88.如实施方式86所述的组合物，其中所述抗体是人源化抗体。89.如实施方式88所述的组合物，其中所述抗体包括SEQ ID NO :3所列的重链序列和SEQ ID NO :4所列的轻链序列。90.如实施方式77-85中任一项所述的组合物，其中所述抑制剂是核酸。91.如实施方式90所述的组合物，其中所述核酸是siRNA。附图简要说明图I中a-p小图显示L0XL2在实体肿瘤和肝纤维化中高表达且分泌。图I的a小图显示L0XL2转录物在实体肿瘤中与非肿瘤组织相比的qRT-PCR分析。图I的b和c小图显示喉鳞状细胞癌匹配肿瘤切片中的I型胶原(图Ib)和L0XL2(图Ic)表达的免疫组化(IHC)。图I的d和e小图显示来自肺鳞状细胞癌(2级)切片的IHC分析，测试I型胶原(

图1，d小图)和L0XL2 (图1，e小图)的表达。图I的f 和g小图显示胰腺癌(3级)切片中L0XL2表达的IHC分析。图I的f小图显示基质和肿瘤间质边缘中的L0XL2表达；而图I的f小图和图I的g小图中也显见血管球结构上的L0XL2表达。图I的h和i小图显示卵巢癌网膜转移中L0XL2表达的IHC分析。图I的h小图显示肿瘤细胞表达，图I的i小图显示血管球结构中的L0XL2表达。图I的j和k小图显示胰腺癌切片的IHC。图I的j小图显示L0XL2表达，图I的k小图显示LOX表达。图I的I小图显示肾透明细胞癌切片的L0XL2表达。图I的m小图和In显示活性丙肝引起肝纤维化中L0XL2表达的IHC(图I的m小图5X放大；图I的n小图40X放大)。图I的o和p小图分别显不脂肪肝切片的L0XL2和LOX表达的IHC (40X放大)。图2的a-f小图显示分泌的L0XL2在体外促进肿瘤细胞侵袭。图2的a和b小图显示Hs578t肿瘤细胞培养物的L0XL2 (图2的a小图)和I型胶原(图2的b小图)共染色的免疫荧光分析。I型胶原和L0XL2的表达共定位在这些培养物的胞外基质中。图2的c-f小图显示，用以下培养基:MCF7条件培养基(图2的c小图)、MDA-MB231条件培养基(图2的d小图)、用4ug抗IgG抗体预孵育的MDA-MB231条件培养基(图2的e小图)或用4ug抗L0XL2抗体AB0023预孵育的MDA-MB231条件培养基(图2的f小图)，处理培养 的MCF-7细胞后，MCF-7细胞培养物的罗丹明鬼笔环肽染色。图3的a-k小图显示L0XL2在体外和体内促进成纤维细胞激活。图3的a小图显示蛋白(“Western”)印迹分析，测试张力对人包皮成纤维细胞(HFF)中L0XL2表达水平的影响。在细胞培养板(标为I的泳道)、0. 2%双丙烯酰胺交联胶原包被的凝胶(标为2的泳道)、或0. 8%双丙烯酰胺交联胶原包被的凝胶(标为3的泳道)上培养细胞。图3的b和e小图显示用非靶向siRNA(图3，b小图)或L0XL2siRNA(图3，c小图)转染且转染后10天染色I型胶原的HFF细胞的照片。图3的d和e小图显示用非靶向siRNA(图3，d小图)或L0XL2siRNA(图3，e小图)转染且转染后10天进行罗丹明鬼笔环肽染色的HFF细胞的照片。图3的f 和g小图显示低张力(图3的f 小图)或高张力(图3的g小图)下生长然后用罗丹明鬼笔环肽染色的HFF细胞的照片。图3的h小图显示HFF细胞溶解物的蛋白(“Western”)印迹，所述细胞来自与MDA-MD-231或MCF7-L0XL2细胞的微孔膜(transwell)培养。图3的i小图显示通过光密度测定对图3的h小图所示结果的定量,表明对PSMAD2和VEGF表达的AB0023特异性影响。图3的j小图显示nu/nu小鼠肾被膜下产生的异种移植物大小比较，所述小鼠植入MCF7细胞(MCF7-对照)或稳定转染有L0XL2表达载体的MCF7细胞(MCF7-L0XL2)。图3的k小图显示异种移植物的定量RT-PCR分析，以检测表达L0XL2的肿瘤中各种间质组分的相对诱导。采用小鼠特异性引物区分间质表达与移植(人)细胞中的表达。aSMA = a平滑肌肌动蛋白；C0L1A1 = I型胶原；MMP9 =基质金属蛋白酶9 ；FN1 =纤连蛋白I型；VM=波形蛋白。间质中MCF7-L0XL2诱导肿瘤与MCF7诱导肿瘤相比的激活倍数由代表各基因的柱上方的数字显示。图4的a-o小图显示抗L0XL2抗体AB0023体外和体内抑制血管生成和血管发生的示例。图4的a和b小图显示HUVEC细胞的罗丹明鬼笔环肽染色，所述细胞用非靶向siRNA(图4，a小图)或靶向L0XL2的siRNA(图4，b小图)转染，随后培养10天。图4的c-i小图显示体外血管形成实验的结果，其中培养中的人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)用递增浓度的AB0023处理，然后染色内皮标记⑶31。4张小图显示没有抗体(图4，c小图)或存在lug/ml (图4，d小图)、10ug/ml(图4，e小图)或50ug/ml (图4，f小图)AB0023时培养的HUVEC。还进行分支点平均数(图4，g小图)、血管平均数(图4，h小图)和平均总管长(图4，i小图)的定量。图4的j-m小图显示Matrigel 胶栓分析中抗L0XL2抗体AB0023对血管生成的影响。Balb/C小鼠胁部植入含bFGF的Matrigel 胶栓，然后用AB0023或载剂(PBST)处理。移植后第10天，仅用载剂处理的动物中胶栓的组织学分析(H&E染色)显示分支和侵袭脉管系统(图4的j小图)，这在AB0023处理动物的胶栓中几乎没有(图4的k小图)。用单独载剂(图4的I小图)和AB0023 (图4的m小图)所处理动物的胶栓的⑶31染色提供了类似结果，即AB0023处理动物的胶栓中缺乏血管发生。图4的n小图提供了载剂处理和AB0023处理动物的胶栓中平均血管数的定量分析，表明AB0023处理小鼠中血管发生减少 7倍(p = 0. 0319)。图4的O小图显示载剂处理和AB0023处理小鼠的胶栓中⑶31阳性细胞的定量，确证血管发生减少(p = 0. 0168)。图5的a-u小图显示在原发性肿瘤和癌的转移性异种移植模型中抗L0XL2抗体AB0023都在体内有效减少间质激活且抑制肿瘤环境的产生。对于图5的a和b小图所示结果，将约106MDA-MB231细胞注入小鼠(左心室)以产生弥散型骨转移模型，注射后28天，评价肿瘤负荷。用抗LOX抗体M64、抗L0XL2抗体AB0023、多西他赛(Taxotere)或载剂对照处理注射的动物。图5的a小图显示第28天股骨中的肿瘤细胞负荷(AB0023 p = 0. 0021,M64 p = 0. 5262);图5的b小图显示第28天总腹部骨中的肿瘤细胞负荷(AB0023 p =0. 0197，M64 p = 0. 5153)。对于图5的c-m小图所示的结果，用MDA-MB-435细胞系产生原发性肿瘤并如所述处理。对此模型系统中仅用载剂处理的宿主动物中所产生肿瘤的切片进行L0XL2(图5，c小图)和LOX(图5，d小图)表达染色。图5的e小图显示用单独载剂、多西他赛(肿瘤体积减小的阳性对照)、抗L0XL2抗体AB0023和抗LOX抗体M64处理小鼠的肿瘤体积测量。AB0023处理的小鼠保持肿瘤体积显著减小(在第3周为45%，p = 0.001 ;第5周为33%，P = O. 0240)，而M64处理的小鼠不保持(在第3周为27%，p = 0. 040 ;第5周不显著)。图5的f-i小图显示载剂处理(图5，f小图)、AB0023处理(图5，g小图)、M64处理(图5，h小图)和多西他赛处理(图5，i小图)动物的肿瘤的天狼星红(Sirius Red)染色示例。图5的j-m小图显示用单独载剂(图5，j小图)、AB0023(图5，k小图)、M64(图5，I小图)和多西他赛(图5，m小图)处理动物所得肿瘤切片中a平滑肌肌动蛋白(a -SM)表达的IHC分析。图5n显示MDA-MB-435诱导肿瘤的肿瘤环境中天狼星红染色、a -SMA表达和⑶31表达的定量。结果表明AB0023处理小鼠中由天狼星红染色所测定的交联胶原减少61% (P = 0. 0027)，由a -SMA表达所评价的TAF存在减少88% (p = 0. 011)，由CD31表达所评价的肿瘤脉管系统减少74% (p = 0. 0002)。图5的O小图显示AB0023和BAPN处理小鼠中MDA-MB-435诱导的原发性肿瘤的肿瘤体积的单独研究结果；表明抗L0XL2抗体处理后肿瘤体积在统计上显著减小。图5的p小图显示AB0023和BAPN处理小鼠的MDA-MB-435诱导肿瘤中的天狼星红染色(胶原生成)、⑶31表达(血管发生)和a -SMA表达(成纤维细胞激活)的定量分析；表明在AB0023处理小鼠中所有3种标记都减少。图5的q小图显示AB0023处理和对照(载剂处理)小鼠的MDA-MB-435诱导肿瘤中L0XL2、VEGF和SDF-I表达的分析；表明AB0023处理的MDA-MB-435肿瘤中 VEGF 水平降低 76% (P = 0. 0001)，SDFl 水平降低 80% (p = 0. 0200)，L0XL2 水平降低 55% (P = 0. 0005)。
图5的r和s小图提供了 AB0023处理的MDA-MB-435肿瘤中坏死的证据。图5的r小图显示AB0023处理的MDA-MB-435肿瘤切片中肿瘤坏死因子a (TNF- a )的IHC分析。图5的s小图显示AB0023处理的MDA-MB-435肿瘤切片的苏木精与伊红(H&E)染色。图5t和5u提供了 AB0023处理的MDA-MB-435肿瘤中固缩的证据。载剂处理的肿瘤切片中核轮廓分明(图5，t小图)，AB0023处理的肿瘤切片中核出现固缩(图5，u小图)。图6的a-e小图显示AB0023介导的对CCl4诱发的肝纤维化和肌成纤维细胞激活的抑制。图6的a小图显示CCl4处理小鼠又用抗L0XL2抗体AB0023、抗LOX抗体M64或载剂处理的K-M生存分析(Kaplan Meier survival analysis)。存活率的显著提高在AB0023治疗方式中显见(对数秩次检验中P = O. 0029，或曼泰尔-卡克斯(Mantel-Cox)检验中P = O. 0064)。图6的b小图显示AB0023处理小鼠的肝中桥接纤维化量显著减少(p =0. 0020)。图6的c和d小图显示载剂处理小鼠的肝门区切片中a -SMA的IHC分析(图6，c小图)，与AB0023处理小鼠的肝作比较(图6，d小图)。图6的e小图提供a -SMA信号的定量分析，证明AB0023处理动物的肝中桥接纤维化缺乏伴有a -SMA阳性肌成纤维细胞 里显者减少(P = 0. 0260)。图7的a-z小图显示各种人肿瘤和正常组织中L0XL2表达的证据。(a_f小图)对人结肠腺癌(a小图)、胰腺癌(b小图)、子宫腺癌(c小图)、肾细胞癌(d小图)、胃腺癌(e小图)和喉咽鳞状细胞癌(f小图)进行L0XL2转录物的定量RT-PCR分析；观察到L0XL2转录物随着肿瘤级别提高而增加的趋势。(g_y小图)各种L0X/L的蛋白质印迹分析显示用于人和小鼠组织切片IHC的多克隆抗体特异于L0XL2(g小图，cLOX =成熟L0X，前肽切割；MCD=仅蛋白催化结构域；FL=全长蛋白；此特异性也由ELISA确认(数据未显示))。图中其它L0XL2表达示例为乳腺浸润性导管癌(h小图)、子宫内膜癌(i小图)、结肠腺癌(j小图)、肝细胞癌(k小图，也对LOX表达染色(I小图))、胰腺神经内分泌癌(m小图，也对LOX表达染色(n小图))、黑素瘤(0小图)、正常心脏(p小图，也用⑶31染色(q小图))、正常肝(r小图)、正常肺(s小图，也用CD31染色(t小图))、正常卵巢(u小图)、正常脾(v小图)、正常平滑肌(X小图，也对LOX表达染色(w小图))和正常动脉(z小图，也对LOX表达染色(y小图))。图I的表7总结了人健康组织中的L0XL2表达。用抗L0XL2多克隆抗体染色人正常组织，汇编对L0XL2相对表达水平的定性评估。图8的a-t小图显示分泌的L0XL2在体外促进肿瘤细胞的重构和侵袭。(a小图)各种肿瘤和成纤维细胞系中的L0XL2转录物(常氧条件，RPL19用作参比)的qRT-PCR分析(Ct值)。(b小图)人肿瘤和成纤维细胞系中L0XL2表达的蛋白质分析(全细胞团=细胞；条件培养基=CM)。(c小图)用纯化重组人L0XL2的Amplex Red试验显示L0XL2的87kD和55kD形式都具有活性且被BAPN抑制(混合物=2种形式的 50 50混合物)。(d小图)BAPN抑制纯化重组人L0XL2的剂量反应曲线(Amplex Red试验；数据根据对照标准化)。(e-g小图)用非靶向siRNA(siNT)或L0XL2siRNA转染HS578t且随后对L0XL2或I型胶原的表达染色。L0XL2表达与I型胶原共定位(siNT的L0XL2染色(e小图)，L0XL2siRNA的L0XL2染色(f小图)和I型胶原(g小图))。(h小图)MC3T3E1中的LOX分泌(CM浓缩 20X)。(i、j小图)常氧(i小图)或缺氧(j小图)条件下肿瘤或成纤维细胞系的LOX表达显示无可测的LOX分泌不可检测(CM浓缩 20X)。(k、I小图)用非靶向shRNA(k小图)转染并用罗丹明鬼笔环肽染色的MDA-MB-231细胞保持其间质表型，而用L0XL2shRNA(l小图)转染的细胞显现更上皮化的表型。(m、n小图)蛋白质印迹分析和ELISA(n小图)都显示AB0023特异于L0XL2。(o小图)AB0023抑制L0XL2酶活性的剂量反应曲线(AmplexRed试验)。(p小图)AB0023与小鼠L0XL2交叉反应。(q_t小图)SW620细胞的生长培养基补充有以下条件培养基MDA-MB-231CM(r小图)或转染有空载体(q小图)、L0XL2 (s小图)或L0XL2Y689F(t小图)的HEK293CM。所述细胞用罗丹明鬼笔环肽染色。图9的a-b小图显示不同张力下HFF细胞的L0XL2表达并确认了 L0XL2敲减。(a小图)HFF细胞生长在细胞培养板(塑料)或者含2mg/ml (2)或3mg/ml (3) I型胶原的I型胶原凝胶上。所述凝胶脱离(漂浮)或锚定于培养 皿(附着)。通过Western技术分析所述条件培养基并探测L0XL2表达。(b小图)用非靶向siRNA(siNT)或L0XL2siRNA(siL0XL2)转染HFF细胞并经蛋白质印迹分析探测条件培养基的L0XL2表达。图10的a-b小图显示体内基质胶栓中浸润细胞的L0XL2表达(a、b小图)。对基质胶栓中内皮细胞浸润的IHC分析确认了 L0XL2表达(a小图)。所述切片还用CD31染色(b小图)以确认内皮细胞的存在。图11的a-o小图显示AB0023在原发性肿瘤和癌的转移性异种移植模型中的体内功效。(a小图)MDA-MB-231细胞的qRT-PCR分析证实所有L0X/L蛋白的转录(RPL-19用作参比)。(b-e小图)从载剂(b小图)、抗L0XL2抗体AB0023 (c小图)、抗LOX抗体M64 (d小图)或多西他赛(e小图)处理小鼠中收获的MDA-MB-435已建立原发性肿瘤的CD31染色显示AB0023处理中CD31染色比载剂处理降低74% (p = 0. 0002)。(f、g小图)就VEGF(f小图)和L0XL2(g小图)表达染色的人乳腺癌显示TAF表达的相似性。(h_o小图)来自载剂和AB0023处理小鼠的MDA-MB-435已建立原发性肿瘤就L0XL2 (h小图，载剂处理；i小图，AB0023处理)、VEGF(j小图，载剂;k小图，AB0023)和SDF-1 (I小图，载剂;m小图，AB0023)的表达进行染色以及用H&E(n小图，载剂；0小图AB0023)染色。图12的a-d小图显示CC14诱发纤维化模型中鼠肝内的纤维发生。(a_d小图)鼠CC14诱发肝纤维化模型显示肝损伤和纤维化的早期迹象，由早死动物(第11天)的肝(a小图)相比健康肝(b小图)的I型胶原染色证实(天狼星红)。用于桥接纤维化分析的肝示例中AB0023处理小鼠(d小图)的桥接纤维化完全性显著低于载剂处理(c小图)(p =0. 002)。发明详述除非另有说明，本文的实施采用细胞生物学、毒理学、分子生物学、生物化学、细胞培养、免疫学、肿瘤学、重组DNA领域和相关领域中的标准方法和常规技术，所述方法和技术在本领域技术范围内。这些技术描述于文献中并因而本领域技术人员可用。参见例如Alberts, B.等“Molecular Biology of the Cell (《细胞分子生物学》)”,第5版,纽约州纽约市的加兰德科学出版社(arland Science)008 ；Voet, D.等“Fundamentals ofBiochemistry Life at the Molecular Level (基础生物化学分子水平的生命》)”第3版,新泽西州霍博肯的约翰威利出版社(John Wiley & Sons), 2008 ;Sambrook, J.等，“Molecular Cloning A Laboratory Manual (《分子克隆实验室手册》)”第3版，冷泉港实验出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press), 2001 ；Ausubel, F.等 “CurrentProtocols in Molecular Biology (《新编分子生物学实验指南》)”纽约的约翰威利出版社，1987,定期更新；Freshney, R. I. , “Culture of Animal Cells A Manual of BasicTechnique (《动物细胞培养基本技术手册》)”第4版，新泽西州萨默塞特的约翰威利出版社,2000 ,Methods in Enzymology (《酶学方法》)”丛书,加利福尼亚州圣地亚哥的学术出版社(Academic Press)。本发明人鉴定了基质酶赖氨酰氧化酶样2 (L0XL2)在产生肿瘤和纤维化疾病的病理微环境中的作用。人肿瘤和肝纤维化的分析显示激活的成纤维细胞和新生血管有广泛且保守的L0XL2表达。用抗L0XL2单克隆抗体抑制L0XL2在癌的原发性和转移性异种移植模型以及CCl4诱导的肝纤维化中都有效。L0XL2抑制不仅引起成纤维细胞激活、成纤维细胞募集、结缔组织形成和血管形成的大幅减少，还导致促血管生成生长因子和细胞因子如VEGF和SDFl生成显著降低。抑制赖氨酰氧化酶(LOXL)若有此类影响，也很微小。已采用小分子P -氨基丙腈(BAPN)研究体外和体内抑制L0X/L活性的影响。BAPN共价修饰酶结构域中的赖氨酸-酪氨酸醌并因而起不可逆抑制剂的作用。BAPN缺乏特异性，因为它不仅抑制不同L0X/L的潜在各种活性，还抑制其它胺氧化酶的类似结构域。所述抗L0XL2抗体优于小分子泛赖氨酰氧化酶抑制剂P -氨基丙腈(BAPN)。所述抗L0XL2抗体 起特异性L0XL2抑制剂的作用，代表在肿瘤和纤维化疾病中有广泛应用性的新治疗方法。本发明人揭示了 L0XL2在确立肿瘤和纤维化疾病的病理微环境中的作用，证明L0XL2是治疗的靶标。TAF和肿瘤脉管系统的L0XL2蛋白表达和分泌在实体肿瘤中普遍存在，在肿瘤-间质界面尤其明显。L0XL2也在结缔组织形成和血管球微血管增生区域中显著表达，这两者都与多种癌症预后差相关联。在活性肝纤维化中，L0XL2在肝细胞-肌成纤维细胞界面和相关新生血管处的表达类似。本发明人进一步确定了 L0XL2表达导致多种细胞类型中的肌动蛋白细胞骨架重构，所述细胞类型包括上皮来源的肿瘤细胞、内皮细胞和成纤维细胞。L0XL2对疾病进展的一个作用是激活和募集疾病相关成纤维细胞，最可能是通过其酶催化纤维胶原交联和局部基质张力的相应变化。在肿瘤和肝纤维化中，张力增加可导致疾病相关的细胞分化。生成纤维胶原和产生组织内张力后，TAF(可能还有肌成纤维细胞)分泌许多血管生成性、血管发生性和趋化性的生长因子以及细胞因子支持肿瘤发生和纤维化的发展。本文公开了癌和纤维化模型中对分泌L0XL2活性的特异性抑制导致由多种参数评价的疾病显著减轻。抑制L0XL2能直接影响血管生成以及疾病相关上皮的侵袭和分化。然而，单独抑制血管生成不能完全引起L0XL2抑制后观察到的效果，因为针对VEGFR和PlGF途径的有效抗血管生成并不如同L0XL2的抑制那样影响肿瘤中的SMA阳性细胞数量。本文还公开了体内L0XL2抑制导致成纤维细胞激活和募集的抑制，其结果包括结缔组织形成和促血管生成生长因子及细胞因子的表达显著降低，肿瘤脉管系统形成缺失，肿瘤细胞坏死和自噬增加。L0XL2抑制也大幅减少作为纤维化标记的纤维胶原生成，这并非由于胶原表达的直接调节而是由于活化肌成纤维细胞(引起大部分胶原生成的细胞类型)数量显著减少，。提出了许多疾病相关活化成纤维细胞的可能来源，包括纤维细胞和其它骨髓衍生细胞、常驻成纤维细胞(resident fibroblast)或其它前体、上皮细胞的上皮-间质转换(EMT)。在本文公开的内容中，在涉及不同疾病位点的3种很不同的小鼠模型中获得治疗性益处，在2种适于进一步分析的模型中所述机制看来保守，其中成纤维细胞激活显著减少。这些结果提示L0XL2对于成纤维细胞最终分化和激活是重要的，且不依赖于其来源。本发明人在本文中揭示单独L0XL2抑制足以获得治疗性功效，尽管使用的模型系统所含细胞产生包括LOX在内的多种赖氨酰氧化酶型酶。作为比对，使用特定LOX特异性单克隆抗体在肿瘤和纤维化模型中提供很少的治疗益处，所述抗体靶向的肽先前被鉴定为产生能抑制LOX酶活性的多克隆抗血清。L0XL2在患病与健康组织中的差异表达提供了一个功能性治疗窗口。为了支持抗L0XL2抗体AB0023的安全性，本发明人发现AB0023每周2次50mg/kg持续14周的剂量在小鼠中耐受良好，对重量或行为没有影响且在剖检、血液学、临床化学和组织病理学分析时未见药物相关观察。采用人源化抗L0XL2变体(AB0024)在猕猴中的前期研究进一步支持了抗L0XL2抗体治疗在100mg/kg重复剂量时耐受良好。抗体治疗提供了高度特异性抑制机制的一种示例。事实上，在基于细胞的实验和体内，用抑制其酶活性的抗体(AB0023)特异性靶向分泌的L0XL2优于特异性较低的细胞穿透性泛抑制剂BAPN。(应注意，与以前的报道相反，发现L0XL2在体外易为BAPN抑制，具有低纳摩尔IC50,与LOX观察到的类似;图8的D小图和Rodriguez等，(2010) J. Biol.Chem. 285 :20964_20974。)除了特异性，此治疗模式提供额外的优点作为L0XL2的非竞争性别构抑制剂，AB0023和AB0024独立于底物浓度或L0XL2与其底物间的结合而起作用，而 不可逆抑制剂BAPN作为竞争性抑制剂且在高底物浓度或L0XL2与其底物结合的条件下不太有效。在活动性疾病中，抑制的这种替代机制是对基质酶有广泛应用性的新型治疗方法，所述酶在含局部高浓度底物如纤维胶原的动态复合细胞环境中发挥作用。如本文所述，L0XL2的别构抑制是一种抑制纤维化疾病和肿瘤的生长和进展的新方法，这是通过靶向疾病进展的基本共有特征，如产生间质室或基质微环境或转移性生境。即抑制单一靶标(L0XL2)对结缔组织形成的多种不同推动剂有多重效果。靶向L0XL2可通过使用单克隆抗体而具有高度特异性。此外，靶向肿瘤微环境中遗传上更稳定的间质细胞能降低抗药性的可能性。定义“肿瘤环境”指肿瘤和其周边组织。肿瘤环境的某子集是肿瘤-间质界面，即肿瘤周边(例如肿瘤囊)与毗邻间质组织。另一子集是肿瘤本身；而另一子集是肿瘤外的间质组织。
“成纤维细胞激活”指正常成纤维细胞响应肿瘤细胞释放的信号(例如生长因子、细胞因子)转变成肿瘤相关成纤维细胞(TAF)的过程。这种生长因子的一种示例是转化生长因子(TGF-P)。成纤维细胞激活的示例性结果是活化的成纤维细胞中a平滑肌肌动蛋白(aSMA)的表达增加和血管内皮生长因子(VEGF)的表达增加。“肿瘤相关成纤维细胞(TAF) ”是已经历成纤维细胞激活的成纤维细胞，以a平滑肌肌动蛋白(aSMA)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达增加等为特征。“肌成纤维细胞”是兼具成纤维细胞和平滑肌细胞特征的细胞。它们存在于纤维组织，特征为表达a平滑肌肌动蛋白等。“结缔组织形成”指纤维或结缔组织的生长。一些肿瘤引发结缔组织形成反应，即致密纤维组织在肿瘤周边弥散性生长。“血管生成(angiogenesis) ”指从已存在的血管中形成新血管。“血管发生(vasculogenesis) ”指在不存在已有血管的情况下形成新血管。肿瘤间质
肿瘤的生长和发展取决于肿瘤和其周边间质组织间的相互作用。肿瘤在含结缔组织、成纤维细胞、肌成纤维细胞、白血球、内皮细胞、周细胞和平滑肌细胞的间质框架内生长。生长的肿瘤通过分泌生长因子(影响周围间质细胞行为)和分泌蛋白酶(重构间质胞外基质(stromal extracellular matrix))来影响周边间质。间质细胞进而分泌刺激所述肿瘤细胞生长和分裂的生长因子；并分泌进一步修饰基质的蛋白酶。肿瘤和其周边间质组织以此方式形成支持肿瘤进一步生长的肿瘤环境。例如，研究显示某些癌取决于肿瘤相关成纤维细胞的存在以持续生长，且在正常成纤维细胞存在时不以可检测或可观水平生长。还显示某些肿瘤的强生长需要通常由肥大细胞分泌的特定基质金属蛋白酶，其通过从胞外基质释放血管生成因子而起作用。赖氨酰氧化酶型酶本文所用的术语“赖氨酰氧化酶型酶”和“L0X/L”指催化赖氨酸和羟赖氨酸残基的e -氨基氧化脱氨的蛋白家族成员，该氧化脱氨导致肽基赖氨酸转变成肽基-a -氨基己 二酸-S -半醛(醛赖氨酸)并释放化学计量量的氨和过氧化氢
I!
00OO
1I
Ch-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2 +H2OCH-CH2-CH2-CH2-CH=O +NH3
I+O2I+H2O2
NHNH
II
肽基赖氨酸肽基醛赖氨酸此反应最常胞外发生于胶原和弹性蛋白中的赖氨酸残基上。醛赖氨酸的醛基具有反应性且能与其它醛赖氨酸和赖氨酸残基自发缩合，导致胶原分子交联以形成胶原纤维。已从鸡、大鼠、小鼠、牛和人中纯化赖氨酰氧化酶型酶。所有赖氨酰氧化酶型酶包含长约205个氨基酸的共有催化结构域，其位于所述蛋白羧基末端部分且含有该酶的活性位点。所述活性位点包括含保守氨基酸序列的铜结合位点，所述序列含配位Cu(II)原子的4个组氨酸残基。所述活性位点还包含赖氨酰酪氨酰醌(LTQ)辅因子，由赖氨酸和酪氨酸残基(对应于大鼠赖氨酰氧化酶的lys314和tyr349，以及人赖氨酰氧化酶的lys320和tyr355)之间的分子内共价连接形成。形成LTQ辅因子的酪氨酸残基周边序列也在赖氨酰氧化酶型酶中保守。所述催化结构域还包含10个保守性半胱氨酸残基，他们参与5个二硫键的形成。所述催化结构域还包括纤连蛋白结合结构域。最后，所述催化结构域中存在含有4个半胱氨酸残基的类似生长因子和细胞因子受体结构域的氨基酸序列。尽管存在这些保守区，不同赖氨酰氧化酶型酶可在催化结构域内和之外通过核苷酸和氨基酸序列不同的区域来彼此区分。此酶家族中分离和表征的第一个成员是赖氨酰氧化酶(EC 1.4. 3. 13);也称为蛋白-赖氨酸6-氧化酶、蛋白-L-赖氨酸氧6-氧化还原酶(脱氨基)或L0X。参见例如Harris 等，Biochim. Biophys. Acta 341 :332-344 (1974) ；Rayton 等，J. Biol. Chem. 254 621-626(1979) ；Stassen, Biophys. Acta 438:49-60(1976)。
随后发现了其它赖氨酰氧化酶型酶。这些蛋白称为“L0X样”或“L0XL”。它们都包含上述共有催化结构域并具有类似酶活性。目前，已知人和小鼠中都存在5种不同赖氨酰氧化酶型酶L0X和4种LOX相关或LOX样蛋白LOXLl (也标注为“赖氨酰氧化酶样”、“L0XL”或“L0L”)、L0XL2 (也标注为 “LOR-1 ”)、L0XL3 (也标注为 “L0R-2” )和 L0XL4。编码所述 5种不同赖氨酰氧化酶型酶的基因各位于不同染色体。参见例如Molnar等,Biochim BiophysActa. 1647:220-24(2003) ；Csiszar, Prog. Nucl. Acid Res. 70 :1-32 (2001) ;2001 年 11 月 8日发表的WO 01/83702和美国专利第6，300，092号，其都通过引用纳入本文。已从鼠EC细胞系中分离出名为LOXC的LOX样蛋白，其与L0XL4具有一些相似性但表达模式不同。Ito等(2001) J. Biol. Chem. 276 =24023-24029 从果蝇(Drosophila)中分离了 2 种赖氨酰氧化酶型酶 DmLOXL-I 和 DmL0XL-2。尽管所有赖氨酰氧化酶型酶共有共同的催化结构域，但它们也彼此不同，具体是在其氨基末端区。所述4种LOXL蛋白相较LOX具有氨基末端延伸。因此，人前LOX原(preproLOX)(即信号序列切割前的初级翻译产物，见下)包含417个氨基酸残基；L0XL1包含574个，L0XL2包含638个，L0XL3包含753个而L0XL4包含756个。L0XL2、L0XL3和L0XL4在其氨基末端区含有4个重复的清除受体富半胱氨酸(SRCR)结构域。这些结构域在LOX或LOXLl中不存在。在分泌、跨膜或胞外基质蛋白中发现SRCR结构域，已知该结构域在许多分泌和受体蛋白中介导配体结合。Hoheneste等(1999)Nat. Struct. Biol. 6 :228-232 ；Sasaki 等(1998)EMBO J. 17 :1606-1613。L0XL3 在 SRCR 结构域外还包含氨基末端区的核定位信号。富脯氨酸结构域看来是LOXL I特有的。Molnar等(2003) Biochim. Biophys. Acta 1647:220-224。各种赖氨酰氧化酶型酶的糖基化模式也不同。所述赖氨酰氧化酶型酶的组织分布也不同。人LOX mRNA在心脏、胎盘、睾丸、肺、肾和子宫中高表达，但在脑和肝中微弱表达。人LOXlmRNA在胎盘、肾、肌肉、心脏、肺和胰腺中表达，且与LOX类似，在脑和肝中表达水平低许多。Kim等(1995) J. Biol.Chem. 270 :7176-7182。高水平的L0XL2 mRNA在子宫、胎盘和其它器官中表达，但如LOX和L0XL1，其在脑和肝中低水平表达。Jourdan Le-Saux 等(1999) J. Biol. Chem. 274 12939 12944。L0XL3mRNA在睾丸、脾和前列腺中高表达，在胎盘中中等表达，在肝中不表达，而在肝中观察到高水平的 L0XL4mRNA。Huang 等(2001)Matrix Biol. 20 :153-157 ；Maki 和Kivirikko(2001)Biochem. J. 355 :381-387 ;Jourdan Le-Saux 等(2001)Genomics 74:211-218 !Asuncion 等(2001)Matrix Biol. 20 :487-491 不同赖氨酰氧化酶型酶在疾病中的表达和/或参与也改变。参见例如Kagen(1994)Pathol. Res. Pract. 190 :910-919 ；Murawaki 等(1991)Hepatology 14:1167-1173 ；Siegel 等(1978)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 :2945-2949 Jourdan Le-Saux等(1994)Biochem. Biophys. Res. Comm. 199 :587-592 ；Kim 等(1999)J. Cell Biochem. 72 181-188。赖氨酰氧化酶型酶还与许多癌症有关，包括头颈癌、膀胱癌、结肠癌、食管癌和乳腺癌。参见例如 Wu 等(2007) Cancer Res. 67 :4123-4129 ;Gorough 等(2007) J. Pathol. 212 74-82 ；Csiszar(2001)Prog. Nucl. Acid Res. 70 1-32 和 Kirschmann 等(2002)CancerRes. 62 :4478-4483o
因此，尽管所述赖氨酰氧化酶型酶在结构和功能上呈现某些重叠，它们各具有独特的结构以及功能。例如，就结构而言，针对人LOX蛋白催化结构域产生的某些抗体不结合人L0XL2。就功能而言，据报道小鼠中靶向缺失LOX看来对分娩致命，而LOXLl缺陷不引起严重的发育表型。Hornstra 等(2003) J. Biol. Chem. 278 :14387-14393 ;Bronson 等(2005)Neurosci. Lett. 390 :118_122。尽管最广泛记载的赖氨酰氧化酶型酶活性是氧化细胞外胶原和弹性蛋白中的特定赖氨酸残基，但有证据显示赖氨酰氧化酶型酶还参与许多胞内过程。例如，据报道某些赖氨酰氧化酶型酶调节基因表达。Li 等(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 :12817-12822 ；Giampuzzi 等(2000) J. Biol. Chem. 275 :36341-36349。此外，据报道 LOX 氧化组蛋白 Hl中的赖氨酸残基。LOX的其它胞外活性包括诱导单核细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞趋化性。Lazarus 等(1995)Matrix Biol. 14 :727-731 ;Nelson 等(1988)Proc. Soc. Exp. Biol.Med. 188 :346-352。LOX自身表达受许多生长因子和类固醇如TGF-P、TNF-a和干扰素诱导。Csiszar (2001)Prog. Nucl. Acid Res. 70 :1_32。近期研究显不LOX在多种生物学功能如发育调节、肿瘤抑制、细胞迁移和细胞衰老中具有其它作用。 来自各种来源的赖氨酰氧化酶(LOX)蛋白的示例包括具有的氨基酸序列与以下序列之一所表达或翻译的多肽基本相同的酶EMBL/GenBank登录号M94054 ；AAA59525. I-mRNA ；S45875 ；AAB23549. I-mRNA ；S78694 ；AAB21243. I-mRNA ；AF039291 ；AAD02130. I-mRNA ;BC074820 ；AAH74820. I-mRNA ;BC074872 ；AAH74872. I-mRNA ；M84150 ；AAA59541. I-基因组DNA。LOX的一个实施方式是人赖氨酰氧化酶(hLOX)前蛋白原。赖氨酰氧化酶样酶编码序列的示例性公开如下LOXLI由以GenBank/EMBLBC015090 保藏的 mRNA 编码、AAH15090. I ；L0XL2 由以 GenBank/EMBL U89942 保藏的 mRNA编码；L0XL3 由以 GenBank/EMBL AF282619 保藏的 mRNA 编码、AAK51671. I ；L0XL4 由以GenBank/EMBL AF338441 保藏的 mRNA 编码、AAK71934. I。称为前肽原的LOX蛋白初级翻译产物包含从氨基酸1-21延伸的信号序列。此信号序列在小鼠和人LOX中都通过Cys21与Ala22间的切割来胞内释放，从而产生LOX的46-48kDa前肽形式，在本文中也称为全长形式。所述前肽在通过高尔基体时进行N-糖基化以产生50kDa蛋白，然后分泌到胞外环境中。在此阶段，所述蛋白没有催化活性。在小鼠LOX的Glyl68和Aspl69之间、人LOX的Glyl74和Aspl75之间的进一步切割产生成熟、具催化活性的30-32kDA酶，释放18kDa前肽。此最终切割事件由金属内切蛋白酶前胶原C蛋白酶催化，该酶也称为骨形态发生蛋白-I (BMP-I)。有趣的是，该酶还在LOX底物一胶原的加工中发挥作用。此后去除N-糖基单元。预测在可能的信号肽切割位点在L0XL1、L0XL2、L0XL3和L0XL4的氨基末端。所预测信号切割位点为L0XL1在Gly25和Gln26之间，L0XL2在Ala25和Gln26之间，L0XL3在 Gly25 和 Ser26 之间，L0XL4 在 Arg23 和 Pro24 之间。已鉴定L0XL1蛋白的BMP-I切割位点在Ser354和Asp355之间。Borel等(2001)J. Biol. Chem. 276 :48944_48949。已预测其它赖氨酰氧化酶型酶的潜在BMP-I切割位点，预测是根据前胶原和前LOX中BMP-I切割的共有序列位于Ala/Gly-Asp序列，该序列后常有酸性或带电残基。L0XL3中预测的BMP-I切割位点位于Gly447和Asp448之间；加工此位点可产生与成熟LOX大小类似的成熟肽。也在L0XL4内鉴定了潜在的BMP-I切割位点，位于残基 Ala569 和 Asp570 之间。Kim 等(2003) J. Biol. Chem. 278 :52071_52074。L0XL2 也可与其它LOXL家族成员类似地进行蛋白水解切割并分泌。Akiri等(2003)Cancer Res. 63 1657-1666。如赖氨酰氧化酶型酶中存在共有催化结构域所预期，存在活性位点的所述酶原C末端30kDa区的序列高度保守(约95%)。在所述酶原结构域中观察到较为中等的保守性(约 60-70% )。就本公开的目的而言，术语“赖氨酰氧化酶型酶”包括所有上述5种赖氨酸氧化酶(LOX, LOXLl、L0XL2、L0XL3和L0XL4)，也包括基本保留酶活性如催化赖氨酰残基的能力的LOX、LOXLU L0XL2、L0XL3和L0XL4的功能片段和/或衍生物。通常，功能片段和/或衍生物保留其至少50%的赖氨酸氧化活性。在一些实施方式中，功能片段和/或衍生物保留其至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%的赖氨酸氧化活性。赖氨酰氧化酶型酶的功能片段还旨在包括不显著改变催化活性的保守性氨基酸取代(就天然多肽序列而言)。术语“保守性氨基酸取代”指基于某些共有结构和/或性质 的氨基酸分组。就共有结构而言，氨基酸可分成含非极性侧链(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)，含极性非带电侧链(丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸和半胱氨酸)和含极性带电侧链(赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸)。含芳族侧链的氨基酸组包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。脯氨酸、色氨酸和组氨酸中存在杂环侧链。在含非极性侧链的氨基酸组中，具有短烃侧链的氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)可与具有较长、非烃侧链的氨基酸(甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)相区分。在具有极性带电侧链的氨基酸中，酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)可与带碱性侧链的氨基酸(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)相区分。一种确定个体氨基酸共有性质的功能法是分析同源生物体对应蛋白之间氨基酸改变的归一化频率(Schulz, G. E.和 R. H. Schirmer, Principles of ProteinStructure (《蛋白结构原理》)，施普林格出版公司(Springer-Verlag), 1979)。根据此类分析，可限定氨基酸组，同源蛋白中优选用组内的氨基酸相互取代，从而对总体的蛋白结构具有相似的影响(Schulz, G. E.和R. H. Schirmer,《蛋白结构原理》,施普林格出版公司，1979)。根据此类分析，可确定彼此保守性取代的以下氨基酸组(i)含带电基团的氨基酸，由Glu、Asp、Lys、Arg和His组成，(ii)含带正电基团的氨基酸，由Lys、Arg和His组成，(iii)含带负电基团的氨基酸，由Glu和Asp组成，(iv)含芳族基团的氨基酸，由Phe、Tyr和Trp组成，(V)含氮环基团的氨基酸，由His和Trp组成，(vi)含大的脂肪族非极性基团的氨基酸，由Val、Leu和Ile组成，(vii)含微极性基团的氨基酸，由Met和Cys组成，(viii)含小残基的氨基酸，由 Ser、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gin 和 Pro 组成，(ix)含脂肪族基团的氨基酸，由Val、Leu、Ile、Met和Cys组成，以及(X)含羟基的氨基酸，由Ser和Thr组成。因此，如上所示范，氨基酸的保守性取代为本领域技术人员已知且可常规进行而不改变所得分子的生物学活性。本领域技术人员还认识到，多肽非必需区域的单一氨基酸取代通常不显著改变生物学活性。参见例如Watson等，“Molecular Biology of theGene(《基因分子生物学》)”第4版，1987，加利福尼亚州门洛帕克的本杰明/卡明斯出版公司(The Benjamin/Cummings Pub. Co.),第 224 页。其它关于赖氨酰氧化酶型酶的信息，参见例如Rucker等(1998)Am. J. Clin.Nutr. 67 :996S-1002S 和 Kagan 等(2003) J. Cell. Biochem 88 :660_672。还参见共有的美国专利申请公开号2009/0053224 (2009年2月26日提交)和2009/0104201 (2009年4月23日提交)，所述公开通过引用纳入本文。赖氨酰氧化酶型酶活性的调节剂赖氨酰氧化酶型酶活性的调节剂包括激活剂(激动剂)和抑制剂(拮抗剂)，可用多种筛选实验选择。在一种实施方式中，可通过确定测试化合物是否结合赖氨酰氧化酶型 酶来鉴定调节剂；其中如果发生结合，所述化合物是候选调节剂。任选地，可用这种候选调节剂完成其它试验。或者，可使候选化合物接触赖氨酰氧化酶型酶，分析该赖氨酰氧化酶型酶的生物学活性；改变所述赖氨酰氧化酶型酶生物学活性的化合物是赖氨酰氧化酶型酶的调节剂。通常，降低赖氨酰氧化酶型酶生物学活性的化合物是该酶的抑制剂。赖氨酰氧化酶型酶活性的调节剂的其它鉴定方法包括在含一种或多种赖氨酰氧化酶型酶的细胞培养物中孵育候选化合物并分析所述细胞的一种或多种生物学活性或特征。改变培养中细胞的生物学活性或特征的化合物是赖氨酰氧化酶型酶活性的潜在调节齐U。例如，可分析的生物学活性包括赖氨酸氧化、过氧化物生成、氨生成、赖氨酰氧化酶型酶的水平、编码赖氨酰氧化酶型酶的mRNA水平和/或赖氨酰氧化酶型酶的一种或多种特异性功能。在上述实验的其它实施方式中，未接触所述候选化合物时，一种或多种生物学活性或细胞特征与一种或多种赖氨酰氧化酶型酶的水平或活性相关联。例如，所述生物学活性可以是细胞功能如迁移、趋化性、上皮-间质转化，所述变化通过与一种或多种对照或参比样品比对来检测。例如，阴性对照样品可包括加有候选化合物的赖氨酰氧化酶型酶水平降低的培养物；或赖氨酰氧化酶型酶含量与测试培养物相同但没有加入候选化合物的培养物。在一些实施方式中，含不同赖氨酰氧化酶型酶水平的单独培养物与候选化合物接触。如果观察到生物活性变化，且如果所述变化在赖氨酰氧化酶型酶水平较高的培养物中更大，则该化合物鉴定为赖氨酰氧化酶型酶的活性调节剂。确定化合物是赖氨酰氧化酶型酶的激活剂还是抑制剂，可从该化合物诱导的表型中显现，或可能需要进一步实验，例如测试该化合物对一种或多种赖氨酰氧化酶型酶的酶活性的影响。本领域已知获得赖氨酰氧化酶型酶的生化或重组方法，以及上述鉴定赖氨酰氧化酶型酶活性调节剂的细胞培养和酶实验方法。赖氨酰氧化酶型酶的酶活性可通过许多不同方法分析。例如，评价赖氨酰氧化酶活性可通过检测和/或定量过氧化氢、铵离子和/或醛的生成，通过分析赖氨酸氧化和/或胶原交联，或通过测量细胞侵袭力、细胞粘附、细胞生长或转移性生长。参见例如Trackman等(1981)Anal. Biochem. 113 :336-342 ;Kagan 等(1982)Meth. Enzymol. 82A :637-649 ;Palamakumbura 等(2002)Anal. Biochem. 300 :245-251 ；Albini 等(1987)Cancer Res. 47 3239-3245 ;Kamath 等(2001) Cancer Res. 61 :5933-5940 ;美国专利第 4，997，854 号和美国专利申请公开第2004/0248871号。例如，测试化合物包括但不限于有机小分子(如分子量为约50-约2，500Da的有机分子)，核酸或蛋白。所述化合物或多种化合物可化学合成或微生物学法生成和/或包含于例如来自如植物、动物或微生物的样品如细胞提取物中。此外，所述化合物在本领域已知，但迄今未知能否调节赖氨酰氧化酶型酶的活性。分析赖氨酰氧化酶型酶调节剂的反应混合物可以是无细胞提取物或可包括细胞培养物或组织培养物。例如，多种化合物可以加入反应混合物、加入培养基、注入细胞或给予转基因动物。例如，所述试验中采用的细胞或组织可以是细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、脊椎动物细胞、哺乳动物细胞、灵长类动物细胞、人细胞或者可包括或获自非人转基因动物。本领域技术人员已知用于产生和筛选大型文库的一些方法以鉴定对靶标如赖氨酰氧化酶型酶有特异亲和性的化合物。这些方法包括噬菌体展示法，其中从噬菌体展示随机肽并用固定受体通过亲和层析进行筛选。参见例如WO 91/1727UW0 92/01047和美国专利第5，223，409号。在另一方法中，用光刻法合成固定在固相载体(例如“芯片(chip)”)上的聚合物组合库。参见例如美国专利第5，143，854号、WO 90/15070和WO 92/10092。使固定的聚合物接触带标记受体(例如赖氨酰氧化酶型酶)并扫描载体以确定标记位置，从而鉴定结合所述受体的聚合物。已描述了在连续纤维素膜载体系统上合成和筛选肽库，其可用于鉴定感兴趣多肽(例如赖氨酰氧化酶型酶)的结合配体,参见例如Kramer (1998)Methods Mol. Biol. 87 25-39。这类试验鉴定的配体是感兴趣蛋白的候选调节剂,可选择用于进一步测试。例如，此方法还可用于确定感兴趣蛋白中的结合位点和识别基序。参见例如Rudiger (1997)EMBOJ. 16 :1501-1507 和 Weiergraber(1996)FEBS Lett. 379 :122-126。WO 98/25146描述了筛选复合物库中具所需性质化合物的其它方法，所需性质如激活、结合、或拮抗多肽或其细胞受体的能力。这些库中的复合物包括测试化合物、记录该化合物合成中至少一步的标记、易为受体分子修饰的栓系(tether)。用系丝的修饰表明复合物含有具备所需性质的化合物。可解码标记来揭示这种化合物合成中的至少一步。鉴定与赖氨酰氧化酶型酶相互作用的化合物的其它方法是，例如，带噬菌体展示系统的体外筛选、滤膜结合试验、用例如BIAcore设备(法玛西亚公司(Pharmacia)) “实时”测量相互作用。
所有这些方法可根据本文使用以鉴定赖氨酰氧化酶型酶或相关多肽的激活剂/激动剂和抑制剂/拮抗剂。合成赖氨酰氧化酶型酶调节剂的另一方法是使用肽的模拟类似物。例如，可通过用立体异构体即D-氨基酸取代天然产生的氨基酸来生成模拟肽类似物；参见例如Tsukida(1997) J. Med. Chem. 40 :3534-3541。此外，可将前模拟组分纳入肽以重建可能在移除部分原始多肽时丧失的构象性质。参见例如Nachman (1995) Regul. Pept. 57 :359_370。另一构建肽模拟物的方法是将非手性0-氨基酸残基纳入肽，引起脂肪链的聚甲烯单元取代酰胺键。Banerjee (1996) Biopolymers 39 :769_777。其它系统中小肽激素的超活性拟妝类似物已有描述。Zhang(1996)Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 :327-331。赖氨酰氧化酶型酶调节剂的肽模拟物还可通过经连续酰胺烷化合成肽模拟物组合库，然后测试所得化合物如测试其结合和免疫学性质来鉴定。产生和使用拟肽组合库的方法已有描述。参见例如 Ostresh(1996)Methods in Enzymology 267 :220-234 和Dorner (1996) Bioorg. Med. Chem. 4 :709_715。此外,一种或多种赖氛酸氧化酶型酶的三维和/或晶体结构可用于设计一种或多种赖氨酰氧化酶型酶活性的肽模拟抑制剂。Rose (1996)Biochemistry 35 :12933-12944 ；Rutenber (1996)Bioorg. Med. Chem. 4 :1545-1558。基于结构设计和合成模拟天然生物多肽活性的低分子量合成分子进一步描述于例如 Dowd (1998) Nature Biotechnol. 16 :190-195 ；Kieber-Emmons (1997) CurrentOpinion Biotechnol. 8 :435-441 ；Moore (1997)Proc. West Pharmacol. Soc. 40 :115-119 ；Mathews(1997)Proc.West Pharmacol.Soc.40 121-125 ；和 Mukhija(1998)EuropeanJ. Biochem. 254 :433_438。本领域技术人员还熟知能设计、合成和评估有机小化合物的模拟物，例如，所述模拟物能用作赖氨酰氧化酶型酶的底物或配体。例如，已描述海帕洛素(hapalosin)的D-葡萄糖模拟物在拮抗细胞毒性中多重耐药性辅助相关蛋白(multidrug resistanceassitance-associated protein)中呈现与海帕洛素类似的与海帕洛素类似的功效。Dinh (1998) J. Med. Chem. 41 :981_987。 可研究赖氨酰氧化酶型酶结构以引导选择调节剂如小分子、肽、肽模拟物和抗体。赖氨酰氧化酶型酶的结构特性有助于鉴定结合赖氨酰氧化酶型酶或作为其配体、底物、结合伴侣或受体的天然或合成分子。参见例如Engleman(1997) J. Clin. Invest. 99 2284-2292。例如，可用合适计算机程序进行赖氨酰氧化酶型酶结构基序的折叠模拟和计算机重设计。Olszewski (1996)Proteins 25 :286-299 ；Hoffman (1995) Comput. Appl.Biosci. 11 :675-679。蛋白质折叠的计算机建模可用于详细肽和蛋白结构的构象和能量分析。Monge (1995) J. Mol. Biol. 247 :995-1012 ；Renouf (1995) Adv. Exp. Med. Biol. 376 37-45。合适程序可用于鉴定赖氨酰氧化酶型酶中与配体和结合伴侣相互作用的位点，使用计算机辅助搜索互补肽序列。Fassina(1994) Immunomethods 5:114-120。设计蛋白和肽的其它系统描述于如 Berry (1994) Biochem. Soc. Trans. 22 :1033-1036 ；ffodak(1987)，Ann.N. Y. Acad. Sci. 501 :1-13 ;和 Pabo (1986) Biochemistry 25 :5987-5991。上述结构分析所得结果可用于例如制备作为一种或多种赖氨酰氧化酶型酶活性调节剂的有机分子、肽和肽模拟物。赖氨酰氧化酶型酶的抑制剂可以是竞争性抑制剂、无竞争性抑制剂、混合抑制剂或非竞争性抑制剂。竞争性抑制剂通常具有与底物的结构类似性，常结合活性位点，在底物浓度较低时更有效。存在竞争性抑制剂时表观Km提高。无竞争性抑制剂一般结合酶-底物复合体或结合在底物结合活性位点后变得可用的位点，且可使活性位点变形。存在无竞争性抑制剂时表观Km和Vmax都降低，底物浓度对抑制影响很小或没有。混合抑制剂能结合游离酶和酶-底物复合体并因而影响底物结合和催化活性。非竞争性抑制是混合抑制的特殊情况，其中所述抑制剂以相等亲和力结合酶和酶-底物复合体，且抑制不受底物浓度影响。非竞争性抑制剂一般在活性位点之外区域结合酶。关于酶抑制的其它详情参见例如Voet等(2008)，同上。有些酶如赖氨酰氧化酶型酶的酶，其天然底物(例如胶原、弹性蛋白)通常在体内以极大过量(与体内能获得的任何抑制剂的浓度相比)存在，非竞争性抑制剂对于这些酶具有优势，因为抑制独立于底物浓度。抗体在某些实施方式中，赖氨酰氧化酶型酶的调节剂是抗体。在其它实施方式中，抗体是赖氨酰氧化酶型酶活性的抑制剂。
本文所用的术语“抗体”指含有的肽序列(例如可变区序列)特异性结合抗原表位的分离或重组多肽结合剂。所述术语以广义使用，特别涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、纳米抗体、双抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)，以及包括但不限于Fv、scFv、Fab、Fab' F{ah' )；^PFab2的抗体片段，只要它们表现出所需生物学活性。术语“人抗体”指含人来源序列的抗体，除了可能的非人CDR区以外，并且不意味着存在免疫球蛋白分子的完整结构，只要所述抗体在人体中具有最小的免疫原性效果(即不诱导临床显著生成其自身抗体)。“抗体片段”包括全长抗体的部分，例如全长抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的示例包括Fab、Fab'、F(ab' )2,和Fv片段；双抗体；线性抗体(Zapata等(1995) ProteinEng. 8(10) :1057-1062);单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生称为“Fab”片段的各具有单个抗原结合位点的2种相同抗原结合片段以及剩余“Fe”片段，Fe的命名反映了易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有2种抗原组合位点且仍能交联抗原的F(ab' )2片段。“Fv”是含有完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。此区域由一条重链和一条轻链可变区的紧密、非共价结合的二聚体组成。此构型中各可变区的所有3种CDRS相互作用以在Vh-' 二聚体表面确定抗原结合位点。所述6种CDR共同赋予抗体抗原结合特异性。然而，单个可变区(或仅含6种抗原特异性CDR其中3种的分离Vh或 '区)仍能识别和结合抗原，尽管亲和力一般低于完整Fv片段。在重链和轻链可变区外，“Fab”片段还含有轻链恒定区和重链第一恒定区(CH1)。最初在木瓜蛋白酶消化抗体后观察到Fab片段。Fab'片段与Fab片段的差异在于F(ab')片段在重链CH1结构域羧基末端含有一些其它残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。F(ab' )2片段含有通过二硫键在铰链区附近连接的2个Fab片段，其最初在胃蛋白酶消化抗体后观察到。Fab' -SH是本文中对Fab'片段的标识，其中恒定区的半胱氨酸残基携带游离巯基。抗体片段的其它化学偶联也已知。任何脊椎动物种抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区氨基酸序列分入称为K和\的2种显著不同类型中的一种。根据重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可分成5个主要类别IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可进一步分成亚类(同种型)，例如 IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2。“单链Fv”或“sFv”或“scFv”抗体片段包含抗体的Vh和\结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。在一些实施方式中，所述Fv多肽还包括Vh和\结构域间的多肽接头，使所述sFv能形成抗原结合所需的结构。关于sFv的综述参见Pluckthun, ThePharmacology of MonoclonalAntibodies (《单克隆抗体药理学》)，第 113 卷(Rosenburg和Moore编)，纽约的施普林格出版公司，第269-315页(1994)。术语“双抗体”指具有2个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包括在同一多肽链(Vh-VJ中接有轻链可变区的重链可变区(Vh)。通过使用短到使同一链的2个结构域间不能配对的接头，迫使所述结构域与另一链的互补结构域配对，从而产生2个抗原结合位点。例如，双抗体另外描述于EP 404, 097 ；W0 93/11161和Hollinger等(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444-6448。“分离”抗体是从其天然环境组分中鉴定并分离和/或回收的抗体。其天然环境组分可包括酶、激素和其它蛋白或非蛋白溶质。在一些实施方式中，分离的抗体纯化到(I)按罗氏蛋白质定量法所测定，抗体大于95重量％，例如大于99重量％，(2)纯化程度足以获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基，例如通过使用转杯测序仪，或(3)通过在还原或非还原条件下凝胶电泳(例如SDS-PAGE)，由考马斯蓝或银染检测达均质性。术语“分离”抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为将缺少所述抗体天然环境中的至少一种组分。在某些实施方式中，通过至少一个纯化步骤制备分离抗体。在一些实施方式中，抗体是人源化抗体或人抗体。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体互补决定区(CDR)的残基由来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔中具有所需特异性、亲和性和性能的CDR残基取代。因此，非人(例如小鼠)抗体的人源化形式是含有非人免疫球蛋白衍生最小序列的嵌合免疫球蛋白。所述非人序列主要位于可变区，具体在互补决定区(CDR)中。在一些实施方式中，人免疫球蛋白的Fv构架残基由相应的非人残基取代。人源化抗体还可包括在受体抗体或输入CDR或构架序列中都未发现的残基。在某些实施方式中，人源化抗体包括至少I种且通常2种可变区的几乎全部，其中全部或几乎全部CDR对应于非人免疫球蛋白且全部或几乎全部框架区是人免疫球蛋白共有序列的框架区。就本公开的目的而言，人源化抗体还可包括免疫球蛋白片段，如 Fv、Fab、Fab'、F(ab' )2或抗体的其它抗原结合亚序列。所述人源化抗体还可包括至少部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常为人免疫球蛋白的 Fe。参见例如 Jones 等(1986)Nature 321 :522-525 ；Riechmann 等(1988)Nature 332 323-329 ;和 Presta(1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593_596。本领域已知使非人抗体的人源化方法。一般，人源化抗体具有引自非人来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”或“供体”残基，其一般获自“输入”或“供体”可变区。例如，可基本根据Winter和其同事的方法进行人源化，通过用啮齿动物⑶R或⑶R序列取代人抗体的对应序列。参见例如Jones等，同上；Riechmann等，同上和Verhoeyen等(1988) Science 239:1534-1536。因此，这种“人源化”抗体包括嵌合抗体(美国专利第4，816，567号)，其中显著少于完整人可变区的序列被非人物种的对应序列取代。在某些实施方式中，人源化抗体是其中一些CDR残基和可选的一些框架区残基由啮齿动物抗体(例如小鼠单克隆抗体)类似位点的残基取代的人抗体。例如，还可用卩遼菌体展示库生成人抗体。Hoogenboom等(1991) J. Mol. Biol, 227 :381 ;Marks等(1991) J. Mol. Biol. 222 :581。制备人单克隆抗体的其它方法描述于Cole等(1985) “Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (《单克隆抗体和癌症治疗》)”ARL出版社(Alan R.Liss),第 77 页，和 Boerner 等(1991) J. Tmmuno 1. 147 :86_95。可通过将人免疫球蛋白位点基因座引入转基因动物(例如小鼠)来制备人抗体，该动物中内源免疫球蛋白基因已部分或完全灭活。免疫攻击时，观察到人抗体生成，其与人体中所见在各方面相类似，包括基因重排、拼装和抗体库。例如，此方法描述于美国专利号 5，545,807 ;5，545，806 ;5，569,825 ;5，625，126 ;5，633，425 ;5，661，016，以及以下科学出版物=Marks 等(1992)Bio/Technology 10:779-783(1992) ;Lonberg 等(1994)Nature 368 :856-859 ；Morrison(1994)Nature 368 :812-813 ;Fishwald 等(1996)NatureBiotechnology 14 :845-851 ；Neuberger(1996)Nature Biotechnology 14:826;和Lonberg 等(1995)Intern. Rev. Immunol. 13 :65-93。
可如上所述用已知的选择和/或突变方法使抗体亲和性成熟。在一些实施方式中，亲和性成熟抗体的亲和性是制备该成熟抗体的起始抗体(一般是小鼠、兔、鸡，人源化或人)亲和性的5倍或更高、10倍或更高、20倍或更高、或者30倍或更高。抗体还可双特异性抗体。双特异性抗体是对至少2种不同抗原有结合特异性的单克隆抗体，且可以是人或人源化抗体。本情况中，所述2种不同结合特异性可针对2种不同赖氨酰氧化酶型酶或单一赖氨酰氧化酶型酶上的2种不同表位。本文所述抗体还可以是免疫偶联物。这类免疫偶联物包括偶联第二分子如报告子的抗体(例如针对赖氨酰氧化酶型酶)。免疫偶联物还可包括与细胞毒性剂如化疗剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素(例如提供放射偶联物)偶联的抗体。“特异性结合”或“特异于”特定多肽或特定多肽表位的抗体结合该特定多肽或表 位而不显著结合任何其它多肽或多肽表位。在一些实施方式中，本文的抗体特异性结合其靶标，以单克隆抗体、scFv、Fab形式或其他抗体形式，在约4°C、25°C、37°C或42°C的温度下测得的解离常数(Kd)等于或小于100nM，可选低于10nM，可选低于InM，可选低于0. 5nM，可选低于0. InM，可选低于0. OlnM,或可选低于0. 005nM。在某些实施方式中，本文的抗体结合赖氨酰氧化酶型酶中的一个或多个加工位点(例如蛋白裂解位点)，从而有效阻断酶原或前原酶加工成催化活性酶，以降低赖氨酰氧化酶型酶的活性。在某些实施方式中，和与其它赖氨酰氧化酶型酶如LOXLl、L0XL3和L0XL4的结合亲和性相比，本文所述的抗体结合人LOX和/或人L0XL2的亲和性更高，例如高10倍，至少100倍，或甚至至少1000倍。在某些实施方式中，本文所述的抗体是赖氨酰氧化酶型酶催化活性的非竞争性抑制剂。在某些实施方式中，本文所述的抗体在赖氨酰氧化酶型酶催化域外结合。在某些实施方式中，本文所述的抗体结合L0XL2的SRCR4结构域。在某些实施方式中，结合L0XL2的SRCR4结构域并用作非竞争性抑制剂的抗L0XL2抗体是本文和共有美国专利申请公开号US2009/0053224及US 2009/0104201中所述的AB0023抗体。在某些实施方式中，结合L0XL2的SRCR4结构域并用作非竞争性抑制剂的抗L0XL2抗体是本文和共有美国专利申请公开号US 2009/0053224 及 US 2009/0104201 中所述的 AB0024 抗体(AB0023 抗体的人形式)。可选地，本文所述的抗体不仅结合赖氨酰氧化酶型酶，还减少或抑制赖氨酰氧化酶型酶的摄取或内化，例如经整合蛋白P I或其它细胞受体或蛋白。例如，这种抗体可以结合胞外基质蛋白、细胞受体和/或整合蛋白。共有的美国专利申请公开号US 2009/0053224和US 2009/0104201中提供了对识别赖氨酰氧化酶型酶的示例性抗体和涉及赖氨酰氧化酶型酶抗体的其它说明，所述专利申请通过引用纳入用以描述赖氨酰氧化酶型酶抗体、其生产和应用。调节赖氨酰氧化酶型酶的多核苷酸反义可通过下调赖氨酰氧化酶转录或翻译水平的表达来实现赖氨酰氧化酶型酶的调节(例如抑制)。一种这类调节方法包括使用能序列特异性结合编码赖氨酰氧化酶型酶的mRNA转录物的反义寡核苷酸或多聚核苷酸。
反义寡核苷酸(或反义寡核苷酸类似物)与靶mRNA分子的结合可导致胞内RNA酶H酶切割所述杂交体。在某些情况中，形成反义RNA-mRNA杂交体可干扰正确剪接。这两种情况中，适合翻译的完整、功能性靶mRNA数量减少或消去。在其它情况中，反义寡核苷酸或寡核苷酸类似物与靶mRNA的结合可防止(例如通过位阻)核糖体结合，从而防止mRNA翻译。反义寡核苷酸可包括任何核苷酸亚基类型，例如它们可以是DNA，RNA,类似物如肽核酸(PNA)，或上述的混合物。RNA寡核苷酸与靶mRNA分子形成更稳定的双链体，但未杂交的寡核苷酸在胞内的稳定性低于其它类型的寡核苷酸和寡核苷酸类似物。这可通过利用为此目的设计的载体在细胞内表达RNA寡核苷酸来抵消。例如，此方法可用于尝试靶向编码高丰度且长寿命蛋白的mRNA。设计反义寡核苷酸时可考虑其它方面，包括(i)结合靶序列的充分特异性；(ii)溶解性；(iii)抵御胞内和胞外核酸酶的稳定性；(iv)穿透细胞膜的能力；和(V)用于处理 生物体时的低毒性。已有算法根据引起靶mRNA和寡核苷酸结构改变能量的热动力学循环来鉴定与革巴mRNA具有最高预测结合亲和性的寡核苷酸序列。例如，Walton等(1999)Biotechnol.Bioeng. 65 :1_9使用这种方法设计针对兔-球蛋白(RBG)和小鼠肿瘤坏死因子-(TNF )转录物的反义寡核苷酸。同一研究组还报道了细胞培养中针对3种模型靶mRNA(人乳酸脱氢酶A和B及大鼠gpl30)所合理选定的寡核苷酸的反义活性在几乎所有情况中证实有效。这包括在2种细胞类型中使用通过磷酸二酯和硫代磷酸化学制备的寡核苷酸针对3种不同靶标的测试。此外，有多种利用体外系统设计和预测特定寡核苷酸功效的方法。参见例如，Matveeva 等(1998)Nature Biotechnology 16:1374-1375。本文所述的反义寡核苷酸包括具有至少10个核苷酸的多聚核苷酸或多聚核苷酸类似物，例如，具有10-15个、15-20个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少22个、至少25个、至少30个或甚至至少40个核苷酸。这种多聚核苷酸或多聚核苷酸类似物能在生理条件下与编码赖氨酰氧化酶型酶如LOX或L0XL2的mRNA在体内退火或杂交(即基于碱基互补性形成双链结构)。本文所述的反义寡核苷酸可由给予细胞或组织的核酸构建物表达。可选地，反义序列表达受诱导型启动子控制，从而反义序列的表达可在细胞或组织中打开和关闭。或者，反义寡核苷酸可化学合成并直接给予细胞或组织，例如，作为药物组合物的一部分。反义技术可产生高度精确的反义设计算法和各种寡核苷酸递送系统，从而使本领域普通技术人员能设计和实施适于下调已知序列表达的反义方法。涉及反义技术的其它信息参见例如 Lichtenstein 等 “Antisense Technology A Practical Approach (《反义技术实践方法》)”牛津大学出版社(Oxford University Press), 1998。小RNA 和 RNAi抑制赖氨酰氧化酶型酶活性的另一方法是RNA干扰(RNAi)，该方法使用与靶mRNA同源并导致其降解的双链小干扰RNA(siRNA)分子。Carthew(2001) Curr. Opin. Cell.Biol. 13 :244-248oRNA干扰通常是两步法。在称为起始步骤的第一步中，输入dsRNA被消化成21_23个核苷酸(nt)的小干扰RNA(siRNA)，这可能是通过双链特异性核糖核酸酶RNA酶III家族成员切酶(Dicer)的作用，该酶以ATP依赖性方式切割双链RNA。例如，输入RNA可直接或者经转基因或病毒递送。连续切割事件使RNA降解成19-21bp双链体(siRNA)，各具有2-核苷酸的 3’突出端。Hutvagner 等(2002) Curr. Opin. Genet. Dev. 12 :225-232 ；Bernstein (2001)Nature 409 :363_366。在第二个效应步骤中，siRNA双链 体结合核酸酶复合体以形成RNA诱导沉默复合体(RISC)。激活RISC需要siRNA双链体的ATP依赖性解旋。然后，活性RISC(含有单一siRNA和RNA酶)通过碱基配对相互作用靶向同源转录物且通常将mRNA从siRNA的3’末端起切割成约12个核苷酸的片段。Hutvagner等，同上；Hammond等(2001) Nat. Rev. Gen. 2 110-119 ；Sharp (2001) Genes. Dev. 15 :485_490。RNAi 和相关方法也描述于 Tuschl (2001) Chem. Biochem. 2 :239-245 ;Cullen (2002)Nat. Tmmuno1. 3 :597_599 ；和 Brantl (2002)Biochem. Biophys. Acta. 1575 15-25。适用于本文作为赖氨酰氧化酶型酶活性抑制剂的RNAi分子的示例性合成策略是扫描起始密码子下游合适mRNA序列的AA 二核苷酸序列。各AA和所述下游(即3’毗邻)19个核苷酸记录为潜在siRNA靶位点。优选编码区的靶位点，因为结合mRNA未翻译区(UTR)的蛋白和/或翻译起始复合体可干扰siRNA内切核酸酶复合体的结合。Tuschl (2001)，同上。但应理解，针对非翻译区的siRNA也可有效，已证实针对GAPDH基因5 ’ UTR的siRNA介导细胞 GAPDH mRNA 降低约 90% 且完全消除蛋白水平(www. ambion. com/ tech lib/tn/91/912.html)。一旦如上所述获得一组潜在靶位点，使用序列比对软件(如获自NCBI的BLAST软件,WWW. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/))比较潜在祀标的序列与合适基因组数据库(例如人、小鼠、大鼠等)。排除与其它编码序列有显著同源性的潜在靶位点。选择合格的靶序列作为siRNA合成模板。选定序列可包括低G/C含量的序列，因为这些序列在调节基因沉默中显示比G/C含量高于55 %的序列更有效。可沿靶基因长度选择多个靶位点用于评估。为了更好地评估选定siRNA，组合使用阴性对照。阴性对照siRNA可包括核苷酸组成与测试siRNA相同，但与所述基因组缺乏显著同源性的序列。因此，例如，可使用siRNA的混杂核苷酸序列，只要它不显示与任何其它基因的显著同源性。本文的SiRNA分子可从表达载体中转录，所述载体一旦引入宿主细胞能促进siRNA转录物的稳定表达。这些载体经工程改造以表达小发夹RNA (shRNA)，shRNA在体内加工成能实施基因特异性沉默的siRNA分子。参见例如Brummelkamp等(2002) Science 296 550-553 ;Paddison 等(2002)Genes Dev. 16 :948-958 ；Paul等(2002)Nature Biotech. 20 505-508 ；Yu 等(2002)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 :6047_6052。小发夹RNA(shRNA)是形成双链、发夹环结构的单链多核苷酸。所述双链区由第一序列和第二序列形成，所述第一序列可与靶序列如编码赖氨酰氧化酶型酶的多核苷酸(例如LOX或L0XL2mRNA)杂交，所述第二序列与所述第一序列互补。所述第一和第二序列形成双链区；而位于第一和第二序列之间的未碱基配对接头核苷酸形成发夹环结构。shRNA的双链区(茎)可包括限制性内切核酸酶识别位点。shRNA分子可具有可选的核苷酸突出端，如2_bp突出端，例如3’ UU-突出端。尽管可有变化，茎长度范围通常为约15-49、约15-35、约19-35、约21_31bp，或约21_29bp，环大小范围可为约4-30bp，例如约4-23bp。对于细胞内的shRNA表达，可采用含启动子(例如RNA聚合酶III Hl-RNA启动子或U6RNA启动子)、插入shRNA编码序列的克隆位点和转录终止信号(例如4_5个腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基对的延伸)的质粒载体。聚合酶III启动子一般具有明确的转录起始和终止位点，其转录物缺乏聚(A)尾。这些启动子的终止信号由聚胸腺嘧啶道确定，所述转录物通常在第二编码尿苷后切割。此位置的切割在所表达shRNA中产生3’UU突出端，其与合成siRNA的3’突出端类似。上面引用的参考文献描述了在哺乳动物细胞中表达shRNA的其它方法。 合适shRNA表达载体的一个示例是pSUPER (华盛顿州西雅图的OE有限公司(Oligoengine, Inc.))，包括具有明确转录起始位点和终止信号的聚合酶III Hl-RNA基因启动子，所述终止信号由5个连续腺嘌呤-胸腺喃唳对组成。Brummelkamp等，同上。在第二尿苷(在终止序列编码的5个之中)后的位点切割转录产物，产生类似合成siRNA末端的转录物，其还包含核苷酸突出端。将待转录成shRNA的序列克隆入这类载体，从而它们产生的转录物含有通过短接头相隔开的第一序列和第二序列，所述第一序列与部分mRNA靶 标(例如编码赖氨酰氧化酶型酶的mRNA)互补的第一序列，所述第二序列含有第一序列的反向互补序列。所得转录物自身向后折叠以形成介导RNA干扰(RNAi)的茎-环结构。另一合适的siRNA表达载体在单独pol III启动子调控下编码有义和反义siRNA。Miyagishi 等(2002) Nature Biotech. 20 :497_500。此载体产生的 siRNA 还包括 5 个胸腺嘧啶(T5)的终止信号。siRNA、shRNA和/或其编码载体可通过多种方法引入细胞，例如脂转染。还开发了载体介导的方法。例如，可用逆转录病毒将siRNA分子递送到细胞内。在某些情况下，用逆转录病毒递送siRNA可提供优势，因为逆转录病毒递送能有效、均一且可立即选择稳定“敲减”细胞。Devroe 等(2002) BMC Biotechnol. 2 :15。近期科学出版物证实这种短双链RNA分子在抑制靶mRNA表达中的功效并因而清楚证明这类分子的治疗潜力。例如，已利用RNAi抑制感染丙肝病毒的细胞(McCaffrey等(2002)Nature 418 :38-39)、HIV-1 感染细胞(Jacque 等(2002)Nature 418 :435-438)、宫颈癌细胞(Jiang 等(2002)Oncogene 21 :6041-6048)和白血病细胞(Wilda 等(2002)Oncogene 21 :5716-5724)。调节赖氨酰氧化酶型酶表达的方法调节赖氨酰氧化酶型酶活性的另一方法是调节其编码基因的表达，如果基因表达受到抑制则产生较低水平的活性，如果基因表达激活则产生较高水平的活性。可通过多种方法实现细胞中基因表达的调节。例如，通过链置换或三螺旋形成结合基因组DNA(例如赖氨酰氧化酶型基因的调控区)的寡核苷酸可阻断转录，从而防止赖氨酰氧化酶型酶表达。对此，描述了所谓“转回”化学连接的用途，其中寡核苷酸识别其靶标一条链上的聚嘌呤延伸和另一链上的同型嘌呤序列。还可用含人工碱基的寡核苷酸获得三螺旋形成，从而扩展了涉及离子强度和PH的结合条件。例如，赖氨酰氧化酶型酶编码基因的转录调节还可通过将含功能结构域和DNA结合域的融合蛋白、或编码这种融合蛋白的核酸引入细胞。例如，功能结构域可以是转录激活域或转录抑制域。示例性转录激活域包括VP16、VP64和NF- K B的p65亚基；示例性转录抑制域包括KRAB、KOX和v-erbA。在某些实施方式中，这类融合蛋白的DNA结合域部分是在赖氨酰氧化酶型酶编码基因或其附近结合、或在该基因调控区结合的序列特异性DNA结合域。DNA结合域可天然结合于基因或调控区或其毗邻序列，或者可改造成如此结合。例如，可从天然产生的蛋白中获得所述DNA结合域，所述蛋白调节赖氨酰氧化酶型酶编码基因的表达。或者，所述DNA结合域可改造成结合在赖氨酰氧化酶型酶编码基因内或其附近或者该基因调控区中的选择序列。锌指DNA结合域对此有用，因为能改造锌指蛋白以结合任何选择的DNA序列。锌指结合域包括一种或多种锌指结构。Miller等(1985)EMB0 J 4 :1609-1614 ；Rhodes (1993)Scientific American，2月56-65 ;美国专利第6，453，242号。通常，单个锌指长约30个氨基酸且包含4个锌-配位氨基酸残基。结构研究证明典型(C2H2)锌指基序包含堆积靠向a螺旋(一般包含2个锌-配位组氨酸残基)的2个P片层(保持于P转角，一般含有 2个锌-配位半胱氨酸残基)。 锌指包括典型C2H2锌指(即其中锌离子通过2个半胱氨酸和2个组氨酸残基配位)和非典型锌指，例如C3H锌指(其中锌离子通过3个半胱氨酸残基和I个组氨酸残基配位)和C4锌指(其中锌离子通过4个半胱氨酸残基配位)。非典型锌指还可包括其中非半胱氨酸或组氨酸的氨基酸取代这些锌-配位残基之一的锌指。参见例如WO 02/057293 (2002年
7月 25 日)和 US 2003/0108880 (2003 年 6 月 12 日)。可改造锌指结合域以具有和天然产生锌指蛋白相比的新结合特异性；从而可构建改造成结合选择序列的锌指结合域。参见例如Beerli等(2002)Nature Biotechnol. 20 135-141 ；Pabo 等(2001)Ann. Rev. Biochem.70 :313-340 ;Isalan 等(2001)NatureBiotechnol. 19 :656-660 ；Segal 等(2001)Curr. Opin. Biotechnol. 12 :632-637 ；Choo 等(2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10 :411_416。改造方法包括但不限于合理设计和各种经验选择方法。例如，合理设计包括使用含三联(或四联)核苷酸序列和个体锌指氨基酸序列的数据库，其中三联或四联核苷酸序列各与一个或多个结合具体三联或四联序列的锌指氨基酸序列相关联。参见例如美国专利号6，140,081 ;6，453，242 ;6，534，261 ;6，610，512 ；6，746,838 ;6，866，997 ;7，030，215 ;7，067，617 ;美国专利申请公开号 U. S. 2002/0165356 ；2004/0197892 ；2007/0154989 ；2007/0213269 ;和国际专利申请公开号 WO 98/53059 和 WO2003/016496。示例性选择方法包括噬菌体展示、相互作用陷阱、杂交选择和双杂交系统，其公开于美国专利号 5，789，538 ;5，925，523 ;6，007，988 ;6，013，453 ;6，140，466 ;6，200，759 ；6，242，568 ;6，410，248 ;6，733，970 ;6，790，941 ;7，029，847 和 7，297，491 ；以及美国专利申请公开号 2007/0009948 和 2007/0009962 ；W0 98/37186 ；W0 01/60970 和 GB 2，338，237。例如，提高锌指结合域的结合特异性描述于美国专利号6，794，136 (2004年9月21日)。涉及指间接头序列的其它锌指改造方面公开于美国专利号6，479，626和美国专利申请公开号 2003/0119023。还参见例如 Moore 等(2001a)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1432-1436 ；Moore 等(2001b)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 :1437-1441 和 WO 01/53480。
关于使用含经改造锌指DNA结合域的融合蛋白的更多细节参见例如美国专利 6，534，261 ;6，607，882 ;6，824，978 ;6，933，113 ;6，979，539 ;7，013，219 ;7，070，934 ；7，163,824 和 7，220,719。调节赖氨酰氧化酶型酶表达的其它方法包括定向诱变基因或控制该基因表达的调控区。例如，在美国专利申请公开2005/0064474、2007/0134796和2007/0218528中提供了使用含核酸酶结构域和改造DNA结合域的融合蛋白的定向诱变的示例性方法。制剂、药盒和给予途径还提供了含鉴定为赖氨酰氧化酶型酶活性调节剂(例如赖氨酰氧化酶型酶的抑制剂或激活剂)的化合物的治疗组合物。这些组合物通常包括调节剂和药学上可接受的载体。补充的活性化合物也可纳入所述组合物。可使用赖氨酰氧化酶型酶的活性调节剂，特别是抑制剂，例如与化疗剂或抗肿瘤剂联用以减少或去除结缔组织形成和/或成纤维细胞 激活。因此，本文所述治疗组合物可包含赖氨酰氧化酶型酶活性调节剂和一种或多种化疗剂或抗肿瘤剂。在其它实施方式中，治疗性组合物包括治疗有效量的赖氨酰氧化酶型酶活性调节剂，但不含有化疗剂或抗肿瘤剂，所述组合物与化疗剂或抗肿瘤剂分开给予。本文所用的术语“治疗有效量”或“有效量”指单独或与另一治疗剂联合给予细胞、组织或对象(例如哺乳动物如人或非人动物，如灵长类动物、啮齿动物、牛、马、猪、羊等)时，有效防止或缓解疾病病症或疾病进展的治疗剂含量。治疗有效剂量还指足以引起症状完全或部分缓解如治疗、治愈、防止或缓解相关医学病症或者治疗、治愈、防止或缓解这些病症的速度提高的化合物量。例如，赖氨酰氧化酶型酶活性抑制剂的治疗有效量随着疾病或紊乱类型、疾病或紊乱的广泛性、患有疾病或紊乱的生物体大小而改变。本文所述治疗组合物用于减少由肿瘤生长和/或纤维化引起的结缔组织形成等。因此，赖氨酰氧化酶型酶(例如L0XL2)活性调节剂(例如抑制剂)的“治疗有效量”是引起结缔组织形成和/或结缔组织形成相关症状减轻的量。例如，当赖氨酰氧化酶抑制剂是抗体且所述抗体在体内给予时，取决于例如体重、给予途径、疾病严重性等，正常剂量可从每天约10ng/kg变化到多至100mg/kg哺乳动物体重或更高,例如约I微克/千克/天_50毫克/千克/天，如约30毫克/千克/天，任选约100微克/千克/天-20毫克/千克/天，500微克/千克/天-10毫克/千克/天，或I毫克/千克/天-10毫克/千克/天。还可不按每日方案来给予剂量，例如每周一次，每周二次，每周三次，每10天一次，每两周一次，或每月一次。剂量可以例如从每剂量约10ng/kg到多至100mg/kg哺乳动物体重或更高，例如约I微克/千克/剂量-50毫克/千克/剂量，如约30毫克/千克/剂量，任选约100微克/千克/剂量-20毫克/千克/剂量，500微克/千克/剂量-10毫克/千克/剂量，或I毫克/千克/剂量-10毫克/千克/剂量，或约15毫克/千克/剂量。在一个实施例中，剂量为约15/毫克/千克，每周给予两次。治疗期可为例如2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周或14周或更久。剂量方案可包括每两周给予某剂量(例如从每剂量约10ng/kg到多至100mg/kg哺乳动物体重或更高，例如约I微克/千克/剂量-50毫克/千克/剂量，如约30毫克/千克/剂量，任选约100微克/千克/剂量-20毫克/千克/剂量，500微克/千克/剂量-10毫克/千克/剂量，或I毫克/千克/剂量-10毫克/千克/剂量，或约15毫克/千克/剂量)。赖氨酰氧化酶型酶活性调节剂与化疗剂或抗肿瘤剂联用时，也可以指所述组合的治疗有效剂量，该剂量是引起结缔组织形成减少的所述调节剂与化疗剂或抗肿瘤剂的组合量，无论是组合、依序或同时给予。大于一种的浓度组合可以是治疗有效的。根据本公开，本领域技术人员已知各种药物组合物和其制备及应用技术。合适药物组合物和其给予技术的详细列表可参见本文的详细说明，并可由例如以下的教材进一步补充Remington ' s Pharmaceutical Sciences (《雷明顿药物科学》)，第 17 版，1985 ;Brunton 等,“Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics (《古德曼吉尔曼治疗学的药理学基础》)”，麦格劳希尔公司(McGraw-Hill)，2005 ;费城科学大学(编)，“Remington :The Science and Practice of Pharmacy (《雷明顿药物科学和实践》)，，，Lffff 出版社(Lippincott Williams & Wilkins)，2005 ;和费城科学大学(编)，“Remington The Principles of Pharmacy Practice (《雷明顿:药物实践原理》)”, Lffff 出版社，2008。公开的治疗组合物还包括药学上可接受的材料、组合物或载剂,如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，即运载体。这些运载体参与将主题调节剂从一个器 官或机体区域转运到另一器官或机体区域。各运载体从与制剂的其它成分的相容性和对患者无害的意义上而言应“可接受”。能用作药学上可接受运载体的材料的一些示例包括糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素和其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可油和栓剂蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯,如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂,如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原水；等渗盐水；林格溶液；乙醇；磷酸盐缓冲液；和药物制剂中采用的其它无毒相容性物质。所述组合物中还可存在湿润剂，乳化剂和润滑剂如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂，释放剂，涂覆剂，甜味剂，增味剂和芳香剂，防腐剂和抗氧化剂。本文的另一方面涉及给予赖氨酰氧化酶型酶活性调节剂的药盒。本文的另一方面涉及组合给予赖氨酰氧化酶型酶活性调节剂和化疗剂或抗肿瘤剂的药盒。在一个实施方式中，药盒包括配制于药物运载体中的赖氨酰氧化酶型酶活性抑制剂(例如L0XL2抑制剂，如抗L0XL2抗体)，可选含有至少一种化疗剂或抗肿瘤剂，适当配制成一种或多种单独药物制剂。制剂和递送方法可根据结缔组织形成的位置和程度调整。示例性制剂包括但不限于适于胃肠外给药例如静脉内、动脉内、眼内或皮下给药的制剂，包括包封于胶束、脂质体或药物释放胶囊(活性药剂纳入设计用于缓慢释放的生物相容性包衣内)的制剂；可摄取的制剂；外用制剂，如滴眼剂、乳膏、油膏和凝胶；和其它制剂如吸入剂、气溶胶和喷雾剂。本文的化合物剂量根据治疗需求的程度和严重性、所给予组合物的活性、对象的整体健康状况和技术人员熟知的其它考量而变化。可给予治疗组合物以通过任何适当途径减少肿瘤生长引起的结缔组织形成，所述途径使组合物沿着相邻间质组织递送到肿瘤-间质界面(即肿瘤周边(例如肿瘤囊))和/或肿瘤外间质组织。在其它实施方式中，本文所述组合物局部递送。局部递送可使组合物非全身递送到例如伤口或纤维化区域，比全身递送降低了组合物的身体负担。例如，这种局部递送可通过使用各种医疗植入装置实现或者通过注射或手术实现，所述装置包括但不限于支架和导管。本领域已确立包封、植入、包埋、和使所需药剂附于医疗装置如支架和导管的其它方法，本文已考虑。抗L0XL2 抗体针对L0XL2的单克隆抗体描述于共有的美国专利申请公开号US2009/0053224 (2009年2月26日)。此抗体命名为AB0023。感兴趣的抗体是所含重链具有 AB0023 的 CDR(CDR1、CDR2 和 CDR3)和所含轻链具有 AB0023 的 CDR(CDR1、CDR2 和 CDR3)的抗体。其重链可变区的CDR和间插构架区序列如下(CDR1、CDR2和CDR3的序列有下划线) MEWSRVFIFLLSVTAGVHSQVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTYYLIEffVKQRPGQGLEfflGVINPGSGGTNYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAYYFCARNWMNFDYffGQGTTLTYSS(SEQ ID NO 1)还提供了与SEQ ID NO 1的同源性为75%或更高、80%或更高、90%或更高、95%或更高、或99 %或更高的其它重链可变区氨基酸序列。AB0023抗体轻链可变区的⑶R和间插构架区序列是(⑶R1、⑶R2和⑶R3的序列有下划线)MRCLAEFLGLLVLWIPGAI⑶IVMTQAAPSVSVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYffFLQRPGQSPQFLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO 2)还提供了与SEQ ID NO 2的同源性为75%或更高、80%或更高、90%或更高、95%或更高、或99 %或更高的其它轻链可变区氨基酸序列。上述抗L0XL2单克隆抗体的人源化形式描述于共有的美国专利申请公开号US2009/0053224 (2009年2月26日)。示例性人源化抗体命名为AB0024。感兴趣的人源化抗体是所含重链具有AB0024的CDR(CDR1、CDR2和CDR3)和所含轻链具有AB0024的CDR(CDR1、⑶R2和⑶R3)的抗体。其重链可变区的⑶R和间插构架区序列如下(CDR1XDR2和⑶R3的序列有下划线) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTYYLIEffVRQAPGQGLEfflGVINPGSGGTNYNEKFKGRATITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARNWMNFDYffGQGTTVTVSS(SEQ ID NO :3)还提供了与SEQ ID NO 3的同源性为75%或更高、80%或更高、90%或更高、95%或更高、或99 %或更高的其它重链可变区氨基酸序列。AB0024抗体轻链可变区的⑶R和间插构架区序列是(⑶R1、⑶R2和⑶R3的序列有下划线)DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSKSLLHSNGNTYLYffFLQKPGQSPQFLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO 4) 还提供了与SEQ ID NO :4的同源性为75%或更高、80%或更高、90%或更高、95%或更高、或99 %或更高的其它轻链可变区氨基酸序列。共有的美国专利申请公开号US 2009/0053224(2009年2月26日)公开了其它抗L0XL2抗体序列包括可变区、构架区氨基酸序列和互补决定区氨基酸序列的其它人源化形式，所述专利申请的公开通过引用全文纳入本文用以提供各种抗L0XL2抗体的氨基酸序列。
实施例实施例I :组织和细胞系细胞系获自ATCC (弗吉尼亚州的马纳萨斯)且根据实验维持于DMEM+10% FBS或无血清DMEM中。实施例2 :构建体和表达载体产生人、大鼠和猕猴L0XL2表达载体通过PCR从正常大鼠cDNA (心、肾、骨胳肌和结肠cDNA的混合物，美国博诚研究中心(Biochain Institute))中克隆大鼠 L0XL2,使用 Platinum Pfx DNA 聚合 酶(英杰公司(Invitrogen))和引物 5’ atggagatcccttttggctc 3，(SEQ ID NO:5)和5’ ttactgcacagagagctgatta3’ (SEQ ID NO :6)。在 94°C起始孵育 4 分钟后，运行 94°C 15秒、55°C 30秒和68°C 2. 5分钟的30轮PCR。PCR片段经凝胶纯化(凝胶提取试剂盒，凯杰公司(Qiagen))并验证序列(MCLab,加利福尼亚州的南旧金山)。正确的克隆通过PCR使用引物 5，atagctagcgccaccatggagatcccttttggctc 3，(SEQ ID NO 7)和 5，tatactcgagtctgcacagagagctgattatttag3，(SEQ ID NO :8)扩增(如上所述,但进行 18 轮)，克隆至IjpSecTag2hygro_B (英杰公司)中NheI和XhoI位点处,并验证序列。称猴L0XL2通过PCR (如上所述)从正常cDNA(胃、肾、结肠、阴茎和骨胳肌cDNA的混合物，美国博诚研究中心)中克隆，使用引物 5，cctgtcccccctgagcctggcacag3，(SEQ ID NO :9)和 5，ttactgcggggagagctggttgttcaagag3’(SEQ ID NO : 10)(产生具有不完整信号肽的片段)，正确的ORF序列通过多重PCR反应的比对来确定。所述序列克隆到pSecTag2hygro载体中(切除外源信号肽)在 SfiI 和 NotI 位点，使用引物 5，tataggcccagccggcccagtatgacagctggccc3，(SEQ ID NO 11)和 5，tatagcggccgcctgcggggagagctggttg3，(SEQ ID NO :12),并验证序列(MCLab)。人L0XL2由复能基因公司(Genecopoeia,马里兰州德国镇)组装入pReceiverM08载体并包含血凝素(HA)和his6标签。无催化活性的L0XL2由GeraNeufeld实验室(Technion,以色列理工学院)馈赠，其在赖氨酸酪氨酰醌(LTQ)区中具有Y689F突变。实施例3 :抗体生成和纯化杂交瘤细胞在低IgG DMEM、10%胎牛血清、含青霉素/链霉素、5%杂交瘤克隆因子和HT培养基补充物中生长。BALB/c小鼠中产生腹水，通过含MabSelect树脂(GE健康公司(GE Health))的填充床层析纯化抗体。分批结合后，收集流通物且用10倍柱体积的pH 7. 4的PBS清洗树脂。用pH 3的0. IM柠檬酸洗脱抗体。用I : 10体积0. IM Tris pH8. 0中和洗脱物并在0. 01%吐温20/PBS中4°C透析过夜。小鼠抗人L0XL2抗体(AB0023)通过用全长L0XL2蛋白免疫而获得，并经SEC-HPLC(Tosoh TSKGEL G3000SWXL 7. 8X300)纯化。采用分析型尺寸排阻层析评价抗体稳定性和纯度。在SDS-PAGE考马斯(英杰公司BT 4-12%凝胶)还原和非还原凝胶上运行纯化的AB0023以评估纯度。通过ELISA检测效力以测定Kd，用Amplex Red实验(分子探针(Molecular Probes) /英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)测定对L0XL2酶活性的影响。通过280nm吸光度测量抗体浓度，所用消光系数Abs 0.1%为I. 4。用等电聚焦(英杰公司pH 3-10IEF凝胶)进行身份鉴定分析。对于安全分析，以0. 01-lEU/ml的敏感度测量内毒素水平(查尔斯河实验室(Charles River) EndoSafe PTS)。用具有氨基酸序列DTYERPRPGGRYRPGC(SEQ ID NO :13)的肽来免疫获得抗LOX抗体。实施例4 :纯化L0XL2和L0XL2片段Ni-琼脂糖凝胶(GE医疗保健公司(GE Healthcare))树脂用0. IM Tris-HCL pH8. 0平衡。将条件培养基上样到已平衡的树脂上。上样后，用0. IM Tris-HCL pH 8.0,0. 25MNaCl、0. 02M咪唑清洗镍亲和柱。用0. IM Tris pH 8. 0,0. 150M NaCl、0. 3M咪唑进行洗脱。用4-12% BisTris凝胶(英杰公司)进行还原样品上的SDS-PAGE以测定纯度。然后将纯 化蛋白在0. 05M硼酸盐pH 8. 0中4°C透析过夜。实施例5 :免疫荧光实验罗丹明鬼笔环肽染色在染色日之前24小时，细胞以80%融合度接种于8腔室玻片。24小时后，吸出培养基并用PBS清洗腔室。然后将细胞用4%多聚甲醛(PFA)室温固定20分钟，随后用0.5%皂苷(JT贝克公司(JT Baker)，新泽西州菲利普斯堡)室温渗透5分钟。然后将细胞用
I 100稀释的罗丹明鬼笔环肽(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)室温染色15分钟。用Vectashield (载体实验室公司(Vector Laboratories),加利福尼亚州伯林盖姆)封固玻片。L0X、L0XL2和I型胶原的共定位免疫荧光将Hs578t细胞接种于8腔室载玻片(BD珐康公司(BD Falcon)，新泽西州富兰克林湖)并孵育过夜。就低融合度而言，细胞以30-40，000个细胞/玻片接种。采用低融合度条件检测接种24小时后胞质中的L0X。就高融合度而言，细胞以100，000个细胞/玻片接种。采用高融合度条件检测接种约48-72小时后的基质关联LOX和胶原。细胞孵育24小时后，将抗LOX或抗L0XL2mAb在常规生长培养基中加至玻片，终浓度为lug/ml，玻片孵育约24小时。24小时后，移除培养基，用IxPBS清洗细胞。然后，细胞在4%多聚甲醛(PFA)中室温固定20分钟。对于胶原检测，在用4% PFA固定细胞前I小时加入抗胶原抗体(I 50抗I型胶原兔多克隆，新泽西州吉布斯敦的卡尔生物化学公司(Calbiochem))并用抗兔Cy3 (杰克逊免疫实验室(ImmunoJackson Labs),宾夕法尼亚州西格洛夫)作为第二抗体来检测。通过室温下加入皂苷缓冲液(含0. 5%皂苷/1% BSA的PBS)到细胞并孵育20分钟使细胞透化。第二抗体(Alexa Fluor 488驴抗小鼠IgG,加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)在室温下加入皂苷缓冲液并孵育30-45分钟。细胞在皂苷缓冲液中清洗3次，然后用Vectashield (载体实验室公司，加利福尼亚州伯林盖姆)封固。实施例6 :基于细胞的实验制备用于蛋白质印迹分析的细胞裂解物和条件培养基样品Hs578T、MDA-MB-231、MCF7、A549 和 HFF 细胞系在补充有 10% FBS(PAA，加拿大安大略的怡陶碧谷)和L-谷氨酰胺(密迪亚泰克有限公司(Mediatech)，弗吉尼亚州马纳萨斯)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，弗吉尼亚州马纳萨斯)中培养。细胞在常氧(95 %空气，5 % CO2)或低氧(2 % O2，5 % CO2，用N2平衡)条件下37 °C培养。收集条件培养基(无FBS的DMEM)并用Amicon Ultra-4 (密理博公司，马萨诸塞州比尔里卡)浓缩。刮下细胞、在8M尿素(溶于16mM Na2HPO4)中涡旋振荡并超声处理。然后用Amicon Ultra_15(密理博公司，马萨诸塞州比尔里卡)浓缩细胞裂解物。浓缩的条件培养基和细胞裂解物与SDS样品缓冲液(波士顿生物制品公司(Boston Bioproducts),马萨诸塞州伍斯特)混合并在95°C煮沸5分钟。通讨含L0XL2的培养某诱导EMT样表型在接触条件培养基(CM)前24小时，MCF7或SW620细胞以50，000个细胞/孔接种于HGDMEM(含4. 5g/l葡萄糖的高葡萄糖达氏修正伊氏培养基)+10% FBS、2mM L-谷氨酰胺中的8腔室培养玻片。将来自MDA MB 231细胞的500ul新鲜条件培养基加入含MCF7细胞的腔室。用CM孵育细胞48-96小时。来自MCF7或SW620细胞的条件培养基用作阴性对照。CM孵育48-96小时后，如上所述将细胞用罗丹明鬼笔环肽染色。L0XL2 CM处理的SW620细朐中EMT样夺化需要L0XL2催化活件 大鼠、猕猴和人L0XL2 (野生型和Y689F突变体)单独转染入T175瓶中的HEK293细胞，根据生产商说明使用脂质体2000转染剂(Lipofectamine 2000,加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)。转染后4小时吸出转染培养基并用30mlDMEM+0. 5% FBS替换，细胞在37°C、5% CO2生长72小时。收集条件培养基，在10，000丽截止柱(密理博公司)中浓缩 IOX并经0. 2um滤器(Aerodisk公司)过滤。三维I型胶原凝胶HFF细胞以2x IO5个细胞/孔的密度在6孔板内的2mg/ml或3mg/ml I型胶原凝胶中生长。Wozniak MA和Keely PJ(2005)Biological Procedures Online 7(1) :144_161。简而言之，用中和溶液(含IOOmM HEPES的PBS，pH 7. 3)混合I型胶原(BD生物科学公司(BD Biosciences))且将含10% FBS和2mM L-谷氨酰胺的Iml RPMI (密迪亚泰克有限公司)中的HFF细胞加入孔内。板在37°C孵育30分钟，然后加入2ml/孔的RPMI/10 % FBS/2mM谷氨酰胺培养基。通过用小吸管端移动凝胶使一半凝胶浮于孔中，另一半则保持附着。在第4、7和8天收集等分的条件培养基，用SDS-PAGE凝胶解析，通过印迹将凝胶中的蛋白质转至硝酸纤维素膜。用小鼠抗L0XL2单克隆抗体孵育膜，然后用HRP偶联的山羊抗小鼠抗体(GE医疗保健公司)孵育。用化学发光溶液(阿尔法新技术公司(AlphaInnotech))显现信号并用UVP成像分析。二维聚丙烯酿胺凝胶电泳如前所述(Schlunck等2007)浇注聚丙烯酰胺凝胶并置于6孔板中。细胞以IxIO5个细胞/孔接种于6孔板并在不改变培养基的情况下培养7-8天。然后，移除培养基以分析。然后，裂解凝胶上的细胞以便蛋白质印迹(“Western”)分析或用4%多聚甲醛固定并用罗丹明鬼笔环肽(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)根据生产商建议染色。HFF 细胞中 siRNA 敲减 Lox 和 Lox12用于抑制L0XL2表达的siRNA序列如下5’ -UAU GCU UUC CGG AAU CUC GAG GGU C-3’ (SEQ ID NO 14)(双链寡核苷酸)5’ -UGG AGU AAU CGG AUU CUG CAA CCU C-3’ (SEQ ID NO 15)(双链寡核苷酸)5’ -UCA ACG AAU UGU CAA AUU UGA ACC C-3’ (SEQ ID NO 16)(双链寡核苷酸)
用于抑制LOX表达的siRNA序列如下5’ -AUA ACA GCC AGG ACU CAA UCC CUG U_3，(SEQ ID NO 17)(双链寡核苷酸)将60 微升的 20uM siRNA 混合入 Iml OptiMEM (终 siRNA 为 IOOnM) ；30ulDharmafect 3转染试剂(美国热科学公司(Thermo Scientific),伊利诺伊州芝加哥)混合入Iml OptiMEM 。合并2种混合物并室温孵育20分钟。将HFF细胞在IOcm2细胞培养板上培养，直到其达到约75%融合度，然后进行胰蛋白酶处理并重悬于IOml完全培养基。将2ml转染混合物(如前段所述)加到所述细胞，所得混合物接种于IOcm2培养皿。5天后收获细胞培养物以测量蛋白水平。体外HUVEC实骀将人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)接种于成纤维细胞饲养层并在24孔板内培养于、(龙沙公司(Lonza))的EBM-2培养基(开发用于低血清环境中正常人内皮细胞的基础培养基)中的，所述培养基补充有hEGF、氢化可的松、GA-1000 (庆大霉素，两性霉素-B) ,FBS (胎牛血清)IOml (最终2% )、VEGF、hFGF-B、R3-IGF-l、抗坏血酸和肝素。细胞生长直到培养物显示处于血管形成的最早期阶段。在此时间点(第I天)，将无添加物(对照)、含抗L0XL2抗体AB0023或苏拉明的0. 5ml新鲜内皮细胞生长培养基加入孔中。然后，板在37°C和5%CO2培养。在第4、7和9天，从所有孔中移除培养基并仔细换成含上面所列添加物的0. 5ml新鲜培养基。在第11天，固定板且如下测定小管的⑶31表达。用Iml PBS清洗孔并用Iml冰冷70%乙醇室温固定30分钟。然后，用I : 400稀释在含1% BSA的PBS中的0. 5ml小鼠抗人⑶31抗体37°C孵育细胞60分钟。然后，孔用Iml PBS清洗3次，接着用I : 500稀释在含1% BSA的PBS中的0. 5ml碱性磷酸酶偶联山羊抗小鼠IgG 二抗37°C孵育60分钟。孔再用Iml PBS清洗3次，随后用0. 5ml新鲜制备并过滤的BCIP/NBT底物37°C孵育10分钟。然后，孔用Iml蒸馏水小心清洗3次，空气干燥过夜。用尼康Coolpix相机在徕卡倒置显微镜上以IOx放大拍摄各孔的数码图像。每孔成像4个随机视野，共产生96个图像。然后，图像转成BMP文档并输入图像分析包以测量血管分支数、血管数和血管总长。这些测量的进行通过图像阈值设定为仅检测⑶31染色血管，然后软件对之缩略以产生单一像素宽度血管，从中能测量单独血管长度、血管总长和血管分支点数量。然后，数据输出到Excel以计算各数据集的平均值和标准偏差。用一元方差分析(one way AN0VA)进行基本统计。实施例7 :转移和原发性肿瘤发生的异种移植模型为提供生长肿瘤组织储液用于后续原位移植，5-6周龄裸鼠(NCr nu/nu)右侧胁部皮下注射2x 106MDA-MB-435-GFP细胞(抗癌公司(Anticancer, Inc.),加利福尼亚州圣地亚哥)。为此目的，收获MDA-MB-435-GFP细胞培养物并通过胰蛋白酶处理来解离，用含血清的冷培养基清洗3次，然后留于冰上直到注射。细胞在收获后30分钟内以0. Iml的总体积注入动物胁部皮下空间。在肿瘤细胞注射后4-6周杀死裸鼠以收获肿瘤组织用于手术原位移植(SOI)肿瘤片段。通过手术原位移植(SOI)将肿瘤小块( Imm3)植入雌性裸鼠(NCr nu/nu)乳腺，所述肿瘤小块提取自皮下生长的GFP表达乳腺肿瘤。当平均原发性肿瘤体积达到75mm3时，开始用AB0023 (抗L0XL2单克隆抗体)、M64 (抗LOX单克隆抗体)和载体(全部经腹膜内注射)以及多西他赛(通过静脉内注射)处理。给予小鼠30mg/kg剂量的抗体，每周2次持续28天,给予10mg/kg的多西他赛,每周I次持续3周。每周记录体重和肿瘤大小。研究结束时，在二氧化碳麻醉后通过颈脱位法杀死小鼠。原发性乳腺肿瘤经成像、收获、对称切半并速冻用于组织学和免疫组化分析。实施例8 =CCl4诱发的肝纤维化雄性BALB/c小鼠(10-12周龄)获自阿拉贡生物科学公司(Aragen Biosciences,加利福尼亚州摩根希尔)。小鼠分成4组。3组小鼠注射CCl4 (西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich),密苏里州圣路易斯)，剩余组的小鼠注射盐水。CCl4以lml/kg体重(I I (v/v)比的CCl4 矿物油)腹膜内给予小鼠，每周2次持续4周。对照组中，0.9%盐水(I I (v/v)比的盐水矿物油)腹膜内给予小鼠，使用
同一给药方案。
014处理组中，第一组用AB0023(稀释于PBS/0. 01%吐温-20)处理，第二组用p印4M64(稀释于IOml-组氨酸缓冲液)处理，第三组用载剂(PBST)处理。抗体和载剂以30mg/kg的剂量每周2次腹膜内注射。首次给予CCl4前一天开始处理并持续直到研究结束。给予CCl4和抗体4周后终止研究。给药完成后96小时对小鼠施以安乐死和人道处死并收获肝。速冻肝用于组织学和免疫组化分析。实施例9 :体内基质胶(Matrigel)塞血管生成实验无胸腺雌性NCr nu/nu小鼠胁部皮下注射0. 5ml的补充有100ng/ml FGF和60U肝素的高浓度基质胶(BD生物科学公司，加利福尼亚州圣何塞)。抗体处理开始后I周进行基质胶注射。通过腹膜内注射每周给予2次30mg/kg抗体(或PBST,作为对照)。在移植后10天通过切断胶栓与所附皮肤而收获基质胶栓，用10%中性缓冲福尔马林固定并石蜡包埋。切下5um切片，用苏木精与伊红、抗⑶31或抗⑶34抗体染色以评价血管形成的程度。实施例10 :免疫组化除非另有说明，免疫组化(IHC)操作所用溶液获自保科医学公司(BiocareMedical，加利福尼亚州康科德)。所有过程室温进行。玻片用4% PFA固定10分钟，随后用Peroxidazed-K保科医学公司，加利福尼亚州康科德)处理5分钟。然后，玻片用SNIPER(保科医学公司，加利福尼亚州康科德)封闭背景10分钟。一抗(2-5ug/ml终浓度)用达芬奇绿色通用稀释剂(Da Vinci Green Universal Diluent)稀释并施用于玻片30分钟。然后玻片在PBS-吐温-20中淋洗。用Mach2聚合物试剂盒通过加入兔探针用时30分钟检测抗原。将DAB发色团加至玻片3-5分钟，然后用去离子水淋洗玻片I次。然后用苏木精复染玻片，接着用梯度乙醇脱水。用entellan封片胶(电子显微镜科学公司(ElectronMicroscopy Sciences),宾夕法尼亚州海特菲尔德)封固玻片。实施例11 :IHC图像的定量分析肝纤维化各处理方案随机选择10个视野(或区或叶)且用天狼星红染色。用于评分的区域为I. 7mm X I. 3mm并含有至少8个门三联管。计数完全桥接纤维化的三联管和区。将完全桥接纤维化区的数量除以三联管区的总数，从各场获得完全桥接纤维化百分数。对10个视野的百分数(每种处理)取平均值并计算标准误差。
通过染色aSMA表达分析成纤维细胞激活对于各处理，选择5个视野且用抗a平滑肌肌动蛋白(aSMA)抗体染色。由Metamorph(分子设备公司(Molecular Devices),宾夕法尼亚州唐宁顿)分析肝门区的aSMA阳性信号(阈值面积％ )。比较进行AB0023处理动物的切片中的aSMA阳性信号与载剂(PBS)处理动物的切片所得信号。实施例12 :RT_PCR分析总RNA分离和定量实时PCR
用RNeasy Mini试剂盒(凯杰公司，加利福尼亚州瓦伦西亚)根据生产商说明从冷冻组织块中提取RNA。简而言之，用Polytron手持式电动均质器将组织在RLT裂解缓冲液中均质化，用无核酸酶的水(安碧公司(Ambion)，德克萨斯州奥斯汀)洗脱。用重组DNA酶1(安碧公司，德克萨斯州奥斯汀)去除剩余的基因组DNA污染。用100纳克总RNA/反应进行逆转录酶介导的cDNA合成，随后用BrilliantII qPCR 一步核心试剂盒(安捷伦公司(Agilent)，加利福尼亚州圣克拉拉)进行PCR。反应一式两份在Mx3000P仪器(安捷伦公司，加利福尼亚州圣克拉拉)中进行。通过实时PCRCTaqMan )分析基因表达，使用由Beacon Designer软件针对人(h)和小鼠(m)设计的物种特异性引物和探针组hLOX 正向5’ CTTGACTGGGGAAGGGTCTG 3，(SEQ ID NO: 18)，反向5，AAAACGGGGCTCAAATCACG 3，(SEQ ID NO 19),探针5，ATCCCACCCTTGGCATTGCTTGGT 3，(SEQ ID NO 20)hLOXLl 正向5，AGCAGACTTCCTCCCCAACC 3，(SEQ ID NO 21),反向5，CAGTAGGTCGTAGTGGCTGAAC 3，(SEQ ID NO 22)探针5，CACGGCACACCTGGGAGTGGCAC 3，(SEQ ID NO 23)hL0XL2 正向5，GGGGTTTGTCCACAGAGCTG 3，(SEQ ID NO 24),反向5，ACGTGTCACTGGAGAAGAGC 3’ (SEQ ID NO 25),探针5，TGGAGCAGCACCAAGAGCCAGTCT 3，(SEQ ID NO 26)hL0XL3 正向5，GTGTGCGACAAAGGCTGGAG 3，(SEQ ID NO 27),反向5，CCGCGTTGACCCTCTTTTCG 3，(SEQ ID NO 28),探针5，AAGCCCAGCATCCCGCAGACCAC 3，(SEQ ID NO 29)hL0XL4 正向5，CTTACCACACACATGGGTGTTTC 3，(SEQ ID NO 30),反向5，TCAAGCACTCCGTAACTGTTGG 3，(SEQ ID NO 31),探针5’ CCTTGGAAGCACAGACCTCGGGCA 3’ (SEQ ID NO 32)hACTA2 ( a平滑肌肌动蛋白)正向5’ CTATCCAGGCGGTGCTGTC 3’ (SEQ ID NO 33),反向5，ATGATGGCATGGGGCAAGG 3，(SEQ ID NO 34),探针5，CCTCTGGACGCACAACTGGCATCG 3，(SEQ ID NO 35)
hFNl (纤连蛋白)正向5，TGGGAGTTTCCTGAGGGTTTTC 3，(SEQ ID NO 36),反向5，GCATCTTGGTTGGCTGCATATG 3，(SEQ ID NO 37),探针5，AGGGCTGCACATTGCCTGTTCTGC 3，(SEQ ID NO 38)hV頂(波形蛋白)正向5，CAGGCAAAGCAGGAGTCCAC 3，(SEQ ID NO 39),反向5，CTTCAACGGCAAAGTTCTCTTCC 3，(SEQ ID NO 40),探针5，ACCGGAGACAGGTGCAGTCCCTCA 3，(SEQ ID NO 41) hSNAIl (Snail)正向5，TCAAGATGCACATCCGAAGCC 3，(SEQ ID NO 42),反向5，CAGTGGGGACAGGAGAAGGG 3，(SEQ ID NO 43),探针5，CCTGCGTCTGCGGAACCTGCGG 3，(SEQ ID NO 44)hCOLlAl (I 型胶原)正向5，ACAGAACGGCCTCAGGTACC 3，(SEQ ID NO 45),反向5，TTCTTGGTCTCGTCACAGATCAC 3，(SEQ ID NO 46),探针5，CGTGTGGAAACCCGAGCCCTGCC 3，(SEQ ID NO 47)hRPL19 (核糖体蛋白 L19)正向5’ CCGGCTGCTCAGAAGATAC 3’ (SEQ ID NO 48),反向5，TTCAGGTACAGGCTGTGATACAT 3，(SEQ ID NO 49),探针5，TGGCGATCGATCTTCTTAGATTCACG 3’ (SEQ ID NO 50)mLOX 正向5，CAAGAGGGAAGCAGAGCCTTC 3，(SEQ ID NO 51),反向5，GCACCTTCTGAATGTAAGAGTCTC 3，(SEQ ID NO 52),探针5’ACCAAGGAGCACGCACCACAACGA 3’ (SEQ ID NO 53)mLOXLl 正向5，GGCCTTCGCCACCACCTATC 3，(SEQ ID NO 54),反向5，GTAGTACACGTAGCCCTGTTCG 3，(SEQ ID NO 55),探针5，CCAGCCATCCTCCTACCCGCAGCA 3，(SEQ ID NO 56)mL0XL2 正向5’ GCTATGTAGAGGCCAAGTCCTG 3’ (SEQ ID NO 57),反向5’ CAGTGACACCCCAGCCATTG 3’ (SEQ ID NO 58),探针5’ TCCTCCTACGGTCCAGGCGAAGGC 3’ (SEQ ID NO 59)mL0XL3 正向5，AACGGCAAGCTGTCTGGAAG 3’ (SEQ ID NO 60),反向5，AGCCAACATTGACCTAGCACTG 3，(SEQ ID NO 61),探针5’ TCCCGCCCATTCCCACCCATCTCG 3’ (SEQ ID NO 62)mL0XL4 正向5’ CAAGACAGGTCCAGTAGAGTTAGG 3’ (SEQ ID NO 63),反向5，AGGTCTTATACCACCTGAGCAAG 3’ (SEQ ID NO 64),
探针5’ACAGAGCACAGCCGCCTCACTGGA 3’ (SEQ ID NO :65)mACTA2 ( a平滑肌肌动蛋白)正向5’ TCTGCCTCTAGCACACAACTG 3’ (SEQ ID NO :66)，反向5’ AAACCACGAGTAACAAATCAAAGC 3’ (SEQ ID NO :67)，探针5，TGTGGATCAGCGCCTCCAGTTCCT 3，(SEQ ID NO :68)mFNl (纤连蛋白)正向5，CACCTCTGCTTTCTTTTGCCATC 3，(SEQ ID NO :69)，反向5，CTGTGGGAGGGGTGTTTGAAC 3，(SEQ ID NO :70)， 探针5，TGCAGCACTGTCAGGACATGGCCT 3，(SEQ ID NO :71)mV頂(波形蛋白)正向5，CGCCCTCATTCCCTTGTTGC 3，(SEQ ID NO :72)，反向5’ GGAGGACGAGGACACAGACC 3’ (SEQ ID NO :73)，探针5，TTCCAGCCGCAGCAAGCCAGCC 3，(SEQ ID NO :74)mCOLlAl (I 型胶原)正向5’ CGGCTGTGTGCGATGACG 3’ (SEQ ID NO :75)，反向5，ACGTATTCTTCCGGGCAGAAAG 3，(SEQ ID NO :76),探针5，CAGCACTCGCCCTCCCGTCTTTGG 3，(SEQ ID NO :77)mRPL19 (核糖体蛋 L19)正向5，AGAAGGTGACCTGGATGAGAA 3’ (SEQ ID NO :78)，反向5，TGATACATATGGCGGTCAATCT 3，(SEQ ID NO :79)，探针5，CTTCTCAGGAGATACCGGGAATCCAAG 3，(SEQ ID NO :80)通过肿瘤与正常样品间阈值循环(Ct)的差异计算转录物水平的平均变化倍数。各表达水平根据RPL19基因的表达水平归一化。实施例13 L0XL2在多种肿瘤间质和肝纤维化病理细胞中高表达肿瘤中的L0XL2转录物分析显示大部分主要实体肿瘤中的表达高于非肿瘤组织(小结于图I的A小图)。在一些肿瘤类型中，L0XL2转录物显示出随着分期或分级的提高而增加表达的趋势(如结肠癌、胰腺癌、子宫癌、肾细胞癌、胃癌和头颈癌，图7的A、B、C、D、E、F小图；III级肺腺癌中转录物也提高(未显示))。通过免疫组化进一步研究L0XL2蛋白在肿瘤中的分布和定位，使用L0XL2特异性多克隆抗体(图7的G小图)和经少处理的新鲜冷冻组织。除一些胞质信号外，L0XL2在肿瘤中大量分泌且通常与胶原基质区相关联(图I的B、C、D、E、F小图；图7的11、1、1、1(^、0小图)。在多种实体肿瘤中观察到类似的表达模式，具有间质成纤维细胞和脉管系统以及一些肿瘤细胞区域的L0XL2表达(图I的C、E、F、G、H、I、J ;图7的H-O小图)。图I的k小图显示LOX表达。表达L0XL2的间质成纤维细胞是a SMA阳性(未显示)。在活动性疾病界面如肿瘤-间质边界检测到显著的分泌L0XL2信号(图I的E、F、G小图；图7的H小图)，强L0XL2信号与指示肿瘤相关血管生成的血管球微血管结构相关联(图I的F、I小图)。L0XL2还在高度血管生成性肿瘤如透明细胞性肾细胞癌中高表达(图I的L小图)。相比之下，在大部分非肿瘤组织和主要器官如心、肝和肺中检测到极少L0XL2蛋白(图7的P、R、S ;小结于图7的表I)。与先前报道一致，在生殖器官如卵巢和子宫中观察到一些信号，以及在脾的网状纤维(示例于图7的U、v小图中)和一些非肿瘤性肾区域也观察到。尽管L0XL2在肿瘤相关脉管系统中有高表达，但在健康组织脉管系统中检测到极少L0XL2表达(图7的P、Q、S、T小图)。差异性表达、分泌和与活动性疾病的关联支持在肿瘤学中靶向L0XL2。尽管先前已报道了肿瘤细胞的L0XL2表达(主要是胞质)，此分析显示肿瘤相关间质细胞如TAF和新生血管的广泛表达。此L0XL2定位模式在不同来源的实体肿瘤中保守。相比之下，对肿瘤组织中LOX蛋白测得的主要定位模式是成纤维细胞和内皮细胞以及一些肿瘤细胞的胞质染色，分泌的迹象较少且与肿瘤中胶原基质的关联较少。此表达模式也在不同肿瘤类型中保守(图I的K小图，图7的L、N小图)。与L0XL2相反，在正常组织如动脉和血管及非血管平滑肌中检测到高水平LOX蛋白(图7的W、X、Y、Z小图)。动脉中显著的LOX表达与将牛主动脉描述为经切割酶活性LOX蛋白主要来源的文献报道一致。
还评估纤维化肝中的L0XL2和LOX表达。L0XL2在疾病界面高表达和分泌，所述疾病界面由成纤维细胞、肝细胞、血管和炎性细胞构成(图I的M、N、0小图)。也检测到LOX蛋白，但在成纤维细胞中主要是胞质细胞定位(图I的P小图)。尽管这些疾病的病因不同，但在肿瘤和活性纤维化肝中都观察到类似的LOX和L0XL2表达和定位模式。实施例14 :分泌的L0XL2在体外促进肿瘤细胞的重构和侵袭常氧条件下许多不同肿瘤细胞系表达L0XL2 (图8的A、B小图)。在条件培养基中检测到L0XL2蛋白的全长( 80kDa)和切割蛋白( 55KDa)。与先前的报道相反，对纯化L0XL2蛋白的分析显示这两种L0XL2形式在体外都具有酶活性且为BAPN抑制(图8的C、D小图)。使用免疫荧光和L0XL2特异性单克隆抗体(AB0023)表明L0XL2与其底物I型胶原共定位于肿瘤细胞的胞外基质，与肿瘤组织所得结果一致(图2的A、B小图；图8的E、F、G小图)。相比之下，尽管在来自成骨细胞细胞系的条件培养基中存在分泌的加工L0X(图8的H小图)，在分离自常氧或低氧条件下肿瘤细胞系或者成纤维细胞的条件培养基中未重复检测到L0X(图8的I、J小图)，但在细胞团部分中发现。已描述L0XL2在上皮-间质转换(EMT)中通过与EMT相关转录因子SNAIL直接相互作用而发挥作用。在表达所有5种赖氨酰氧化酶型酶的乳腺癌细胞系MDA-MB-231中通过用shRNA敲减L0XL2去除L0XL2，导致肌动蛋白细胞骨架重构以产生具有肌动蛋白应力纤维关联减少的更上皮化表型(由鬼笔环肽染色呈现，图8的K、L小图)。然而，未观察到L0XL2抑制引起完全间质-上皮转换(MET)样变化，因为细胞对E-钙粘蛋白仍保持阴性。我们通过用来自MDA-MB231或Hs_578t肿瘤细胞、含外源分泌L0XL2的条件培养基处理MCF7细胞(其在常氧条件下表达少量L0XL2)，研究了胞外L0XL2在重构肿瘤细胞的作用。用IgG对照抗体或抑制性L0XL2单克隆抗体AB0023处理条件所述培养基。AB0023结合L0XL2的SRCR3-4区，证明与其它赖氨酰氧化酶型酶没有交叉反应性(图8的M、N小图)，且抑制L0XL2的赖氨酰氧化酶活性(图8的0小图)。AB0023以类似亲和性结合人和小鼠L0XL2 (图8的P小图)。含L0XL2的条件培养基诱发肌动蛋白细胞骨架重构，引起细胞形态拉长且肌动蛋白应力纤维增加，此重构通过加入AB0023来消除(图2的C、D、E、F小图)。然而，用BAPN预孵育条件培养基不抑制此表型变化，即使是用高浓度(2mM，数据未显示)。单用纯化、酶活性L0XL2不能诱发细胞重构，表明细胞分泌的L0XL2与其它蛋白协同诱发这些变化。为进一步研究分泌L0XL2引起表型重构所需的结构域，表达该蛋白的截短和突变形式并评估其诱发此变化的能力，包括N末端SRCR结构域和分泌但没有酶活性的L0XL2变体，所述变体通过突变酶结构域中LTQ形成所需的赖氨酸残基而产生。在条件培养基中表达时，单独SRCR结构域(数据未显示)和无酶活性的L0XL2都不能诱发重构(图8的Q、R、S、T小图)，表明此过程既需要酶结构域也需要酶活性。总之，这些数据支持分泌、有酶活性的L0XL2在肿瘤细胞肌动蛋白细胞骨架趋向更间质化表型的重构中的作用。实施例15 L0XL2在体外和体内促进成纤维细胞激活为研究成纤维细胞对L0XL2分泌的调节，使用包被有胶原基质的双丙烯酰胺交联凝胶和漂浮或附着的胶原凝胶，建立可变张力的体外模型。低张力(0.2%双丙烯酰胺和漂浮胶原凝胶)时，胞内检测到L0XL2蛋白，条件培养基中的分泌蛋白很有限。较高张力(0.8%双丙烯酰胺、附着胶原凝胶和标准组织培养板)时，成纤维细胞大量分泌L0XL2(图3的A小图，图9的A小图)。这些数据表明可通过局部张力变化(例如，与炎症或基质生成或交联相关)诱导L0XL2分泌。在0. 2或0. 8%双丙烯酰胺胶原凝胶或者漂浮或附着胶原凝胶上生长的HFF细胞中都未检测到显著水平的分泌L0X，但仅对于在经组织培养处理的塑料制品上生长的HFF细胞。 考虑到人肿瘤中TAF的L0XL2高表达和L0XL2对肿瘤细胞重构的影响，用siRNA敲减检测L0XL2对成纤维细胞形态的作用。消除HFF中的L0XL2导致胞间构造比对照转染细胞减少。siL0XL2细胞仍分泌I型胶原，但该胶原排列紊乱且缺失对照转染细胞中明显的纤维结构组成(图3的B、C小图；图9的B小图)。用鬼笔环肽染色siL0XL2敲减细胞显示肌动蛋白细胞骨架的巨大变化细胞不太拉长而是更圆，中央或周边肌动蛋白应力纤维减少(图3的D、E小图)。与此表型变化一致，在低张力条件(0. 2%双丙烯酰胺)下生长的分泌较少L0XL2的成纤维细胞显现更圆、肌动蛋白应力纤维减少的上皮样结构，而在较高张力(0.8%双丙烯酰胺)下生长的分泌显著更多L0XL2的细胞呈现更细长、成纤维细胞样表型(图3的F、G小图)。这些发现支持L0XL2通过胶原胞外基质在维持活化成纤维细胞形态和胞内构造中起作用。对L0XL2参与成纤维细胞激活、纤维化和结缔组织形成相关途径进行检测。存在或缺失AB0023情况下，在成纤维细胞或肿瘤细胞系中用I3DGF-BB处理细胞后的10-60分钟时间段没有观察到对AKT磷酸化的显著影响(未显示)。TGFb信号传递的研究证实AB0023在10-60分钟时间框内中度抑制(约10-20% )SMAD2磷酸化。然而，用来自肿瘤细胞系的含L0XL2的条件培养基通过微孔膜共培养更长一段时间来处理HFF细胞后，显现更强烈的影响。72小时后，存在AB0023的共培养引起pSMAD2磷酸化相对减少56-94% (图3，H、I小图)。还观察到a-SMA水平降低41 %。对肿瘤相关成纤维细胞特征性的VEGF蛋白表达的评估显示存在AB0023时减少39-46%。总之，这些数据表明L0XL2不通过直接强化生长因子推动的信号途径起作用，因为在短孵育时间内进行的实验中可预期更显著的影响。相反，这些结果可能表明L0XL2可通过其对胞外基质的活性来介导TGFb信号传递和相关成纤维细胞活性。显示张力增加可诱导胞外基质中潜在复合体的TGFb信号传递激活。因此，这些发现与通过胞外基质中L0XL2诱发变化来调节信号传递相一致，直接或可能经整合蛋白介导的交联纤维胶原感应。通过比较稳定转染有编码L0XL2表达载体的MCF7细胞(MCF7-L0XL2)与MCF7对照细胞的肿瘤形成在体内评估L0XL2表达的结果。转染细胞体外增殖率低于MCF7-对照细胞观察到的增殖率。然而，nu/nu小鼠肾被膜中产生肿瘤后，MCF7-L0XL2细胞比对照MCF7细胞产生更大的肿瘤(体积增加3. 5X)(图3的J小图)。用带小鼠特异性引物的qRT-PCR对这些肿瘤间质组分的分析表明，与对照相比，MCF7-L0XL2细胞诱导间质激活，a SMA、I型胶原、波形蛋白、MMP9和纤连蛋白的转录物增加(图3的K小图)。这些结果支持L0XL2在体内激活和重构肿瘤关联间质中的作用。总之，这些结果提示破坏L0XL2可扰动细胞和其环境间的相互作用，这可能是通过破坏胶原/基质介导的信号传递，导致肌动蛋白细胞骨架的胞内构造和成纤维细胞的胞间构造受到破坏。这些数据还表明L0XL2可在维持更高活化状态中发挥自身刺激作用，并因而对进行中的疾病相关成纤维细胞如TAF和肌成纤维细胞的激活很重要。实施例16 :抗L0XL2抗体AB0023在体外和体内抑制血管生成
分析人肿瘤显示血管球血管和其它新生血管的内皮细胞显著表达L0XL2。已知L0XL2由培养的原代内皮细胞表达并描述为对此情况中的血管弹性组织生成很重要。用siRNA敲减消除HUVEC细胞的L0XL2并检测形态变化。与对照转染细胞相比，siL0XL2 HUVEC细胞显示肌动蛋白应力纤维减少(图4的A、B小图)，与上述L0XL2对成纤维细胞和肿瘤细胞的影响类似。为进一步评价分泌L0XL2的作用，采用体外HUVEC血管形成实验研究抗L0XL2抗体AB0023抑制血管生成的能力。AB0023以剂量依赖性方式抑制血管分支、血管长度和所形成血管的总数，在50ug/ml完全抑制所有过程(图4的C、D、E、F、G、H、I小图)。AB0023抑制这些过程的IC50计算值(图4的G、H、I小图；分别为22. 2nM、19. 9nM、33. 2nM)与体外就AB0023抑制纯化L0XL2酶活性观察到的表观IC50 —致( 30nM)。用含bFGF的基质胶栓评价AB0023体内抑制血管生成的能力，所述胶栓插入Balb/C小鼠胁部。分离自载剂处理动物的胶栓含有由CD31阳性细胞构成的脉管系统侵袭和分支的迹象(图4的J、L小图)，而分离自经AB0023腹膜内注射处理动物的胶栓显示有限的脉管系统迹象，⑶31阳性细胞少很多(图4的K、M小图)。通过IHC确认浸润内皮细胞的L0XL2表达(图10的A、B小图)。定量分析单独胶栓的血管平均数，得到AB0023处理动物减少 7倍(p = 0. 0319 ;图4的N小图)。定量基质胶栓中⑶31阳性细胞的另一分析还显示AB0023处理动物中减少显著(p = 0. 0168 ;图4的0小图)。这些结果表明分泌的L0XL2在血管生成的多个方面发挥重要作用，血管生成在体外和体内都直接受到AB0023抑制。实施例17 :抑制L0XL2在原发性肿瘤和癌的转移性异种移植模型中提供体内治疗益处在弥散型骨转移模型中评价抑制L0XL2或LOX的治疗结果。采用靶向L0XL2或LOX的特异性抗体处理小鼠，所述小鼠的左心室注射 100万个带标记的MDA-MB-231细胞。乳腺肿瘤细胞系MDA-MB-231广泛用作研究LOX的模型，其表达所有5种赖氨酰氧化酶型酶(图11的A小图)。将L0XL2抑制性抗体AB0023减少肿瘤负荷的能力与LOX特异性抗体M64作比较，M64是靶向与上述产生抑制性多克隆抗血清的LOX酶结构域中同一肽序列的单克隆抗体。28天后，抗L0XL2 AB0023处理肿瘤中观察到的股骨和总腹部骨的肿瘤细胞负荷显著减少(股骨中值减少127倍，p = 0. 0021 ;总腹部骨中值减少28倍，p = 0. 0197 ;图5的A、B小图)，但在抗LOX抗体M64处理肿瘤中未见减少(分别为p = 0. 5262和0. 5153 ；图5的A、B小图；还采用高剂量多西他赛(20mg/kg)作为阳性对照)。在另一研究中，在联用每周2次30mg/kg AB0023与每周I次5mg/kg紫杉醇(Paclitaxel)处理的动物中观察到显著的存活益处(P = O. 025)。我们对人肿瘤的分析显示不同癌症的间质细胞有此前尚未认识到的强L0XL2表达。原发性肿瘤生成的异种移植模型通常不是对于肿瘤微环境和人肿瘤中明显的结缔组织形成的好模型，因此评估许多不同细胞系以鉴定产生代表人肿瘤中L0XL2表达的肿瘤形成的模型。选择MDA-MB-435作为分析抗L0XL2抗体AB0023的原发性肿瘤模型，因为这些细胞形成的肿瘤产生结缔组织形成反应并与人肿瘤在L0XL2定位方面具有相似性，在肿瘤-间质界面和胶原基质上有分泌的L0XL2蛋白；并与由成纤维细胞、血管和一些肿瘤细胞表达的L0XL2有相似性(图5的C小图)。MDA-MB-435-产生肿瘤中的LOX定位也与人肿瘤中检测到的模式一致，胞质染色成纤维细胞、肿瘤细胞亚组和血管，有证据显示与所述基质关联的分泌LOX(图5的D小图)。肿瘤初始在nu/nu小鼠胁部增殖，然后植入哺乳动物脂肪垫并使其建立。用抗L0XL2 AB0023处理已建立的原发性肿瘤，肿瘤体积在3周内减小45% (p = 0. 001)。用抗 LOX M64中也观察到较弱的抑制，肿瘤体积减小27% (p = 0. 04)。所述研究再延长2周可产生持续的肿瘤生长。然而，用AB0023处理可使肿瘤体积保持统计上的显著减小(P =0. 024，体积减小33% ;图5的E小图)，但用抗LOX抗体M64处理则不能。总之，这些结果表明抗L0XL2 AB0023在5周内有效减少已建立原发性肿瘤的肿瘤负荷。实施例18 :抑制L0XL2显著减少间质激活且抑制肿瘤微环境产生为进一步研究抗L0XL2 AB0023减小原发性肿瘤体积的机制，在MDA-MB-435所建立原发性肿瘤的研究中，于第39天从载剂处理对照以及抗L0XL2 AB0023处理、抗LOX M64处理、和多西他赛处理组中收获涵盖匹配范围的相对尺寸的肿瘤。对肿瘤进行切片用于组织学和免疫组化，用各种特异性细胞标记的抗体进行分析。令人惊讶的是，AB0023所处理肿瘤的组成不同于所有其它组，包括分离自高剂量多西他赛所处理动物(正对照组)的很小肿瘤，后者尽管尺寸小但在组成上与大许多的载剂处理肿瘤类似。AB0023处理的肿瘤缺乏许多重要的肿瘤微环境特征。具体地，天狼星红染色减少61%证实胶原基质或结缔组织形成显著减少(P = 0. 0027 ;图5的G、N小图)。与此相关，SMA信号评价存在活化TAF时的减少为88% (图5的K、N小图)。在抗LOX M64或多西他赛处理的肿瘤中这些标记都未见显著差异(图5的F-N小图)。在抗L0XL2 AB0023处理的肿瘤中肿瘤脉管系统也显著减少(⑶31信号减少74%，p = 0. 0002 ;图5的N小图)。尽管效率较低，多西他赛处理也减少相对肿瘤脉管系统(⑶31信号减少43%，p = 0. 023 ;图5的N小图)，与先前的报道一致(图5的N小图；图11的B、C、D、E小图)。在使用MDA-MB-435原发性肿瘤模型的独立研究中，直接比较AB0023 (5mg/kg,每周2次)与BAPN(每日100mg/kg)。46天后，AB0023处理的动物中观察到肿瘤体积有类似减小(38.4% ; = 0.04;图5的0小图)。相比之下，每日用BAPN处理的小鼠中观察到肿瘤体积减小19% (统计上不显著)(图5的0小图)。重要的是，对这些肿瘤的间质和基质的分析显示AB0023在抑制间质激活和产生肿瘤基本结构上明显更有效。根据天狼星红染色评价，AB0023处理再次引起胶原生成减少(47%减少，p = 0. 0193)，并且按a SMA阳性测定大幅降低了成纤维细胞激活(>90%减少，p = 0.0161)，与第一研究类似，而用BAPN处理的肿瘤含有结缔组织增生性基质和活化成纤维细胞，与载剂处理的对照类似(图5的P小图)。脉管系统形成再次在AB0023处理的肿瘤中受到显著抑制(⑶31信号减少52%，P = O. 0307)，而BAPN处理不引起肿瘤脉管系统减少(图5的P小图)。总之，这些结果确认了 AB0023在抑制LOXL2介导的肿瘤微环境产生上的有效性。相比之下，泛LOX/L抑制剂BAPN对抑制成纤维细胞激活、结缔组织形成或血管生成无效。考虑到激活的肿瘤相关成纤维细胞在通过血管生成、脉管发生和其它过程促进肿瘤生长中显现的重要作用，以及在抗L0XL2 AB0023处理肿瘤中活化成纤维细胞的大幅减少，研究了 AB0023处理对表达肿瘤发生的其它相关重要因子的影响。TAF引起肿瘤中显著的VEGF生成，人肿瘤中L0XL2和VEGF表达模式的相似性在于TAF关联表达(图11的F、G小图)。分析MDA-MB-435肿瘤显示AB0023处理肿瘤中的VEGF信号比载剂处理肿瘤减少76% (p = 0. 0001 ;图5的Q小图)。对TAF表达的促血管生成和促肿瘤生成细胞因子SDF-1/CXCL12的分析显示相似的信号减少(80%, p = 0. 0205 ;图5的Q小图)。AB0023所处理动物的组织中结缔组织生长因子(CTGF)的水平也有降低。在AB0023处理的肿瘤中L0XL2信号本身减少55% (p = 0.0005)(图5的Q小图；图11的H、I、J、K、L、M小图)。用抗LOX抗体处理的动物中未见这些生长因子水平或L0XL2水平的降低。采用基于组织的ELISA测量转化生长因子P I (TGF- ^ I)和TGF- ^信号传递下游标记磷酸化SMAD2 (PSMAD2)的水平。在AB0023所处理动物的成纤维细胞和肿瘤细胞中这两种蛋白的水平都有减少。在抗LOX处理的动物或未接受抗体的对照中没有观察到相当的减少。这些结果表明抑制L0XL2会阻断肿瘤组织中的TGF-P信号途径，导致肿瘤生长变缓和/或肿瘤细胞死亡。用H&E染色和其它标记分析肿瘤显示AB0023处理的肿瘤中存在成纤维细胞，尽管总体丰度低于载剂处理的对照(图11的N、0小图)。这表明除成纤维细胞激活外，进行的成纤维细胞募集也可能受到抗L0XL2处理影响。总之，这些数据显示AB0023抑制L0XL2会引起TAF激活和成纤维细胞募集的显著减少，关键的血管生成性、脉管发生性和肿瘤关联性因子如VEGF、SDF-I以及L0XL2本身的水平相应地显著降低。AB0023所处理肿瘤中的肿瘤细胞还显示不同于载剂处理的肿瘤细胞。AB0023处理组中的许多肿瘤含有明显坏死区域(图5的R、S小图)，而其它处理组中坏死很少。此夕卜，AB0023处理的肿瘤呈现存活性降低的其它迹象，核的固缩和胞质浓缩增加与早期肿瘤坏死一致，相比之下载剂处理的肿瘤中核完整(图5的T、U小图)。自噬相关蛋白苄氯素(Beclin)-I的水平在来自AB0023处理动物和多西他赛处理动物的肿瘤细胞中有增加，但在抗LOX抗体处理动物或载剂对照的肿瘤细胞中不增加。这些结果与AB0023处理动物的肿瘤细胞由于除去TAF分泌的生长因子而经历坏死和II型自噬性细胞死亡的想法一致，如上所述在AB0023处理动物中TAF的数量有减少。这些分析显示AB0023抑制L0XL2在降低肿瘤负荷和建立肿瘤微环境方面比抗LOX抗体M64或泛L0X/L抑制剂BAPN明显更有效。用特异性单克隆抗体抑制L0XL2提供了新治疗策略的示例,所述策略祀向遗传上比肿瘤细胞更稳定的间质微环境。间质L0XL2表达模式在多种肿瘤间的保守性表明L0XL2抑制剂用于 癌症治疗的广泛适用性。抑制L0XL2活性的结果超出肿瘤基本结构的改变，还包括对TAF生成生长因子、促血管生成蛋白和促血管发生蛋白的影响。因此，抗L0XL2疗法尽管具有高度靶特异性，其具有对肿瘤发展产生不利影响的广泛治疗效果。
实施例19 :抗L0XL2 AB0023体内抑制肝纤维化和肌成纤维细胞激活在Balb/C小鼠中评价抗L0XL2和抗LOX抗体处理对CCl4诱导的肝纤维化的有效性。CCl4注射动物引起的显著死亡程度与肝损伤相关且是纤维发生的证据(图12的A、B小图)，其可通过抗L0XL2抗体AB0023防止，但抗LOX特异性抗体M64则不能(AB0023存活益处的对数秩次检验P = O. 0029，曼泰尔-卡克斯检验p = 0. 0029，图6的A小图)。分析所有组中存活动物的肝显示AB0023显著抑制桥接纤维化(p = 0. 002，图6的B小图；图12的C、D小图)，而抗LOX M64处理尽管显示减少桥接纤维化的趋势，但未达到统计显著性(p=0. 127)。载剂处理(图6的C小图)和M64处理动物的肝门隔含有与桥接纤维化相关的显著a SMA阳性肌成纤维细胞群。与AB0023处理动物中缺失桥接纤维化一致，AB0023处理动物的肝门隔(图6的C、D小图)中a SMA阳性肌成纤维细胞群显著减少，表明AB0023抑制CCl4诱导的疾病相关成纤维细胞激活。图6的e小图提供了 a-SM信号的定量分析，证明AB0023处理动物的肝中桥接纤维化缺失伴随着a -SMA阳性肌成纤维细胞数量的显著减少(P = 0. 0260)。这些结果与肌成纤维细胞体内激活需要L0XL2相一致,与上述涉及间质TAF的观察类似。 参考文献Akagawa, H. , A. Narita 等 (2007). " Systematic screening of lysyloxidase-like(LOXL)family genes demonstrates that L0XL2 is a susceptibility geneto intracranial aneurysms.(系统筛选赖氨酰氧化酶样酶(LOXL)家族基因证明L0XL2是颅内动脉瘤的易感基因)"HumGenet 121 (3-4) :377-87.Akiri, G. , E. Sabo 等.(2003). " Lysyl oxidase-related protein-1 promotestumor fibrosis and tumor progression in vivo.(赖氨酸氧化酶相关蛋白-I体内促进肿瘤纤维化和肿瘤进展)"Cancer Res 63(7) :1657-66.Asuncion, L. , B. Fogelgren 等.(2001). " A novel human lysyl oxidase-likegene(L0XL4)on chromosome 10q24 has an altered scavenger receptor cysteine richdomain.(染色体10q24上的一种新型人赖氨酰氧化酶样基因(L0XL4)具有改变的清除受体半胱氨酸富集结构域)"Matrix Biol 20(7) :487-91. Atsawasuwan, P. , Y. Mochida等.(2008). " Lysyl oxidase binds transforming growth factor-beta and regulatesits signaling via amine oxidase activity.(赖氨酰氧化酶结合转化生长因子-3并通过胺氧化酶活性调节其信号传递)"J Biol Chem 283(49) =34229-40.Atsawasuwan, P. , Y. Mochida 等 (2005). " Expression of lysyl oxidaseisoforms in MC3T3-E1 osteoblastic cells.(在MC3T3-E1 成骨细胞中表达赖氨酸氧化酶同种型)"Biochem Biophys Res Commun 327(4) :1042-6.Bhowmick, N. A. , E. G. Neilson 等.(2004). " Stromal fibroblasts in cancerinitiation and progression (癌症起始和进展中的间质成纤维细胞)"Nature432(7015) :332-7.Cardone, A. , A. Tolino 等 (1997). " Prognostic value of desmoplasticreaction and lymphocytic infiltration in the management of breast cancer.(结缔组织形成反应和淋巴细胞浸润对调控乳腺癌的预后价值)"Panminerva Med 39(3)174-7.
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权利要求
1.一种抑制肿瘤环境中成纤维细胞激活的方法，所述方法包括抑制赖氨酰氧化酶样2 (L0XL2)的活性。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述成纤维细胞激活由转化生长因子-β (TGF-β)信号传递介导。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述L0XL2活性抑制导致胞外基质破坏。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述胞外基质破坏导致肿瘤间质细胞的细胞骨架破裂。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述成纤维细胞是肿瘤相关成纤维细胞(TAF) ο
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述成纤维细胞是肌成纤维细胞。
7.一种抑制肿瘤环境中结缔组织形成的方法，所述方法包括抑制赖氨酰氧化酶样2 (L0XL2)的活性。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述肿瘤是转移性肿瘤。
9.一种抑制肿瘤环境中血管发生的方法，所述方法包括抑制赖氨酰氧化酶样2 (L0XL2)的活性。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述血管发生包括募集血管细胞或血管细胞祖细胞到肿瘤环境。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述血管发生包括血管分支。
12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述血管发生包括血管长度增加。
13.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述血管发生包括血管数量增加。
14.一种减少肿瘤间质中肿瘤相关成纤维细胞(TAF)数量的方法，所述方法包括抑制赖氨酰氧化酶样2 (LOXL2)的活性。
15.一种抑制肿瘤环境中胶原沉积的方法，所述方法包括抑制赖氨酰氧化酶样2 (LOXL2)的活性。
16.一种调节肿瘤环境的方法，所述方法包括抑制赖氨酰氧化酶样2 (LOXL2)的活性。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述调节包括结缔组织形成减少。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述调节包括肿瘤相关成纤维细胞(TAF)数量减少。
19.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述调节包括肌成纤维细胞数量减少。
20.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述调节包括重构细胞的细胞骨架。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述细胞是肿瘤细胞。
22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述细胞是成纤维细胞。
23.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述细胞是内皮细胞。
24.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述调节包括肿瘤脉管系统减少。
25.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述调节包括胶原生成减少。
26.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述调节包括成纤维细胞激活减少。
27.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述调节包括抑制成纤维细胞募集到肿瘤环境中。
28.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述调节包括编码间质组分的基因表达减少。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述间质组分选自下组α平滑肌肌动蛋白、I型胶原、波形蛋白、基质金属蛋白酶9和纤连蛋白。
30.一种调节肿瘤环境中生长因子生成的方法，所述方法包括抑制赖氨酰氧化酶样.2 (LOXL2)的活性。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述生长因子选自下组血管内皮生长因子(VEGF)和间质细胞衍生因子-I (SDF-I)。
32.—种增加肿瘤中坏死的方法，所述方法包括抑制赖氨酰氧化酶样2(LOXL2)的活性。
33.一种增加肿瘤中固缩的方法，所述方法包括抑制赖氨酰氧化酶样2 (LOXL2)的活性。
34.如权利要求1、7、9、14、15、16、30、32或33中任一项所述的方法，其特征在于，所述LOXL2的活性用抗LOXL2抗体抑制。
35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述抗体包括SEQID NO :1所列的重链序列和SEQ ID NO :2所列的轻链序列。
36.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述抗体是人源化抗体。
37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述抗体包括SEQID NO :3所列的重链序列和SEQ ID NO 4所列的轻链序列。
38.如权利要求1、7、9、14、15、16、30、32或33中任一项所述的方法，其特征在于，所述LOXL2的活性用核酸抑制。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述核酸是siRNA。
40.一种鉴定LOXL2抑制剂的方法，所述方法包括分析测试分子调节肿瘤环境的能力。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述调节包括结缔组织形成减少。
42.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述调节包括肿瘤相关成纤维细胞(TAF)数量减少。
43.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述调节包括肌成纤维细胞数量减少。
44.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述调节包括重构细胞的细胞骨架。
45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述细胞是肿瘤细胞。
46.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述细胞是成纤维细胞。
47.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述细胞是内皮细胞。
48.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述调节包括肿瘤脉管系统减少。
49.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述肿瘤脉管系统减少的证据是CD31和/或血管内皮生长因子(VEGF)水平降低。
50.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述调节包括胶原生成减少和/或胶原交联程度降低。
51.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述调节包括成纤维细胞激活减少。
52.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述调节包括抑制成纤维细胞募集到肿瘤环境中。
53.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述调节包括编码间质组分的基因的表达减少。
54.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述间质组分选自下组α平滑肌肌动蛋白、I型胶原、波形蛋白、基质金属蛋白酶9和纤连蛋白。
55.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述调节包括降低肿瘤环境中间质细胞衍生因子-I (SDF-I)的水平。
56.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述调节包括增加肿瘤细胞坏死和/或固缩的发生率。
57.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述测试分子是分子量小于IkD的有机小分子。
58.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述测试分子是多肽。
59.如权利要求58所述的方法，其特征在于，所述多肽是抗体。
60.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述测试分子是核酸。
61.如权利要求60所述的方法，其特征在于，所述核酸是siRNA。
全文摘要
本文公开了通过抑制胞外酶赖氨酰氧化酶样2(LOXL2)的活性来调节肿瘤环境的方法。本文公开的方法在肿瘤中有效减少肿瘤生长、减少细胞募集到肿瘤、减少成纤维细胞激活、减少结缔组织形成、减少血管发生、减少TAF数量、减少生长因子生成、抑制胶原沉积，并提高坏死及固缩。LOXL2活性的示例性抑制剂是抗体和siRNA。
文档编号A61K39/395GK102711821SQ201080047972
公开日2012年10月3日 申请日期2010年8月20日 优先权日2009年8月21日
发明者P·范瓦拉西拉, V·史密斯 申请人:吉联亚生物科技有限公司