一种胎盘多肽注射液制备方法

专利名称：一种胎盘多肽注射液制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物化学药品的制备方法，具体涉及一种胎盘多肽注射液制备方法。
背景技术：
当前市场上的胎盘制品，如胎盘组织注射液，主要生产工艺沿袭传统中药炮制方法，采用高温煮沸提取，減压浓缩等工艺制备，另外，也有企业使用抗体检查后的胎盘作为原料，采用低温提取工艺制备胎盘制剂，在乙型肝炎的治疗过程中辅助使用。前者容易做到，将产品中的可能残留的病毒灭活，从而保障产品的安全，但由于是在高温下操作，因此，但出现将产品中的活性成分减少或活性降低极低的情况，后者则恰好与前者相反，由于是低温操作，虽然可以较好的保持产品的活性，以保证其效力，但却容易出现些病毒不会被去除或灭活，从而便产品的安全性受到影响的情况。在中药材制作中的胎盘叫紫河车，现介绍如下
紫河车[异名]胞衣《梅师集验方》，混沌皮、混元丹《本草蒙签》，胎衣、混沌衣《纲目》。 [基原]为健康人的胎盘。[药材]干燥的胎盘为不规则的类圆形或椭圆形碟状，直径9 16厘米，厚薄不一。紫红色或棕红色，有的为黄色。一面凹凸不平，有多数沟纹，为绒毛叶； 一面为羊膜包被，较光滑，在中央或一侧附有脐带的残余，四周散布细血管，每具重50 100克。质硬脆，有腥气，以整齐、黄色或紫红色、洁净者为佳。[成分]胎盘的成分较复杂。 胎盘球蛋白制品中含有多种抗体，在临床上长期以来用于被动免疫。人胎盘中还含有干扰素(interferon商品胎盘球蛋白中也多半含有)，它有抑制多种病毒对人细胞的作用，以及含有能抑制流感病毒的巨球蛋白，称β—抑制因子。胎盘含有与血液凝固有关的成分，其中有类似凝血因子XIII的纤维蛋白稳定因子；尿激酶Urokinase)抑制物(能抑制尿激酶活化纤维蛋白溶酶元的作用)和纤维蛋白溶酶元活化物。通常情况下纤维蛋白溶酶元活化物的作用低于抑制物。人胎盘中含有的激素有促性腺激素A和B、催乳素，促甲状腺激素、催乳素样物质，多种留体激素如雌酮、雌二醇、雌三醇、孕甾嗣、雄甾酮、去氧皮质甾酮、11一去氢皮质甾酮(化合物A)、可的松(化合物 E)、17—羟皮质留酮(化合物F)等。人胎盘催乳素与人垂体生长激素的化学结构上相关， 有免疫交叉反应，在垂体切除大鼠与生长激素也有明显的协同作用，所以也称催乳素一生长激素；或谓胎盘催乳素有生长激素的作用。人胎盘的酸性抽提物中还得到较多量的能松驰大鼠十二指肠和降大鼠血压的成分，其性质同前列腺素Ep人胎盘中含有多种有应用价值的酶，如溶菌酶、激肽酶、组胺酶、催产素酶等。另含红细胞生成素、磷脂(其中卵磷脂占45. 5 46. 5%)、多种多糖。[药理]①抗感染作用胎盘Y—球蛋白含有麻疹、流感等抗体以及白喉抗毒素等， 可用于预防或减轻麻疹等传染病。因系蛋白质，故口服无效，必须注射。胎盘Y—球蛋白中还含干扰素，临床上可用于预防或控制病毒感染。胎盘中还含有溶菌酶，可防止小鼠(腹腔注射)由肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、弗氏痢疾杆菌的内毒素引起的死亡；对内毒素对大鼠的伤害也有一定的保护作用；但对大肠杆菌引起的内毒素血症无作用。②增强机体抵抗力给小鼠口服胎盘粉，能减轻其结核病变，而在试管中反能促进结核杆菌的生长，故认为其作用主要在于增加机体抵抗力。③激素样作用，胎盘在生理上能产生绒毛膜促性腺激素，对卵巢作用很小，但对睾丸则有兴奋作用；此外，也能产生雌激素及孕激素。胎盘中可能含有这些激素，因而具有这些激素的药理作用。绒毛膜促性腺激素是蛋白质类物质，口服无效，需要注射。④对血凝的影响胎盘中含有所谓“尿激酶抑制物”，能抑制尿激酶对纤维蛋白溶酶元的“活化”作用；此可解释妊娠时纤维蛋白溶酶元活性之降低。据测定，妊娠时子宫肌层中纤维蛋白溶酶元活化物与尿激酶抑制物的比例为1:34，而胎中二者之比例则高达 1:1197。人胎盘中含有低分子的凝血因子XIII (—种糖蛋白)，因此可用来治疗因XIII凝血因子缺乏的出血患者。此种凝血因子不仅能稳定纤维蛋白凝块、促进创伤愈合，在动物实验中还有抗组织胺的作用。(5)其他作用在离体试验中，胎盘提取物能促进受抑制心脏的恢复。胎盘蛋白中，含有“肾素样”的升压物质，在血液循环的调节上，其意义尚待进一步阐明。人胎盘中尚含某种糖蛋白成分，在体外试验中，能抑制淋巴细胞中DNA的合成，但不影响细胞的活力。胎盘提取物大量时能抑制去氧麻黄碱引起的发热等等多种作用。功用主治补气，养血，益精。治虚损，赢瘦，劳热骨蒸、咳喘，咯血，盗汗，遗精， 阳痿，妇女血气不足，不孕或乳少。临床报道①治疗支气管哮喘②治疗慢性气管炎用新鲜胎盘制成20%蒸馏液，每日肌注1次，每次2毫升，10天为一个疗程6治疗久病体弱、经过其他方法治疗不效而反复发作之患者47例，结果无效17例，显效24例，好转6例。对咳、痰、喘都有一定的疗效， 患者体质也有不同程度的增强。未见副作用。③治疗皮肤溃疡；④治疗母乳缺乏症。《中医药大辞典》上海出版社，1985年版，P2363。

发明内容
本发明的目的在于提供一种既可确保有效成分、即在胎盘收集后通过检验选出无乙肝、无丙肝、无艾滋病、无梅毒等病毒的原料，改进制作方法，提供一种既可确保有效成分、又可较为彻底杀死病原微生物的胎盘多肽注射液的新型制备方法；制作出的胎盘多肽注射液，除了能作免疫调节剂外，还用在治疗下肢骨折的临床和创面愈合方面有明显疗效。为达到上述的目的，一种胎盘多肽注射液制备方法，发明的方法依次包括以下步骤
(1)、收集健康产妇足月分娩的胎盘，将其胎盘清洗干净，浙干；
(2)、按胎盘与生理盐水51的比例加入0. 75 1. 0% (质量百分比)生理盐水，将胎盘捣碎得到胎盘组织浆；
(3)、再按胎盘组织浆与0.75% 1%(质量百分比)生理盐水1 :4比例配制好透析液后， 进行透析；共透析3次，第1、2次分别为20 24小时，第3次为40 50小时；
(4)、取经过3次透析后的透析液，澄清，上清液先经过0.45Mfli 1. 0 Mm孔径的滤芯过滤，再用分子量为5000 10000道尔顿的膜进行超滤；超滤后，在60°C 士0. 5°C下连续10 小时病毒灭活；
(5)将进行病毒灭活后的超滤液用0.22ΜΠ1滤芯除菌过滤后，灌封，检漏。
本方法首先进行原料胎盘病毒检验，即在胎盘收集后通过检验选出无乙肝、无丙肝、无艾滋病、无梅毒等病毒的原料胎盘。本方法制备的产品为无色或淡黄色澄清液体。由于本发明的操作步骤中，即在胎盘收集后通过检验选出无乙肝、无丙肝、无艾滋病、无梅毒等病毒的原料，改进制作方法，并60°C 士 0.5°C连续10小时病毒灭活，增加了低温透析工艺，提供一种既可确保胎盘多肽注射液有效成分、又可较为彻底杀死在胎盘多肽注射液的病原微生物的新型制备方法。制作出的胎盘多肽注射液，除了能作免疫调节剂外， 还用在治疗下肢骨折的临床和创面愈合方面有明显疗效，预先除去杀死在胎盘多肽注射液的病原微生物残留物。得到的产品，既确保制品生产和使用的安全性，又提高了产品的生产率，同时最大程度的保留原有成分的活性。下面通过具体实施方式
对本发明的方法作详细的描述。
具体实施例方式
实施例1
一种胎盘多肽注射液制备方法，首先进行原料胎盘病毒检验，即在胎盘收集后通过检验选出无乙肝、无丙肝、无艾滋病、无梅毒等病毒的胎盘； 具体依次包括如下步骤 (1)、收集健康产妇足月分娩的胎盘，将其20个胎盘清洗干净，浙干得胎盘约7000克；
(2)、按胎盘组织与生理盐水51的比例加入0. 75% 1% (质量百分比)生理盐水，捣碎得到胎盘组织浆8400克；
(3)、按胎盘组织浆与0.75% 1% (质量百分比)生理盐水按1 :4比例配制透析液，然后进行透析；共透析3次，第1、2次分别为20 M小时，第3次为40 50小时；
(4)、收集3次透析液提总量90.7L ；
(5)、取3次透析后的透析液，澄清后用0.45Mfli孔径的滤芯过滤，再用分子量5000 10000道尔顿的膜进行超滤；超滤液在60°C 士0. 5°C下连续10小时病毒灭活；
(6)将进行病毒灭活后的药液温度降至5°C士 1°C，用0.22Mffl滤芯除菌过滤后灌封，得每支装量为細1的胎盘多肽注射液共18850支；
(7)检漏把产品均勻地摆放在机动门安瓿瓶灭菌器专用车上，将车缓缓推进安瓿灭菌器箱体内，关闭箱门；
检漏负压-80 kPa、负压检漏时间300秒， 检漏正压80 kPa、正压检漏时间300秒， 清洗时间600秒、压力限度130 kPa。(8)设置完成后程序开始运行，先抽真空，当真空度在-80 Ua后，停止抽真空。打开色水阀，将色水吸入灭菌器中至盖过产品后关闭色水阀。打开气阀，再将色水抽回贮器罐中；
(9)打开纯化水阀门，淋洗产品外壁上的色水1;
(10)打开灭菌器门，取出产品，剔除带色的漏封产品。实施例2
一种胎盘多肽注射液制备方法，首先进行原料胎盘病毒检验，即在胎盘收集后通过检验选出无乙肝、无丙肝、无艾滋病、无梅毒等病毒的胎盘；具体依次包括如下步骤 (1)、收集健康产妇足月分娩的胎盘，将其50个胎盘清洗干净，浙干后得胎盘约17500
克；
(2)、按胎盘组织与生理盐水51的比例加入0. 75% 1. 0% (质量百分比)生理盐水， 进行捣碎得到胎盘组织浆21000克；
(3)、按胎盘组织浆与透析液1:4比例配制透析液，进行透析；共透析3次，第1、2次分别为20 24小时，第3次分别为40 50小时；
(4)、收集3次透析总量226.8L；
(5)、取经过3次透析后的透析液，澄清后用1.0 μ 孔径的滤芯过滤，再用分子量 5000 10000道尔顿的膜进行超滤；超滤液在60°C 士0. 5°C下连续10小时病毒灭活；
(6)将进行病毒灭活后的低温5°C士 1°C下，用0.22Mffl，除菌过滤后灌封，得每支4ml 的胎盘多肽注射液共46390支。(7)检漏把产品均勻地摆放在机动门安瓿瓶灭菌器专用车上，将车缓缓推进安瓿灭菌器箱体内，关闭箱门。检漏负压-80 kpa，负压检漏时间300秒， 检漏正压80 kpa,正压检漏时间300秒，
清洗时间600秒，压力限度130 kpa。(8)设置完成后程序开始运行，先抽真空，当真空度在-SOKpa后，停止抽真空。打开色水阀，将色水吸入灭菌器中至盖过产品后关闭色水阀。打开气阀，再将色水抽回贮器罐中。(9)打开纯化水阀I，淋洗产品外壁上的色水。(IO)打开灭菌器门，取出产品，剔除带色的漏封产品。产品质量标准
本产品为小容量注射剂，按国家药品标准《WS-10001- (HD-1430) -2003-2006))执行， 其质量标准如下
外观应为无色至淡黄色澄明液体。鉴别应在258士4nm处有最大吸收峰。可见异物20支检查的供试品中，均不得检出明显可见异物。如检出微细可见异物的供试品仅有1只，应另取20支同法复试，均不得检出。装量应不低于4ml/支。pH 值应为 6.0 6. 5。非蛋白氮含量颜色应浅于对照管。含量测定应不低于0. 6。不溶性微粒测定每瓶含IOMm以上的微粒不得过6000粒，每瓶含25Mm以上的微粒不得过600粒。过敏性实验攻击后30分钟内不得出现过敏反应。无菌检查应无菌生长。异常毒性检查小白鼠应均健存，体重均增加。热原检查注射剂量按家兔体重每Ikg注射3. 0ml，按以下两个条件判定一、在初试3只家兔中，体温升温均低于0. 60°C，并且3只家兔升温总和低于1. 4°C:或在复试的5只家兔中，体温升高0. 6°C或0. 6°C以上的家兔仅1只，并且初试、复试合并8只家兔的体温升高总和为3. 5°C或3. 5°C以下，判定热原检查符合规定。二、在初试3只家兔中，体温升温均低于0. 60C以上的家兔超过1只或在复试的 5只家兔中，体温升高0. 6°C或0. 6°C以上的家兔超过1只或在初试、复试合并8只家兔的体温升高总和超过3. 5°C，判定热原检查不符合规定。临床效果
胎盘多肽注射液在治疗骨伤和创面愈合方面的作用，能够有效缩短骨折和骨伤的愈合治疗周期。所述的治疗效果好、有效率高、无毒副作用。够有效缩短创面愈合和疤痕修复的治疗周期。胎盘多肽注射液是以健康产妇的胎盘为原料，经先进的生物制药技术获得的小容量生物制剂，含有多种营养素、生长因子及免疫因子等，这些大量的活性成分帮助协调、 提高自身免疫，增强新陈代谢，促进受损细胞和创伤的自我修复和愈合。将胎盘多肽注射液以0. 9%的氯化钠溶剂或5%的葡萄糖溶液或葡萄糖氯化钠溶液稀释后，经静脉滴注或肌肉注射，或将胎盘多肽注射液原液或其稀释液直接注射或外用于患病部位，从而达到治疗作用。能有效缩短治疗周期、治疗效果好、有效率高、无毒副作用。临床一般资料本组(1)病例均为住院病人，其中男性62例，女性47例；年龄15 80岁；锁骨骨折10例，肱骨外科颈骨折8例，肱骨骨折8例，肱骨髁上骨折5例，桡骨、尺骨骨折10例，克雷氏骨折10例，掌指骨骨折6例，股骨粗隆间骨折9例，股骨骨折8例，髌骨骨折8例，胫骨、腓骨骨折11例，内踝骨、外踝骨折7例，跖骨骨折6例。(2)分组方法采用单盲随机配对原则，分为治疗组和用药对照组。其中治疗组53 例，对照组53例。(3)治疗方法两组患者均接受复位、固定、功能锻炼治疗；采用单盲随机配对方法，治疗组给予胎盘多肽注射液8ml+葡萄糖或生理盐水静滴，每天1次，以10天为一疗程， 连用2个疗程。对照组给予丹参针液静滴。观察疼痛肿胀消退时间。1周后观察骨折愈合情况。(4)疗效判断标准
①临床治愈比同类骨折愈合时间提前1/3以上达到临床愈合标准者；
②显效比同类骨折愈合时间提前1/4 1/3，达到临床愈合标准者；
③有效比同类骨折愈(有)效与同类骨折正常愈合时间相同。(5)治疗结果胎盘多肽注射液的有效率为95. 8%，无不良反应发生。临床资料⑴李某某，女，36岁，已婚，于2006年3月确诊为急性胆囊炎。行胆囊切除术，观察一周发现手术伤口愈合不良，加用胎盘多肽注射液2支(8ml)稀释于250ml 0. 9%的生理盐水中进行静脉滴注，未出现过敏反应，连续用药7天后，伤口愈合明显好转。 患者感觉身体情况良好，无不适现象。骨折临床资料
1病例选择符合骨折诊断标准
除了多发性骨折、多段骨折、骨不连接以及肝肾功能不全者。1. 1 一般资料观察病例50例，男性27例，女性23例，病程3_4周。1. 2 一般资料观察病例50例，男性27例，女性23例，病程3_4周。
1. 3治疗方法应用胎盘多肽注射液8ml，加入生理盐水注射液250ml或500ml静滴，每天1次，按病情及患者经济条件应用3-4周。1. 4观察项目观察患者治疗前后骨折部位骨痂生长情况。显效X线片有大量骨痂生长；有效x线片见中等量骨痂生长；无效:x线片仅有少量骨痂生长或无骨痂生长。1. 5安全观察治疗期间密切观察药物毒副反应的发生。2.结果
2. 1 50例骨折患者中，显效3例，有效35例，总有效率76%以上。2.2治疗期间未发生任何明显的不良反应。3. 1 讨论
骨折愈合一个复杂的过程，损伤组织可刺激多种细胞增生形成新生组织即骨痂。骨折初期为纤维性骨痂，通过软骨内化骨和膜内化骨方式发生钙盐沉积，并且产生大量的胶原， 形成骨性骨痂。骨性骨痂把骨缺损的两端连在一起，以致外来压力施加到骨缺损处时，不再发生断裂。本临床观察结果显示，胎盘多肽注射液可促进骨性骨痂组织的形成，并无不良反应事件发生，推断其机制可能与影响胶原组织的合成以及钙盐沉积相关。选取自2006年8 月 2009年12月收治的闭合性下肢骨折病例132例，均给予手术治疗，其中男89例，女43 例，年龄为15 65岁，平均为30. 4岁，其中胫骨骨折78例，股骨骨折54例。所选患者均无糖尿病、高血压、肺心病等可能影响骨折愈合的基础疾病，所有患者均采用随机法分为治疗组和对照组，每组各66例。3. 2治疗方法
两组患者均采用切开复位、钢板或骨内钉内固定术，术后给予理疗及肢体功能锻炼，常规术后应用抗生素，在此基础上治疗组静脉滴注胎盘多肽注射液，一次8ml稀释于250ml 0.9%氯化钠注射液中，1次/日，14日为一个疗程，每个患者治疗1个疗程。对照组除常规用药外，均不给予其他促进骨折愈合药物。两组患者出院后均随访6—10月。3. 3疗效判断
(1)采用骨折临床愈合标准①局部无压痛及纵向叩击痛；②局部无异常活动；③X 线照片显示骨折线模糊，有连续骨痂通过骨折线；④功能测定在解除固定情况下，上肢能平举I kg重量达I min ；下肢能徒步连续步行3 min，并不少于30步；⑤连续观察2周，骨折处不变形，则观察的第1天即为临床愈合日期。4.统计方法
骨折愈合时间采用均数士标准差(X is)表示，结果用SPSS 11. 5软件进行统计学分析，治疗组和对照组采用t检验，选定P<0. 05为有统计学意义。术后发生感染人数为计量资料，以率表示，统计方法采用两样本率的X检验，P<0，05为差异有统计学意义
5.结果治疗过程中，患者耐受性良好，治疗组和对照组均未发生毒副反应，治疗组中 1例股骨骨折患者术后发生感染，对照组有两例胫骨骨折患者术后并发感染，给予伤口分泌物细菌培养及药敏试验后，应用敏感抗生素，加强伤口换药，感染得以控制，未继发骨髓炎， 伤口延期愈合。其余患者治疗前后血尿常规及肝肾功能检验均未发生异常。治疗组骨折愈合时间明显短于对照组(表1)；
表1治疗组和对照组骨折愈合时间(周)(X士 S) 组别股骨干胫骨治疗组13.8+1. 5 14. 5+1. 2
对照组16. 7+2. 117. 1+2.0
(表2)资料(略)表明感染发生率对照组高于治疗组。
本组临床资料表明，对于下肢骨折，在严格手术操作的前提下，胎盘多肽注射液可明显提高骨折的愈合时间；此外，可以提高人体免疫力，具有较为明显的抗感染作用。胎盘多肽中的小分子多肽对骨折愈合的具体作用机制尚有待进一步作基础研究，但其对骨折愈合时间的缩短，通过临床观察，确有明显的促进作用。
权利要求
1. 一种胎盘多肽注射液制备方法，其特征是首先进行原料胎盘病毒检验，即在胎盘收集后通过检验选出无乙肝、无丙肝、无艾滋病、无梅毒病毒的胎盘； 具体依次包括如下步骤(1)、收集上述健康产妇足月分娩的胎盘，将其胎盘清洗干净，浙干；(2)、按胎盘与生理盐水51的比例加入0. 75 1. 0%质量百分比的生理盐水，将胎盘捣碎得到胎盘组织浆；(3)、再按胎盘组织浆与质量百分比0.75% 1%的生理盐水1 :4比例配制好透析液后， 进行透析；共透析3次，第1、2次分别为20 24小时，第3次为40 50小时；(4)、取经过3次透析后的透析液，澄清，上清液先经过0.45ΜΠ1 1. 0 Mm孔径的滤芯过滤，再用分子量为5000 10000道尔顿的膜进行超滤；超滤后，在60°C 士0. 5°C下连续10 小时病毒灭活；(5)、将进行病毒灭活后的超滤液用0.22ΜΠ1滤芯除菌过滤后，灌封，检漏。
全文摘要
本发明公开的一种胎盘多肽注射液制备方法，方法依次包括经过病毒检验的胎盘，用胎盘与生理盐水配合捣碎得到胎盘组织浆;进一步用胎盘组织浆配制好透析液后，进行透析3次，透析液澄清后的上清液先经过0.45μm～l.0μm孔径的滤芯过滤，再用分子量为5000～10000道尔顿的膜进行超滤；超滤后，在60℃±0.5℃下连续10小时病毒灭活的超滤液用0.22μm滤芯除菌过滤后，灌封，检漏；由于采用了低温透析工艺，提供一种既可确保胎盘多肽注射液有效成分、又可较为彻底杀死除去在胎盘多肽注射液的病原微生物的新型制备方法，制作出的胎盘多肽注射液，疗效显著，既确保制品生产和使用的安全性，又提高了产品的生产率。
文档编号A61K9/00GK102284057SQ201110209778
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月26日 优先权日2011年7月26日
发明者李祥, 王 华, 苏嘉丽, 赵学梅, 钟正晓 申请人:贵州泰邦生物制品有限公司