专利名称：一种昆虫或节肢动物次生代谢物的提取方法
技术领域：
本发明涉及昆虫的提取加工领域，具体涉及一种昆虫或节肢动物次生代谢物的提取方法，采用该方法提取所得提取物对G+阳性菌或G—阴性菌有不同程度的抑菌作用，可用来制备具有抑菌活性的药物。
背景技术：
昆虫作为地球上种类最多，数量最大的物种，无疑是蕴藏巨大天然产物资源的生物宝库，我国古代就有着许多昆虫入药的记载，如中医巨著《本草纲目》以及《本草纲目拾遗》等都有昆虫入药的记载。据不完全调查，我国昆虫的种类已超过了 10万种，已发现有药用价值的不过209种，不到昆虫总数的洲，而常用的昆虫类中药不到20种，也就是说不少昆虫的药用价值尚未被发现，努力发掘将具有重要的科学意义和应用前景。药用昆虫资源丰富，能够为新药的开发提供大量的有生物活性的化合物。目前已成功开发的昆虫类新药均为发酵虫草的制剂。此外，中医中药在昆虫的应用方面具有独特、 丰富的经验，因此药用昆虫在发掘新药源、治疗疑难病方面均有巨大潜力，值得进一步研究。而且由于昆虫种类繁多，不少昆虫的药用价值尚未被发现。因此昆虫在开发新药源方面极具潜力，应努力发掘。昆虫作为重要的药用资源和具有重要生理活性的先导化合物来源，澳大利亚、巴西、新西兰、加拿大、和英国等国家由于享有独特的生态环境，昆虫天然产物的研究一直处于世界领先地位。目前我国的昆虫研究，主要集中在昆虫的分泌物，代谢物和昆虫毒素的利用，以及生物活性大分子的应用和昆虫化学生态学的研究上。早期对昆虫小分子化合物生化学活性的研究仅仅局限于斑蝥、虫草等少数昆虫种类。药用昆虫仍限于中草药的方剂配伍中，在我国至今采用的是全虫入药的传统方式，药用成分不清。因此昆虫天然产(药)物研究具有十分重要的意义。昆虫抑菌活性成分，多年来除在昆虫的防御系统的研究中，涉及农药的应用有所触及外，而近年来作为昆虫抗菌肽活性研究较为活跃，昆虫抗菌肽是昆虫体内含有的高分子化合物研究，不属于次生代谢物范畴。尽管进一步的研究抗菌肽结构与活性的关系和作用机理屡有报道，但与传统抗生素相比，昆虫抗菌肽的抗菌活性还远不够理想。所以就国内外研究现状分析表明，有关昆虫的大部分研究工作，目前仍只是在昆虫分类学、化学生态学的学科范围内进行的，人们尚未真正用心研究它们的生物活性与人类疾病的关系。迄今为止，尚未见到其它的更多的类似昆虫次生代谢物小分子的化合物或昆虫天然产物化学与创新药物的研究成果的报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种昆虫或节肢动物次生代谢物的提取方法，采用该方法所得提取物浸膏对G+阳性菌或G-阴性菌有不同程度的抑菌作用，可用来分离和制备具有抑菌活性的活性化合物，进一步发现抑菌或抗菌的药物先导化合物。
—种昆虫或节肢动物次生代谢物的提取方法，其包括如下步骤将干燥的昆虫或节肢动物粉渣先用二氯甲烷浸泡两次以上(浸泡以能淹没粉渣为宜)，每次浸泡时间不少于 36h，然后固液分离(合并所得浸提液并浓缩干燥得脂溶性提取物)；所得粉渣干燥后再用甲醇水溶液浸泡两次以上，每次浸泡时间不少于36h，合并浸泡所得醇提液并冷冻干燥后得浸膏，该浸膏即为水溶性提取物。上述的这两种脂溶性提取物和水溶性提取物即为昆虫或节肢动物体内的次生代谢物。所述昆虫选自长白山红蚁、九香虫、蟑螂、蝼蛄或五谷虫等；所述节肢动物选自蝎子或蜘蛛等。具体的，该提取方法为将干燥的昆虫或节肢动物粉渣先用二氯甲烷浸泡两次，每次浸泡36 - 48h，然后固液分离(合并所得浸提液并浓缩干燥得脂溶性提取物)；所得粉渣干燥后再用质量浓度70%的甲醇水溶液浸泡两次，每次浸泡36 - 48h，合并浸泡所得醇提液并于-60°C放置24h后冷冻干燥得浸膏，该浸膏即为水溶性提取物。采用本发明方法所得昆虫提取物浸膏对G+阳性菌或G—阴性菌有不同程度的抑菌作用，可用来分离制备具有抑菌活性的化合物，为昆虫化学的研究奠定了方法学基础，具有较重要的学术意义和良好的应用前景。长白山红蚁印.)购买自洛阳万国大药房，为膜翅目蚁科切叶蚁亚科。国内外对红蚁的药理和免疫功能实验证明，红蚁具有明显的抗炎、平喘、镇静、护肝、镇痛作用，对人体免疫功能有适应原样双向调节作用。九香虫(Aspongopus chinensis ifeBas)购买自洛阳张仲景大药房，即半翅目，异翅亚目，蝽科的瓜黑蝽。功能与主治理气止痛，温中助阳；用于胃寒胀痛，肝胃气痛，肾虚阳痿，腰膝酸痛。蝎子Qtetermwtrus spinifer)购买自洛阳万国大药房，属节肢动物门蛛形纲钳蝎科动物东亚钳蝎(拉丁)的干燥体，主产于河南、山东、河北等地。蝎子具有息风止痉、攻毒散结、通络止痛的功效，用于急慢惊厥风、中风面瘫、破伤风痉挛、疮疡肿毒、瘰疬结核、顽固性偏正头痛、风湿痹痛等症。近年来，随着国内外生物医药学、生物化学及分子生物学的发展，蝎子和蝎毒素的应用领域不断拓宽，已成为治疗多种疑难病的药物而应用于临床。蟑螂(^aiia oriental is Zi/waeM)，购自安徽亳州老一堂药房，学名为蜚蠊，属于昆虫纲蜚蠊目(Blattodea)蜚蠊科(Z^aiiiifee)，作为药用最早载于《神农本草经》，主治 “瘀血症坚、寒热、破积聚、喉咽痹、内寒无子”，在历代重要本草典籍如《新修本草》、《本草纲目》、《本草纲目拾遗》中均有收载，近代许多药学专著中也有记述旧。现代科学研究表明蜚蠊黏多糖具有抗癌、抗过敏、治疗妇科疾病、肝炎、肝损伤等方面的功效。蜘蛛Urama ventricosa L. ^oc幻，购自安徽亳州老一堂药房，属于节肢动物门 (JriArc^oi/a)，蛛形纲)，蜘蛛目(AFaneoe、。蜘蛛的地理分布极为广泛，适应性也非常强，具有强大的自然进化能力。蜘蛛都有一对毒腺，位于头部螯肢末端，其开口常位于螯爪术端，能够在极其恶劣的环境中生存。蝼虫古(Gryllotalpa africana Pal. De Beauvois )是一味药用历史悠久的动物药，购自安徽亳州老一堂药房，蝼蛄性寒，味咸，人大、小肠，膀胱经，主治各种水肿，大小便不利，尿潴留，泌尿系统结石等杂症。东方蝼蛄Gryllotalpa orientalis Burmeister为我国的广布种，也是蝼蛄药材的主要商品品种，它含有的化学成分除氨基酸、微量元素外，2007年魏道智等首次从中分得脂肪酸和留醇两大类十三种化合物及苯乙酸。1谷曳(Shrysomyia megacephala / 力.入俗名蛆，购自安徽亳州老一堂药房，泛指丽蝇科昆虫的幼虫。据中国医药《本草求源》、《本草便读》记载，该虫性寒，经干燥研末后， 供搽敷外用，能治疗臁疮、唇疔。本发明与现有技术相比，具有以下优点及突出效果
本发明从昆虫或节肢动物源次生代谢物出发，研究开发具有抑菌作用的活性化合物， 利用生物学相溶性“两段溶剂提取法”即先用溶剂二氯甲烷提取昆虫的脂溶性成份，再用甲醇水溶液提取其中的极性物质。这样一方面可以在原料的处理过程中确保能获取昆虫体内所有的代谢物成分(因次生代谢物在昆虫体内成分复杂、含量很低)；另一方面还要确保提取过程中其本身的生物学活性不变，保证原料分离的可靠性和准确性，有效解决了昆虫天然产物研究的“瓶颈”问题。采用本发明方法提取出来的提取物对G+阳性菌或G—阴性菌有不同程度的抑菌作用。本发明所实施的两段溶剂提取法的抑菌活性筛选研究，适合于所有昆虫、节肢动物和两栖动物。通过设计获得的虫源特征提取物，经进一步分离制备出具有抑菌活性的纯品化合物，继而可以利用波谱分析、电子喷雾及晶体衍射技术进行结构鉴定和表征；筛选评价获得的虫源抑菌活性新化合物，继续对其进行抗生素效力测定，有可能发现并优选出全新骨架抗生素药物先导化合物，为获得新型的抗生素药物奠定基础，为新型抗生素的研制提供新途径和新思路。此外本发明采用的昆虫或节肢动物繁殖快、数量多分布广，是传播疾病的媒介；它们寄生在肮脏恶劣环境中，适应并进化出一套自身分泌抗生素的能力和机制， 能够产生强的抑菌能力。在目前缺乏新结构、新靶点抗生素的现状下，昆虫及节肢动物基于生物相溶性两段溶剂提取法进行的抑菌活性成分的研究，为昆虫或节肢动物化学研究方向奠定了方法学基础，具有较重要的学术意义和良好的应用前景。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围不限于此。各实施例中干燥的昆虫或节肢动物粉渣经下述处理而得取昆虫或节肢动物的全体粉碎过80 目筛，然后置于60 °C烘箱中干燥至恒重后即得。实施例1
一种昆虫或节肢动物次生代谢物的提取方法，其包括如下步骤将干燥的长白山红蚁粉渣先用二氯甲烷浸泡(浸泡以能淹没粉渣为宜，浸泡过程可以用超声波辅助)两次(第一次浸泡结束后过滤，粉渣用新的二氯甲烷再次浸泡)，每次浸泡48h;然后过滤得到浸提液 (合并两次所得浸提液，浓缩干燥得CH2Cl2浸膏，该CH2Cl2浸膏即为昆虫的脂溶性代谢物，密封，放冰箱中保存备用)和粉渣，粉渣干燥后再用质量浓度70%的甲醇水溶液浸泡两次，每次浸泡36h ；合并两次浸泡所得醇提液并于-60°C放置24h后冷冻干燥得浸膏(该浸膏即为提取所得的昆虫水溶性代谢物，表1和2中记为70%甲醇浸膏)，密封放冰箱中保存备用。实施例2
用九香虫粉渣替换长白山红蚁粉渣，其它同实施例1。实施例3
用蟑螂粉渣替换长白山红蚁粉渣，其它同实施例1。
实施例4
用蝼蛄粉渣替换长白山红蚁粉渣，其它同实施例1。实施例5
用五谷虫粉渣替换长白山红蚁粉渣，其它同实施例1。实施例6
用蝎子粉渣替换长白山红蚁粉渣，其它同实施例1。实施例7
用蜘蛛粉渣替换长白山红蚁粉渣，其它同实施例1。上述各实施例所得浸膏(即昆虫提取物)的抑菌试验
取各实施例最后制得的浸膏，用质量浓度70%的甲醇水溶液分别配成浓度为15 mg/mL 和30 mg/mL的溶液(提取过程中所得CH2Cl2浸膏用70%甲醇-油配制成相应浓度进行抑菌效果对比)，以G-菌大肠杆菌(E. coli)、G+菌枯草芽孢杆菌(B. subtilis)作为菌源，溶剂 70%甲醇-油和70%甲醇水溶液作为阴性对照，青霉素作为G+菌阳性对照，硫酸庆大霉素作为G-菌阴性对照，青霉素和硫酸庆大霉素均配制1 mg/mL和10 mg/mL两个浓度，做生物活性测试。观察是否有抑菌圈的生成，并记录其抑菌圈大小，结果详见表1和表2。抑菌活性测试采用平板法对昆虫提取物进行抗菌活性筛选并进行抑菌分类。实验菌株选用临床上使用的病原菌细菌革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌 (B. Subtilis )和金黄色葡萄球菌(S. aureus Rosenbach)；革兰氏阴性菌大肠杆菌(Ε. coli)和绿脓杆菌(P. Aeruginosa)。阳性对照药物G+阳性菌青霉素(Penicillin G Sod) ;G_阴性菌庆大霉素 (Gentamicin)0相应的两种提取物脂溶性代谢物(即CH2Cl2浸膏)和水溶性代谢物(即70% 甲醇浸膏)分别用溶剂70%甲醇-油(油为市售植物油，如鲁花花生油)和70%甲醇-水作为阴性对照进行评价。通过考察抑菌试验，确定所有被评价的昆虫或节肢动物水溶性代谢物的提取物浸膏对G+阳性菌或G—阴性菌具有不同程度的抑菌作用，可用来分离和制备具有抑菌活性的化合物，为昆虫的化学研究奠定了方法学基础，具有较重要的学术意义和良好的应用前景。
表1.各实施例所得昆虫提取物对G+P日I性菌的抑菌作用
权利要求
1.一种昆虫或节肢动物次生代谢物的提取方法，其特征在于，包括如下步骤将干燥的昆虫或节肢动物粉渣先用二氯甲烷浸泡两次以上，每次浸泡时间不少于36h，然后固液分离；所得粉渣干燥后再用甲醇水溶液浸泡两次以上，每次浸泡时间不少于36h，合并浸泡所得醇提液并冷冻干燥后得浸膏。
2.如权利要求1所述昆虫或节肢动物次生代谢物的的提取方法，其特征在于，所述昆虫选自长白山红蚁、九香虫、蟑螂、蝼蛄或五谷虫；所述节肢动物选自蝎子或蜘蛛。
3.如权利要求1或2所述昆虫或节肢动物次生代谢物的提取方法，其特征在于，将干燥的昆虫或节肢动物粉渣先用二氯甲烷浸泡两次，每次浸泡36 — 48h，然后固液分离；所得粉渣干燥后再用质量浓度70%的甲醇水溶液浸泡两次，每次浸泡36 - 48h，合并浸泡所得醇提液并于_60°C放置24h后冷冻干燥得浸膏。
全文摘要
本发明涉及一种昆虫或节肢动物次生代谢物的提取方法，该方法为将干燥的昆虫或节肢动物粉渣先用二氯甲烷浸泡两次以上，每次浸泡时间不少于36h，然后固液分离；所得粉渣干燥后再用甲醇水溶液浸泡两次以上，每次浸泡时间不少于36h，合并浸泡所得醇提液并冷冻干燥后得浸膏。所述昆虫选自长白山红蚁、九香虫、蟑螂、蝼蛄或五谷虫；节肢动物选自蝎子或蜘蛛。采用该方法所得提取物浸膏对G+阳性菌或G-阴性菌有不同程度的抑菌作用，可用来分离制备具有抑菌活性的化合物，为昆虫化学研究奠定了方法学基础，具有较重要的学术意义和良好的应用前景。
文档编号A61K35/64GK102293785SQ201110249570
公开日2011年12月28日 申请日期2011年8月29日 优先权日2011年8月29日
发明者任运来, 刘普, 姜亚玲, 宋政伟, 尹卫平, 李国芝, 李文渊, 段文录 申请人:河南科技大学