专利名称：一种赤芍有效组分的制备方法与用途的制作方法
技术领域：
本发明属于中药领域，涉及中药有效提取物，具体涉及一种从赤芍中提取有效组分的制备方法及其制药用途。
背景技术：
心血管疾病是危害人类健康的第一杀手，近年来，随着我国人口老年化以及人们工作、生活、饮食结构及环境等的变化，冠心病等心脑血管疾病的发生率也逐年增多，严重威胁着人民的身心健康。天然产物中许多活性物质具有抗心肌缺血、缺氧作用，其中一些已开发成治疗冠心病和心绞痛的新药。因而从天然产物中寻找具有抗心肌缺血、缺氧生理活性的有效物质，是发现、开发新药的有效途径之一。我国药用生物资源十分丰富，其生理活性物质是研究和发现新药先导化学物，开发新药的天然宝库。目前，我国从天然产物中提取活性物质，用于开发成治疗冠心病、安全性好、毒性低的新药还很少，从天然产物中提取活性物质，开发成具有抗心肌缺血，用于治疗冠心病和心绞痛的新药，具有重要应用价值和广阔发展前景。赤芍为毛茛科芍药(Paeonialactiflora Pall.)或川赤芍(A veitchii Lynch.)的干燥根。其味苦，微寒，归肝经，具有清热凉血，散瘀镇痛之功效。现代研究表明， 赤芍中主要含有芍药苷、羟基芍药苷、苯甲酰芍药苷、氧化芍药苷、芍药花苷、没食子酰芍药苷等苷类化合物，此外还有环烯醚萜类、三萜类、酚及其苷类、留醇及其苷类、鞣质、酸类、酯类、黄酮类、酮类、烷类、挥发油、糖、氨基酸、蛋白质、脂肪油、树脂、黏液质、生物碱、色素、微量元素等物质。赤芍是传统的活血化瘀类中药，有较强的抗动脉粥样硬化作用，该药也能扩张冠脉血管，增加冠脉血流量从而增加心肌营养性血流量，保护缺血心肌，提高心肌对低氧的耐受性，降低肺血管阻力，减轻后负荷。同时赤芍能够降低门脉高压，对微循环也有影响。药理学研究表明赤芍能抑制血小板聚集，改善红细胞的通透性，增加红细胞对低渗张力的抗性， 有一定稳定红细胞膜结构的作用。另外，赤芍总苷能明显延长大鼠和小鼠的凝血时间，并能延长电刺激大鼠颈总动脉血栓形成的时间，提示赤芍总苷通过对凝血系统和血小板功能的影响而产生抗血栓作用。赤芍具有以上对心血管系统的明显药理作用，因此，从赤芍中分离出有效组分，开发出治疗心血管疾病的现代中药具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种赤芍有效组分的制备方法，通过以下步骤实现将赤芍药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇，加热提取，药渣加乙醇水溶液提取，将提取液浓缩成浸膏，用反相硅胶柱对其进行分离，首先用低浓度甲醇作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改用高浓度甲醇作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件色谱柱为半制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱。该有效组分主要含有没食子酸甲酯、芍药苷或五没食子酰葡萄糖。
本发明优选的赤芍有效组分制备方法，通过以下步骤实现取赤芍药材，将其粉碎后加入体积比为1:1的乙酸乙酯和乙醇，加热回流1小时，提取2次，滤液合并得提取液I。 药渣加入70%乙醇，加热回流1小时，提取2次，滤液合并得提取液II，将提取液II浓缩成浸膏，用50%甲醇溶解浸膏，采用ODS-C18柱对其进行分离，首先用5%甲醇作为流动相，得洗脱液I，然后改用60%甲醇作为流动相，得洗脱液II，浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品制备色谱的分离条件色谱柱为半制备柱(Lichrospher Cl8; 10. Omm χ 250mm, 5 μιη )，流动相为水A和乙腈B，梯度洗脱程序如下0min时，流动相A为90%的水，流动相B为10%的乙腈溶液；15min时，流动相A为75%的水，流动相B为25%的乙腈溶液；时，流动相A为70%的水，流动相B为30%的乙腈溶液；柱温为室温；样品经制备液相色谱分离，在23. 9^26. 8 min时间段收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分。本发明的另一个目的是提供所述赤芍有效组分在制备治疗、预防心血管疾病的药物中的应用。经药理实验证明，本发明提供的赤芍有效组分对心肌细胞有保护作用。本发明的赤芍有效组分可以作为活性成分，加入药剂学上接受的辅料，按照药剂学上记载的制剂的制备方法制成制剂。所述的制剂包括注射液、滴注液、粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口含剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、 丹剂、喷雾剂、滴丸剂、崩解剂、口崩片、微丸等。本发明提供的赤芍有效组分可在制备治疗、预防心血管疾病药物中的应用。本发明提供的制备方法设计合理，能快速准确地得到有效成分，在生产中更易于药物的质量控制。
图1赤芍有效组分的HPLC色谱图(λ =230nm)，其中1没食子酸甲酯，2芍药苷， 3五没食子酰葡萄糖。图2 1号色谱峰质谱图。图3 2号色谱峰质谱图。图4 3号色谱峰质谱图。
具体实施例方式
下面将结合实施例进一步详细说明本发明的实质内容和有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。实施例一赤芍有效组分的制备
将赤芍药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇，加热提取得提取液I，弃之。药渣加入乙醇，加热提取得提取液II，将提取液II浓缩成浸膏，用50%甲醇溶解浸膏，采用ODS-C18柱对其进行分离，首先用低浓度甲醇作为流动相，得洗脱液I，然后改用高浓度甲醇作为流动相，得洗脱液II，浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品，经制备液相色谱分离， 在时间段23. 9^26. Smin收集溶液，浓缩干燥后得到有效组分。实施例二赤芍有效组分的制备
取赤芍药材250g，将其粉碎后加入体积比为1:1的乙酸乙酯和乙醇，加热回流1小时， 提取2次，滤液合并得提取液I。药渣加入70%乙醇，加热回流1小时，提取2次，滤液合并得提取液II，将提取液11浓缩成浸膏，用50%甲醇溶解浸膏，采用ODS-C18柱对其进行分离，首先用5%甲醇作为流动相，得洗脱液I，然后改用60%甲醇作为流动相，得洗脱液II，浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品制备色谱的分离条件色谱柱为半制备柱(Lichrospher C18 ； 10. Omm ,、250mm, 5 μ ι )，流动相为水A和乙腈B，梯度洗脱程序如下0min时，流动相A为90%的水，流动相B为10%的乙腈溶液；15min时，流动相A为75% 的水，流动相B为25%的乙腈溶液；时，流动相A为70%的水，流动相B为30%的乙腈溶液；流速为3ml/min，柱温为室温；样品经制备液相色谱分离，在时间段23. 9^26. Smin收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分。该有效组分主要含有没食子酸甲酯、芍药苷、五没食子酰葡萄糖，其色谱图及质谱图见图广4。实施例三滴丸制剂的制备
取赤芍有效组分0. 5g与10. 5g聚乙二醇-20000混合均勻，加热熔融，化料后移至滴丸滴灌中，药液滴至6、°C液体石蜡中，除油，制得滴丸400粒。实施例四冻干粉针剂的制备
取赤芍有效组分0. 5g、葡萄糖4. 5g、硫代硫酸钠0. 9g和蒸馏水1000ml，上述组分混合均勻后，分装400支，冷冻干燥，即得。实施例五赤芍组分的活性评价实验
1.赤芍组分对H》2损伤心肌细胞的保护作用
体外培养H9C2心肌细胞，培养液为DMEM(高糖)+10%FBS (G) +1%非必需氨基酸+0. 1%双抗。取对数生长期细胞置于96孔细胞培养板上，恒温培养M h后，加入200 μ mol/mL H2O2 损伤心肌细胞30 min,再加入终浓度为50 μ g/mL的赤芍组分孵育M h，采用MTT法测定细胞活力。结果表明，该组分对H2O2损伤心肌细胞的保护率为58.96%。2.赤芍组分对缺氧复氧损伤心肌细胞的保护作用
体外培养H9C2心肌细胞，培养液为DMEM(高糖)+10%FBS (G) +1%非必需氨基酸+0. 1%双抗。取对数生长期细胞置于96孔细胞培养板上，恒温培养M h后，在缺氧小室中培养6 h。 缺氧结束后，取出细胞培养板加入经无糖Hank’ s稀释的终浓度为50 μ g/mL的赤芍组分，在正常培养条件下孵育6 h，取细胞培养上清液测定乳酸脱氢酶(LDH)含量。结果表明，该组分对缺氧复氧损伤的心肌细胞保护率为52. 17%。
权利要求
1.一种赤芍有效组分，其特征在于，通过以下步骤获得将赤芍药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇，加热提取，药渣加乙醇水溶液提取，将提取液浓缩成浸膏，用反相硅胶柱对其进行分离，首先用低浓度甲醇溶液作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改用高浓度甲醇溶液作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品，用制备液相色谱继续分离得到的样品，制备色谱的分离条件色谱柱为半制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分；该有效组分中主要含有没食子酸甲酯、芍药苷、五没食子酰葡萄糖。
2.根据权利要求1所述的一种赤芍有效组分，其特征在于，低浓度甲醇为5%的甲醇溶液，高浓度甲醇60 %的甲醇溶液。
3.根据权利要求1所述的一种赤芍有效组分，其特征在于，通过以下步骤获得取赤芍药材，将其粉碎后加入体积比1:1的乙酸乙酯和乙醇，加热回流1小时，提取2次，滤液合并得提取液I，药渣加入70%乙醇，加热回流1小时，提取2次，滤液合并得提取液II，将提取液II浓缩成浸膏，用50%甲醇溶液溶解浸膏，采用ODS-C18柱对其进行分离，首先用5%甲醇溶液作为流动相，得洗脱液I，然后改用60%甲醇溶液作为流动相，得洗脱液II，浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品制备色谱的分离条件色谱柱为半制备柱，Lichrospher C18 ； 10. Omm250mm, 5 μ ι,流动相为水A和乙腈B，梯度洗脱程序为=Omin, 10%Β ； 15min,25%B ；34min, 30%B ；流速为3ml/min，柱温为室温；样品经制备液相色谱分离，在23. 9^26. Smin时间段收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分。
4.根据权利要求1或3所述的一种赤芍有效组分在制备治疗心血管疾病的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物由赤芍有效组分加入药剂学上可接受的辅料，按照药剂学上记载的制剂制备方法制成。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的制剂包括液体制剂或固体制剂。
全文摘要
本发明提供一种赤芍有效组分，该有效组分主要含有没食子酸甲酯，芍药苷，五没食子酰葡萄糖等几种化合物。药材通过加热提取，浓缩，硅胶柱分离，洗脱，洗脱液浓缩干燥，再用液相色谱继续分离，收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分。本发明提供的赤芍有效组分可在制备治疗、预防心血管疾病药物中的应用。本发明方法设计合理，能快速准确地得到有效成分，在生产中更易于药物的质量控制。
文档编号A61K36/71GK102258587SQ201110057638
公开日2011年11月30日 申请日期2011年3月10日 优先权日2011年3月10日
发明者李云飞, 王毅, 程翼宇, 葛志伟 申请人:浙江大学