专利名称：甲鱼肽在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及甲鱼肽的用途，尤其是涉及在抑制肿瘤药物领域中的用途。
背景技术：
肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤，一般所说的癌即指恶性肿瘤，世界每年死于癌症的人数多达数百万人，而自1997年以来，癌症成为中国人的第一死因，每年有近130万人死于癌症，现在抑制癌细胞的生长与转移的方法主要有手术，化疗和放疗，一般对身体的伤害较大，容易使人的免疫力下降。申请号201010103157. 9专利文献中公开了甲鱼小分子多肽的制备方法；《中国食品学报》2008，02:徐怀德等“甲鱼蛋白酶解产物体外ACE抑制和抗氧化活性研究”公开了体外实验证实甲鱼蛋白酶解物ACE抑制和抗氧化活性的作用；现有技术和专利中均未述及甲鱼低聚肽关于辅助抑制肿瘤细胞生长或转移应用的报导，也没有关于分子量在1000以下的甲鱼低聚肽在治疗和预防抗肿瘤方面的报道。
发明内容
本发明的目的是提供甲鱼肽的新用途，即在制药中的新应用；本发明的另一目的是提供一种能抑制癌细胞生长和转移，有较高的营养价值，吸收率高，不妨害人体身体健康的药物或保健食品。本发明甲鱼肽是以甲鱼为主要原料，分子量分布在lOOOODalton以内的小分子肽，其中140-1000Dalton分子量范围占50%以上。本发明还涉及甲鱼肽在作为制备防治肿瘤疾病的药中的应用。涉及分子量分布在lOOOODalton以内的甲鱼肽在作为制备防治肿瘤疾病的药中的应用。涉及分子量分布在2000DaltOn以内的甲鱼肽在作为制备防治肿瘤疾病的药中的应用。涉及分子量分布在140 lOOODalton范围以内的甲鱼肽在作为制备防治肿瘤疾病的药中的应用。
涉及分子量分布在300 700Dalton范围以内的甲鱼肽在作为制备防治肿瘤疾病的药中的应用。本发明的甲鱼肽是鳖科动物鳖Trionyx sinensis Wiegmann的全体为原料制备的。为了更好地理解本发明的实质，下面将用分子量在140 lOOOODalton的甲鱼低聚肽的药理实验及结果来说明其在制药领域的新用途。分子量小于lOOOODalton的甲鱼肽抑制肿瘤的生长和转移的功效研究。1.材料与方法1.1样品来源及处理受试药为甲鱼肽口服液干粉，Ig甲鱼肽/干粉，由江中药业股份有限公司提供，人临床服用量为4g甲鱼肽/d，100ml/do1.2实验动物及环境清洁级健康昆明种小鼠，雌雄各半，体重18_22g，江西中医学院实验动物中心提供，许可证号SCXK(赣)2006 — 0001。动物饲养于江西中医学院动物室，环境许可证SYXK (赣)2004-0001，饲养环境温度21 23 °C，相对湿度50 60%。1.3实验方法
1.3.1动物分组根据体重随机分为4组，每组10只。设立空白对照组、甲鱼肽口服液低、中、高剂量组。1. 3. 2剂量设计甲鱼肽口服液每人每日推荐摄入量为4. 0g/60kg体重。由此推算出小鼠每日摄入量为低剂量组，3. 33g生药/kg体重；中剂量组，6. 67g生药/kg体重； 高剂量组，13. 34g生药/kg体重，分别相当于人每日摄入量的5、10和20倍。将样品以蒸馏水配制成相应浓度(0. 1665g干粉/ml、0. 3335g干粉/ml、0. 667g干粉/ml)的灌胃液进行实验，小鼠灌胃量按0.2ml/10g体重计算。每日灌胃1次，连续30天。各组小鼠均饲以普通饲料，自由进食、饮水。30天后对各亚组小鼠进行辅助抑制肿瘤功能检验。1. 3. 3甲鱼肽对小鼠肉瘤S180的抑瘤作用将腹腔接种小鼠肉瘤S180细胞后8 天的昆明小鼠颈椎脱白处死，无菌条件下取出腹水，用生理盐水1:2稀释，给每只小鼠腋窝皮下接种瘤液0. 2ml。接种后次日，甲鱼肽口服液低、中、高剂量给分别按3. 33g生药/kg体重、6. 67g生药/kg体重、13. 34g生药/kg体重灌胃低、中、高浓度的甲鱼肽药液，每天1次， 连续给药30天。末次给药后24小时，颈椎脱白处死动物，分别称体重、瘤重，计算肿瘤生长抑制率(％)，计算公式为
肿瘤生长抑制率％ =(对照均组平均瘤重-治疗组平瘤重)+对照组平均瘤重X
100% ο1.3.4甲鱼肽对小鼠移植性肿瘤Lewis肺癌的抑瘤作用用小鼠移植性肿瘤 Lewis肺癌生长良好的瘤源，无菌条件下取荷瘤动物的实体瘤组织，用剪刀剪成小碎块，用套管针移植或用玻璃勻浆器加无菌生理盐水磨成勻浆，计数每ml勻浆液中的瘤细胞数，给每只动物皮下接种2X106细胞。接种后24小时分组给药，甲鱼肽口服液低、中、高剂量给分别按3. 33g生药/kg体重、6. 67g生药/kg体重、13. 34g生药/kg体重灌胃低、中、高浓度的甲鱼肽药液，每天1次，连续给药30天。末次给药后24小时，颈椎脱白处死动物，分别称体重、瘤重，计算肿瘤生长抑制率(％)，计算公式为
肿瘤生长抑制率％ =(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)+对照组平均瘤重X
100% ο1. 3. 5 甲鱼肽对S180小鼠、Lewis肺癌小鼠脾淋巴细胞转化的影响接种瘤液与给药同1. 3. 3和1. 3. 4。末次给药后24小时取脾脏，分别在筛网上研磨、离心、计数单个细胞，配成终浓度，颈椎脱臼处死动物。无菌条件下取出脾为2. 5X IO6个细胞/ml，分别加入96孔板中，同时设空白对照孔。置37°C 5% C02培养箱中培养72小时，培养结束前6 小时向每孔加入[3H]_TdR，终浓度为1 μ Ci/孔。多头收集器将细胞收集于玻璃纤维滤纸上， 烤干，放入加有4ml闪烁液的测量瓶中，液闪仪上测定每个样品的cpm值。1.3.6 甲鱼肽对S180小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的影响接种瘤液与给药同1. 3. 3末次给药后24小时处死小鼠，按4 mL/只腹腔注射含小牛血清Hank’ s液，轻轻按摩腹部20次，以充分洗出腹腔巨噬细胞，然后将腹壁剪开一个小口，用胶头吸管吸取腹腔洗液2ml于试管内(或用注射器)，用Iml加样器吸取腹腔洗液0. 5ml加入盛有0. 5mll% 鸡血红细胞悬液的试管内，混勻，用注射器(装大针头)吸取0. 5ml混合液，加入玻片的琼脂圈内，放置孵箱内37°C孵育15 20min，孵育结束 后迅速用生理盐水将未贴壁细胞冲掉，于甲醇液中固定lmin，姬姆萨液染色15min，用蒸馏水冲洗干净，晾干，油镜下计数巨噬细胞， 每张片计数100个，按下式计算吞噬百分率和吞噬指数，以吞噬百分率或吞噬指数表示小鼠巨噬细胞的吞噬能力。吞噬百分率％ =(吞噬鸡红细胞的巨噬数/计数巨噬细胞数)X 100% 吞噬指数=被吞噬鸡红细胞数/吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数。1.3.7 甲鱼肽对Lewis肺癌小鼠碳粒廓清实验的影响接种瘤液与给药同 1. 3. 4。小鼠末次给药后，从尾静脉注入用生理盐水稀释3-4倍印度墨汁0. lml/10g体重，分别于注入墨汁后2 min和10 min时分别从小鼠眼内眦静脉丛取血20 yL，并立即加到2 mLO. l%Na2C03溶液中，混勻，在600 nm波长处测光密度值(OD)，以0. l%Na2C03溶液作为空白对照。将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸擦干，
分别称重，计算胸腺/体重和脾脏/体重。以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。1. 3. 7甲鱼肽对Lewis肺癌小鼠NK细胞活性的影响(乳酸脱氢酶测定法) 接种瘤液与给药同1.3. 4。小鼠末次给药后，颈椎脱白处死小鼠，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’ s液的小平皿中，研磨脾脏，制成单细胞悬液，经200目筛网过滤，用Hank’ s 液洗2次，每次离心IOmin (IOOOr · min _ ”，弃上清液将细胞浆弹起，加入015mL灭菌水20s，裂解红细胞后再加入0. 5mL 2倍Hank，s液及8mLHank，s液，离心IOmin (IOOOr -min _ O，用ImL 10 %小牛血清RPMI1640完全培养液重悬，用1 %乙酸稀释后计数，台盼蓝染色计数活细胞数(均在95 %以上)，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2 XlO7个/ mL。试验前24h将靶细胞(YAC21细胞)传代培养，应用前以Hank's 液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4 X IO5个/ mL。取YAC21细胞和脾细胞各100 μ L (效靶比50 1)加入U型96孔培养板中，YAC21细胞自然释放孔加 YAC21细胞和培养液各100 μ L，上述各项设3个平行孔，于37 °C、5 %C02培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r · min _ 1离心5min，每孔吸取上清液100 μ L置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100 μ L，反应8min，每孔加入lmol _1的 HCl 30yL ,在酶标仪490nm处测定光密度值。1.3.84统计方法实验数据以 i±S表示，采用单因素方差分析，比较模型对照组、甲鱼伏组之间的差异，P<0. 05判断为差
异具有显著性。2 结果
2. 1甲鱼肽口服液对小鼠肉瘤S180的抑瘤作用
甲鱼肽口服液中、高剂量对小鼠肉瘤S180有较强的抑制作用，抑制率分别为30. 86% 和 46. 91% (Ρ<0· 05)，见表 1。表1甲鱼肽口服液对小鼠肉瘤S180的抑瘤作用的影响(_ )
权利要求
1.甲鱼肽在制备防治肿瘤疾病的药中的应用。
2.根据权利要求1所述的甲鱼肽，其特征在于甲鱼肽分子量分布在lOOOODalton以内。
3.根据权利要求2所述的甲鱼肽，其特征在于甲鱼肽分子量分布在2000DaltOn以内。
4.根据权利要求3所述的甲鱼肽，其特征在于甲鱼肽分子量分布在140 IOOODalton范围以内。
5.根据权利要求4所述的甲鱼肽，其特征在于甲鱼肽分子量分布在300 700DaltOn 范围以内。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种甲鱼肽的新用途，即在制药中的新应用；本发明的另一目的是提供一种能抑制癌细胞生长和转移，有较高的营养价值，吸收率高，不妨害人体身体健康的药物或保健食品，本发明甲鱼低聚肽是以甲鱼为主要原料，分子量分布在10000Dalton以内的小分子肽，其中140-1000分子量范围占50%以上。
文档编号A61P35/00GK102319419SQ20111023623
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月18日 优先权日2011年8月18日
发明者刘根云, 卢建中, 易敏之, 钟虹光, 马莉 申请人:江中药业股份有限公司