病毒感染的治疗的制作方法

专利名称：病毒感染的治疗的制作方法
病毒感染的治疗本申请是国际申请日2004年12月17日，国际申请号PCT/GB2004/005360，进入中国国家阶段日期2006年6月19日，中国国家申请号200480037908. 4，发明名称为“病毒感染的治疗”的分案申请。本发明涉及具有抗病毒活性的多肽、其衍生物或者类似物，还涉及编码所述多肽、 其衍生物或者类似物的核酸。本发明还提供了此类多肽、衍生物、类似物或者核酸作为药物的用途以及在治疗方法中的用途。抗病毒剂可以靶向病毒复制周期的6个阶段之一，这些阶段为0.病毒对细胞的附着；0.渗透(或者病毒膜与细胞膜的融合)；0.病毒的脱壳；0.病毒核酸的复制；0.子代病毒颗粒的成熟；和0.子代病毒向细胞外流体的释放。这6个阶段中，复制(上面的阶段4)是靶标，其通过常规抗病毒治疗可以最有效地影响。然而，可以论证病毒向细胞的附着是更吸引人的靶标，因为试剂不需要进入宿主细胞。然而，在该领域中还没有研发成功的疗法。因此本发明的一个目的是提供调节病毒向细胞的附着的治疗剂。脂蛋白(LP)是存在于血清和其他细胞外流体中的球形大分子复合体，由脂类和蛋白质组成，并且涉及脂类在身体周围的运输。已经将它们根据它们的密度分类，主要的类别是高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、和极低密度脂蛋白(VLDL)。它们的蛋白质称作载脂蛋白，并且已经描述了许多载脂蛋白，包括载脂蛋白A、B、C、D、E、F、G、H和J。此外，已经记载了载脂蛋白A、B和C的一些亚型。已经描述了将LP与病毒结合的多种相互作用。这些相互作用多数涉及病毒对脂蛋白的结合，这导致减小的病毒感染性，或者相反地，提供了病毒进入细胞的“搭车”方法。 此外，一些病毒利用LP的细胞受体(例如，LDL受体)作为进入细胞的工具，尽管这些受体也可以被细胞作为内源抗病毒剂释放(例如，VLDL受体的可溶性形式被HeLa细胞释放到培养基中并且抑制人鼻病毒感染)。此外，也已经报导了某些载脂蛋白和病毒蛋白质之间的直接结合。例如a.丙型肝炎病毒核心蛋白质结合载脂蛋白AII ；b.乙型肝炎病毒表面抗原结合载脂蛋白H;和c.猿猴免疫缺陷病毒(SIV) gp32蛋白质和人免疫缺陷病毒(HIV)gp41蛋白结合载脂蛋白Al。在发明人的实验室中进行的工作表明脑中存在潜伏的1型单纯疱疹病毒(HSVl) 和具有特定基因的特定等位基因-APOE基因的AP0E-e4等位基因增加了患阿尔茨海默氏病 (AD)的危险。考虑到还发现AP0E-e4携带者更可能患感冒疮(其是外周神经系统中HSVl 的再活化后发现的病变)，这些结果提示AP0E-e4携带者更可能遭受HSVl感染造成的伤害，并且提示在载脂蛋白E和某些病毒之间可能存在相互作用(尽管此类相互作用不必一定涉及抗病毒效应)。HSVl和apoE之间的一种可能的作用方式涉及如下的独立发现它们都使用细胞硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)分子作为它们对细胞的最初结合位点，随后附着到二级受体，其引起在含有LP的HSVl和apoE之间这些HSPG位点发生竞争的可能性，这将影响病毒进入。已经表明载脂蛋白E影响免疫系统(似乎与它在脂类代谢中的角色无关)，包括抑制T淋巴细胞增殖。已经检查了来自apoE的残基130-169的许多肽与淋巴细胞之间的相互作用。(Clay et al.，Biochemistry，34 11142-11151 (1995))。预测由 apoE 残基 141-149 组成的区域尤其重要。已经描述了神经元细胞系中此类肽的相似的相互作用。WO 94/04177公开使用含有脂类和两亲性螺旋肽的颗粒允许清除微生物产生的毒素，并且可以通过对细菌细胞膜的影响增加抗细菌药物的有效性。然而，没有提出含有此类 apoA衍生的肽的颗粒可以用作抗病毒药物。也不清楚颗粒中肽的施用是否将导致有效利用该颗粒的任一组分的抗病毒作用，所述颗粒中的肽是所公开的研发中的关键成分(所述颗粒可以在使用前形成或是内源地形成)。已经表明来自apoA的两亲性螺旋肽(Ananatharamiah在Meth. Enz.，128 627-647(1986)中描述)防止病毒膜与细胞膜的融合，并且还防止受感染的细胞膜的融合 (Srinivas et al. J. Cellular Biochem.，45 :224-237 (1991))。该肽在防止 HSVl 和 HIV 的融合方面也是有效的(Owens et al.，J Clin. Invest. ,86 :1142-1150 (1990))。然而，所述肽至少对于HSVl对细胞的附着是无效的(Srinivas et al.上文)。Azuma等人已经报导与庆大霉素相比，apoE的肽衍生物具有强烈的抗细菌作用 (Peptides, 21 :327-330 (2000)) ApoE 133-162 最有效，apoE134_155 几乎无效。按照上述研究，发明人进行实验来评估来自ApoE的肽(其能够形成螺旋)是否具有抗病毒活性。他发现ApoE的肽片段apoE141_149的串联重复(即，2 X LRKLRKRLL-SEQ ID No. 1)实际上具有抗病毒作用。而本发明人不希望被任何假说束缚，他认为该片段防止病毒颗粒对细胞的附着，导致如通过噬菌斑减小测定技术测量的病毒的感染性减小。实施例1 阐明了所述肽对诸如HSV1、HSV2和HIV的病毒是多么有效。因此，该肽当直接应用于病毒， 或者当在细胞存在下应用于病毒时是有效的，并且因此该肽可以用于在病毒到达它们的靶细胞很久前灭活游离的病毒颗粒。按照对apoE141_149的串联重复(即2 X LRKLRKRLL-SEQ ID No. 1)产生的数据，发明人决定研究载脂蛋白的其他片段的抗病毒活性。根据本发明的第一方面，提供了包含SEQ ID No. 2的apoE141_149的串联重复或者其平截的多肽、其衍生物或者类似物，其特征是将SEQ ID No. 2的至少一个亮氨酸(L)残基用具有包含至少4个碳原子和至少一个氮原子的侧链的氨基酸替代。"SEQ ID No. 2 的 apoE141_149 的串联重复”指具有氨基酸序列LRKLRKRLLLRKLRKRLL 的肽。串联重复在这里指apoE141_149dp或者apoEm舰。将该肽也分配代码Gim或者 Gmip (其中ρ表示N末端保护(例如，通过乙酰基)，和C末端保护(例如，通过酰胺基))。“其平截”指通过除去氨基酸减小SEQ ID No. 2的18聚体的大小。氨基酸的减少可以通过从肽的C或者N末端除去残基或者可以通过从肽的核心(即，SEQ ID No. 2的氨基酸2-17)缺失一个或多个氨基酸来完成。
“其衍生物或类似物”指将氨基酸残基用具有相似侧链或者肽主链性质的残基(天然氨基酸、非天然氨基酸或者氨基酸模拟物)替代。此外，此类肽的末端可以通过用与乙酰基或者酰胺基有相似性质的N和C-末端保护基保护。本发明人进行了详尽的实验来评估来自载脂蛋白的肽和其衍生物的抗病毒活性。 来自ApoE的肽和衍生物尤其是焦点。令发明人惊奇的是，他们发现所测试的多数肽几乎没有或者没有抗病毒作用。令人惊奇的例外是根据本发明的第一方面的肽。实施例2-7阐明了与apoE141_149的串联重复和来自载脂蛋白的其他肽相比，根据本发明的肽的功效。本发明人已经鉴定色氨酸(W)、精氨酸(R)或者赖氨酸(K)可以代替apoE141_149串联重复中的亮氨酸并且该类肽具有令人惊奇的抗病毒活性。本发明人明白这些氨基酸具有包含至少4个碳并且还含有氮原子的侧链。因此，在根据本发明的第一方面的肽中用于代替亮氨酸的氨基酸是色氨酸(W)、精氨酸(R)或者赖氨酸(K)或者其衍生物。本发明人已经发现其中用W替代至少一个L的肽具有独特的抗病毒活性。因此最优选地，根据本发明的第一方面的肽包含含有SEQ ID No.2的apoE141_149的串联重复或者其平截的多肽、其衍生物或者类似物，其特征是通过色氨酸(W)替代SEQ ID No. 2的至少一个亮氨酸(L)残基。在研发工作中，发明人注意到W替代可以预期增加该肽形成α螺旋的可能性并且想知道这是否可以解释根据本发明的第一方面的化合物的抗病毒功效。然而，他认为这不能解释根据本发明的肽的令人惊奇的功效。这是因为许多备选替代将预计增加α螺旋形成(例如，对于形成α螺旋的多种L取代的肽的可能性计算见表1)。然而，形成螺旋的可能性(表1)不与根据本发明的肽的抗病毒活性相关(见实施例5)。表1.在水性0. 15Μ NaCl缓冲液中37°C下形成α螺旋的多种肽分子的预计比例(% )(使用AGAWR 二级结构预测软件，可以从http://www.embl_heidelberg.de/ Services/serrano/agadir/agadir-start. Html MM ) °
氨基酸替代
Ε, Glu A, Ala D, Asp W1Trp M1Met Y1Tyr F, Phe I, lie Q, Gln无交换
肽序列
ERKERKREEERKERKREE ARKARKRAAARKARKRAA DRKDRKRDDDRKDRKRDD WRKWRKRWWWRKWRKRWW MRKMRKRMMMRKMRKRWiM YRKYRKRYYYRKYRKRYY FRKFRKRFFFRKFRKRFF IRKIRKRHIRKIRKRil QRKQRKRQQQRKQRKRQQ
%螺旋
6.24 1.85 1.59 1.47 1.01 0.8 0.79 0.6 0.55 0.51发明人还注意到1.从W取代的增加非常小(0.51%的GIN Ip分子将形成螺旋，W取代的肽微小地增加到1.47% )；和2.将预测许多其他替代将增加在任一时刻形成α螺旋的分子比例。例如，用E 或A替代L增加形成α螺旋的可能性高于W替代增加形成α螺旋的可能性(分别增加到 6. 和1. 87% )。然而，这些替代都实际上消除了抗病毒活性(例如，见实施例3或实施例5中的肽GIN39)。因此，形成α螺旋的可能性和根据本发明的“L-被替代的”肽的抗病毒活性的强度之间没有相关性。根据本发明的肽的功效更加令人惊奇，因为将L(亮氨酸)用根据本发明的第一方面的氨基酸替代将使得肽的两亲性减小。(表2阐明了认可的氨基酸的疏水性顺序)。技术人员可能实际上怀疑使得肽更具两亲性将赋予抗病毒特征。因此，出人意料地，SEQ ID No. 2的根据本发明的替代导致它们的抗病毒活性的显著增加。表2氨基酸的疏水性Phe > Leu = lie > Tyr = Trp > Val > Met > Pro > Cys > Ala > Gly > Thr > Ser > Lys > Gln > Asn > His > Glu > Asp > Arg如下文中更详细讨论的，可以根据本发明的第一发明用许多不同的替代和缺失操作SEQ ID No. 2使得肽具有抗病毒活性。然而，优选根据本发明的第一方面的多肽具有至少两个W、R或者K替代，更优选地有三个或更多W、R或者K替代。除了用W、R或者K进行一个或多个L替代，还优选将至少一个其他氨基酸(优选至少一个其他亮氨酸残基)用天冬酰胺(N)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、异亮氨酸(I)、谷氨酰胺(Q)或者组氨酸(H)替代。尤其优选此类其他替代是Y 或C。所替代的多肽可以包含18个氨基酸(或者其衍生物)并且从而对应于SEQ ID No. 2的全长。然而，发明人已经令人惊奇地发现基于SEQ ID No. 2的截短的肽也具有作为抗病毒剂的功效。因此，优选的肽或者其衍生物可以具有小于18个氨基酸。例如，根据本发明的第一方面的一些肽可以长为17、16、15、14、13、12、11、10或者更少的氨基酸。根据本发明的肽和其衍生物优选具有抑制病毒生长的功效，从而它们的IC50值为30 μ M或者更小。优选IC50值为20 μ M或者更小，更优选IC50值为10 μ M或者更小。优选的肽在病毒种之间具有相似的IC5(1。例如，优选的肽对于抑制HSV1、HSV2和 HIV生长具有相似的IC5tl值。将理解可以用本领域技术人员已知的许多氨基酸变体将经修饰的氨基酸代替到 apoE141_149的串联重复中。如果该修饰不显著改变肽的化学性质，那么此类肽将仍然具有抗病毒活性。例如，可以将R或者K的侧链胺上的氢用亚甲基(-NH2 - -NH(Me)或-N(Me)2) 代替。根据本发明的第一方面的优选的肽具有氨基酸序列(a) WRKffRKRffffffRKffRKRffff (SEQ ID No. 3)。该肽对应于全长串联重复，其中用色氨
酸残基替代所有亮氨酸。在本文中将该肽称作GIN7。(b)WRKffRKRffRKffRKR(SEQ ID No. 4)。该肽对应于全长串联重复，其中用色氨酸残基替代所有亮氨酸并通过切除氨基酸9、10、17和18而平截。在本文中将该肽称作GIN32。(c) WRKWRKRffffLRKLRKRLL (SEQID No. 5)。该肽对应于全长串联重复，其中用色氨酸残基替代一部分亮氨酸。在本文中将该肽称作GIN34。(d) WRKffRKRffffRKffRKRffff (SEQ ID No. 52)。该肽对应于缺失 9 位的 W残基的 SEQ ID
No. 3。在本文中将该肽称作MU 58。
(e) WRKffRKRffRKffRKRff (SEQ ID No. 53)。该肽对应于缺失 9、10 禾口 18 位的 W 残基的 SEQ ID No. 3。在本文中将该肽称作MU 59。(f) WRKffRKRffffFRKffRKRffff (SEQ ID No. 54)。该肽对应于将 10 位的 W 残基用 F 替代的SEQ ID No. 3。在本文中将该肽称作MU 60。(g) WRKffRKRffFFRKffRKRFF (SEQ ID No. 55)。该肽对应于将 9、10、17 和 18 位的 W 残基用F替代的SEQ ID No. 3。在本文中将该肽称作MU 61。(h) WRKCRKRCffffRKCRKRCff (SEQ ID No. 56)。该肽对应于将 4、8、13 禾口 17 位的 W 残
基用C残基替代的SEQ ID No. 3。在本文中将该肽称作MU 68。(i) LRKLRKRLLffRKffRKRffff (SEQID No. 57)。该肽对应于将 10、13、17 和 18 位的 L 残基用W残基替代的SEQ ID No. 2。在本文中将该肽称作MU 111。(j) LRKLRKRLLLRKLRKRffff (SEQ ID No. 58)。该肽对应于将 17 禾口 18 位的 L 残基用 W残基替代的SEQ ID No. 2。在本文中将该肽称作MU 112。(k) LRKLRKRLLffRKffRKRLL (SEQ ID No. 59)。该肽对应于将 10 禾Π 13 位的 L 残基用 W残基替代的SEQ ID No. 2。在本文中将该肽称作MU 113。(1) WRKffRKRLLLRKLRKRLL (SEQ ID No. 60)。该肽对应于将 1 和 4 位的 L 残基用 W 残基替代的SEQ ID No. 2。在本文中将该肽称作MU114。(m) WRKLRKRLLLRKLRKRLL (SEQ ID No. 61)。该肽对应于将 1 位的 L 残基用 W 残基替代的SEQ ID No. 2。在本文中将该肽称作MU 115。(n) WRKffRKFFFRKffRKRffff (SEQ ID No. 62)。该肽对应于将 8、9 禾口 10 位的 W 残基用 F残基替代并且缺失7位的R残基的SEQ ID No. 3。在本文中将该肽称作MU 116。(o)WRKffRKRffffFRKFRKRFF(SEQ ID No. 63)。该肽对应于将 10、13、17 和 18 位的 W 残基用F残基替代的SEQ ID No. 3。在本文中将该肽称作MU 117。(p) RRKRRKRRRRRKRRKRRR(SEQ ID No. 64)。该肽对应于全长串联重复，其中所有亮氨酸用精氨酸(R)残基替代。在本文中将该肽称作MU16。(q)KRKKRKRKKKRKKRKRKK(SEQ ID No. 65)。该肽对应于全长串联重复，其中所有亮氨酸用赖氨酸(K)残基替代。在本文中将该肽称作MU 18。发明人还理解可以根据本发明使用的肽可以包含超过仅ApoE141_149的简单的二聚体串联重复或者其平截。例如，可以将包含三聚体或者更大数目重复的肽用作抗病毒剂。在本发明的另一实施方案中，可以合成抗病毒肽，其包含如上定义的肽以及向其加入的另外的氨基酸。例如，可以对来自SEQ ID No. 2的肽的C或者N末端加入1、2、3或更多氨基酸。备选地，所述肽可以包含大于SEQ ID No. 1的9个氨基酸的肽的串联重复。 此类肽可以具有加入SEQ ID No. 2的N末端、C末端和/或第9和10个氨基酸之间的氨基酸。最优选地，向SEQ ID No. 2的C末端和第9和10个氨基酸之间加入氨基酸。将理解可以如上述对来自SEQ ID No. 2的肽进行修饰。作为实例，WRKWRKRffffRWRKWRKRffffR(SEQ ID No. 66)代表根据本发明的另一种优选的肽。该肽对应于ApoE141_15(l的全长串联重复(即， LRKLRKRLLR-SEQ ID No. 67的串联重复)，其中用色氨酸残基替代所有亮氨酸。在本文中将该肽称作MU83。在根据本发明的第一方面的apoE141_149的串联重复的衍生物的开发期间，理解SEQ ID No. 2的平截，和其变体也具有令人惊奇的抗病毒活性。这些包括
LRKLRKRLLLRKLRK(SEQ ID No. 7)。该肽对应于缺失残基16、17和18的全长串联重复的截短形式。该肽具有这样的优点该肽短于Gim并且因此生产更便宜。在本文中将该肽称作GIN 4。LRKLRKRLRKLRKR(SEQ ID No. 8)。该肽对应于通过切除氨基酸9、10、17和18截短
的全长串联重复。在本文中将该肽称作GIN 8。LRKLRKLRKLRKLRKLRK(SEQ ID No. 9)。该肽对应于包含LRK基序重复的全长串联重复的变体。在本文中将该肽称作GIN 9。此外，发现YRKYRKRYYYRKYRKRYY(SEQ ID No. 6)具有抗病毒剂的效果。该肽对应于apoE141_149的全长串联重复，其中酪氨酸残基替代所有亮氨酸残基。在本文中将该肽称作 GIN 41。根据本发明的第二方面，提供了根据本发明的第一方面的多肽、其衍生物或者类似物或者SEQ ID No. 6、7、8或9的肽，它们用作药物。根据本发明的第三方面，提供了根据本发明的第一方面的多肽、其衍生物或者类似物或者SEQ ID No. 6、7、8或9的肽用于生产治疗病毒感染的药物的用途。将理解根据本发明的第一方面的多肽、其衍生物或者类似物的治疗效果还可以由增加此类多肽、衍生物或类似物的活性的试剂“间接”介导。本发明提供了此类试剂的第一种医学用途。从而，根据本发明的第四方面，提供了能够增强根据本发明的第一方面的多肽、衍生物或者类似物的生物活性的试剂，其用作药物。能够增强根据本发明的多肽、衍生物或者类似物的生物活性的试剂可以通过多种方式实现它们的效果。例如，此类试剂可以增加此类多肽、衍生物或类似物的表达。备选地 (或者额外地)，此类试剂可以例如通过减小根据本发明的多肽、衍生物或者类似物的更新来增加根据本发明的多肽、衍生物或者类似物在生物系统中的半寿期。由于它们的增加的生物学活性，根据本发明的第一三方面的多肽、其衍生物或者类似物可以用作抗病毒剂。根据本发明的第一、二和三方面的多肽、衍生物或者类似物可以用于治疗多种病毒感染。所述病毒可以是任意病毒，尤其有包膜的病毒。优选的病毒是痘病毒、虹彩病毒、 批膜病毒或者环状病毒。更优选的病毒是线状病毒、沙粒病毒、布尼病毒或者弹状病毒。甚至更优选的病毒是副黏病毒或者正黏病毒。设想病毒可以优选地包括肝DNA病毒、冠状病毒、黄病毒或者逆转录病毒。优选地，病毒包括疱疹病毒或者慢病毒。在优选实施方案中， 病毒可以是人类免疫缺陷病毒(HIV)、人2-型单纯疱疹病毒(HSV2)，或者人1型单纯疱疹病毒(HSVl)。根据本发明的第一、二和三方面的多肽、衍生物或者类似物可以用于作为单一疗法(即仅使用该化合物)或者与用于抗病毒治疗的其他化合物或治疗(例如，无环鸟苷、 gangcylovir、病毒唑、干扰素、抗-HIV药物，包括逆转录酶的核苷、核苷酸或非核苷抑制剂、蛋白酶抑制剂和融合抑制剂)组合用于治疗病毒感染。该多肽、衍生物或类似物可以用作预防剂(以预防病毒感染的进展)或可以用于治疗存在的感染。根据本发明多肽的衍生物可以包括增加或者减小多肽的体内半寿期的衍生物。能够增加根据本发明多肽的半寿期的衍生物的实例包括所述多肽的拟肽衍生物、所述多肽的 D-氨基酸衍生物和肽-拟肽杂合分子。根据本发明的多肽可以受到多种方式的降解(如生物系统中的蛋白酶活性)。此类降解可以限制多肽的生物利用率并且因此限制多肽实现它们的生物功能的能力。有多种成熟的技术可以设计和产生在生物背景中具有增强的稳定性的肽衍生物。此类肽衍生物由于对蛋白酶介导的降解的抗性增加而具有改善的生物利用率。优选地，适于根据本发明使用的肽衍生物或者类似物比该它所来源的肽对蛋白酶更有抗性。肽衍生物和它所来源的肽的蛋白酶抗性可以通过公知的蛋白质降解测定法评价。然后可以比较肽衍生物和肽的蛋白酶抗性的相对值。可以从根据本发明的第一方面的肽的结构知识容易地设计本发明肽的拟肽衍生物。可以用通过商业途径可获得的软件根据成熟的方案开发拟肽衍生物。反拟肽(Retrop印toid)(其中所有氨基酸都被拟肽残基以相反顺序替代)也能够模拟来自载脂蛋白的抗病毒肽。预计与肽或者含有一个拟肽残基的拟肽-肽杂合分子相比，反拟肽以相反方向结合在配体结合沟中。结果，拟肽残基的侧链能够指向最初肽中侧链相同的方向。根据本发明多肽的修饰形式的另一实施方案包含多肽的D-氨基酸形式。使用 D-氨基酸而不是L-氨基酸制备肽极大地减小了正常代谢过程对此类试剂剂的不希望的分解，减小了需要使用的试剂的量，以及它的施用频率。本发明的多肽、类似物或衍生物代表生物细胞可以有利地表达的产物。从而，本发明在第五方面还提供了编码根据本发明的第一方面的多肽、衍生物或类似物的核酸序列。编码 apoE141_149 的核酸具有 DNA 序歹丨J cttcgtaaacttcgtaaacgtcttctt (SEQ ID. No. 10),而 GINl 具有序列 cttcgtaaacttcgtaaacgtcttcttcttcgtaaacttcgtaaacgtcttc tt (SEQ ID. No. 11)。根据本发明的第五方面的优选的核酸编码此处鉴定为GIN 4、7、8、9、32、34和41 的肽，这些核酸各自具有下面的序列cttcgtaaac ttcgtaaact tcgtaaactt cgtaaacttc gtaaacttcg taaa(SEQ ID No. 16)；tggcgtaaat ggcgtaaacg ttggtggtgg cgtaaatggc gtaaacgttg gtgg(SEQ ID No. 12)；cttcgtaaac ttcgtaaacg tcttcgtaaa cttcgtaaac gt(SEQ ID No. 17)；cttcgtaaac ttcgtaaact tcgtaaactt cgtaaacttc gtaaacttcg taaa (SEQ ID No. 18)；tggcgtaaat ggcgtaaacg ttggcgtaaa tggcgtaaac gt(SEQ ID No. 13)；tggcgtaaat ggcgtaaacg ttggtggctt cgtaaacttc gtaaacgtct tctt， (SEQ ID No. 14)；和tatcgtaaat atcgtaaacg ttattattat cgtaaatatc gtaaacgtta ttat(SEQ ID No. 15).技术人员将理解可以容易地产生根据本发明的其他优选的肽的核酸序列。
将理解，由于遗传密码的冗余性，根据本发明的第五方面的核酸序列可以从天然存在的ApoE基因改变，只要密码子编码根据本发明的第一方面的多肽、其衍生物或者类似物。将理解根据本发明的多肽、衍生物和类似物代表通过技术施用的有利的试剂，所述技术包括编码此类分子的核酸序列的细胞表达。此类细胞表达方法尤其适于医学用途， 在所述医学用途中需要所述多肽、衍生物和类似物的长时间的治疗效果。从而，根据本发明的第六方面，提供了根据本发明的第五方面的核酸序列，其用作药物。所述核酸可以优选是分离的或纯化的核酸序列。核酸序列可以优选是DNA序列。核酸序列可以还包含能够控制和/或增强其表达的元件。核酸分子可以包含在适宜的载体中以形成重组载体。该载体可以例如是质粒、粘粒或噬菌体。此类重组载体可以非常有用地用于本发明的递送系统来用核酸分子转化细胞。重组载体还可以包括其他功能元件。例如，可以设计重组载体使得该载体将在细胞中自主复制。在该情况中，在重组载体中可能需要诱导核酸复制的元件。备选地，可以设计重组载体使得载体和重组核酸分子整合到细胞的基因组中。在该情况中，有利于定位整合(例如，通过同源重组)的核酸序列是理想的。重组载体还可以具有编码用作克隆过程中的选择性标记的基因的DNA。如果需要，重组载体可以还包含控制基因表达的启动子或调节子。核酸分子可以(但不是必须的)是整合到所治疗的受试者的细胞的DNA中的核酸分子。未分化的细胞可以被稳定转化，导致产生遗传修饰的子细胞(在该情况中，可能需要例如用特定转录因子或者基因激活子调节受试者中的表达)。备选地，可以将递送系统设计成有利于在所治疗的受试者中分化细胞的不稳定或者瞬时转化。当是这种情况时，表达的调节较不重要，因为当经转化的细胞死亡或者停止表达蛋白质时，所述DNA分子的表达将停止(理想地，当已经实现了所希望的治疗效果时)。递送系统可以对受试者提供核酸分子而不将该核酸分子整合到载体中。例如，核酸分子可以掺入脂质体或者病毒颗粒中。备选地，可以通过适宜的方法，如直接胞吞摄入将 “裸露”的核酸分子插入受试者的细胞。可以通过转染、感染、显微注射、细胞融合、原生质体融合或者射弹轰击 (ballistic bombardment)将核酸分子转移到受试者的细胞中。例如，可以通过用包被的金颗粒的射弹转染、含有核酸分子的脂质体、病毒载体(例如，腺病毒)和通过直接应用核酸分子提供直接核酸摄入(例如，胞吞)的方式进行转移。将理解根据本发明的多肽、试剂、核酸或者衍生物可以以单一疗法使用(即，仅使用根据本发明的多肽、试剂、核酸或者衍生物预防和/或治疗病毒感染)。备选地，可以将根据本发明的多肽、试剂、核酸或者衍生物用作添加剂(adjunct)，或者与已知的疗法组合使用。根据本发明的多肽、试剂、核酸或者衍生物可以组合在具有许多不同形式的组合物中，这些形式具体取决于组合物使用的方式。从而，例如，组合物可以是粉剂、片剂、胶囊剂、液体、软膏剂、霜剂、凝胶剂、水凝胶、气溶胶、喷雾剂、微团、透皮贴剂、脂质体的形式或者可以施用于人或动物的任意其他适宜的形式。将理解本发明组合物的载体应该是对其施用的受试者良好耐受的，并且优选适于能够将所述多肽、试剂、核酸或衍生物递送到靶组
幺口
/Ν ο包含根据本发明的多肽、试剂、核酸或者衍生物的组合物可以以多种方法使用。例如，可能需要经口使用，在该情况中化合物可以包含在组合物中，该组合物可以例如以片剂、胶囊剂或液体的形式经口摄入。备选地，可以通过注射将组合物施用到血流中。注射可以是静脉内(大丸剂(bolus)或灌注)或者皮下的(大丸剂或灌注)的。可以通过吸入 (例如，鼻内)施用化合物。可以配制组合物用于局部使用。例如，可以将软膏剂应用于皮肤、口或生殖器中或者周围的区域以治疗特定病毒感染。局部应用于皮肤对于治疗皮肤的病毒感染或者作为经皮递送的工具递送到其他组织。阴道内施用对于治疗性传播疾病(包括艾滋病)尤其有效。多肽、试剂、核酸或衍生物还可以掺入缓释或延释装置。此类装置可以例如插入在皮肤上或皮肤下，并且化合物可以在几周或甚至几个月内释放。当需要用根据本发明的多肽、试剂、核酸或者衍生物长期治疗并且将通常需要频繁施用(例如，至少每天注射)时，此类装置尤其有用。将理解所需的多肽、试剂、核酸或者衍生物的量由它的生物学活性和生物利用率决定，生物利用率又取决于施用方式、所用多肽、试剂、核酸或者衍生物的理化性质和是否将所述多肽、试剂、核酸或者衍生物用作单一疗法或者用于组合疗法中。施用频率将也受到上述因素，尤其所述多肽、试剂、核酸或者衍生物在所治疗的受试者中的半寿期的影响。将施用的最佳剂量可以由本领域技术人员确定，并且随着施用的具体多肽、试剂、 核酸或者衍生物、制剂的强度、施用方式和疾病状况的发展而变。取决于所治疗的具体受试者的额外因素将导致需要调节剂量，所述额外因素包括受试者年龄、体重、性别、饮食和施用时间。将理解技术人员能够根据肽的药物动力学，尤其实施例中给出的IC5tl值计算所需的剂量，和靶组织处肽的最佳浓度。通常，可以0.0148/1^体重到0.58/1^体重的根据本发明的多肽、试剂、核酸或者衍生物的日剂量可以用于预防和/或治疗病毒感染，这取决于使用哪种特定多肽、试剂、核酸或者衍生物。更优选地，日剂量为0. 01mg/kg体重到200mg/kg体重，最优选地，约lmg/kg 到 100mg/kg。已知方法，如制药工业通常使用的那些方法(例如，体内实验、临床试验等等)可以用于建立根据本发明的多肽、试剂、核酸或者衍生物的特定剂型和精确治疗方案(如多肽、试剂、核酸或者衍生物的日剂量和施用频率)。日剂量可以作为单次施用(例如，单次每日注射)给予。备选地，所用的多肽、试剂、核酸或者衍生物可能需要一天内施用两次或多次。作为实例，根据本发明的多肽、试剂、 核酸或者衍生物可以作为25mg到7000mg(S卩，假设体重70kg)的两次(或者多次，取决于状况的严重性)日剂量施用。接受治疗的患者可以在醒来时服用第一次剂量然后在傍晚(如果两次剂量方案)服用第二次剂量，或者之后以3或4小时间隔服用。备选地，可以用缓释装置对患者提供最佳剂量，不需要施用重复剂量。本发明提供了药物组合物，其包含治疗有效量的根据本发明的多肽、试剂、核酸或者衍生物和任选地可药用的载体。在一个实施方案中，所述多肽、试剂、核酸或者衍生物的量为约0. Olmg到约800mg。在另一实施方案中，多肽、试剂、核酸或者衍生物的量为约 0. Olmg到约500mg。在另一实施方案中，多肽、试剂、核酸或者衍生物的量为约0. Olmg到约 250mg。在另一实施方案中，多肽、试剂、核酸或者衍生物的量为约0. Img到约60mg。在另一实施方案中，多肽、试剂、核酸或者衍生物的量为约0. Img到约20mg。本发明提供了制备药物组合物的方法，其包括将治疗有效量的根据本发明的多肽、试剂、核酸或者衍生物与可药用载体合并。“治疗有效量”是根据本发明第一方面的多肽、试剂、核酸或者衍生物的任何剂量，其当施用于受试者时提供了病毒感染的预防和/或治疗。“受试者”是脊椎动物、哺乳动物、家畜或人。本文所用的“可药用载体”是本领域技术人员已知的用于配制药物组合物的任何
生理学载体。在优选实施方案中，药物载体是液体并且药物组合物是溶液的形式。在另一实施方案中，可药用载体是固体并且组合物是粉末或片剂的形式。在另一实施方案中，药物载体是凝胶并且组合物是霜剂等形式。固态载体可以包括一种或多种物质，其也可以作为调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、填充剂、助流剂、压缩助剂、粘合剂或者片剂崩解剂；它还可以是包胶材料。在粉剂中，载体是细分的固体，其与细分活性多肽、试剂、核酸或者衍生物混合。在片剂中，活性多肽、试剂、核酸或者衍生物与具有必要压缩性质的载体以适当比例混合并且以所希望的形状和大小压缩。粉剂和片剂优选含有高达99%活性多肽、试剂、核酸或者衍生物。适宜的固态载体包括例如，磷酸钙、硬脂酸镁、滑石粉、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、 低熔点蜡和离子交换树脂。液态载体用于制备溶液、混悬剂、乳剂、糖浆剂、酏剂和压缩的组合物。活性多肽、 试剂、核酸或者衍生物可以溶解或者悬浮在可药用液态载体中，所述载体为诸如水、有机溶剂、水和有机溶剂的混合物或者可药用油或脂肪。液态载体可以含有其他适宜的药物添加剂，如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、增甜剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或者渗透调节剂。用于经口或者肠胃外施用的液态载体的适宜的实例包括水 (部分含有上面的添加剂，例如，纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素钠溶液)、醇(包括一元醇和多元醇，例如，乙二醇)和它们的衍生物，和油(例如，分馏的椰子油和花生油)。对于肠胃外施用，载体还可以是油酯，如油酸乙酯和十四烷酸异丙酯。无菌液态载体可用于无菌液体形式的组合物用以肠胃外施用。用于压缩的组合物的液态载体可以是卤代烃或者其他可药用推进剂。通过例如肌内、鞘内、硬膜夕卜、腹膜内、静脉内和特别是皮下、大脑内或脑室内注射可以利用液体药物组合物，其为无菌溶液或混悬剂。可以将所述多肽、试剂、核酸或衍生物制备成无菌固态组合物，其可以在施用时施用无菌水、盐水或其他适宜的无菌可注射介质溶解或者悬浮。载体意在包括必要的和惰性粘合剂、悬浮剂、润滑剂、调味剂、增甜剂、防腐剂、染料和包衣。根据本发明的多肽、试剂、核酸或衍生物可以以无菌溶液或者悬浮液的形式经口施用，所述溶液或悬浮液含有其他溶质或悬浮剂(例如，足够的盐水或葡萄糖使得溶液等渗)、胆汁盐、阿拉伯树胶、明胶、去水山梨糖醇单油酸酯、聚山梨酯80(山梨醇的油酸酯和其与氧化乙烯共聚的酸酐)等等。根据本发明的多肽、试剂、核酸或衍生物还可以以液体或固体组合物形式经口施用。适于经口施用的组合物包括固体形式，如丸剂、胶囊剂、粒剂、片剂、和粉剂，和液体形式，如溶液、糖浆、酏剂和混悬剂。用于肠胃外施用的形式包括无菌溶液、乳剂和混悬剂。将仅作为实例进一步描述本发明，参考下面的实施例和附图，在附图中

图1显示了如实施例1中描述的apoE141_149dp和apoE263_2TO对HSVl感染性的影响 (点为来自多达4个值的平均值)；图2显示了如实施例1中描述的apoE141_149dp和apoE263_2TO对HSV2感染性的影响 (点为来自多达4个值的平均值)；图3图解如实施例1中描述的通过ELISA测量的即他141__和apoE263_2ai在急性感染的U937细胞中对HIV-IpM产生的抑制(点为三个实验的平均值)(apoE141_149dp对HIV具有显著活性(AN0VA，ρ < 0. 001)，而apoE263_2ai对HIV的活性没有达到显著性(AN0VA ；0. 06 < ρ < 0. 62))；图4图解了如实施例2中描述的4种肽(GINl、lp、2和3)对HSVl感染性的影响；图5图解了如实施例2中描述的4种肽(GIN4-7)对HSVl感染性的影响；图6图解了如实施例2中描述的4种肽(GIN 8-11)对HSVl感染性的影响；图7比较并图解了如实施例2中描述的肽GIN 7,GIN 32,GIN ；34和GIWp对HSVl 感染性的影响；图8图解了如实施例4中描述的肽GIN7对生长在过表达CCR5共同受体的NP_2 神经胶质瘤细胞中的HIV分离物SF162的抗HIV作用；图9显示了 GIN7的典型的质谱数据并且阐明该肽为> 95%纯度；图10显示了 GIN7的典型的HPLC数据并且阐明该肽为> 95%纯度。实施例1用apoE141_149进行实验以确定该肽是否具有作为抗病毒剂的任何功效。1. 1 HSVl图1和表1显示了抗-HSVl活性测试的典型结果。测定法包括对M孔板中的汇合的Vero细胞用含有病毒和不同量的肽的培养基处理1小时，然后除去该接种物，并加入含有0. 2%高粘度羧甲基纤维素的粘性“覆盖”培养基。覆盖培养基仅允许感染与受感染的细胞紧密相邻的那些细胞。孵育2天并固定和染色后，可以见到受感染的细胞的小的斑点 (或者“噬斑”)，将它们计数。这些噬斑的每一个对应于1小时孵育期间单个细胞的感染。 apoE141_149dp在约20 μ M的浓度下将噬斑数目减少40%。注意到肽仅在实验系统中存在1小时。表1 用含有apoE141_149dp或者apoE263_2ai的病毒接种后Vero细胞中HSVl噬斑形成。 对未处理的孔的值加下划线。
权利要求
1.包含SEQID No.2的即他141_149的串联重复或者其平截的多肽、其衍生物或者类似物，其特征是将SEQ ID No. 2的至少一个亮氨酸(L)残基用具有包含至少4个碳原子和至少一个氮原子的侧链的氨基酸替代。
2.根据权利要求1的多肽、其衍生物或者类似物，其中用于替代亮氨酸的氨基酸是色氨酸(W)、精氨酸(R)或者赖氨酸(K)或者它们的衍生物。
3.根据权利要求2的多肽、其衍生物或者类似物，其中用于替代亮氨酸的氨基酸是色氨酸(W)或者其衍生物。
4.根据权利要求1-3任一项的多肽、其衍生物或者类似物，其中进行至少两个W、R或K 替代。
5.根据权利要求1-4任一项的多肽、其衍生物或者类似物，其中将至少一个另外的氨基酸用天冬酰胺(N)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、异亮氨酸 (I)、谷氨酰胺(Q)或者组氨酸(H)替代或缺失。
6.根据权利要求1-4任一项的多肽、其衍生物或者类似物，其具有氨基酸序 ^lJ =WRKffRKRffffffRKffRKRffff (SEQ ID No. 3) ；WRKffRKRffRKffRKR (SEQ ID No. 4) WRKffRKRffffLRKLRKRLL (SEQ ID No. 5) ；YRKYRKRYYYRKYRKRYY (SEQ ID No. 6) WRKffRKRffffRKffRKRffff(SEQ ID No. 52) ；WRKffRKRffRKffRKRff (SEQ ID No. 53) WRKffRKRffffFRKffRKRffff(SEQ ID No.54) ；WRKffRKRffFFRKffRKRFF(SEQ ID No.55) WRKCRKRCffffRKCRKRCff(SEQ ID No.56) ；LRKLRKRLLffRKffRKRffff(SEQ ID No.57) LRKLRKRLLLRKLRKRffff(SEQ ID No. 58) ；LRKLRKRLLffRKRLL(SEQ ID No. 59) WRKffRKRLLLRKLRKRLL(SEQ ID No.60) ；WRKLRKRLLLRKLRKRLL(SEQ ID No.61) WRKffRKFFFRKffRKRffff (SEQ ID No.62) ；WRKffRKRffffFRKFRKRFF(SEQ ID No.63) RRKRRKRRRRRKKRRKRRR(SEQ ID No. 64)；或 KRKKRKRKKKRKKRKRKK (SEQ ID No. 65)。
7.根据前面权利要求任一项的多肽、衍生物或者类似物，其中向所述肽加入氨基酸。
8.根据权利要求8的多肽、衍生物或者类似物，其中向SEQID No. 2的N末端、C末端和/或在第9和10个氨基酸之间加入氨基酸。
9.根据权利要求8的多肽、衍生物或者类似物，其包含WRKWRKRffffRWRKWRKRffffR(SEQID No. 66)。
10.根据前面权利要求任一项的多肽、衍生物或者类似物，其是拟肽类似物。
11.根据前面权利要求任一项的多肽、衍生物或者类似物，其是肽/拟肽杂合分子。
12.包含YRKYRKRYYYRKYRKRYY(SEQ ID No. 6)的多肽、其衍生物或者类似物。
13.包含LRKLRKRLLLRKLRK(SEQID No. 7)的多肽、其衍生物或者类似物。
14.包含LRKLRKRLRKLRKR(SEQID No. 8)的多肽、其衍生物或者类似物。
15.包含LRKLRKLRKLRKLRKLRK(SEQIDNo. 9)的多肽、其衍生物或者类似物。
16.根据前面权利要求任一项的多肽、衍生物或者类似物，其用作药物。
17.根据权利要求1-15任一项的多肽、衍生物或者类似物在制备用于治疗病毒感染的药物中的应用。
18.能够增强根据权利要求1-15任一项的多肽、衍生物或者类似物的生物学活性的试剂在制备用于治疗病毒感染的药物中的应用。
19.预防和/或治疗病毒感染的方法，其包括对需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的根据前面权利要求任一项的多肽、衍生物或类似物。
20.核酸序列，其编码根据权利要求1-15任一项的多肽、衍生物或者类似物。
21.根据权利要求20的核酸序列，其用作药物。
22.预防和/或治疗病毒感染的方法，其包括对需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的根据权利要求20或21的核酸序列。
全文摘要
本发明涉及来自apoE141-149的串联重复的多肽和它们作为药物的用途。所述肽包含串联重复和其平截，所述肽的至少一个亮氨酸(L)被具有包含至少4个碳原子和至少一个氮原子的侧链的氨基酸替代。此类肽可以用于预防或治疗病毒感染。
文档编号A61K38/00GK102336815SQ20111024952
公开日2012年2月1日 申请日期2004年12月17日 优先权日2003年12月17日
发明者C·多布森 申请人:Ai2有限公司