专利名称：一种构建中医脾虚证艾滋病猴模型的方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种构建中医模型的方法及用途，具体涉及一种构建中医脾虚证艾滋病模型的方法及用途。
背景技术：
目前艾滋病的治疗主要是应用高效抗逆转录病毒疗法(HARRT)治疗、免疫治疗、 生物治疗、疫苗、中医药治疗等。其中，中医临床治疗具有辨证论治的特点，可根据患者的自身体质特征和症状表现采用个体化治疗，且中药通过调节机体免疫系统，延长患者带毒生存时间，毒副作用少，依从性好。中医药特别是在感染HIV病毒后的无症状期发挥积极的治疗作用。近几年中医药防治艾滋病的实验取得了可喜的成绩，通过体外抑制HIV病毒细胞培养、药物筛选和动物实验发现了多种具有抑制艾滋病病毒作用的中药，临床试验研究也证实了中药在稳定和提高免疫功能、消除和缓解症状、改善生活质量方面具有较好的效果。 中医药通过多环节、多靶点的调节，从多个途径介入，通过影响病毒——宿主网络，改变疾病的病理状态或推迟疾病的进程，在临床治疗中更强调对患者生活质量和生存期的改善， 与西医药着重于抑制病毒有着较大的区别，因此，作为病因病机基础研究和评价标准的动物模型应该有别于西医药研究所采纳的动物模型。然而，目前尚未建立适合中医药筛选抗艾滋病的动物模型，给中医药的筛选工作带来了困难。艾滋病中医动物模型应能够和艾滋病的病因、病理变化相似；满足中医临床的症状模拟，评价指标特异性强、客观；模型应能够被药物反证。概括而言，应符合中医动物模型的基本要求。另外，该模型应该价操作简单、操作步骤和环节精炼，实验结果的重复性好。中医药艾滋病动物模型必须始终以中医理论为指导，体现中医特色。中医的证候是中医药理论和临床的基础，因此，动物模型应该符合中医的证和病机变化。目前，中医艾滋病证候的研究已进行了多年，形成了多种学说，基本认为艾滋病的证候以复合证、虚实夹杂为特点，具有复杂的病机，体现了多样性的特点。我们长期的临床和实验研究认为，AIDS病因病机为HIV侵入人体，首先损伤脾脏，致脾气亏虚，进而损及其他四脏，终至五脏气血阴阳俱虚，并伴有气滞血瘀，或痰饮水湿，或风寒火热等邪毒为其基本病机的疾病。艾滋病复杂的临床症状表现，说明除了 HIV病毒之外，其他的因素也参与了证候的形成。利用当前成熟的技术，在动物身上复制能够和临床证候更为相似的动物模型，能够更好地模拟临床表现，提供与临床“证”相似的模型，丰富艾滋病的中医动物模型库， 切中中医动物模型中“辨证”的要求。由于临床上艾滋病的发生、发展过程中，症状、证型存在随时空变化而改变的性质，提示某种因素复制的艾滋病动物模型在不同的时期，其所表现的证可能是不同的，这种证的变化尽量拟合临床证的变化。除了客观的症状指标外， 应选择科学、准确、量化的指标衡量证候，并应注意这些指标应该有较强的特异性。如艾滋病动物脾虚模型，就应该选小肠木糖吸收试验等指标。药物反证(以下简称反证)，又称以药测证也是衡量模型是否成功的有效手段。当建立稳定的动物模型后，再用该模型相对应的基本方药进行观察治疗，如果治疗能改善或消除模型的症状和检测指标，则佐证了此模型成立，反之亦然。综上所述，中医艾滋病动物模型应在满足模拟艾滋病病因、病理的基础上，应能体现中医证的特色，满足中医学的发病学原理，模型的症状、客观指标和药物反证比较一致，与中医理论较为吻合。该模型的建立将有利于揭示艾滋病“证”的实质，验证并探讨中医中药的疗效和机理，促进中医药防治艾滋病的理论研究。猴艾滋病病毒SIV属逆转录病毒科慢病毒亚科病毒，SIV病毒株于1985年首先从恒河猴中成功地分离。SIV引起的症状和人AIDS明显相似，第一阶段为感染后第1 3周，其间会出现一个病毒复制的高峰，常表现在血浆中的P27核心蛋白大量增值，有明显的病毒血症，表现为发热、皮疹、腹泻和外周浅表淋巴结肿大等，类似于人感染的临床症状。第二阶段为持续无临床症状期。该期时间长短不一，短的仅为2个月，长的可达几年。 其表现为P27核心蛋白水平下降而相应的抗体出现。第三阶段为AIDS期，猴外周血中⑶4 细胞逐渐下降，血浆病毒水平回升，并伴有体重下降、全身衰竭和机会感染(主要表现为顽固的腹泻和肺炎)。约有20% 30%的感染猴因缺乏有效的免疫应答而死亡。。SIV和 HIV同属逆转录病毒科慢病毒亚科病毒，SIV与⑶4受体和辅助受体CCR5，CXCR4密切相关，并可使猴子致病，还可以通过母猴喂养小猴传播。SIV猴模型作为AIDS模型，得到了越来越多人认可。国内外艾滋病实验大多数都是应用SIV猴模型，作为AIDS发病机理、药物治疗、疫苗研制的技术平台。本发明人克服了诸多技术问题，成功构建了一种艾滋病灵长类中医脾虚证动物模型。在所述动物中复制的重复性、稳定性好；能体现中医证的特色，模型的症状、客观指标和药物反证比较一致，与中医理论较为吻合。该模型的建立将有利于揭示艾滋病“证”的实质，验证并探讨中医中药的疗效和机理，促进中医药防治艾滋病的理论研究为中医药治疗艾滋病疗效评价和药物筛选提供了比较理想的动物模型。
发明内容
本发明的目的，是构建一种中医脾虚证艾滋病猴模型。这种中医脾虚证艾滋病猴模型，是由同一造模动物中医脾虚症候模型和SIV感染模型叠加构建而成。具由中医脾虚症候和SIV感染艾滋病症候双重特点。本发明的目的是这样实现的
本发明通过两种方案构建了中医脾虚证艾滋病猴模型。第一种是用生大黄浓缩液灌胃先造成中医脾虚症猴模型，然后静脉注射感染SIV 病毒，感染14天后检测并最终确认病毒感染，达到构建复合模型。中医脾虚症候模型根据实验要求和恒河猴自身身体状况，连续使用生大黄浓缩液灌胃对恒河猴进行为期4周左右的造模可达实验设计要求。第二种是恒河猴经静脉注射感染猴艾滋病病毒后再用生大黄浓缩液灌胃造脾虚证。SIV感染模型采用SIVmac239病毒株进行静脉感染方式，感染14天后抽血检测确认感染情况，然后用生大黄浓缩液灌胃进行中医脾虚症候模型构建，最终构建复合模型。恒河猴造模成脾虚后出现明显的腹泻、摄食量减少、进食速度减慢、厌食等典型中医脾虚情况；随着造模时间的延长症状逐渐加重。但如果不加用大黄维持复合模型，则症状会逐渐缓解。恒河猴感染艾滋病病毒后，表现和艾滋病人极为相似，猴感染SIV后病情发展有三个阶段急性感染、慢性感染早期和慢性感染中后期，产生抗艾滋病病毒抗体IgM和IgG 体液分离病毒阳性，检测病毒阳性。中医脾虚SIV复合模型病毒构建前后血浆病毒载量与正常状况下SIV感染猴模型的血浆病毒载量相比较无明显差别，但⑶4计数较正常状况下SIV感染猴模型的更低。⑶4/ CD8比值倒置状况也较正常状况下SIV感染猴模型更加严重。整体来说，中医脾虚SIV复合模型病情较自然感染的恒河猴病情严重。本发明的特点和突出优势在于
成功构建了一种中医脾虚证艾滋病猴模型。在最接近于人类的动物模型上既能体现中医脾虚证候特点及演变规律，并可从中获得稳定的脾虚症状和脾虚证相关客观指标，又能体现最接近人类艾滋病的感染与发病过程和症状，并可从中获得稳定的病毒学、免疫学及病理学相关客观指标。构建的病、证结合的艾滋病猴模型具有重复性和稳定性，有利于揭示艾滋病“证”的实质，验证并探讨中医中药的疗效和机理，促进中医药防治艾滋病的理论研究。以下通过实施例进一步说明本发明的内容，本领域技术人员能够通过实施例了解本发明所说的一种中医脾虚证艾滋病猴模型的建立方法和用途。但是这些实施例不得理解为对本发明权利要求的限制。实施例1 第一种构建中医脾虚证艾滋病猴模型的方法和用途
权利要求
1.一种构建中医脾虚证艾滋病猴模型的方法，其特征在于选择健康成年雄性恒河猴， 经血清学检测猴艾滋病病毒SIV，猴逆转录D型病毒(SRV)，猴B病毒和猴T淋巴细胞性I型病毒(STLV-I)抗体阴性，无中医脾虚、气虚症状体征；采用的毒株为SIVmac239病毒株，经健康猴PBMC体外扩增；用生大黄浓缩液灌胃造成脾虚证，生大黄浓缩液为将生大黄粉碎成的粗粉加沸水煎煮，制成ImL=Ig生药的浓缩液，灌胃剂量是0.5 g/kg.d至3.0 g/kg. d ；灌胃时间是3至7周；采用静脉注射方式进行病毒接种，接种量为1: (1000-5000)。
2.根据权利要求1所述的构建中医脾虚证艾滋病猴模型的方法，其特征在于用放射免疫学方法检测三碘甲状腺原氨酸(T3)、四碘甲状腺原氨酸(T4)、促甲状腺素(TSH)、睾酮(T)、雌二醇(E2)、皮质醇(Cor)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、环腺苷酸(cAMP)、环鸟苷酸 (cGMP)、白介素2 (IL-2)、白介素6 (IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)等指标，用比色法测定 D-木糖；每1-2周收集标本，接种CEMX174细胞，进行病毒分离；用RT-PCR方法测定体液和组织内的SIV病毒载量；每1-2周收集标本，接种CEMX17细胞，进行病毒分离；用RT-PCR方法测定体液和组织内的SIV病毒载量；用流式细胞术测定模型动物的淋巴细胞亚群数据， 包括⑶4、⑶3、⑶8计数；用活检方法取模型动物的淋巴结，福尔马林固定，石蜡包埋，常规病理组织切片处理后，染色，进行病理形态及半定量分析；中医脾虚证艾滋病猴模型指标体系中的主要特异性指标为三碘甲状腺原氨酸(T3)、D-木糖、病毒载量、⑶4、⑶4 /tD8比值。
3.根据权利要求1或2所述的构建中医脾虚证艾滋病猴模型的方法，用于脾虚造模后观察中医证候积分。
4.根据权利要求1或2所述的构建中医脾虚证艾滋病猴模型的方法，用于研究艾滋病的中医病因、病机和证候。
5.根据权利要求1或2所述的构建中医脾虚证艾滋病猴模型的方法，用于抗艾滋病中药和复方的药效评价。
全文摘要
本发明公开了一种构建中医脾虚证艾滋病猴模型的方法及用途。在现有艾滋病实验动物中猴子最接近人类，发明人应用两种方法都成功地构建了恒河猴艾滋病病毒感染中医脾虚证复合模型。第一种方法是用生大黄浓缩液灌胃造脾虚证后经静脉注射感染猴艾滋病病毒。第二种方法是恒河猴经静脉注射感染猴艾滋病病毒后再用生大黄浓缩液灌胃造脾虚证。通过了解艾滋病病毒在脾虚证模型体内感染过程、发病过程、病理变化，以研究包括感染的靶器官、靶组织和靶细胞,对免疫系统的攻击,免疫系统细胞的反应，中医证候的演变规律等。通过所建立的中医脾虚证艾滋病病毒感染猴复合模型，对于研究艾滋病中医发病机理、证候学演变，评价抗艾滋病中药和复方的药效有着不可替代作用。
文档编号A61K49/00GK102228699SQ20111012039
公开日2011年11月2日 申请日期2011年5月11日 优先权日2011年5月11日
发明者何金洋, 刘抗伦, 刘政, 周红燕, 张苗苗, 李志强, 李茂清, 符林春, 胡英杰, 胡董仁, 董伯振, 陈津岩, 陈芝喜 申请人:广州中医药大学