专利名称：开发金针菇免疫调节蛋白及灵芝免疫调节蛋白治疗呼吸道融合病毒引起的发炎及降低病 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术及农业化学。
背景技术：
一、呼吸道融合瘤病毒(Respiratory Syncytial Virus RSV)的介绍呼吸道融合瘤病毒(Respiratory Syncytial Virus RSV)是造成婴儿及幼童严重的病毒性支气管炎及病毒性肺炎等急性病毒性呼吸道疾病的主要原因。其是一种RNA病毒，和腿腺炎病毒，德国麻疫病毒同属副黏液病毒(Paramyxovirus),在多种不同组织中培养都可产生特别的细胞融合现象(syncytial cytopathology),侵入呼吸道后会引起气管上皮细胞坏死、黏液分泌、发炎细胞浸润、黏膜下层水肿。呼吸道融合瘤病毒特别喜欢感染 具有纤毛的呼吸道表皮细胞，在呼吸道会造成细支气管的阻塞与发炎以及黏膜下层细胞的浸润，出现呼气时间延长、肺膨胀不全(atelectasis)及肺炎等症状。在老年人及免疫不全的病人中，呼吸道融合瘤病毒同样会引起严重的呼吸道疾病。从公共卫生的观点来看，世界各国的卫生组织及政府的卫生单位，都把制作呼吸道融合瘤病毒疫苗列为当前防治病毒感染的重要工作之一。呼吸道融合瘤病毒是副黏液病毒科(Paramyxoviridae),肺炎病毒属(Pneumovirus),具有外套膜(envelope),其基因组为单股(-)RNA,由15，222个核酸组成，包含10段的mRNA。这些mRNA可以转译出11种已经被确认存在的蛋白质，包括4种核蛋白壳蛋白质(nucleocapsid protein),分别命名为 nucleocapsid N protein、phosphoprotein P、 large polymerase subunit transcription elongation factorM2-1 ;3种穿透膜的外套醣蛋白质，分别是fusion F protein、attachment G protein及small hydrophobic SH protein ;2 种非结构蛋白质 NS1、NS2 ;1 种基质蛋白质 M protein以及目前推测为负调控因子的M 2-2等蛋白质。目前功能不明确的有NS1、NS2及SH蛋白质等。根据过去科学家们发展呼吸道融合瘤病毒疫苗的试验结果，我们可以归纳出死毒疫苗(inactivated vaccine)引发的免疫反应是Th 2 T-helper cell—系列的反应,会使得下呼吸道(指支气管、肺脏等部位)的病情更加严重，因为Th 2 T-helper cell产生的细胞激素IL-4、IL-IO等，会引起更严重的细胞浸润现象，加重并且加速病情。以台湾北部地区流行病学调查2001/01-2005/12每二年的春秋季为罹患此病高峰期(Lee et al.，2007)，目前并无特效药多为支持性疗法。并且若以glucocorticoids治疗并无法改善其症状(Patelet al.，2008)。而利用我们在这次研究执行中发现FlP-fve可能可以诱导出有效抑制病毒感染及减轻呼吸道疾病病情的Th I T-helper cell的反应，是符合我们所要求的发展临床药物的有效方法。二、真菌类免疫调节蛋白的功能在一些食用菇类，如灵芝、草菇及金针菇中所纯化分离出来的蛋白质，他们具有类似的胺基酸序列及免疫调节功能，我们以将此种类的蛋白质，命名为真菌类免疫调节蛋白质(Fungal immunomodulatory proteins, FIPs) (Hsu et al. , 1997 ；Ko et al. , 1995 ；Lin et al.，1997)。尤其以灵芝在传统中药已成为翘楚，对维持人体健康，有莫大作用。过去研究发现它具有抗过敏发炎(Lee et al. , 2001)、保护肝脏功能(Shieh et al. ,2001) >抗肿瘤及增强免疫功能，但大多局限于粗萃取物(Cuella et al.，1996)研究，或小分子化合物研究(Lai et al. ,2001 ；Zhang et al.，2002)。直到1989年日本明治制药从灵芝中纯化得一免疫调节功能蛋白，LZ8 (Kino et al.，1989)，实验结果发现LZ-8可以明显的抑制全身性过敏反应，治疗肝炎及预防糖尿病，我们实验室最近发现灵芝免疫调节蛋白抑制肺癌细胞终端酶活性(Liao et al.，2006 ；Liao et al.，2007)并造成肺癌细胞衰老(Liaoet al. ,2008)可发展治疗肺癌并已协助益生生技开发股份有限公司申请专利。LZ8具有mitogenic能力，且可抑制CFW老鼠由牛血清蛋白BSA所引起的anaphylaxis。本计划主持人曾自另一可食用的菇类-金针菇(FlP-fve)发现与LZ8及免疫球蛋白的重链区的蛋白质结构有相当程度的相似性，且二级结构多为b-Sheet，而测量其对于人类淋巴球细 胞增殖能力时，当FlP-fve浓度为100微克/毫升时(Ko et al.，1995)，其增殖能力达到最强。而注射FlP-fve蛋白质于老鼠体内，其剂量为8毫克/公斤体重时，具有抑制BSA所引起的systemic anaphylaxis反应。在老鼠足趾肿胀实验中预先腹腔注射FlP-fve蛋白质,齐[J量为5毫克/公斤体重时，即可减小compound 48/80所引起的发炎反应。由以上实验结果得知此蛋白质具有免疫调节活性，经进一步研究免疫调节的机转是为促进IFN-Y及TNF-α基因的转录作用。其中真蕈类免疫调节功能蛋白研究较透澈的为灵芝，此免疫调节功能蛋白质会促进 ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1)的表现(Haak-Frendscho et al.,1993)，并明显增加IFN- Y，因此灵芝增加⑶2表现，引起rosette形成，所以灵芝可借着调节immunocompetent cell上adhesion分子来表现其药性。而灵芝属菌株中，依许瑞祥博士论文中分离区别鉴定 G. applanatum. ，G. formosanum. ，G. fornicatum. ，G. Iucidium,G. tropicum及G. tsugae等数种灵芝。每种菌种间其免疫调节活性差异相当大，目前G. Iucidium及G. tsugae与本研究者发现的FlP-fve已被证实具有免疫调节功能,另本研究团队已同时在今年开发新的免疫调节功能蛋白能力。在蕈类植物中，他们的子实体或菌丝体中，有一些在蕈类植物中，它们的子实体或菌丝体中有一些亲醣蛋白质(lectins),会促进淋巴球的增殖；相反的,有些则会抑制淋巴球的增殖。包括松鸾科的Agaricus bisporus (Koyama et al. , 2002),分子量为64kDa,由4个次单元体构成，会抑制癌细胞U937增殖甚至造成细胞凋亡(Apoptosis)。这些亲醣蛋白质皆具有凝集细胞的能力。蕈类中亲醣蛋白质，其蛋白质上所结合的醣类多不相同，猴头燕 Hericium erinaceum(Kawagishi et al. , 1994)上的醣类是属于 sialic acid 结合，Laetiporus sulfurens (Yoshikawa et al. , 2001)是N_acetyllactosamine 结合,可倉泛促进细胞表面受体的结合，而亲醣蛋白质对于免疫调节功能方面，不同种亲醣蛋白质与不同种抗体或细胞结合能力不太一样,如Agaricus bisporus会与Ig A结合(Irazoqui et al.,1997) ;L_selectin 促使 neutrophil 凝集；C. albicans 所纯化得 manoprotein 亦会降低IL-8与其IL-8receptor结合能力，减缓由IL-8所造成的发炎反应(Kemeny et al. , 1998)。因此本研究主要拟探讨此类凝集蛋白是否可透过减缓发炎反应的免疫调节功能免疫功能，减轻RSV的伤害。
三、金针菇免疫调节蛋白与灵芝免疫调节蛋白由金针燕(Flammulina velutipes)子实体经由阳离子交换树脂CM-52纯化后所得到的蛋白FlP-fve (Fungal immunomodulatory protein),是具有免疫调节功能的蛋白质。由之前的实验得知 FIP-fve可以使正常人类外围血液的淋巴球(HPBMCs)以及Balb/c老鼠的脾脏细胞诱发IFN-Y的产生,并且对细胞有proliferation的能力。而由FlP-fve所诱发的IFN-Y是属于Thl细胞所诱发的细胞激素，可以抑制Th2细胞所产生的细胞激素。重组灵芝免疫调节蛋白是由将灵芝免疫调节蛋白基因置入面包酵母菌，进一步纯化得到13kDa的蛋白。因此在免疫系统上具有降低由Th2cytokine调控IgE、mast cell等所引起的过敏反应，包括慢性气喘、呼吸道发炎等等。因此本篇研究以FlP-fve (100 μ g/ml)刺激 HPBMCs 使 p38 及 ERK(extracellular signal-regulated protein kinase)憐酸化最明显，但不会活化 JNK (the c-Jun NH2-terminal kinase),并且预先处理 p38MAPkinase的抑制剂SB203580(10yM)可以抑制p38的磷酸化。同时证明以FlP-fve (100 μ g/ml)处理HPBMCs 48小时会明显产生IFN- Y，而且诱导也会受到SB203580、LY294002 (PI3_kinase的抑制剂)以及U0126(MEKl/2的抑制剂)所抑制。除了由金针菇子实体纯化的FlP-fve蛋白有诱发IFN-γ的能力以外，重组的FlP-fve融合蛋白(recombinant FlP-fve)也有FlP-fve将近一半的活性。本实验说明了 FlP-fve调控IFN-Y的机制是可以透过p38 MAPkinase pathway及ERK的活化途径,而不是经由活化JNK途径。FlP-fve所诱发高量的IFN-Y却可以藉由抑制TH2细胞所产生的细胞激素的生成，并期望将来可以应用在基因免疫的预防治疗上。
发明内容
本发明的目的在于开发金针菇免疫调节蛋白作为制备治疗呼吸道融合病毒活性的药物应用。本发明提供一种口服真蕈类免疫调节蛋白，包含金针菇免疫调节蛋白或灵芝免疫调节蛋白，可抑制RSV所导致的呼吸道过度反应。金针菇免疫调节蛋白可抑制RSV所诱导的NF- K B的磷酸化与进入细胞核。口服金针菇免疫调节蛋白可抑制RSV所诱导的发炎反应相关激素及降低病毒的表现量。经实验发现金针菇蛋白FlP-fve具有降低RSV感染，进而减少NF- κ B路径相关的发炎物质产生的疗效。
图IA 为实验动物 RSV (Respiratory Syncytial Virus)致敏及灌食 FlP-fve 实验流程；图IB为以12% SDS PAGE电泳胶图呈现纯化后结果。图2为以空斑计数试验观察金针菇与灵芝免疫调节蛋白对于RSV所导致的细胞空斑的影响。图3为以免疫荧光染色观察FlP-fve对于RSV感染力的影响。图4为以酵素免疫吸附试验评估FlP-fve对于RSV感染力的影响。图5为以RT-PCR侦测RSV和IL_4mRNA表现量。
图6为以ELISA侦测IL-6分泌量。图7为以西方墨点法评估FlP-fve对于RSV所导致的NF- κ B和I κ B α磷酸化的影响。图8为以免疫荧光染色观察FlP-fve对于RSV感染后NF- κ B进入细胞核情形的影响。图9为经由RSV刺激后，细胞内的IKK复合体会将I κ B磷酸化，而被磷酸化的I κ B会降解，使NF- κ B被释放，另一方面，NF- κ B也同时被IKK复合体磷酸化并进入细胞核中，NF-κ B进入细胞核后会键结到许多发炎物质相关基因(例如IL-4)的转录位置上，基因表现就会被启动，而使得被感染的细胞产生发炎反应。图10为观察金针菇与灵芝免疫调节蛋白对于感染RSV小鼠呼吸道过度反应的影响。图11为观察金针菇与灵芝免疫调节蛋白对于感染RSV小鼠肺部IL-6含量的影响。主要组件符号说明AHR呼吸道过度反应测定Methacholine (mg/ml)乙酸甲胆喊Penh肺功能指针Control 控制量RSV呼吸道融合病毒FIP-fve/RSV免疫调节蛋白FIP-gts/RSV 灵芝蛋白
具体实施例方式呼吸道融合病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是婴幼儿下呼吸道感染最常见的病毒，由于其感染机制目前尚未明确，因此无法发展有效的疫苗或治疗方式。FlP-fve为一个从金针燕(Flammulina velutipes)纯化出来的免疫调节蛋白，分子量大小为13kDa，被归类在真菌类免疫调节蛋白(FIPs)，此类的蛋白具有调控IFN-Y增力口，减少过敏发炎的功效。本发明以金针菇蛋白FlP-fve处理于感染RSV病毒的HEp-2细胞株，并分别以下列方式来侦测病毒表现量I.空斑计数试验(plaque assay)2.免疫突光染色法(Immunofluorescence)3.酵素免疫吸附试验(ELISA)4.聚合酶链锁反应(RT-PCR)5. BUXCO SYSTEM-AHR6.实验动物七周大BALB/c母鼠由财团法人国家动物中心提供，并饲养于中山医学大学实验动物中心。请参阅图1A,为实验动物RSV(Respiratory Syncytial Virus)致敏及灌食FlP-fve实验流程，图IB为以12% SDS PAGE电泳胶图呈现纯化后结果，金针菇蛋白分子量位于13kDa。M表示marker, C表示粗萃取物，fve表示纯化出的金针燕免疫调节蛋白FlP-fve。请参阅图2，为以空斑计数试验观察金针菇与灵芝免疫调节蛋白对于RSV所导致的细胞空斑的影响。在12孔培养皿中种3X IO5颗HEp-2细胞，隔天分别前处理不同浓度的蛋白2小时后，再感染RSV I小时，并以O. 75%甲基纤维素覆盖之，6天后以结晶紫染色观察空斑形成的情形。请参阅图3，为以免疫荧光染色观察FlP-fve对于RSV感染力的影响。在人类肺癌上皮细胞A549中前处理200 μ g/ml金针菇蛋白2小时后，再感染不同剂量的RSV 48小时，并以专一性荧光抗体侦测RSV，蓝色荧光部分为细胞核，绿色荧光为RSV。请参阅图4，为以酵素免疫吸附试验评估FlP-fve对于RSV感染力的影响。在人类肺癌上皮细胞A549中分别前处理0，50，100，200 μ g/ml金针菇蛋白2小时后，再感染不同剂量的RSV，72小时后以丙酮固定细胞，并使用专一性RSV抗体结合，最后以波长450nm侦 测吸光值。请参阅图5，为以RT-PCR侦测RSV和IL_4mRNA表现量。在人类喉癌细胞HEp_2中分别前处理0，50，100 μ g/ml金针菇蛋白2小时后，再感染RSV (moi = O. 1),48小时后纯化出mRNA并以RT-PCR的方式侦测其RSV和IL-4基因表现量。请参阅图6，为以ELISA侦测IL-6分泌量。在人类喉癌细胞HEp_2中分别前处理0,100,400 μ g/ml金针菇蛋白2小时后，再感染RSV(moi = 3)，24小时后收取培养液并以ELISA的方式侦测其IL-6浓度。 请参阅图7，为以西方墨点法评估FlP-fve对于RSV所导致的NF- κ B和I κ B α磷酸化的影响。在Α549肺癌上皮细胞中感染RSV，并给予200 μ g/ml金针菇蛋白，分别在4小时与8小时后分离出细胞中总蛋白，并以西方墨点法观察磷酸化NF- κ B (P-NF- κ B)与磷酸化ΙκΒα (ρ-Ι κ B α )的蛋白表现量。请参阅图8，为以免疫荧光染色观察FlP-fve对于RSV感染后NF- κ B进入细胞核情形的影响。在人类肺癌上皮细胞Α549中前处理200 μ g/ml金针菇蛋白2小时后，再感染不同剂量的RSV 24小时，并以专一性荧光抗体侦测RSV，蓝色荧光部分为细胞核，红色荧光为 NF-κ B。请参阅图9，为经由RSV刺激后，细胞内的IKK复合体会将I κ B磷酸化，而被磷酸化的I κ B会降解，使NF- κ B被释放，另一方面，NF- κ B也同时被IKK复合体磷酸化并进入细胞核中，NF-κ B进入细胞核后会键结到许多发炎物质相关基因(例如IL-4)的转录位置上，基因表现就会被启动，而使得被感染的细胞产生发炎反应。而本研究的结果展现出FlP-fve可能具有降低RSV感染，进而减少发炎物质产生的潜力。请参阅图10，为观察金针菇与灵芝免疫调节蛋白对于感染RSV小鼠呼吸道过度反应的影响。预先给予每只小鼠口服200ug的金针菇蛋白或50 μ g灵芝蛋白每12小时一次，48小时后以鼻腔滴定方式给予IO8PFU的RSV病毒，并持续给予口服蛋白，致敏后第6天将小鼠暴露在不同浓度分别为O (saline)、5、10、20和40mg/ml的雾状methacholine中，并进行小鼠呼吸道过度反应测定(AHR)。请参阅图11，为观察金针菇与灵芝免疫调节蛋白对于感染RSV小鼠肺部IL-6含量的影响。预先给予每只小鼠口服200 μ g的金针菇蛋白或50 μ g灵芝蛋白每12小时一次，48小时后以鼻腔滴定方式给予108PFU的RSV病毒，并持续给予口服蛋白，致敏后第6天收集小鼠肺部灌洗液并以ELISA侦测IL-6浓度。通过以上实验发现在处理FlP-fve后能够有效抑制RSV病毒的感染。另一方面，过去有研究指出，RSV会刺激细胞中I κ B α的磷酸化和降解，而促使NF- κ B进入细胞核中并结合到基因的转录因子键结区上，使细胞产生发炎反应。在本发明中，以西方墨点法侦测I κ B α和NF- κ B蛋白的磷酸化，发现处理FlP-fve后，两者磷酸化蛋白的表现量都有被抑制的情形，进一步以共轭焦显微镜观察NF- κ B在细胞中的分布情况，结果显示，FlP-fve能明显减少由RSV所导致的NF- κ B进核，而NF- κ B相关的发炎因子IL-4表现量也明显下降。综合以上实验结果，发现金针菇蛋白FlP-fve具有降低RSV感染，进而减少NF- κ B路径相关的发炎物质产生的疗效。最后，以BALA/C小鼠进行动物模式，发现口服金针菇蛋 白的小鼠，可抑制以鼻腔滴定RSV病毒后所引发的气喘现象。
权利要求
1.口服真蕈类免疫调节蛋白，包含金针菇免疫调节蛋白或灵芝免疫调节蛋白，可抑制RSV所导致的呼吸道过度反应。
2.金针菇免疫调节蛋白可抑制RSV所诱导的NF-K B的磷酸化与进入细胞核。
3.口服金针菇免疫调节蛋白可抑制RSV所诱导的发炎反应相关激素及降低病毒的表现量。
全文摘要
本发明以金针菇免疫调节蛋白FIP-fve处理于感染RSV病毒的HEp-2细胞株，发现在处理FIP-fve后能够有效抑制RSV病毒的感染。另一方面，以西方墨点法侦测IκBα和NF-κB蛋白的磷酸化，发现处理FIP-fve后，两者磷酸化蛋白的表现量都有被抑制的情形，进一步以共轭焦显微镜观察NF-κB在细胞中的分布情况，结果显示，FIP-fve能明显减少由RSV所导致的NF-κB进核，而NF-κB相关的发炎因子IL-4表现量也明显下降。综上发现金针菇蛋白FIP-fve具有降低RSV感染，进而减少NF-κB路径相关的发炎物质产生的疗效。最后，以BALA/C小鼠进行动物模式，发现口服金针菇蛋白的小鼠，可抑制以鼻腔滴定RSV病毒后所引发的气喘现象。
文档编号A61K36/074GK102949707SQ201110249738
公开日2013年3月6日 申请日期2011年8月23日 优先权日2011年8月23日
发明者柯俊良, 张语琦 申请人:柯俊良